"CONTEO DE CELULAS SANGUINEAS A TRAVES DE IMGENES DE MICROSCOPIA" TESIS QUE PRESENTA ROBERTO JUAN NAVARRO RAMOS PARA LA OBTENCION

DEL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS (INGENIERIA BIOMEDICA) NOVIEMBRE DE 1999 UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA-IZTAPALAPA DIVISION DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA

AI consejoNacional de Ciencia y Tecnologa(CONACYT), por su

apoyo econmico durante la realizacin de mis estudios de Maestra.
A mis asesores M. en C. Jos Rafael Godnez Fernndez y M. en C. Oscar Yaez Surez, portodas sus enseanzas y consejos para la elaboracin del presente trabajo.

AI laboratorio de

Biofsica y a todos sus integrantes por comentarios, criticas y recomendaciones para este trabajo.

sus

A todos los profesores de la Maestra en Ciencias (Ingeniera

Biomdica) de la Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, por sugran apoyo en todo momento.
A la D. en C. Jatzri Gaytan, por su invaluable ayuda presentacin de los resultados de este trabajo.

para la

A MIS PADRES: POR QUIENES HE LOGRADO TANTAS COSAS, POR SUS TANTAS HORAS DE DESVELOS, POR SUS ENSEASAS Y CONSEJOS, POR SU AMOR, SU COMPRENSION, POR DEDICARME SU VIDA..

GRACIAS

A MI HERMANO: POR SU APOYO, CARIO Y COMPRENSION, POR SUS OPINIONES Y CRITICAS A MI TRABAJO, Y POR ENSEARME CUANDO FUE NECESARIO

A MIS AMIGOS: POR SU AMISTAD INCONDICIONAL EN CADA MOMENTO.

El presente trabajo describe el anlisis de imgenes de microscopa de muestras sanguneas en una cmara de Neubauer, a travs de diferentes tcnicas de procesamiento y blancas. digital de imgenes, para contar automticamente cifras totales de clulas rojas La tcnica se ha automatizado para eliminar el error humano involucrado en los conteos manuales. De esta forma, se pretende lograr conteos mucho ms confiables con un grado de reproducibilidad mucho mayor que con el conteo manual. Se describe la metodologa para realizar la exploracin de las imgenes a travs de las diferentes de etapas procesamiento: segmentacin (umbralizacin, erosin y dilatacin), reconocimiento de objetos (clulas) presentes en las imgenes y aplicando el criterio de conteo una cmara de Neubauer. en Se valoran los resultados obtenidos por medio del conteo automtico comparndolos con los obtenidos con conteo manual aplicando un estudio estadstico que involucraa la prueba de t para muestras pareadas, encontrandodiferencias aceptables, indicando queel sistema es vlido para evaluar muestras sanguneasy obtener el nmero de ellas por mm3 de sangre. Finalmente se describe implementacin y utilidad de un visor de morfologas, que la permita al patlogo o mdico observar las muestras sanguneaspor medio de un monitor de computadora, mismo que permite obtener algunos parmetros importantes para la valoracin del estadoque guardan las clulasde un individuo.Estesoftware tambin permite al usuario calcular algunas mediciones en puntos especficos de una clula, que para 1 puedan ser de inters particular.

CAPITULO I
1.0 IMPORTANCIA DE LAS CLULAS SANGUNEAS Y

Pgina

su CONTEO........................................

1.1 GENERALIDADES ACERCA DE LOS CONTADORES DE CLULAS SANGUNEAS .........5

OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 35 Objetivo General .............................................................................................................. 35 Objetivos Particulares ...................................................................................................... 35

Pgina

CAPITULO I1........................................................................................................................................... MATERIAL Y METODOS ...................................................................................................................

37

37

2.1 MATERIAL ........................................................................................................................................ 37 2.2 METODOS......................................................................................................................................... 2.2.1 MTODOS COMNMENTE UTILIZADOS EN EL LABORATORIO.......................................................... 2.2.2.1 Citometra henztica manual.................................................................................................. 2.2.2.2 Forma en que se realiza el conteo de clulas en una cmara de Neubuuer ........................... 2.2.2.3 Errores en Citometra hemtica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2.4 Recuento deglbulos rojos o eritrocitos................................................................................ 2.2.2.7 Reactivos para realizar recuento celular en una cmara de Neubauer ................................. Pura el recuento de glbulos blancos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 INNOVACIONES A LOS MTODOS UTILIZADOS .................................................................. 2.3.1 MTODOS PARA LA OBTENCIN DE LAS MUESTRAS SANGUNEAS ................................................... 2.3.1.I Protocolo p a m la obtencin de sangre en ratas.................................................................... 2.3.2 PROTOCOLO PARA LA OBTENCIN DE MUESTRAS DE SANGRE HUMANA......................................... 2.3.3 REALIZACI~N EXPERIMENTOS............................................................................................ DE LOS 2.3.3.1 Innovaciones realizadas a la tcnica..................................................................................... Tcnica de las clulas brillantes muestra fuera de foco .................................................................. 2.3.4 Visualizacin de mofologias (MORFOLOG)........................................................................... 2.2.1.1 Frotiso extensiones de sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1.2 Coloracin de los frotis ..........................................................................................................
41

41 41 42 43 45 48 49

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51
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59
5Y 59

63 63 65

CAPITULO 111............................................................................................................................................... ALGORITMOS COMPUTACIONALES .................................................................................................... 3.1 TCNICAS DE PROGRAMACI~NPARA EL PROCESAMIENTO DIGI TALDE LAS IMGENES ..................................................................................................................................................... 3.1.1 CONTADOR DE CLULAS SANGUNEASCONCELSAN ...........................................................

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69
69

69

3.1.1.1 Concel ........................................................................................................................................... 69 3.1.1.2 Celcon ........................................................................................................................................... 75 3.2 VISORDE MORFOLOGIAS MORFOLOG .........................................................................................
3.2.1 R A D I O ...................................................................................................................................................

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79

3.3 DISEO Y CONSTRUCCIN DE UNA INTERFASE GRFICA.....................................................

79

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Pgina CAPITULO IV .........................................................................................................................................

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85

R E S U L T A D O S .............................................................................................................................
4.1 RESULTADOS OBTENIDOS.......................................................................................................... 4.1.1 VALIDACIN DE LOS CONTEOS EN LAS IMCENES ...................................................................... 4.2 RESULTADOS OBTENIDOS. EN EL CONTEO DE CLULAS ROJAS DE RATA

85
86

...............88

4.3 RESULTADOS OBTENIDOS. COMPARACI~N V A L I D A C I ~ N Y DEL SISTEMA

CONCELSAN Y EL CONTEO CLSICOEN UNA CMARA DE NEUBAUER CON CLULAS HUMANAS............................................................................................................................................... 89

4.3.1 CONTEO E N CMARA DE NEUBAUER ........................................................................................... 4.3.1.1 Conteo de clulas blancas ....................................................................................................... 4.3.1.2 Clulas rojas.......................................................................................................................... 4.4 CONTEO A TRAVES CONCELSAN DE

89 89 90
91

.......................................................................................

4.4.1 CONTEO DE CLULAS BLANCAS ................................................................................................... 91 4.4.2 CONTEO DE CLULAS ROJAS ........................................................................................................ 92 4.5 ESTADISTICA DE LOS CONTEOS ............................................................................................... 93

DISCUSION ...............................................................................

97
99
101

CONCLUSIONES................................................................................................... COMENTARIOS Y RECOMENDACIONES ............................................. REFERENCIAS ..................................................................................

103

CAPITULO I

1.0 Importancia de las clulas sanguneas y su conteo.

La sangre es una forma especializada de tejido conectivo que consta de elementos formes, o clulas sanguneas, y una sustancia intercelular lquida, el plasma sanguineo. El volumen de sangre en el adulto humano sano es aproximadamente de cinco litros, y desde el punto de vista cuantitativo la sangre constituye alrededor del 8% del peso corporal. A causa de la fluidez del plasma, las clulas sanguneas no tienen relacin espacial definida; las clulas sanguneas reciben su nombre segn su aspecto en estado fresco, no teidas, y son de dos tipos principales: rojas (eritrocitos) y blancas (leucocitos). Otros elementos formes que se encuentran en la sangre son las plaquetas. [ 1b]
El examen de los elementos formes de la sangre es de importancia clnica, ya que la morfologa, el nmero y las proporciones de los diferentes tipos celulares son indicadores de muchos cambios patolgicos en el cuerpo. Aunque algunas caractersticas de los elementos formes son visibles en sangre fresca, muchas otras slo lo son despus de fijarlas y teirlas. Los mtodos de tincin de Romanowsky, de los cuales son ejemplos los de Giemsa y de Leishman, se usan mucho en los laboratorios hsitolgicos y clnicos. Incluyen la tincin en soluciones que son mezclas de azul de metileno y eosina. Las cifras dadas (estas se mencionan posteriormente) para las dimensiones y el nmero delas clulas slo son valores aproximados, yque con excepcin de los eritrocitos, las dimensiones delas clulas son menores cuando se miden en estado fresco que cuando se miden en un frotis de sangre seca y fijada. Eritrocitos

Los eritrocitos, o glbulos rojos, son clulas muy diferenciadas, especializadas funcionalmente para el transporte de oxgeno. En los mamferos el eritrocito es una clula que ha perdido su ncleo y sus organitos citoplasmticos durante el desarrollo. Cada clula tiene la forma de un disco bicncavo, y cuando se observa de frente tiene contorno circular. En algunas enfermedades se altera la forma de los eritrocitos humanos circulantes. Miden alrededor de 7.6 pm de dimetro, y 1.9 pm en su parte ms gruesa en frotis secos.

Estado del arte

Los eritrocitos son mucho mas numerosos que cualquiera de los otros elementos formes de la sangre. En los varones hay de 5 a 5.5 millones de eritrocitos y en las mujeres, de 4.5 a 5 millones por mm. La residencia prolongada en lugares elevados se acompaa de aumento en el nmero de eritrocitos. La cifra total de eritrocitos por superficie es impresionante. Se eleva a 3500 m2 aproximadamente. Esta rea enorme sirve para el intercambio de gases entre los eritrocitos y su medio. Un eritrocito seco y aislado es de color amarillo verdoso plido. Con regiones densas de color rojo. En un frotis seco de sangre perifrica, los eritrocitos se tien de rojo (con las tinciones de Leishman, o de Giemsa).

Leucocitos

Los leucocitos, o glbulos blancos, son clulas con ncleo. Hay un promedio de 5 O00 a 9 O00 leucocitos por mm3 en la sangre humana normal. En losnioseste nmero es mayor. Su nmero vara notablemente en los estados patolgicos. Si el nmero aumenta por encima de 12 000, el trastorno se llama leucocitosis; si disminuye por debajo de 5 000, se llama leucopenia.[ lb] Hay dos tipos principales de leucocitos: agr-anulares y granulares. Los leucocitos agranulares tienen citoplasma de aspecto homogneo y ncleo con forma que va de esfrica a reniforme. Los leucocitos granulares contienen grnulos especficos abundantes (que en vida son gotitas semilquidas) en su citoplasma, y poseen ncleos de forma muy variable. A su vez, hay dos tipos de leucocitos agranulares: los linfocitos, que son clulas pequeas con citoplasma escaso, ylos monocitos, que son clulas ligeramentems grandes que contienen algo ms de citoplasma. Los leucocitos granulares son de tres tipos: neutrofilos, basofilos y acidofilos (o eosindfilos), quese identifican por la afinidad de sus respectivos grnulos por los colorantes neutros, bsicos y cidos, respectivamente.

Los leucocitos participan generalmente en la defensa celular y humoral del organismo contra agentes extraos. Son capaces de efectuar movimientos ameboides que les ayudan a pasar a travs de las paredes de los vasos sanguneos, y poder penetrar en los tejidos conectivos.
En la sangre humana los linfocitos son clulas esfricas, con dimetro que varia de 6 a 8 pm, aunque algunos pueden ser mayores. La mayor parte solo son un poco mayores que los eritrocitos. Constituyen de 20 a 35% de los leucocitos de la sangre normal. La caracterstica ms notable del linfocito pequeo es que tiene un ncleo relativamente grande rodeado por un anillo estrecho de citoplasma. El ncleo aparece esfrico, pero por lo general muestra una pequea identacin en un lado.

CAPITULO I

Algunos de los linfocitos de la sangre circulante normal pueden medir de 1O a 12 pm. Su tamao ms grande se debe principalmente a una cantidad mayor de citoplasma. Estas clulas a veces se denominan linfocitos de tamao medio.
Los monocitos, son clulas que constituyen del 3 al 8 % de los leucocitos de la sangre normal. Miden de 9 a 11 pm de dimetro, pero en los frotis secos se pueden aplanar para alcanzar un dimetro de 20 pm o ms. El ncleo suele estar excntrico en las clulas y es ovoide o reniforme. En las clulas ms viejas el ncleo puede presentar una profunda depresin que le da la forma de herradura. En su interior, la cromatina se dispone en forma de una red fina, por lo que el ncleo no se tie con tanta intensidad como el de los linfocitos. El citoplasma es relativamente abundante y con la tincin de Wrigth es de color azul grisceo plido en los frotis secos. A menudo presenta un aspecto vacuolado o reticulado y contiene una poblacin de grnulos azurfilos; stos suelen ser ms numerosos, pero ms pequeos que los de los linfocitos. Los grnulos son lisosomas primarios. El citoplasma tambin contiene algo de retculo endoplsmico granuloso, pero menos ribososmas libres que los que se encuentran en los linfocitos.

Leucocitos granulosos

En contraste con los linfocitos y monocitos, los leucocitos granulares siempre contienen grnulos especficos. Se caracterizan por la presencia de un ncleo multilobulado (poliformo). Por esta razn, a veces, se les ha llamado leucocitos polimorfonucleares.

Neutrfilos

Los leucocitos polimorfonucleares neutrfilos tienen un dimetro de 7 a 9 pm en estado fresco y de 10 a 12 pm en los frotis secos. Son el grupo ms numeroso de leucocitos en la sangre humana y constituyen el 65 a 75 YOdel total. El ncleo es muy variable en su forma. Suele constar de tres a cinco lbulos ovoides irregulares unidos por filamentos delgados de cromatina. El nmero de lbulos aumenta con la edad. No se observan nucleolos. En fiotis secos de sangre perifrica de mujeres se puede observar un pequeo apndice nuclear unido al resto del ncleo por una banda de cromatina en casi 3 YOde los neutrfilos. Es probable que este palillo de tambor, observado por primera vez por Davidson y Smith, represente el cromosoma sexual. Se supone que se encuentra en todas las clulas femeninas, pero en la mayor parte de las clulas est ntimamente unido a uno de los lbulos del ncleo y por ello queda oculto.
Eosinfilos
Los leucocitos eosinfilos o acidfilos, son algo ms grandes que los neutrfilos y en estado fresco tienen un dimetro de 9 a 10 pm. En los fiotis secos, el tamao de las clulas aplanadas varia de 12 a 14 pm. Normalmente constituyen alrededor de 2 a 4 YO
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Estado del arte

de los glbulos blancos. El ncleo suele ser bilobulado. Como caracterstica, el citoplasma est lleno de grnulos gruesos refringentes de tamao uniforme que se tien intensamente con los colorantes cidos. Los grnulos especficos tienen un aspecto llamativo en las micrografias electrnicas, pues parecen presentar bandas por la presencia de cristales cilndricos densos dentro de ellos. Se ha demostrado quelos grnulos contienen peroxidasas, as como cierto nmero de enzimas hidrolticas. Por ello estos grnulos como los de los neutrfilos, son de naturaleza lisosmica.

Basfilos

Es dificil encontrar estas clulas en la sangre humana, ya que slo constituyen alrededor de 0.5 a 1 % del nmero total de leucocitos. Tienen ms o menos el mismo tamao que los neutrfilos, de 7 a 9 pm de dimetro en estado fresco y de 10 pm o un poco ms en los frotis secos. A menudo el ncleo presenta contorno irregular y est parcialmente estrechado para formar dos lbulos gruesos yde tamao variable. De manera caracterstica, algunos cubrenel ncleo y contribuyen a ocultar su entorno. Estos grnulos son hidrosolubles y por lo tanto estn disueltos en parte o faltan en las preparaciones sistemticas. Son basfilos y metacromticos y contienen histamina, heparina, y serotonina. A diferencia de los grnulos de los otros tipos de leucocitos granulares, no se considera que sean lisosomas.
El cuadro sinptico 1.1 muestra detalladamente los diferentes elementos que integran la fase de elementos formes de la sangre. El factor primordial por el cual es de suma importancia conocer el nmero de clulas sanguneas por mm3 que se encuentran en el cuerpo humano, es detectar posibles patologas que se acompaan de una disminucin o incremento en la densidad de las clulas. Tambin resulta desuma importancia conocer la morfologa de cada tipo celular a travs de su observacin, ya que el diagnostico preciso de una patologa no solo sebasaen el conteo celular sino tambin en la observacin detallada dela morfologa, y en mediciones puntuales de ciertas partes de cada uno de los diferentes tipos celulares (por ejemplo, microcitosis, poiquilocitosis, etc).

CAPITULO I

O Basfilos

3 Granulocitos

O Neutrfilos

Fase de elementos formes Agranulocito

O Eosinfilos

0 Linfocito

Monocito

Cuadro sinptico l . 1 Diferenciacin de la fase de elementos formes de la sangre en sus componentes [IC]

1.1 Generalidades acerca de los contadores de clulas sanguneas

Los primeros intentos para contar el nmero de clulas sanguneas fueron realizados en el siglo XVII, poco tiempo despus de haber sido descubiertas por el investigador Van Leeuwenheok. Utilizando un rudimentario microscopio y la sangre de un pollo, Van Leeuwenheok cont el numero de eritrocitos presentes en una muestra, depositada en un capilar graduado de vidrio[2b]. La tcnica general del conteo de clulas empleando un microscopio, en un contenedor transparente, se fue desarrollando gradualmente, a travs de mejoras tanto al microscopio como al contenedor, hasta llegar al diseo de "cmaras de conteo", esto despus dos de siglos de investigacin continua. Es en el siglo XIX cuando se desarrollan las tcnicas de dilucin de la sangre, que permiten el diseo de cmaras ms precisas. El resultado son conteos ms exactos y ms fciles de realizar utilizando una cmara rectangular de poca profundidad con una delgada cubierta de vidrio, diseada por Burke, en la cual la sangre diluida esta contenida.
5

Estado del arte

Enel siglo XX, con los avances en la electrnica y la electroptica, se han realizado muchos intentos para simplificar el conteo de clulas sanguneas. En 1934 Moldavan describi un procedimiento con el cual las clulas diluidas en suspensin son contadas por medio de un dispositivo fotoelctrico. Lamentablemente debido a imperfecciones del dispositivo fotoelctrico, este primer intento para automatizar la tcnica de conteo de los eritrocitos, fue fallido. Posteriormente, infinidad de aparatos fueron diseados utilizando el principio en el que se basa el dispositivo de Moldavan. Aproximadamente en 1945, se describi un mtodo con el cual la concentracin de eritrocitos en la sangre podra ser determinada indirectamente utilizando turbidimetra. Este mtodo fue estudiado y mejorado, resultando en un instrumento apropiado, que se muestra esquemticamente en la figura No l . 1. En este instrumento los eritrocitos no son contados uno a uno, como en el caso de los primeros contadores automticos, por ello el instrumento deba de ser calibrado contra una preparacin de clulas de referencia o una preparacin artificial estndar.

Celda de absorcin

Filtro

: ,

4
Anillo
fotocelda

LamDara

Diafragm

Figura l. 1 Diagrama esquemtico del mtodo de esparcimiento de luz de Kleine.La cantidad de luz esparcida en el anillo fotodetector es tomada como proporcional a la concentracin de clulas en la celda de absorcin

CAPITULO I

En la misma dcada se describi otro instrumento con el cual los eritrocitos podan ser contados automticamente, por medio de un punto de exploracin fotoelctrico, a travs de una delgada capa de sangre diluida. En este instrumento, el microscopista es reemplazado por un fotomultiplicador y una unidad contadora. La cmara de conteo es movida por medio de un motor que maneja el sistema. Un instrumento basado en esta tecnologa es conocido como el contador Casella, el cual se muestra en la figura 1.2. Posteriormente, en instrumentos mas sofisticados, los cuales se basaban en un punto de exploracin flotante, se tomaron medidas especiales, para compensar los errores causados por la superposicin (oclusin) o irregularidades en los bordes de las clulas.
Hendidura P o t o m u l t i p l i c a d ~

Condensador de campo negro

Figura 1.2. Diagrama esquemtico del dispositivo que utiliza punto de exploracin fotoelctrica

En 1953, se da a conocer un mtodo, en el cual la sangre era forzada a pasar a travs de una estacin ptica de deteccin en forma de un delgado hilo de fluido. Este procedimiento reduca la probabilidad de superposicin de las clulas sanguneas, que podan ser contadas una a una. El contador EEL es un instrumento basado en este principio (el diagrama de este instrumento se muestra en la figura 1.3). Pero debido a la conglomeracin en el largo y delgado capilar, este mtodo ya no es utilizado actualmente.

Estado del arte

Figura 1.3 Diagrama esquemtico de un sistema utilizando mtodo un clulas[2b].

fotoelctrico de conteo simultneo de

En 1956, Coulter [la] introdujo un contador automtico de clulas. Este aparato se basa en la menor conductividad de los eritrocitos, en comparacin con el lquido en el cual se diluyen. Enel instrumento de Coulter, las clulas sanguneas suspendidas en una solucin electroltica, son inducidas a un flujo a travs de un campo elctrico, en un orificio pequeo taladrado enun zafiro delgado. El campo elctrico que rodeaeste orificio pequeo, es la partesensora del instrumento. Gracias a la porcin pequea de la seccin de sensado, las clulas sanguneas son detectadas y contadas casi una a una. Uno de los modelos de este instrumento se muestra en la figura 1.4.

Figura 1.4 Contador Coulter modelo F, con accesorios para hematcrito y calculo de HGM [3b].

Las mediciones del tamao de las clulas tambin fueron iniciadas gracias al microscopio, inventado por Van Leeuwenheok. Pero fue hasta 17 18 que Jurin estableci adecuadamente el dimetro de las clulas rojas humanas. De igual modo que el conteo de clulas, el establecimiento del tamao de estas fue realizado visualmente, hasta el siglo XX. A comienzos del siglo XX, las tcnicas de centrifugacin fueron aplicadas a
8

CAPITULO I

toda la sangre, permitiendo una medida del paquete de clulas rojas o hematcrito. De aqu, Wintrobe defini los indices de las clulas rojas.
El desarrollo del mtodo de Coulter, a mediados del siglo XX, para el conteo de clulas, sugera que estas podan ser medidas simultneamente, a travs de la aplicacin de un impulso elctrico, el cual al pasar a travs de las clulas da como resultado una corriente proporcional al volumen de estas. Argumentos similares fueron utilizados posteriormente para validar los sistemas de conteo con celdas fotoelctricas. As mismo, por medio de estas tcnicas se inicio el desarrollo de sistemas combinados con los cuales se calculan tanto el tamao como el nmero de las clulas presentes en una muestra.

1.2 TEORIA Y TECNOLOGIA PARA EL CONTEO DECELULAS

1.2.1 Descripcin del problema.

Conceptualmente, el conteo de clulas es simple. Un problema puede ser el reconocer cada tipo celular presente en un determinado volumen en una muestra[ 1 1b]. Algunos de los problemas ms significativos son:
1. La sangre es un fluido de dos fases con una viscosidad no constante. 2. El gran nmero de clulas por unidad de volumen de sangre, demanda que se realice una dilucin o que se utilice un elemento de sensado lo suficientemente pequeo. 3. Las clulas son en general, mas densas que el fluido que las circunda. Esto crea un problema en cuanto a establecer y mantener una suspensin homognea para realizar el anlisis. 4. Las clulas son tan pequeas, que se requieren de sensores con muy alta sensibilidad para discriminar entre ellas y ruido aleatorio. 5. Las diferencias entre los diferentes tipos celulares pueden ser muy sutiles, requiriendo complicadas preparaciones y algoritmos para discriminar entre las diferentes clases.

1.2.2 Mtodos de dilucin.

Para detectar clulas individuales como partculas distintas, es generalmente necesario diluir la muestra de sangre, previamente al conteo. Las diluciones para el conteo de clulas sanguneas son completamente altas, y deben de ser tanto como 50,000 a l . De esta forma existen diversas tcnicas de dilucin para el conteo de clulas. Los mtodos de dilucin incluyen pipeteo manual, dilucin semiautomtica y recipientes de dilucin automtica.

Estudo del arte

1.2.3 Pipetas manuales. En los mtodos manuales de conteo de clulas (hematocitmetro), los diferentes tipos de clulas sanguneas, requieren diluciones en un rango comprendido entre 1 en 20 para clulas blancas, y de 1 en 200 para clulas rojas. En principio, existen 3 formas en las cuales las clulas pueden ser diluidas: (1) Pipetas de Thoma, estas pipetas estn diseadas para contener simultneamente la sangre y el lquido de dilucin, (2) Pipetas del tipo Sahli, que transfieren 20 pL de sangre a un contenedor, el cual contiene la cantidad apropiada de liquido de dilucin; y (3) Capilares diseados para realizar una puncin y reteneren ellos el volumen requerido de sangre. Para exactitud, las pipetas deben de ser calibradas ya sea a travs de un procedimiento gravimtrico o una valoracin fotomtrica. Los mktodos fotomtricos, sonquiz tcnicamente ms fciles de realizar, especialmente en el laboratorio de hematologa en donde la fotometra es un procedimiento de rutina. El mtodo gravimtrico es mucho ms exacto, y debe de ser utilizado para mtodos de referencia o si se desea unainexactitud menor que el 1%.

1.2.4 Dilucin semiautomtica

Diversos sistemas han sido diseados para simplificar la operacin de dilucin, eliminando uno o mas de los pasos. Estos sistemas incluyen, pipetas con autollenado, automedicin y dilucin, recipientes flexibles, y micropipetas de ensayo [lb].
1.2.4.1 Pipetas con autollenado, automedicin y dilucin

Estos dispositivos consisten en un tubo capilar delgado, ajustado a un mango de plstico, y a un recipiente tambin de plstico, en el cual est depositado un volumen predeterminado de lquido de dilucin. (ver figura 1.5). La sangre es extrada hacia el capilar. La dilucin es llevada a cabo despus de introducir el capilar dentro del recipiente. Las paredes del recipiente son presionadas gentilmente antes de insertar el mango del capilar, esto es, se crea una presin negativa. Cuando las paredes son liberadas la sangre es extrada desde el tubo hacia el diluyente. El tubo capilar es enjuagado con el diluyente apretando ligeramente el recipiente, forzando al fluido dentro del capilar y llenando la cmara. Cuando la presin es liberada, el diluyente regresa hacia el recipiente. Despus de mezclar la sangre con el diluyente por medio de agitacin, la pipeta de dilucin es regresada a su posicin inicial poniendo el capilar y reconectndolo al recipiente. Ahora el recipiente es exprimido gentilmente forzando a la sangre diluida hacia fuera del capilar, en forma degotas uniformes para llenar el hematocitmetro.

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CAPITULO I

Capilar

Figura 1.5 Micropipeta de dilucin de automedicin, consiste en una cmara de plstico conteniendo una cantidad premedida de diluyente y un capilar [2b].

1.2.4.2 Recipientes flexibles.

Este es otro aparato que simplifica el mtodo del capilar. El principio consiste en tomar la muestra directamente del tubo capilar por medio de un dispositivo metlico el cual es empujado a travs del capilar y colecta la muestra tomada. El dispositivo metlico es puesto despus enel diluyente y la muestra es mezclada a travs de rotacin, de aqu el nombre de "recipientes flexibles". La inexactitud de este mtodo se ha reportado menor a 1% y una imprecisin de 0.24% para una muestra de 20 pL.
1.2.4.3 Micropipetas de ensayo.

Estos dispositivos simplifican la extraccin y distribucin de una muestra en una pipeta ordinaria. Se utilizan medios mecnicos o automticos para su desalojamiento. En estos dispositivos, se puede lograr, una exactitud aproximada del 98% y una reproducibilidad del 99%.
1.2.4.4 Dilucin automtica.

El problema de diseo de un sistema dilutor de sangre totalmente automtico, es lograr resultados exactos y reproducibles en un rango de 5 a 50 pLde muestra sangunea. Estos problemas son algo diferentes desde la perspectiva de diseo para grandes volmenes de muestra sangunea y pequea dilucin. Para esta ltima clase de dilutor, es usualmente adecuado proveer al sistema con dos pistones del mismo diseo, uno largo para el diluyente y otro pequeo para la muestra, estos conectados a travs de una conexin de vlvulas apropiada. Cuando el volumen de la muestra es del orden de 5 a 50 pL, las limitaciones del diseo deben de ser mucho ms estrictas. Una variabilidad de f 2 pL, en una muestra del dispositivo el cual puede ser aceptable en 100 pL, se transforma en un totalmente
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Estado def arte

inmanejable f 10% si el dispositivo tiene 20 pL. Como quiera que sea, esta cantidad es muy fcil de perder en un sistema de vlvulas o en un sistema de tubos distensibles. Para un contador de clulas sanguneas, el dilutor debe de tener las siguientes caractersticas: Cero distensibilidad en el sistema de muestreo del dispositivo, la vlvula debe de ser del tipo no removible, o debe introducir variabilidad nicamente en muy altos volmenes de diluyente donde puede ser mucho mejor tolerado, la unidad debe de permitir rpida calibracin en el laboratorio para compensar cualquier deterioro, y debe de mantenersu calibracin por largos periodos de tiempo. El mtodo automtico de dilucin mas comnmente utilizado emplea una vlvula de corte para el dispositivo de muestreo (ver figura 1.6). La sangre es extrada y depositadaen una pequea cmara contenedora, dentro del elemento movible de la vlvula. Despus la muestra es capturada por el movimiento de la vlvula, y esta es lavada por una gran cantidad de diluyente. Las vlvulas de este diseo en general, estn fabricadas en metal o en cermica.

1.2.5 Diluyentes para el conteo de clulas.

Preparar la sangre para el conteo de clulas involucra el realizar la dilucin de la muestra. Debido a las diferentes densidades de los elementos formes de la sangre, el factor de dilucin es diferente, se emplean diferentes diluyentes (ver tabla 1).

Sensor
Valvula

rotatoria
esquiuada

Muestra
sanguinea

Figura 1.6 Mtodo de dilucin automtica, en el cual la sangre diluida es aspirada (izquierda) dentro de una cmara capilar contenedora, dentro de una vlvula rotativa de corte [2b].

1.3 Conteo de clulas rojas.

Diversos diluyentes para el conteo visual de clulas rojas han sido desarrollados (ver tabla No 1).
12

CAPITULO I

Para contadores automticos, especialmente aquellos basados en el mtodo de resistencia elctrica, es deseable evitar alteraciones en el pH, temperatura y en el grado de ionizacin, ya que esto puede influenciar al campo elctrico y permitir alteraciones en el tamao, forma y estabilidad de las clulas sanguneas en el diluyente. La solucin utilizada para la dilucin debe estar lo ms posible libre de partculas. Soluciones comerciales salinas (para uso intravenoso) son generalmente apropiadas; con otro tipo de soluciones podra ser necesario remover partculas de polvo a travs de membranas de filtracin. El diluyente debe dar un conteo menor a 100 partculas en el volumen medido. Cuando se utiliza solucin salina fisiolgica (9.0 g/L NaCl), los conteos deben ser realizados rpidamente despus de la dilucin, esto para evitar errores debidos a las alteraciones morfolgicas y lisis de las clulas.

Tabla No 1. Soluciones de dilucin para el conteo de eritrocitos en hematocitmetro Ulbl Solucin de Dacie Solucin de Hayem

I
~~

Solucin Normal Salina Solucin Fuerte

Solucin de Gowers

Solucin de Toison

Citrato trisdico (30%), 99ml Fonnaldehdo concentrado, lml Cloruro de Mercurio, 0.25 g Cloruro de Sodio, 0.5 g Sulfato de Sodio, 2.5g Agua Destilada, a 100 m1 Cloruro de Sodio, 0.85 g Agua Destilada, a 1O0 m1 Citrato de Sodio, 1.O g Cloruro de Sodio, 0.6 g Formaldehdo, 1.O m1 4gua destilada, a 100 m1 Sulfato de sodio, 6.75 g 4cido Actico (3%), 3.5 m1 4gua destilada, a 1 15.0 m1 Cloruro de Sodio, 1.Og Sulfato de Sodio, 8.0g Violeta metlica 5B, 0.025g Glicerol, 30.0 m1 Agua destilada, a 180.0 m1

13

TABLA No 1. (Continuacin) Soluciones de dilucin para el conteo de plaquetas [ l l b ] Solucin de Brecher-Cronkite Solucin de Dacie

Solucin de Rees-Ecker

lGramo de oxalato de amonio disuelto de 1O0 m1 de agua destilada. Citrato de sodio, 5.0g 40% de formaldehdo, lml Agua destilada, a 100 m1 1 m1 al 0.2% de Azul Cresil brillante esto se adiciona a la solucin descrita previo a su uso. Azul Cresil brillante, O. 1 g Citrato de Sodio, 3.8 g 40% de formaldehdo, 0.2 m1 Agua destilada, a 100 m1

1.3.2 Conteo de clulas blancas.

Cuando se cuentan clulas blancas, es necesario destruir por hemlisis la mayor parte posible o en el mejor de los casos el total de clulas rojas. Para el conteo visual se emplea una solucin de cido actico o O. 1M HCI. Tpicamente, un tinte, violeta de genciana, se incluye en la solucin, para colorear el ncleo de las clulas y hacer ms fcil su reconocimiento [ 12bl. Para contadores automticos se requiere una destmcci6n mas completa de la membranadelas clulas rojas, esto para reducir la posibilidad de conteos falsos producidos por los restos de las clulas. Tpicamente, se emplea un agente con alta concentracin, que produzca lisis, tales como la saponina.

1.3.3Conteo de Plaquetas.

En el conteo de plaquetas por medios visuales, tambin es necesario eliminar la interferencia producida por las clulas rojas. Esto puede ser hecho a travs de lisis en una solucin de oxalato de amonio (10mgA). Alternativamente, las clulas rojas son eliminadas permitiendo que la muestra completa sedimente a baja temperatura (en un refi-igerador). El plasma sobrenadante, el cual contiene a las plaquetas, sediluye en una solucin de formal-citrato. La cuenta es luego corregida multiplicando por un factor conocido el volumen del paquete de clulas rojas.

14

CAPITULO I

Algunos mtodos automticos para el conteo de plaquetas siguen tcnicas similares. No obstante, las tcnicas automticas ms comunes cuentan las plaquetas, y los diferentes tipos celulares al mismo tiempo, y enel mismo diluyente, empleando discriminacin electrnica para separar los dos tipos diferentes de clulas [ 1 1b- 12bl.

1.4 Mtodos de deteccin

La esencia de un contador automtico de clulas es el detector. Existen dos tecnologas apropiadas para este propsito, la deteccin ptica y la deteccin elctrica. En la primera (disparos de 1uz)un detector fotoelctrico responde al cambio en la intensidad de la luz causada por la presencia de las clulas de la sangre. En la segunda (impedancia de apertura) la alteracin de la impedancia de una pequea apertura, llena con una solucin conductiva, es causada por la presencia de las clulas sanguneas [2a4a].
1.4.1Medicin ptica

En trminos muy generales, el mtodo para la medicin de las clulas a travs onda del disparo de un haz de luz, se muestra en la figura 1.7. Un plano de electromagntica monocromtica de una longitud de onda h que sepropaga en un medio conun ndice de refraccin qo choca sobre la celda, la cual es caracterizada por su volumen, forma e ndice de refraccin qp.La interaccin de la radiacin incidente y la celda produce una onda pulsada, teniendo una intensidad la cual vara dependiendo del ngulo a. La dependencia angular dela intensidad dela radiacin pulsada es una funcin de laspropiedades de la partcula pulsada. La teora de pulsacin de una radiacin electromagntica ha sido desarrollada completamente para el caso particular de esferas homogneas, y ahora existen disponibles programas de computadora para calcular la distribucin de la intensidad y otras cantidades relevantes. La fuerte dependencia de las funciones de pulsacin con el tamao de una partcula se ilustran en la figura 1.8 y son tpicas para las clulas rojas de la sangre. Los parmetros de los sistemas pticos pueden ser escogidos para quela intensidad medida vare aproximadamente en forma lineal de acuerdo al tamao de la clula.

15

Aceptancia de apertur Fuente de

Particula oulsada

Figura 1.7 Ejemplo de un arreglo ptico para conteo de clulas a travs del sistema de luz pulsada [lb].

1.4.2 Mtodo elctrico (Impedancia de apertura). El mtodo elctrico de medicin de clulas se muestra esquemticamente en la figura 1.9. Las clulas suspendidas en un electrolito se hacen pasar a travks de una pequea apertura en un aislante. En ambos lados dela apertura estn ea tinas de electrolito largas. Aplicando la ley de Ohm para el caso en donde no existe ninguna partcula en la apertura obtenemos [8a-9a]:

R=VlI=p(lIQj

Ec. 1.1

donde V es el voltaje entre los electrodos, I es el flujo de la carga, R es la resistencia de la apertura, p es la resistividad del electrolito, t es la longitud de la apertura, y a es el rea de seccin cruzada de la apertura. Cuando una partcula pequea de muy alta resistividad, mayor quela del electrolito, entra en la apertura, la resistencia en la apertura se incrementa. La partcula acta como un hoyo no conductor desplazando al electrolito. El cambio en la resistencia puede ser calculada a travs de los principios bsicos de cualquier circuito electrnico cuando se conocen el voltaje, y la corriente circulante. Aqu se muestra, el caso d e la esfera con resistencia infinita, la cual produce:

A I 4 M=-=Kv(l+--x+V 5

843 1120

x2 -P..

Ec. 1.2

donde AI es el cambio en el flujo de la corriente, K es la resistencia de la apertura dividida por su volumen, v es el volumen de la esfera y x es el radio de la seccin cruzada de la apertura.
16

CAPITULO I

Escogiendo un dimetro de apertura de 50 pm y manteniendo una corriente constante, que permita pulsos con voltajes lineales, con un volumen particular (dentro de 5%) desde 10 fl a 140 fl. El tamao de la resolucin para este sistema es esencialmente limitado por el ruido de Johnson dela resistencia de apertura y es tambin tpicamente menor que 1 fl.

Angulo de pulsado (grados) Figura 1.8 Intensidades de pulsado diferenciales como hncin del ngulo de pulsado para el tamao e ndice de refraccin, parmetros tpicos de las clulas rojas [2b].

1.4.3 Mtodos de transporte de clulas

La determinacin del conteo de clulas requiere de contar cada clula enun volumen conocido de sangre diluida. Existen dos metodologas principales. En una (transporte mecnico), las clulas son transportadas a una pelcula estacionaria o al fondo de una cmara poco profunda (hematocitmetro) el cual es llevado a travs de la estacin de deteccin o escudriado pticamente por medio de traslacin mecnica (movimientos de la platina del microscopio). En el otro mtodo (transporte de fluido), las clulas estn suspendidas, en un fluido el cual es llevado despus por fuerzas hidrodinmicas y pasado por la estacin de deteccin; Ambos detectores, tanto pticos como elctricos pueden ser utilizados.

17

Estado del arte

ELECTROLITO

(P =RESISTAXDAD)

fj
,
ELECRTODO

\,

/"-

APERTURA
DE SENSADO

1.4.4 Transporte mecnico Un hematocitmetro es llenado con muestras de sangre diluida, y las clulas son sedimentadas formando una monocapa en el fondo. El conteo es ejecutado pasando la imagen de esta monocapa de clulas a travs de una estacin de deteccin ptica o visual. Esto puedeser efectuado transportando al hematocitmetro a travs de una estacin ptica fija, o el hematocitmetro es fijado y una imagen de lasclulases obtenida moviendo mecnicamente un prisma o espejo. El conteo de clulas se determina contando el nmero de clulas en una rea dada de la monocapa. El mtodo supone que las clulas se han sedimentado de manera aleatoria. As,

clulaslmm3 = Dilzxcl~llas/rea(mm2) Ec. 1.3

donde D es el factor de dilucin y h es la altura de la cmara de conteo (mm). La determinacin del rea de conteo es generalmente exacta. La exactitud del mtodo del hematocitmetro es limitada, debido a la incertidumbre en la altura de la cmara. Puesto que un sistema de alta resolucin ptica es requerido para contar las clulas, el espesor de la cmara y su cubierta selladora de cristal deben ser menores que la distancia de trabajo de un objetivo de microscopio (0.1 mm). De esta forma, 10 pm la representan un error potencial en la cuenta del 10%. La incertidumbre de
18

CAPITULO I

profundidad fisica de la cmara de conteo o una inclinacin en la cubierta de cristal pueden ser de varios micrmetros, y esto llega a ser el factor lmite en la exactitud del conteo de clulas.

1.4.5 Transporte de fluidos

En este mtodo las clulas son contadas como parte del fluido que pasa a travs de una estacin de deteccin. El resultado es una secuencia de pulsos elctricos cuya razn esta relacionada al conteo de clulas X como:

donde t es la razn del pulso de llegada (pulsos / S ) , Ki es la razn de flujo (m/s), y K es el volumen del elemento de sensado (m3). El conteo de clulas puede ser determinado de dos formas: directamente a travs de la ecuacin anterior contando en un periodo conocido de tiempo o alternativamente acumulando el nmero total de clulas contadas mientras un volumen conocido de fluido es pasado a travs de un detector. En otro caso, los problemas tcnicos son asegurar que la razn de fluido es conocida y constante durante el periodo de conteo, que no exista recirculacin que cause mltiples conteos de una sola clula, y que cada clula sea detectada. La razn de flujo es generalmente controlada por el desplazamiento de un pistn bien ajustado o una columna mvil de mercurio, movindose en un cilindro de dimensiones conocidas. Por ello, la geometra del flujo es dependiente del sistema de deteccin. La Figura 1.10 muestra dos geometras tpicas de flujo comnmente utilizadas. En un caso, la muestra diluida llena la apertura que contiene la estacin de deteccin. En otro caso, la muestra diluida es confinada al centro de la apertura rodeando con una partcula libre inerte, encajonada en el fluido.

19

a
Muestra de

de flnido

Aperhu'a que contiene la estacin detectora

Figura l . 1O Mtodo de transporte de clulas [2b]. (a)Las clulas en una suspensin diluida son llevadas por un flujo laminar a travs de la estacin de deteccin. (b) Las clulas en una suspensin diluida son inyectadas en un sistema de flujo laminar y son llevadas, sin mezclarlas, por un fluido a travs del centro de la estacin de deteccin.

1.5 Procesamiento de seales postdeteccin

Para contadores automticos de clulas, el resultado observado desde la estacin de medicin es un tren de seales elctricas (pulsos) no temporizado, lo cual representa el paso de las clulas sanguneas. Este tren de seales debe de ser procesado para crear el resultado final. El procesamiento tpico incluye (1) discriminacin, (2) correccin de coincidencia y (3) resultados en un formato especifico [la, 2a, 3a, 4a].

1.5.1Tcnicas de discriminacin.

Los instrumentos de conteo de clulas cuentan con la habilidad de discriminar entre seales de un tipo particular de clulas, de las ocasionadas por ruido o en otros casos seales de otras clases de clulas, al asumir, por ejemplo, quelas seales de inters son distinguibles por su amplitud.

Las diferentes tcnicas, de uso comn, de discriminacin por la amplitud de las seales de las clulas, son: (1) umbralizacin a priori, (2) umbralizacin a posteriori y (3) Ajuste de curva.

CAPITULO I

1.5.1.1 Urnbralizacin a priori En esta tcnica un comparador de voltaje (umbral) esta puesto por encima del nivel de ruido en el circuito elctrico de posdeteccin y el conteo de clulas se deriva del nmero de veces que la seal cruza el umbral de voltaje durante el periodo de conteo.

1.5.1.2 Umbralizacin a posteriori

En este mtodo un circuito similar es utilizado y puesto a un umbral bajo, lo cual incluye algo de ruido de los pulsos. La amplitud de cada pulso ocurrido durante el periodo de conteo es digitalizado y el resultado es almacenado en forma de un histograma de clulas versus la seal. Esto es analizado despus del periodo de conteo. Los umbrales de discriminacin son puestos despus en los "valles" para aislar regiones del histograma. (Figura l . 1 1)

Canal

Umbral

&

Figura l . 1 1 Tcnicas de discriminacin de clulas a posteriori [2b]. (a) Las clulas contadas estn acumuladas en canales digitales proporcionales a la amplitud de la seal y forman histograma un resultante. (b) Alternativamente, una curva suavizada es ajustada a travs del histograma y extrapolada. (c) Umbrales a posteriori son aplicados truncando los datos e integrando las clulas contadas restantes. (d) El conteo de clulas es obtenido despus, por integracin de la curva ajustada.

1.5.1.3 Ajuste de curvas

En esta tcnica, se utiliza un sistema similar a aquel que se describi en los prrafos anteriores, excepto que en lugar de un simple umbral de discriminacin, los datos son sujetos a un algoritmo de ajuste estadstico. El conteo de clulas es obtenido despus a travs de la integracin de la curva ajustada.

21

Estado del urte

15 1 . 4 Correccin de coincidencia

El volumen de la estacin de deteccin introduce no linealidad en la relacin entre el conteo de pulsos y el conteo de clulas indicado por el factor exponencial ( x en la K) ecuacin (1.2). Aunque los detectores contadores de clulas tienen relativamente volmenes pequeos de sensado, es generalmente necesario aplicar una correccin por la posibilidad de que ms de una clula est enla estacin de deteccin al mismo tiempo. Esto se llama correccin de coincidencia. Como un ejemplo, la figura l . 12 muestra la geometra tpica para un contador de clulas utilizando deteccin ptica. La deteccin de volumen puede ser expresada en trminos de la duracin del pulso. De esta forma, la probabilidad de coincidencia est tambin dada por la razn de tiempo del ancho de pulso de las clulas o el "tiempo muerto" del detector. Este hecho puede ser utilizado para corregir el conteo:

Razn de conteo corregida=

r
~

1- DT

Ec. 1.5

donde

es la razn observada y DT es el tiempo muerto.

Se incrementa mas el problema de la correccin en la coincidencia cuando mas de un tipo de clula esta siendo enumerada por el mismo detector, como cuando las clulas rojas y las plaquetas son contadas en la misma dilucin. Cuando clulas de diferentes tipos estn en coincidencia, usualmente un tipo es favorecido por el proceso de clasificacin y por lo tanto la correccin de coincidencia debe ser diferentepara cada uno. Las correcciones propias estn determinadas para cada tipo de clula especfico. Esto involucra calcular las probabilidades condicionales de coincidencia.

Figura l. 12 Geometra tpica del flujo de clulas a travs de un sistema de conteo ptico utilizando flujo de vaina
PbI.

CAPITULO I

1.6 Resultados del conteo de clulas en un formato especfico

Los resultados de las mediciones realizadas con los instrumentos de conteo de clulas, pueden ser reportados en una o en masde tres formas: conteos numricos, histogramas, y citogramas [ 1a, 1Oa].
1.6.1 Resultados numricos

Los resultados son presentados generalmente como un simple nmero que representa la cantidad de clulas por unidad de volumen de la muestra original de sangre. En ocasiones tales, como en el conteo de los diferentes tipos de leucocitos, la concentracin puede ser tambin representada por un porcentaje total de leucocitos.
1.6.2 Histogramas

Los resultados de conteo o de las dimensiones de las clulas son mostrados grficamente, como se ilustr en la figura 1.1 l .

1.6.3 Citogramas

En algunos sistemas de conteo de clulas, el paso de cada clula puede ser notado por dos vectores. Por ejemplo, en el conteo de clulas por el mtodo ptico un detector puede ser utilizado para medir la luz pulsada y otro detector para medir la luz absorbida por cada clula. Las dos seales de amplitud, pueden ser trazadas en forma grfica representando cada clula como un punto en un citograma. La figura l . 13 muestra el citrograma producido despus de medir el pulso y la absorcin por las clulas blancas despus de haber sido tratadas con una clase especial de enzimas.

NEUT

LINF

EOS

.u
W

Figura l . I 3 Un citograma o grfica de pulsaciones [2b]. Cada punto representa las amplitudes de dos mediciones pticas hechassimultneamente en lamisma clula. EOS, eosinfilos; LYMPH, linfocitos; MONO, monocitos; NEUT, neutrfilos.
23

Estado del arte

1.7 Calibracin y Control de calidad

No hay preparaciones estables apropiadas para estndares primarios de conteos y mediciones de clulas. Consecuentemente, la calibracin de cada instrumento de conteo y medicin de clulas es realizada utilizando mtodos de transferencia con materiales quasi-estables. Dos mtodos comnmente utilizados son: mtodos con sangre fresca y mtodos con sangre estabilizada [ 1b].

1.7.1 Calibracin con sangre fresca La estabilidad de sangre fresca para conteos y medicin de clulas se limitan a pocas horas. Por ello, dicha tcnica es apropiada nicamente para calibracin cruzada o remover el sesgo entre instrumentos en el mismo laboratorio. Tpicamente, el mtofdo mas estable en el laboratorio es escogido como mtodo de referencia y es utilizado para establecer los "valores de referencia'' para varias sangres frescas. El instrumento a ser calibrado es luego ajustado para recuperar los valores de referencia para las mismas muestras de sangre.

1.7.2 Calibradores de sangre estabilizada

En este mtodo se utiliza un producto comercial, el cual esta constituido por clulas sanguneas, las cuales han sido estabilizadas por medio de tratamiento qumico. Las clulas tratadas sern estables de 4 a 8 semanas, y existen valores asignados de referencia para ser utilizados en la calibracin del instrumento de conteo y medicin de clulas.

1.7.3 Tcnicas de control de calidad

Las tcnicas de control de calidad son utilizadas para verificar la constancia y validez dela calibracin. Para este propsito son utilizadas clulas de la sangre generalmente estabilizadas. La constancia de calibracin (falta de deriva) es verificada por muestre0 repetido de estos materiales. La validez (exactitud) de la calibracin es asegurada por la participacin de un programa de control de calidad de un interlaboratorio donde las muestras de sangre estabilizada son enviadas como desconocidos a un nmero de laboratorios participantes. Los resultados son analizados centralmente y los anlisis son compartidos entre los laboratorios participantes.

24

CAPITULO I

1.8 TIPOS DE EQUIPO DE CONTEO CELULAR

Estos instrumentos son utilizados rutinariamente para realizar conteos de clulas y obtener indices del tamao de las clulas sanguneas. Pueden ser divididos en tres categoras principales: (1) recursos manuales (cmaras hematocitmetros), (2) instrumentos de conteo semiautomtico, y (3) instrumentos automticos multiparmetro [2b, 2a].

1.8.1 Cmaras Hematocitmetro

La unidad ms tpica consiste (figura l . 14) de una delgada superficie de vidrio, modelada en forma de H, a travs de la cual se forman dos reas de conteo. Cuenta con dos soportes elevados para mantener un cubre objetos a una distancia constante de estas reas. Cuando un cubreobjetos pticamente plano es puesto sobre los soportes elevados, se forma una cmara, la cual tiene una profundidad de O. lmm. Una pequea concavidad del fondo de la superficie, directamente sobre el rayado, introduce pequeos rayones, los cuales restan eficiencia, y no sern vistos bajo el microscopio.

Figura l . 14 Cmara de Neubauero hematocitmetro [ 1i]

La cmara contiene un rayado cuadrado de 3mm con una geometra conocida como tipo Neubauer mejorado (figura l . 15). La figura l . 16 ilustra el mtodo utilizado para contar las clulas sanguneas. Este recurso es utilizado para contar clulas rojas, clulas blancas y plaquetas variando la dilucin y contando en regiones como lo resume la tabla No2.

25

Estado del arte

Figura l . 15 Area rayada del hematocitmetro Neubauer mejorado. R, reas para el conteo de clulas rojas; W, reas para el conteo de clulas blancas [2b].

Tabla No 2

Mtodos de hematocitmetro [ 1 lb].

Clulas rojas Clulas blancas Plaquetas

200 20 200

Sahli Thoma Thoma

5 X 0.04

4x1 2x1

26

CAPITULO I

Figura l . 16 Mtodo para contar clulas con un hematocitmetro. Las clulas que tocan las partes superior y derecha debern ser contadas; las clulas que tocan las partes inferior e izquierda no se debern de contar.[2b]

1.8.2 Contadores de clulas sanguneas con redes neuronales

En la dcada de los 60, Prewitt y Mendelson descubrieron la importancia del espectro de color de la luz transmitida a travs de las partes constituyentes (ncleo, citoplasma, etc.) de las clulas biolgicas, determinando la identidad dela clula iluminada. Este fenmeno fue posteriormente estudiado por Young, utilizando clulas humanasdelaserie blanca dela sangre teidas con soluciones de Wright-Giemsa, tambin investigadas por Tycko utilizando solucin de tricromato de Orstein. Miller estudia mas este fenmeno examinando la distribucin de probabilidad p(r,g,b,rl ,r2,r3) espacial multiespectral, donde r, g y b son los constituyentes espectrales rojo, verde y azul y las cantidades rl , r2 y r3 indican los radiovectores de tricromato ocupados por las clulas, donde el origen es tomado en el centrode de la clula. Como se puede observar, la funcin de probabilidad tiene seis dimensiones, tres parmetros espectrales y tres parmetros espaciales. El sistema HEMATRAK de SmithKline se basa en el clculo simultaneo de96de estas medidas de probabilidad con' el propsito de analizar e identificar imgenes de clulas blancas y en el caso de las clulas rojas se realizan 116 mediciones. Las 96 mediciones mencionadas para la identificacin de las clulas blancas y las 1 16 para el caso de las clulas rojas, no son mas que los datos de entrada a una red neuronal que es en realidad la que se encarga de realizar el reconocimiento de cada una de estas clulas. Para poder obtener cada uno de estos parmetros y medirlo con precisin es necesario un preprocesamiento de cada una de las imgenes, este preprocesamiento se puede resumir en pocos pasos estos son: l . Segmentacion, en ncleos celulares sanguneos (clulas blancas), citoplasma de las clulas blancas y citoplasma de las clulas rojas. 2. Medicin de cada uno de los segmentos celulares resultantes.
27

3. Identificacin de cada uno de los segmentos.

Durante dcada la de los 60 se desarrollaron una amplia gama de estos instrumentos, algunos de ellos son: el medidor Perkin-Elmer de Coulter electronics, el dispositivo corning electronics de Larc Company, el SmithKline de Hematrac, y el ADC-500 de ABBOTT instruments.(Ver figura l. 17)

Figura l. 17 La figura muestra los diferentes tipos de aparatos que hncionan bajo los principios discutidos anteriormente, en (a) el aparato de Perkin-Elmer de Coulter electronics, (b) el Corning de LARC, (c) el SmithKline de Hematrac, y (d) el ADC-500 de ABBOTT.

CAPITULO I

1.8.3 Citmetro de flujo

Sin duda alguna las tecnologas ms nuevas con las cuales se trabaja actualmente para el conteo de clulas sanguneas son aquellas basadas en los citmetros de flujo, pero incluyendo la fluorescencia, y la tecnologa lser. Estos dispositivos consisten de una unidad principal, una unidad de lser de poder, y una unidad neumtica. Existen instrumentos comerciales basados en esta tecnologa, algunos de ellos son: Sysmex R-1000, Bayer H*3 Hematology analyzer, y Cell-Dyn 1400. (Ver figura 1.18).

Figura l. 18 Contador automtico Cell-Dyn 1400 [2a].

1.8.4 Funcionamiento.

Miden el ngulo de dispersin, como tambin, la intensidad de fluorescencia para cada partcula analizada. La muestra completa de sangre es automticamente teida con un agente fluorescente, Auramine O, el cual se une al ARN. Este fluorocromo tiene un pico de absorcin a los 432 nm y un pico de emisin a los 533 n m . Cada clula es irradiada por el lser de argn a una longitud de onda de 488 nm. La intensidad de la dispersin (ver esquema del citograma en la figura I. 19), da informacin acerca del tamao, y por otra parte, la intensidad de la fluorescencia verde indica el total de ARN contenido. Con estos parmetros se obtiene un citograma, discriminando as entre las clulas rojas, reticulocitos y plaquetas.

29

Estado del arte

Figura l . 19 Esquema de un citograma, se presentan diversos tipos de poblaciones celulares: RCR = Radio de Clulas rojas, RET = Reticulocitos, PLA = Plaquetas. Los reticulocitos se dividen a travs de sus radios relativos de fluorescencia; RBF: Radio de fluorescencia bajo, RMF: Radio de fluorcscencia medio, RAF: Radio de fluorescencia alto [2b].

1.9 El procesamiento digital de imgenes

Todos los mtodos descritos anteriormente para el conteo de clulas sanguneas, se pueden considerar como buenos o bastantes aceptables, ] u s mientras los mtodos manuales pueden incluir un gran error debido ala aprecincin de quien ejecute el conteo, los mtodos automticos pueden tener un error intrnseco, debido a su limitada capacidad de distinguir si lo que estn contando es una clula o quiz una partcula de polvo, que se encuentra en la solucin diluyente. Los resultados se pueden ver afectados severamente y por lo tanto caer en un conteo falso. Una forma de asegurar que todo lo que se tiene en una muestra, y requiere ser contado son clulas, partculas o simplemente cualquier objeto de inters, es a travs de una imagen. En este sentido, el campo del procesamiento digital de imgenes puede ser de gran ayuda, debido al conjunto de herramientas existentes para llevar a la imagen hasta un punto en donde se pueda observar nicamente aquello de nuestro inters. Cuando se requiere realizar un conteo, de las clulas sanguneas, se recomienda diluir la sangre en factores de 1:200, para las clulas rojas, y 1 :20 para las clulas blancas. Estas diluciones se deben realizar debido al gran nmero de clulas presentes en una muestra. Aun diluida la sangre, tomando en cuenta los factores antes mencionados, se presenta el fenmeno llamado oclusin, la oclusin significa el traslapamiento de dos o mas clulas, en diversos niveles, esto es, puede existir desde un 1% de oclusin hasta un 100% de oclusin. (sobre todo con los eritrocitos). Este fenmeno puede ser eliminado hasta en un 100% diluyendo la sangre en factores cada vez mas altos, pero se debe recordar que entre menor nmero de clulas sean contadas en una misma rea determinada, existir una mayor incertidumbre en el resultado final del conteo. Existen una cantidad innumerable de algoritmos con los cuales se puede obtener informacin acerca del contenido de una imagen y a travs de ellos poder eliminar
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CAPITULO I

algunos problemas como la oclusin. Por ejemplo el filtrado de una imagen, para quitar componentes de ruido en ella, o la segmentacin, que es el procedimiento por medio del cual podemos separar los componentes contenidos en una imagen, y observar aquellos que sean de nuestro inters particular. Dentro del proceso de segmentacin se pueden incluir varios procedimientos como la erosin. Esta consiste en eliminar pixeles de una imagen a travs de un elemento estmcturante (la discusin acerca del elemento estmcturante se deja para el captulo I11 en donde se hablar ampliamente del tema), que puede tener una forma especfica como un rectngulo, un circulo, etc. esto depender de que forma geomtrica tenga lo que se desea eliminar en la imagen. Otra parte de la segmentacin es el proceso de dilatacin que es la contraparte del proceso de erosin. Tambin el procesamiento digital de imgenes considera la clasificacin de objetos, a travs del reconocimiento de patrones, o la identificacin y clasificacin de algn objeto en particular por medio de sus caractersticas particulares, como son el color, la textura, tamao, morfologa, etc. Existen algoritmos, con los cuales se pretende separar objetos quese encuentren traslapados u ocluidos en una imagen, uno de ellos es el algoritmo de watersheds [ 1Ob], el cual primero segmenta a la imagen, y luego calcula la distancia media entre dos objetos, y posteriormente calcula un limite arbitrario entre ellos, y de esta forma los separa como objetos distintos.

Figura 1.20 Segmentacin y separacin de objetos a travs del algoritmo de watersheds [4b]

Lamentablemente este algoritmo tiene algunas fallas en el clculo de la distancia media entre los objetos, estas fallas se ven reflejadas en el resultado final cuando en lugar de dos objetos se forman tres, en otros casos dos o mas objetos se fusionan en la imagen y forman uno solo, como se muestra en la figura 1.2 l . Por lo anterior es necesario disear una tcnica que sea mas efectiva y logre la separacin de cada uno de los objetos que se aprecian en la imagen.

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Estado del urtc

Figura 1.21 (a) Muestra una imagen de prueba, antes de la aplicacin del algoritmo de watersheds, en donde los crculos se encuentran ocluyndose unos con otros, (b) Muestra el resultado del algoritmo en donde con nmeros 1 y 3 muestran que el algoritmo no fue capaz de separar dos objetos, 2 muestra la doble separacin entre dos objetos, y por lo tanto la creacin de un tercero.

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CAPITULO I

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Estado del urte

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Objetivos

OBJETIVOS

Con base en lo comentado en el captulo I, se formulan los siguientes objetivos:

OBJETIVO GENERAL Disear y construir un contador de clulas sanguneas empleando tcnicas de procesamiento digital de imgenes.

OBJETIVOS PARTICULARES

Disear una metodologa de conteo celular empleando la cmara de Neubauery el procesamiento digital de imgenes.

Desarrollar tcnicas experimentales para disminuir la oclusin entre sanguneas y lograr conteos con gran exactitud.

las clulas

Disear un visor que permita observar las caractersticas morfolgicas de las clulas sanguneas, as como tambin medir el dimetro de cada una de ellas.

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OBJETIVOS

Matreial y mdtodos

MATERIAL Y METODOS

2.1 MATERIAL
Para la realizacin de los experimentos desarrollados en este trabajo se empleo el siguiente equipo, que se observa en la figura 2.1 :

Figura 2.1 Equipo empleado, integrado por un microscopio MX - T, computadora Hewlett Packard, pipetas de Thoma, pipetas automticas, cmara de video DIC-U de World Precision Instruments, cmara de Neubauer, soluciones para eritrocitos y leucocitos, etc.[ 1Ofl

Un microscopio ptico triocular (vase tambin figura 2.2), marca Microlux, modelo MX-T, trabajando con un objetivo de 40X y oculares de 16X, es decir que la imagen observada por una persona se aumenta 640 veces. En cuanto al ocular que trabaja con la cmara de video, este solo cuenta con una amplificacin 1X. El microscopio tiene una fuente de poder variable propia, la cual alimenta a la fuente de luz, misma que permite observar la muestra de inters.

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CAPITULO 11

Figura 2.2 Microscopio y Fuente de poder Microlux MX-T. ldicroscopio ptico con tres objetivos de 10 X, 40 X y lOOX con oculares de 16 X [4fl.

Microjeringas marca Unimetrics I.;niversal Corporation, con una capacidad de 25 p1, (como se ilustra en la figura 2.3) para medir el volumen de sangre necesario para la valoracin citomtrica.

Figura 2.3 Microjeriga Unimetrics con capacidad de 25 pl [5fl.

Pipetas automticas mostradas en la figura 2.4, marca GILSON, modelo pipetman, con capacidad de 100 microlitros y 200 microlitros, respectivamente, para medir de forma exacta el volumen pertinente de sangre y liquido de disolucin para llenar la cmara de Neubauer.

Figura 2.4 Pipetas automticas, con capacidad de 100 pl y 200 pl con las que se toman las muestras [ 6 f l .

Cmara de Neubauer doble, como se ilustra en la figura 2.5, marca BOECO, modelo Brigth line, con las siguientes caractersticas:
1- Doble zona de conteo. 2- Profundidad de O. lmm.

Figura 2.5 Cmara de Neubauer y cubre objetos, BOECO con profundidad de O. 1 mm[7fl.

Balanza automtica marca SARTORIUS, modelo BASIC para pesar los diferentes compuestos que forman las soluciones, tanto para glbulos rojos como para glbulos blancos. Para poder formar cada una delas soluciones de disolucin, se necesitaron diferentes compuestos, estos son: 12345Cloruro de sodio. Acido actico Violeta de genciana en polvo Agua destilada Azul de alciano

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CAPITULO TI

Una computadora marca Hewlett Packard, modelo VECTRA con las siguientes caractersticas: 123456Microprocesador Intel Pentium, 166 MHz. 16 Mb de memoria RAM. Disco duro de 1.2 Gb. Monitor UVGA 14" Unidad de disco 3.5", 1.44Mb Unidad de CDROM CREATIVE SPEED 8X

Por otra parte, se utiliz la cmara DIC-U, de la marca WORLD PRESICION, misma que se puede apreciar en la figura 2.6; es una cmara que adquiere imgenes digitalmente. Las caractersticas principales de esta cmara son: 12345678Alta resolucin. Detector CCD Capacidad con bajos niveles de luz. Amplio rango espectral (400-1 10 nm). Exploracin asncrona (entrada externa de pulsos). Respuesta cercana lineal sobre amplios rangos dinmicos. Alta sensitividad. No afecta a la imagen con distorsin geomtrica.

Esta cmara de video cuenta con un programa para la observacin y mejoramiento de las imgenes obtenidas. Pero para los fines de esta tesis nicamente se utiliza este programa para observar y almacenar las imgenes en formato BMP.

Figura 2.6 Cmara de video modelo DIC-U de World Precision Instnlments [8fl.

Para el procesamiento digital de las imgenes, desarrollo del programa, e implementacin de la interfase grfica se utiliz durante todo el proyecto el paquete de cmputo MATLAB, primero, la versin 4.3 y despus la versin 5.2, trabajando principalmente con:
1- Toolbox de procesamiento digital de imgenes (digital image processing). 2- Herramientas de desarrollo de interfases grficas (Graphics property editor, GUI layout tool). 3- Diferentes rutinas desarrolladas para el conteo.
40

Mutreiul y mtodos

2.2 METODOS
2.2.1 Mtodos comnmente utilizados en el laboratorio.

Para llevar a cabo este trabajo, se estudiaron ampliamente dos tcnicas, con las cuales se trabaja comnmente en los laboratorios clnicos, estas son: (1) Frotis o extensiones de sangre, y (2) La cmara de Neubauer. La tcnica con la cual se realizaron los conteos celulares en esta tesis, esta basada en la cmara de Neubauer. De los dos mtodos mencionados, el de la cmara de recuento permite una valoracin de una muestra de sangre en una forma ms confiable que con un frotis. Lo anterior se debe a la distribucin de las clulas, que en el caso de la cmara de Neubauer es homognea, y para el caso de un frotis, es altamente aleatoria. Ambos mtodos tienen un problema en comn, esto es la oclusin, que en el caso de los fi-Otis es muy alta y para lacmara de Neubauer el problema existe pero desde luego no en las mismas circunstancias. En una cmara de Neubauer la sangre se encuentra diluida, ello permite, que al depositar la muestra en la cmara, la distribucin de las clulas sea homognea. Por lo anterior se escogi a esta tcnica como la adecuada para realizar los conteos de clulas. Como se mencion, aqu tambin existen problemas de oclusin, pero estos pueden ser eliminados a travs de tres formas diferentes: (1) Procesamiento digital de imgenes, (2) Adicin de compuestos qumicos a lamuestra (iones del mismo signo) para separar a las clulas y evitar la oclusin, y (3) Trabajar con la parte ptica del microscopio desde la obtencin de la imagen.

2.2.2.1 Citometra hemtica manual.

Las cmaras de recuento estn formadas por un porta objetos grueso rectangular, de vidrio. En el centro de la superficie superior se encuentran cuadrculas, separadas del resto del porta objetos por surcos, y por dos barras transversales elevadas, una a cada lado de la cuadrcula. La cuadrcula en cuestin puede encontrarse en el centro del rea central (cmara sencilla), o puede haber una cuadricula superior y otra inferior (doble cmara). Cuando se coloca sobre barras elevadas un cubre objetos pticamente plano (solo debe emplearse esta variedad), se forma sobre el cubre objetos y la cuadrcula una cmara de mediciones. La cuadrcula, a su vez, presenta lneas que forman una imagen variable, segn el tipo de cmara utilizado, y representa fracciones o mltiplos de milmetro cuadrado. La dilucin de la muestra se puede hacer con una pipeta de Thoma o por el sistema de dilucin en tubo. En la figura 2.8 se presentan las pipetas de Thoma. Con los tubos, se emplean mayores volmenes de sangre y de liquido de dilucin, y la exactitud puede llegar a ser mayor que con las tcnicas de pipetas debido a que losvolumenes son
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CAPITULO I1

mayores. Se han presentado recientemente micropipetas de dilucin desechables, que se llenan solas hasta niveles establecidos. Son de fcil manejo, lashaycondistintos lquidos de dilucin, y en ciertos casos pueden presentar una considerable ventaja. La suspensin diluida de clulas se introduce ala cmara de recuento, y se espera que las clulas sedimenten. Luego se cuenta el nmero de ellas en la o las zonas deseadas. En vista del gran factor de dilucin, y de la pequea superficie sobre la cual se efecta el recuento, se comprende que un error correspondiente a la inclusin o exclusin de un solo glbulo puede modificar importantemente el resultado final.

2.2.2.2 Forma en que se realiza el conteo de clulas en una cmara de Neubauer.

La forma en laquese cuentan clulas en una cmara de Neubauer, es muy sencilla, pero requiere de tener practica y de conocer de manera sistemtica cuando una clula pertenece al rea de conteo o cuando es excluida del mismo. Bsicamentela cmara de Neubauer se divide en cuadrculas de diferentes tamaos, diseadas para contar diferentes tipos de clulas como son: las clulas sanguneas (eritrocitos y clulas blancas), espermatozoides, clulas de lquido cefalorraquideo, etc. Las zonas que se encuentran marcadas con letras R (figura 2.7) pertenecen al recuadro central, y en este se contarn las clulas rojas o eritrocitos. Estos se contarn justo en donde se encuentran marcadas cada una de las letras R, es decir los eritrocitos se contarn en cinco zonas diferentes. A cada uno de estos cuadros tambien se le denimina con una letra diferente del alfabeto, comenzando con la letra A en el primer cuadro superior a la izquierda, yendo en el sentido de las manecillas del reloj hasta llegar al cuadro central al que le corresponde la letra E. Cada uno de estos cuadros pequeiios esta formado a su vez por 16 cuadros, t:s decir, que al contar cinco cuadros diferentes, se estarn contado 80 cuadros pequeos. Para el caso de las clulas blancas estas se cuentan en los cuadros marcados con s las letr 1 W (ver figura 2.7), es decir que, en comparacin con el conteo de las clulas rojas en donde se cuentan cinco cuadros, aqu solamente se contarn cuatro cuadros.

Mutreial y mtodos

Figura 2.7 Ilustracin de las cuadriculas de la Cmara de Neubauer. Las R significan que en esos cuadros deben de ser contados los eritrocitos, las W indican en donde se cuentan las clulas blancas, en las X se pueden contar otro tipo de clulas como son las del liquido cefaloraquideo [3b].

Por otra parte tanto para las clulas rojas como para las blancas existe un procedimiento estndar de inclusin y exclusin de clulas en el conteo, mismo que se detalla a continuacin: Todas aquellas clulas que se encuentren en el borde superior y borde lateral izquierdo del cuadro de conteo, debern ser incluidas en este, pero todas aquellas clulas que se encuentren en el borde inferior y en el borde lateral derecho del cuadro de conteo quedaran excluidas del mismo. Este procedimiento se sigue en los cinco cuadros de para el conteo de las clulas rojas y en los cuatro cuadros para el conteo de clulas blancas.

Figura 2.8 Fotografia de las Pipetas de Thoma, estas son las pipetas en las cuales se realiza la dilucin de la sangre para luego llenar la cmara de Neubauer y realizar el conteo. [2fl

2.2.2.3 Errores en Citometra hemtica.

Pueden tener tres orgenes: el aparato, la tcnica personal, y el error intrnseco.

Aparato. Deben adquirirse aparatos exactos. Se pueden verificar con mercurio las pipetas de 0.02 ml. Se deben descartar las pipetas rotas (en especial las que tienen extremo astillado). Las seales de las pipetas, que muestran el volumen, deben distinguirse claramente. Solo se emplearan cubre objetos pticamente planos.
43

CAPITULO I1

Todo el dispositivo se debe limpiar cuidadosamente despus de cada medicin [3b]. Con una bomba de aspiracin, se lavan bien las pipetas, haciendo pasar por ellas (tres o cuatro veces cada liquido) agua y acetona, en este orden, y finalmente aire hasta que la acetona en el interior de la pipeta se evapora totalmente. Si la sangre se coagula en un tubo, quizh se pueda limpiar por aspiracin al vaco; de no ser as, se deja toda la noche en agua o en un solvente adecuado de protenas, y luego se desprende el coagulo con un estilete de alambre. De vez en vez, se puede lavar todo el equipo con (pipetas, cmarasde recuento y cubre objetos) cido sulfiirico o ntrico al 50 % durante 15 minutos, enjuagando luego con agua. Tcnica personal. Pueden ocurrir errores personales al recoger la muestra de sangre, durante la mezcla, al llenar la cmara, y durante el propio recuento. AI obtener lamuestra,es indispensable que la sangre fluya libremente, paralo cual solo se puncionarn dedos o lbulos de oreja calientes; debe evitarse la presin sobre la zona puncionada. Cualquiera que sea la pipeta utilizada, se debe llenar exacta y rpidamente hasta la seal, para evitar la coagulacin. Si se pasa demasiado de la seal sobre la pipeta, es preferible volver a empezar, con otra pipeta; si se trata de expulsar el exceso, el resultado ser inexacto, porque un poco de sangre adherida a las paredes de la pipeta por encima de la seal, produce unerror. multiplicado por el factor de dilucin. La muestra se debemezclar con cuidado durante dos minutos, antes de cargar la cmara de recuento; lamisma precaucin debe tomarse en caso de diluciones de muestras de sangre completa. Con una cmara de recuento y un cubre objetos limpios, sin gasa, se obtiene un buen llenado por capilaridad. Una vez llena la cmara, debe esperarse dos minutos cuando menos para que los glbulos sedimenten. Error intrinsecu. El error intrnseco depende de la distribucin de los glbulos en la cmara. Disminuye al contar un mayor nmero de glbulos. El error estndar atribuible a la distribucin de los glbulos en el rea de recuento es proporcional a la raz cuadrada del numero de glbulos que se cuentan. Como la raz cuadrada aumenta menos rpidamente que el propio nmero de glbulos, el error por 100 en el recuento disminuye al aumentar el nmero de glbulos contados. Se dice que la combinacin del error intrnseco (4.4 %) y del tcnico (3.3 %) en el recuento de 80 cuadrados pequeos da una variacin media de 7.7 % en los recuentos cuidadosos de glbulos rojos [3b]. Por lo tanto, al repetir el recuento en las mejores condiciones, con una sangre normal (5 millones de glbulos rojos por mm), se obtendrhn cifras entre 4 615 O00 y 5 385 OOCI. Como el error ser mayor si el numero de glbulos contados es menor, se comprende que en una anemia intensa (menos de 3 millones de glbulos rojos por mm3), se tendrn recuentos mas exactos empleando un factor de dilucin igual a la mitad del habitual, o sea 1 a 100 en lugar de 1 a 200. La exactitud aumenta todava mas si se hacen dos recuentos, (lamentablemente el autor no reporta en cuanto se incrementa la exactitud) [3b], cada uno a partir dediluciones diferentes (no de lamisma). Se aconseja esta tcnica.

44

Mutreiul y mtodos

2.2.2.4 Recuento de glbulos rojos o eritrocitos.

Definicin

El recuento de eritrocitos o glbulos rojos consiste en contar el nmero de ellos en 1 mm3 de sangre [3b] .

Valor.

Son mucho mas tiles las mediciones exactas de hemoglobina y hematcrito que las de glbulos rojos, que requieren mas tiempo y estn expuestas a errores. Pero cabe destacar que este procedimiento no es la tcnica estndar para la obtencin de estos parmetros, mientras que el recuento si es considerado de esta forma [20b]. Sin embargo, resulta provechoso un recuento eritrocitario exacto en ciertos casos, y es indispensable para calcular ciertos indices absolutos.

Base de los mtodos.

Se diluye la sangre 200 veces (en vista del enorme nmero de clulas) con un lquido isotnico que impide la coagulacin y la formacin de grumos o rouleaux, y luego se cuentan los glbulos en una cmara. Los lquidos empleados no destruyen los leucocitos, por lo que estos se incluyen en el recuento, pero su nmero total es tan pequeo en comparacin con el de glbulos rojos que el error es francamente desdeable, este se del 0.2%. Una muestra de cmo se observan los eritrocitos sedimentados en la cmara de Neubauer, es la figura 2.9.
Recuento de eritrocitos con pipeta de dilucin para glbulos rojos.

La pipeta de Thoma para glbulos rojos es la que se utiliza con mas frecuencia. Presenta una dilatacin (bulbo) como a la tercera parte de la longitud total del tubo capilar. El tallo o extremo mas largo de la pipeta esta dividido en 10 partes ,iguales. Enseguida antes del bulbo, en la parte mas corta de la pipeta, se encuentra la seal 101. Cuando sellena hasta esta seal, el bulbo contiene 100 veces el volumen, correspondiente a las divisiones de la parte mas larga. Se aspira sangre (directamente de una puncin cutnea o de una mezcla homognea de sangre completa) hasta la seal 0.5, asegurndose de que la columna de sangre sea continua y no tenga burbujas de aire. Para obtener la cantidad de sangre necesaria y que el llenado de la pipeta de Thoma se correcto (es decir sin burbujas de aire), basta con obtener la muestra a travs de puncin en la vena ceflica o dar un pequeo golpe con una lanceta de manera firme sobre la yema de cualquier dedo de las manos. Con practica, se puede llevar a cabo esta maniobra con facilidad, pero es posible pasarse, en cuyo caso el exceso se elimina sujetando la pipeta horizontalmente y tocando su punta con una torunda de algodn absorbente o pedazo de papel filtro
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CAPITULO I1

Figura 2.9 Fotografa digital de Eritrocitos en la cmarade Neubauer. Enesta fotografa sepuedenobservar diferentes zonas en dondeexiste el problema dela oclusin o traslapamiento de clulas. [ 3 f l .

Clculo del nmero de eritrocitos La superficie de 80 cuadros pequeos es 80 X 0.0025 mm2. El volumen de 80 cuadros pequeos es 80 X 0.0025 X 0.1 mm2 = 0.02 mm3. Si R es el nmero de clulas diluido 1:200, el en 80 cuadrados pequeos y en el supuesto de que la sangre se ha nmero de clulas en 1 mm3 desangre es

Rx200~- =R~200~50=10000*R 0.02

... 2.1

Por lo tanto, el nmero de clulas contadas en 80 cuadros pequeos se multiplica por 1O O00 para obtener el nmero de glbulos rojos por milmetro cbico de sangre.
Valores normales.

Adultos. Hombres de 4.0 a 6.2 millones por mm3. Mujeres de 4.0 a 5.5 millones por mm3 . Nios. Al nacer (sangre umbilical) de 4.0 a 6.0 millones por mm3; de 3 meses a 3 aos de 4.0 a 5.2 millones por mm3; de3 a 10 aos, de 4.0 a 5.0 millones por mm3 (promedio = 4.5 millones) [3b,7b].

Mutreiul 1 mtodos

2.2.2.5 Recuento de glbulos blancos o leucocitos.

Definicin.

El recuento de glbulos blancos o leucocitos consiste en contar stos por milmetro cbico de sangre [3b].

Mtodo. Pipeta de Thoma para glbulos blancos.

Es una pipeta especial, parecida a la de los glbulos rojos, pero con un bulbo menor y de graduaciones diferentes. El tallo se divide en 10 partes iguales, con seales 0.5 y 1. En el tallo corto, por encima del bulbo, se encuentra la seal 1 1. Cuando se aspira sangre hasta la seal 0.5, y lquido de dilucin hasta la seal 1 1, la muestra de sangre en el bulbo est diluida 20 veces.
Tcnica del bulbo.

Con una pipeta recta, se toman 0.05 m1 de sangre que se mezclan con 0.95 m1 de lquido de dilucin en un tubo pequeo o frasco de tapn de rosca. Puesto que este mtodo utiliza volmenes mayores, es mas exacto, pero la persona sin experiencia puede encontrar dificil el recoger con bastante rapidez 0.05 m1 de sangre desde una puncin del dedo o lbulo de la oreja.
Diluyente para recuento de glbulosblancos.

Es una dilucin acuosa al 2 o 3 YOde cido actico, con una cantidad de violeta de genciana suficiente para dar un color azul violeta plido. La solucin hipotnica de cido actico destruye los eritrocitos. La violeta de genciana permite observar mejor los glbulos blancos (a los que ligeramente) sobre un fondo violeta. tie
Mezcla y llenado de la cmara de recuento.

Igual que para los eritrocitos.

2.2.2.6 Realizacin del recuento.

Despus de que los glbulos blancos han precipitado, se espera de uno a tres minutos, y se observa la cmara de recuento con un objetivo de pocos aumentos (X 10) para percatarse de que la distribucin de los glbulos blancos es homognea. Luego se cuentan en cuatro cuadros grandes (Imm delado).

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CAPITULO I1

Clculo del nmero de glbulos blancos.

Si llamamos B al nmero de leucocitos en cuatro cuadros grandes, existen B glbulos blancos en 4 X 1 X O. 1 = 0.4 mm3 o sea,
BxlO glbulos blancos ocupan lmm3 4

Pero como la sangre estadiluida 20 veces: numero de glbulos blancos en lmm3 de sangre =
x l o x 2o = 50B [3b,7b]
4
...2.2

Nota. Cuando el numero de leucocitos es bajo (menos de 4 O00 mm3) es preferible, para lograr mas exactitud, emplear una dilucin de uno a 10 (o sea, aspirar sangre hasta la seal uno de la pipeta, o poner 0.1 m1 de sangre en 0.9 m1 de diluyente). Cuando el recuento de glbulos blancos es muy alto, puede ser necesario recurrir ala tcnica descrita para glbulos rojos.

Valores normales

Adultos de 5 O00 a 10 O00 por mm3. Nios al nacer de 10 O00 a 25 O00 por mm3 Un ai0 de 8 O00 a 15 O00 por mm3.

2.2.2.7 Reactivos para realizar recuento celular en una cmara de Neubauer.

Para el recuento de eritrocitos o glbulos rojos.

Liquido de dilucin: Solucin de Dacie (formol-citrato) Preparacin : 1- Solucin de formaldehdo al 40 %, 1Om1 2- Citrato trisdico al 3 % p./v., 990ml Liquido de dilucin: Solucin salina Preparacin:
1- Cloruro de Sodio 9g 2- Agua destilada 1L.

Para el recuento de glbulos blancos

Liquido de dilucin: Acido actico. Preparacin : 1- Es una dilucin acuosa al 2 o 3 % de cido actico. 2- Se agrega una cantidad de violeta de genciana suficiente para dar color azul violeta plido.
2.3 Innovaciones a los mtodos utilizados

La tcnica de conteo de clulas con la cual se trabaja en esta tesis, es una innovacin a la ya conocida tcnica de conteo en una cmara de Neubauer. La innovacin hecha a esta tcnica consta en la inclusin de una cmara de video, con la cual se toman imgenes de las clulas, acto seguido y a travs de un programa desarrollado en ambiente de Matlab 5.2, las clulas sanguneas son contadas con tal exactitud que los resultados se aproximan en gran medida a los obtenidos con el conteo manual realizado en la cmara de Neubauer, tal que las diferencias entre estos son mnimas. (Como se reportan en los resultados de este trabajo, O. 18% en el conteo de glbulos rojos, y 0.06% en el de glbulos blancos). En esta seccin se exponen las innovaciones realizadas a los mtodos explicados en las secciones anteriores, para la realizacin de una citometra hemtica. Al realizar los experimentos se eliminaron, algunas partes del procedimiento descrito en la literatura. Lo anterior con el fin de minimizar, el posible contacto con la sangre, el error humano al llenar las pipetas de Thoma y contar con la plena seguridad de que la cantidad de la muestra depositada en la cmara de Neubauer es la exacta requerida, para un conteo ptimo. Por ejemplo, en el procedimiento descrito por la literatura, la sangre se tiene que aspirar de manera manual hacia la pipeta de Thoma, es decir, el llenado de la pipeta se lleva a cabo a travs de succin que se realiza con la boca, llevando una porcin de la sangre de la muestra hacia el interior de la pipeta, lo anterior incurre en riesgos muy altos para quien desarrolla el llenado de la pipeta. Otra tcnica opcional es realizar la aspiracin por medio deunajeringa,a travs de una manguera, pero esta tcnica tambin incluye un error, ya que al comenzar el llenado de la pipeta es dificil llegar a la marca de 5 sin rebasarla, y cuando esto sucede, parte de las clulas quedan depositadas a lo largo de la pipeta, yde seguir adelante conel llenado, el conteo resultara totalmente alterado. Para poder solucionar los problemas anteriores, primero se midieron los volmenes exactos de sangre y de liquido de disolucin con losquese cargan las pipetas de Thoma. Estos fueron medidos a travs de una microjeringa (ver figura 2.3). Los resulta.dos obtenidos para la pipeta de Thoma de glbulos rojos son:
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CAPITULO TI

1- Volumen de sangre 5 microlitros. 2- Volumen de liquido de disolucin 995 microlitros. Lo que haceun volumen total de un mililitro. Por otra parte, para la pipeta de Thoma de glbulos blancos los volmenes medidos son: 1- Volumen de sangre 5 microlitros. 2- Volumen de liquido de disolucin 295 microlitros.

Lo que hace un volumen total de 300 microlitros.

Una vez medido el volumen total, igual al de las pipetas de Thoma, la siguiente tarea h e realizar una mezcla homognea entre la sangre y 1 liquido de disolucin, como lo muestra la figura 2.10, para cada tipo celular respectivamente. Lo anterior se logra tapando el tubo en donde se encuentra depositada la muestra (sangre y liquido de suaves, en forma disolucin), con papel Parafilm, y realizado movimientos muy perpendicular al largo del tubo. Este movimiento se tiene que realizar alrededor de 20 veces, entonces la sangrc y el liquido de disolucin se homogeneizan perfectamente.

4"

Figura 2.1 O Forma en que se agita el tubo de ensaye. Las flechas indican que el movimiento se realiza de derecha a izquierda con respecto al eje X. Los movimientos deben de ser sumamente lentos y se deben repetir en ciclos de 15 a 20 veces, para homozeneizar la solucin.[ 1dl

Liquido de disolucin y sangre

2.3.1 Mtodos para la obtencin de las muestras sanguneas.

Parala realizacin de este trabajo esde vital importancia la obtencinde muestras de sangre, en las cuales se encuentren en buen estado tanto serie roja (eritrocitos) como serie b1anc.a (leucocitos), es decir,que no exista hemolsis en la muestra obtenida. El trabajar con sangre es un factor de bastante riesgo para aquella persona que manipule cada muestra, debido a ello, se disearon dos protocolos para la obtencin y manejo de la sangre. Donde primero se trabajo con sangre de ratas, y despus con sangre humana. En cuanto a la sangre de rata el protocolo es flexible, pues las ratas utilizadas fueron provistas por el bioterio (de la UAM-I),es por ello que se
50

Mutreial y mtodos

puede decir que existe un control sobre cada rata y es posible que la sangre de cada una de estas no este contaminada con ningn tipo de virus o bacteria peligrosos para el hombre. Pero, en cuanto a la sangre humana el protocolo es francamente poco flexible, (lo anterior queda de manifiesto en la seccin 2.3.2 de este captulo) debido a que no es posible saber, sin ningn examen previo, si la sangre se encuentra contaminada con algn tipo de bacteria o virus, que en el peor de los casos pueden ser, virus de hepatitis (en cualquiera de sus variantes A, B, C, D o E), tuberculosis, VIH, etc.
2.3.1.1 Protocolo para la obtencin de sangre en ratas.

Existen diversas formas para obtener una muestra de sangre en una rata, como son: la puncin cardiaca, puncin en la cola y puncin en la rbita del ojo por encima del lagrimal. En este trabajo se utiliz la puncin cardiaca, debido a que es la forma en la cual, es posible obtener una cantidad abundante de sangre, y la muestra obtenida no presenta hemlisis.

Tcnica de manejo.

En las primeras manipulaciones, se recomienda no utilizar demasiada fuerza y proteger las manos con guantes gruesos de algodn o piel para el caso de una posible mordedura. Se saca la rata de su jaula, tomando al animal por la parte media de su cola y se deposita sobre lamesa, como se muestra en la figura 2.1 l . No intentar trasladar de esta manera al animal a distancias grandes, pues puede volverse sobre si, trepar por su cola y morder (obsrvese la figura 2.12).

Figura 2.1 1 Forma en la que se debe tomar a la rata [6b].

51

CAPITULO I1

Figura 2.12 Cuidado al trasladar a la rata de un lugar ;L otro [6b].

En las siguientes figuras, se ilustra la manera de sujetar a la rata. Se sujeta al animal por la regin media de la cola, situando con la otra mano entre los dedos ndice y medio, la regin del cuello y se abraza al animal con los dedos pulgar, anular y meique. Otras formas de sujecin y traslado se muestran a continuacin. Observar cuidadosamente cmo se acomodan los dedos de lajs) manojs) alrededor de la rata. Tal y como se muestra en las tres ilustraciones de la figura 2.13.

Figura 2.1:: Otras formas de sujecin y traslado [6b].

Mutreiul y mtodos

Anestesia.

La administracin de la anestesia es por va inhalatoria y son dos los mtodos sencillos que sepueden practicar.

Primer Mtodo.
Sujecin. Se cubre el fondo de un frasco de boca ancha con una capa de algodn empapado de ter o cloroformo, que no escurra, y se coloca una toalla de papel doblada sobre el algodn. Se toma a la rata como se mencion y se mantiene en esa posicin hasta quepierda el conocimiento.

Segundo Mtodo.

Campana de vidrio. Se pude tambin practicar la tcnica de la campana de vidrio, en la cual, se introduce a la rata en la campana de vidrio, tal y como se muestra en la figura 2.14, y se deja ah hasta que pierda el conocimiento (de 40 a 60 segundos). Despus mientras se realiza la puncin se puede mantener al animal bajo anestesia, (cabe recordar que este debe encontrarse en el plano I11 de anestesia quirrgica, y por ningn motivo se debe de rebasar tal plano de lo contrario se producira paro bulbar), poniendo frente a la cara del mismo un recipiente que contenga un poco del anestsico como se observaen la figura 2.15.

Figura 2.14 Anestesia por el mtodo de la campana de vidrio [6b].

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CAPITULO I1

Figura 2.15 Forma en la que se debe de continuar con laanestesia va inhalatoria [6b].

Cuidados a seguir por parte de quien realiza la puncin. Puncin.

Puncin cardiaca [6b].

1- Se coloca a la rata dentro de una campana de vidrio, en la que debe de haber un trozo de algodn con ter. Se anestesia y se sujeta de las dos extremidades (anterior y posterior) y boca arriba sobre la mesa. Se extiende al animal (no tenso) y se procede a realizar la puncin cardiaca. 2- Sobre la cavidad torcica, se localiza el extremo terminal del esternn y las costillas del lado izquierdo, aproximadamente entre la cuarta y quinta o entre la quinta y sexta costillas percibir la regin de mximo latido cardiaco. 3 - Limpiar la zona con alcohol al 70 % y algodn. 4- Asegurar nuevamente la regin indicada. 5- Introducir la aguja calibre 26 X 16, embonada a la jeringa, comprobando previamente su hncionamiento (aguja, bisel y mbolo). 6- Siguiendo una trayectoria perpendicular al trax, introduzca la aguja totalmente en la zona de mayor pulsacin. 7- Al soltar la jeringa, debe apreciar los movimientos caractersticos del latido cardiaco. A travs de la misma, desplazar el mbolo lentamente y llenar de sangre (pueden extraerse hasta 10 m1 de sangre sin provocar la muerte del animal). 8- Retirar en movimiento rpido la jeringa, oprimir levemente la piel. Dejar que el animal se recupere de la anestesia.

2.3.2 Protocolo para la obtencin de muestras de sangre humana.

Por precaucin y para evitar posibles contagios entre paciente y quien toma la muestra de sangre se recomienda: puncin una sola vez (principalmente guantes, jeringas, lancetas, torundas de algodn). 2. Promover el uso de guantes quirrgicos, lentes, cubre bocasybata para evitar el posible contacto con sangre infectada.
l . Utilizar todo el material involucrado con el que se realiza la
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Mutreial y mtodos

3. Tener el mximo cuidado con las agujas o lancetas utilizadas durantela puncin. 4. Inutilizar de inmediato las jeringas y agujas, as como lancetas, depositndolas en recipientes especiales que eviten su recuperacin. 5. En el momento de realizar la preparacin para el conteo o realizar un frotis, se recomienda el uso de doble guante quirrgico, esto debido al filo de los cubre objetos y porta objetos, estos pueden rasgar el guante, producir microheridas y provocar un contagio.

Puncin venosa

Casi todas las muestras de sangre se obtienen por puncin venosa. Es el mtodo ms fcil para obtener un volumen de sangre suficiente para llevar a cabo un gran nmero de pruebas. La muestra puede dividirse y tratarse conforme a las necesidades del caso; por ejemplo parte puede mezclarse con anticoagulante para obtener plasma, sangre completa o ambos. La puncin suele hacerse en la vena mediana ceflica. Se localiza o se palpa fcilmente en casi todos los pacientes (salvo en los obesos), y suele ser muy notable en los trabajadores manuales, sobre todo en el brazo dominante. En muchos casos en los cuales resulta dificil localizar la vena, puede hacerse resaltar diciendo al paciente que cierre y abra su mano, o mediante masaje, o por una combinacin de ambos procedimientos. Puede ser til la aplicacin de un apsito caliente sobre la regin. A veces, se tienen que usar las venas del dorso de la mano, pero se necesita un cuidado especial y experiencia para evitar la formacin de hematoma alrededor de estos vasos mviles que carecen de fijacin. La puncin de las venas del cuero cabelludo, de la yugular externa, de la subclavia o de los vasos femorales debe confiarse a un medico experimentado. Despus de localizar la vena, debe verificarse que todos los tubos de ensayo y el resto del equipo se encuentren listos y estn rotulados convenientemente. La sangre puede obtenerse con una jeringa y aguja ordinarias, o un tubo al vaco con su aguja. Este segundo mtodo se utiliza cada vez con mayor frecuencia, debido a sus ventajas, que son:
1. La unidad esta esterilizada de antemano, y no requiere ninguna preparacin.

2. Existe gran variedad de tamaos de tubos, y del anticoagulante que contienen. 3. Es un mtodo ms seguro para la obtencin de sangre, pues las muestras pasan directamente al tubo rotulado. 4. No existe el peligro de que serompan las jeringas. 5. No hace falta preparar anticoagulantes ni sus recipientes, o los rtulos del caso.

La tcnica de obtencin de sangre es prcticamente la misma, biensea con jeringa y aguja o con los sistemas de tubos al vaco.

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CAPITULO I1

Tcnica en el caso del empleo de la jeringa.

Se prepara una jeringa estril seca de tamao conveniente, con una aguja de longitud mediana (2 a 4 cm), estril, de bisel corto, calibre 18 o 20; el protector estril de la aguja se deja sobre la aguja para protegerla. El paciente escoge una posicin cmoda en lacual pueda presentar el brazo y mantenerlo inmvil sin esherzos ni fatiga. No debe intentarse tomar de un enfermo sentado o de pie y cuyo brazo no este apoyado sobre una superficie plana. Se pone una silla al lado de la cama, para que el brazo pueda apoyarse sobre el borde de la mesa o de la cama. Se prepara el brazo frotando la regin anterior del antebrazo con una torunda de algodn estril empapado en una mezcla a partes iguales de alcohol etlico al 70% y ter, o alcohol de 70 % solamente. Se aplica un torniquete de caucho blando, a unos 7 cm por encima del pliegue del codo. El torniquete no debe apretarse demasiado, pues cerrara la arteria adems de las venas. En trminos generales basta con que su cara interior se hunda 1 o 2 mm por debajo del nivel de la piel. Debe sujetarse con un medio nudo, para que pueda quitarse jalando el extremo libre. Se quita ahora el estuche protector de la jeringa y se toma sta de manera que el bisel de la aguja se encuentre hacia arriba.. Se sujeta la parte posterior del brazo del paciente a nivel del codo y se jala ligeramente la piel sobre la vena. Poniendo la aguja paralela al trayecto de la vena. Se hace avanzar la punta de la aguja de 0.5 a 1 cm en el tejido subcutneo, y luego se perfora lapared de la vena. La sangre puede subir espontneamente en la jeringa, pero si no es as, se jala ligeramente el mbolo, a una velocidad igual a la del flujo de sangre. En cuanto se tenga en la jeringa la suficiente cantidad de sangre, se suelta el torniquete. Luego la aguja se retira rpidamente y se aplica una torunda de algodn sobre el sitio de la puncin, indicando al paciente que la comprima con los dedos de la otra mano o que flexione el codo. La aguja se remueve de la jeringa por un movimiento de torsin y la sangre se vaca lentamente en los recipientes correspondientes. Estos se tapan y los que contienen anticoagulantes se invierten varias veces (sin sacudir). Es importante que la jeringa no se vace a travs de la aguja, ni que se empuje mucho mbolo, y que no se forme espuma en los tubos, pues en cualquiera de estos casos probablemente se producir hemlisis. Solamente deben utilizarse para la puncin venosa jeringas y agujas estriles, por peligro de transmitir varios organismos patgenos.

Figura 2.16 Forma en que se realiza la puncin venosa en el brazo de un paciente [3b].

Mutreial y mtodos

Puncin cutnea. Muestras de sangre para microanlisis.

Se utiliza frecuentemente la puncin cutnea cuando bastan pequeas cantidades de sangre: hemoglobina, recuento de glbulos blancos o rojos y plaquetas, frotis de sangre y microanlisis bioqumicos. Se utiliza cuando la puncin venosa resulta dificil, por ejemplo en los nios y en caso de quemaduras extensas. En estos pacientes, pueden obtenerse muestras satisfactorias por puncin cutnea utilizando un tubo de polietileno de 18 cm de largo y 25 mm de dimetro interno. El extremo de este seprolonga con una pequea punta de vidrio de 3 mm de dimetro externo; la unin se hace con una vaina chica de tubo de plstico. Se aspira en el tubo solucin de heparina que se vuelve a expulsar y se deja secarel residuo. Cuando el tubo esta casi lleno de sangre, el extremo abierto se tapa con una canilla formada por un trocito de varilla de vidrio, redondeada en el mechero de Bunsen. Existen tres lugares habituales para la puncin cutnea: el lbulo de la oreja, la yema del dedo, o (en los nios) el taln. Cualquiera que sea el lugar escogido, debe uno cerciorarse primero de que los tejidos estn tibios, para estar seguros de que los vasos cutneos estn dilatados y la sangre fluya libremente. De no ser as, se obtiene poca sangre, de composicin muy distinta la a sangre venosa, debido, bien sea a concentracin por estasis, a dilucin con liquido intersticial (presin), o ambas causas. En el lbulo de la oreja, puede acelerarse la circulacin frotando con una torunda de algodn (seca o humedecida con xilol). En el caso de las manos o los pies, la inmersin en agua a 40 "C durante cinco minutos, seguido por secado rpido con una toalla caliente mejora la circulacin. El lugar de eleccin se frota luego con ter o mezcla de alcohol-ter, que se deja evaporar. Se realiza una puncin limpia de 2 a 3 mm de profundidad con una aguja de Hagedorn estril, hoja de bistur del nmero 22, o pequeas lancetas estriles de metal, en envolturas individuales. Se deja quelas gotas de sangre salgan libremente yse aprieta lo menos posible pues esto puede diluir la sangre con liquido intersticial (linfa). La sangre que se obtiene por puncin cutnea es sobre todo de tipo capilar, y difiere ligeramente de la sangre venosa aunque en muchos casos las diferencias exactas no se han establecido o no existe acuerdo sobre ellas. Generalmente, la sangre capilar contiene ms glucosa y ms leucocitos; las cifras de glbulos rojos y hemoglobina son ms altas. Adems, los glbulos rojos de la sangre capilar son menos frgiles que los venosos. Deben utilizarse en cada paciente un tubo capilar y una hoja de bistur estril nuevos, porque la simple inmersin en alcohol no basta para destruir los diferentes tipos de virus existentes. El lbulo de la oreja no es satisfactorio para el recuento de glbulos rojos y blancos, salvo si est muy caliente; sin embargo, tiene la ventaja de que es el lugar menos doloroso.

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CAPITULO I1

Figura 2.17 Obtencin de la muestra de sangre en el taln de un nio [3b].

La tcnica empleada para la realizacin de todos los experimentos en cuanto a la sangre humana fue puncin cutnea en la yema de un dedo. la Se utilizaron lancetas, de la marca AUTO-CLICK, que son las que comnmente se utilizan para el anlisis de glucosa de pacientes con diabetes. Estas lancetas permiten un traumatismo mnimo en los dedos del paciente, y la cantidad de sangre obtenida es abundante l o cual permite la recoleccin deuna cantidad suficiente de sangre para realizar cada prueba. La sangre fue recolectada en capilares hparinizados de la marca CORNING, con una capacidad de 132 ~ 1 .

Mutreiul y mtodos

2.3.3 Realizacin de los experimentos. 2.3.3.1 Innovaciones realizadas a la tcnica. Tcnica de las clulas brillantes 6 muestra fuera de foco.

Para el conteo de las clulas, se dise una nueva tcnica con la cual se evita la oclusin principalmente entre las clulas rojas. Cabe recordar que por su gran nmero es posible que existaun gran ndice deoclusin o traslapamiento entre ellas. La tcnica es muy siguientes pasos: sencilla, y queda plenamente descrita a travs de los

1. La sangre se debe de diluir en solucin salina al 9%, en el caso de glbulos rojos; para los glbulos blancos se utiliza una solucin al 5% de cido actico. 2. Una vez depositada la muestra en la cmara de Neubauer (colocada en el microscopio) se espera de 3 a 5 minutos para permitir la sedimentacin de las clulas en la cmara. 3. Pasado el tiempo de sedimentacin, se observa primero al microscopio la cmara de Neubauer, para el caso de los glbulos rojos se localiza la cartula central y situndose sobre el cuadro A, se observa con un objetivo de 40 X, cuidando que el cuadro completo quede comprendido en el rea que cubre el objetivo; para los glbulos blancos se localiza el recuadro No1 (cuadricula en la parte superior izquierda de la cmara de Neubauer). Cabe recordar que este mismo procedimiento se sigue para la obtencin de las imgenes restantes (cuadros B, C, D y E, para glbulos rojos, y cuadros 2, 3 y 4 para glbulos blancos). 4. Los parmetros de la cmara de video deben de ser los siguientes: Tiempo de exposicin: 50 ms, Bias o sesgo: 127, Ganancia: 175, Fuente de luz (del microscopio): 6V. 5. El microscopio se desenfoca, esto produce que los eritrocitos se visualicen como puntos brillantes. Pero, por qu brillan las clulas?, a que se debe este fenmeno?. Este brillo se debe a dos fenmenos, que se pueden explicar, basndose en la fisica, en especial en la ptica. El primer fenmeno se debe a la aberracin de las lentes. Cabe recordar que existen varios tipos de aberracin, como por ejemplo la aberracin esfrica y la aberracin cromtica. En este caso el fenmeno se debe a la aberracin esfrica, la cual se sucede como lo indica la figura 2.20, esta se define como un defecto inherente a la lente, por el cual los rayos extremos se enfocan ms cerca de la lente que los rayos que entran cercanos al centro ptico.

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CAPITULO I1

Figura 2.18 Diagrama que muestra como se da en una lente la aberracin esfrica. El punto P es la fuente puntual, P son los rayos que se encuentran a la distancia focal correcta. P son los rayos desviados por la aberracin esfrica de la lente. [8b]

Por lo tanto cuando la muestra biolgica no se encuentra a la distancia focal correcta, se estn entonces observando rayos de luz que pasan a travs de la muestra, mismos que no se encuentran a la distancia focal correcta. El resultado es, un conjunto de objetos que no se encuentran perfectamente definidos, es decir, se conoce o distingue su forma, pero no su contenido. Lo anterior permite observar a las clulas como fuentes puntuales de luz, justo aqu interviene el segundo fenmeno, pues al observar fuentes puntuales de luz se esta produciendo el fenmeno de interferencia o difraccin de luz. La difraccinpuede describirse como un efecto de los bordes el cual queda mejor ejemplificado mediante un rayo de luz que pasa a travs de una estrecha ranura y se proyecta hacia una pantalla. En la pantalla aparecen bandas o lneas alternadas de luz y obscuridad. Si la abertura es un orificio en lugar de una ranura, la pantalla se ilumina por un disco brillante rodeado por anillos concntricos de luz y obscuridad que disminuyen en intensidad conforme se alejan del centro. Entre mayor sea el orificio, los anillos estarn mas prximos del centro; es decir, menor ser el tamao del patrn de difraccin que seforma.
A travs de este procedimiento ptico diseado se evita la oclusin, mientras se guarde la dilucin de la muestra en los factores ya comentados anteriormente, de esta forma se permite la observacin de puntos que pertenecen uno a uno a cadaclula de la muestra y se logra conteo veraz y rpido. un

Figura 2.19 Figuras de difraccin de varias fuentes puntuales de luz. Con este procedimiento se evita la oclusin, y se logra un conteo veraz del nmero de clulas.[8b]

Mutreiul y mtodos

Las clulas se puede apreciar segn se muestra en la figura 2.20 para las clulas rojas y la figura 2.21 para el caso de las clulas blancas.

Figura 2.20 En (a) se muestra, la imagen original de los glbulos rojos tal como se observa comnmente en el microscopio. (b) Muestra Imagen de los eritrocitos con la tcnica del eritrocito brillante 6 fuera de foco. Tomadas de un microscopio Microlux MX-T, con un objetivo de 40 X con la cmara de video DIC-U de WPI [9fl.

Figura 2.21 En (a) se muestra, imagen original de las clulas blancas, en (b) Imagen de clulas blancas con la tcnica de las clulas brillantes fuera de foco. Tomadas de un microscopio Zeiss, con un objetivo de 10 X con la cmara de video DIC-U de WPI [9fl.

El conteo de clulas en la cmara de Neubauer se realiza por medio de un criterio especifico, el cual ya fue explicado en el capitulo No 1. Para la realizacin de este trabajo, esta tcnica fue innovada, pues el rea de la imagen obtenida a travs de la cmara de video es ligeramente ms pequea que el rea que cubre el objetivo del microscopio.
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CAPITULO I1

Por lo anterior, hubo de calcularse el rea de la imagen, para reconfigurar los parmetros de la ecuacin para el clculo de la globulacin roja dado en millones de clulas. El rea que tiene cada uno de los cuadros de conteo (Cuadros A, B, C, D y E de la cmara de Neubauer) para glbulos rojos es de lmm. Por otra parte el rea captada por la cmara de video, con un objetivo de 40X corresponde a 1136 X 972 pixeles que es un rea de 1 104192 pixeles cuadrados, es obvio que el expresar un rea en pixeles resulta inservible, pero calculando el rea en mm2 de cada pixel, tenemos que estos valen 3.2705XlO-* mm2, por lo tanto el rea tomada por la cmara de video equivale a 0.0361mm2. La ecuacin para obtener el numero de clulas rojas por mm3 de sangre fue calculada con los parmetros siguientes:

Se realizan cinco tomas (cuadros A, B, C, D y E), de la cmara de Neubauer. A cada cuadro le corresponde un rea de 0.0361 mm2, correspondiente a una matriz de 1 136x972 pixeles. Por lo tanto el rea de cinco cuadros es:

rea

= 5 x O .O361

mm

... 2.3

Luego se calcula el volumen con respecto a la profundidad de la cmara que es de O. 1 mm, por lo tanto el volumen es de:

V = 5x0.0361mm2 x0.lmm = 0.0180mm3

... 2.4

Si R es el numero de clulas rojas contadas en los cinco cuadros tenemos que:

No de veces que se diluye
l a sanme

R x 200 x

A
No de clulas rojas en 5 cuadros

0.0180

mm

... 2.5

cuadros captados

Por lo tanto el numero de clulas rojas por mm3 es:

R

11 .O8 x10

... 2.6

Se realiz el mismo procedimiento de reconfiguracin de la ecuacin para el clculo de la globulacin blanca por millones. Para este caso, setomanlos cuatro cuadros de los extremos de la cmara de Neubauer (como ya se explic en el captulo 2), estos cuadros se observan con un objetivo de 1OX por lo tanto se obtienen cuatro
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Mutreiuly mtodos

cuadros de 1 136 X 972 pixeles, donde su rea en mm2 corresponde a 0.7905 mm2 cada cuadro. Por lo tanto el de los cinco cuadros rea es: A = 4x.7905mm2

...2.7

Luego entonces el volumen es:

V = 4x.7905mm2xO.lmm = 0.3162mm3

...2.8

Por lo tanto para el caso de las clulas blancas la ecuacin es de la siguiente forma:
1

B x 2 0 x

O .3162

mm

... 2.9

Por ltimo la ecuacin se puede expresar de la siguiente forma:

B X 63 .2447
Las soluciones para conteo

Clulas por mm3

... 2.10

Para el caso de las clulas rojas se utiliz la solucin salina descrita en el captulo 11. En el caso de la solucin para glbulos blancos se utiliz una solucin de cido actico al 5%, con una minucia de azul de alciano, despus se mezcla la solucin hasta homogeneizar el azul con la solucin, como paso siguiente la solucin debe de ser filtrada con un filtro de 0.2 micras, lo anterior para evitar que el colorante se sedimente en la cmara de Neubauer yno permita el conteo. La solucin se prepara al 5%, ya que esto permite que existan menor numero de restos celulares, y el conteo se lleva a cabo con mayor exactitud.

2.3.4 Visualizacin de morfologas (MORFOLOG)

En todo estudio sanguneo en donde se sospeche que un paciente puede estar siendo afectado por alguna patologa que altere el nmero de clulas sanguneas, tambin es de inters para el patlogo poder observar la morfologa celular, es por ello que basndose en la tcnica de los fiotis o extensiones de sangre, mismaquea continuacin se explica, se dise un visor de morfologas con el cual se pretende que el patlogo pueda obtener datos precisos, realizando algunas mediciones puntuales de las clulas.
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CAPITULO TI

2.2.1.1 Frotis o extensiones de sangre.

Los frotis o extensiones, se utilizan ampliamente en una gran gama de estudios clnicos, pues estos no solamente pueden ser elaborados con sangre perifrica. Existen una gran cantidad de tejidos y mucosas de las cuales se pueden elaborar frotis. El frotis generalmente es utilizado para la observacin de algunas clulas de inters, las cuales pueden ser visualizadas a travs de una tincin.

La forma en que se realiza una extensin o frotis es depositado una gota de sangre, de tamao regular, a aproximadamente 3 o 5 mm del borde de un porta objetos, el borde de un segundo porta objetos se coloca sobre la gota de sangre, en un ngulo de aproximadamente 45", permitiendo que la sangre se difunda sobre el extremo que se encuentra en contacto de este segundo porta objetos, luego se realiza la extensin sin aplicar una gran fuerza y en un solo movimiento, ya que el titubear ocasiona que no logre una capauniforme. (vase figura 2.23). Particularmente los frotis de sangre perifrica no son unbuen patrn para realizar conteos de clulas rojas, ya que debido a su alto porcentaje en la sangre, cuando se deposita una gota de esta en un porta 0bjetf.s y se realiza la extensin, es posible separar al frotis en tres zonas principales de odusin (observe la figura ), estas son: la primera zona o zona A, en ella las clulas presentan, en casi todos los casos, un 95% de oclusin, la segunda zona o zona B, en la cual i:xiste entre las clulas un porcentaje de oclusin de aproximadamente 50 a 20%, y findmente la tercera zona o la zona C en donde en muy pocos casos se tiene oclusin, est.2 llevara a pensar que bajo un criterio estadstico se podra llegar a un conteo estanuarizado, pero debido a lo aleatorio del proceso, es decir, desdeel tamao de la gota de sangre quese deposita hasta la forma de realizar la extensin de sangre, este no se puede calificar como un buen mtodo para realizar un conteo de clulas rojas valido.

(2)

(3)

Figura 2.22 Muestra de un frotis con tincin de Wright , realizado y tomado en el laboratorio de biofisica de la UAM Iztapalapa; Como se menciona en el texto existen tres regiones en un frotis (1) Regin A, es la regin de mayor oclusin o traslapamiento de clulas en un frotis, (2)Regin B, regin de oclusin intermedia, (3) Regin C, regin en donde no existe oclusin o traslapamiento [If]. 64

Matreial y mtodos

Sin embargo es posible realizar conteos diferenciales en los frotis. El conteo diferencial se refiere a la cuantificacin, por separado, de cada uno de los diferentes tipos de clulas blancas. Pero la intencin de un visor, no es cuantificar estas clulas, sino, observar cada una de estas y poder medir algunas caractersticas importantes, como radio, dimetro y rea en el caso dequelas clulas no presenten ninguna deformacin; pero en el caso de las patologas que afectan el tamao y morfologa de las clulas (como esferocitosis, poiquilocitosis, etc.), que es precisamente para lo que se requiere, no es posible medir los parmetros antes mencionados, es por ello que se tiene la necesidad de permitir gran libertad al patlogo y dejar que el mida aquellas caractersticas que leparece de importancia fundamental. La prueba de laboratorio ms importante consiste en el examen por el propio mdico de la extensin de sangre perifrica. Es preciso saber valorar un frotis de sangre perifrica para conducir con acierto a un paciente. Con demasiada frecuencia, la extensin de sangre perifrica se utiliza solo para recuento leucocitario diferencial. En el anmico, la morfologa eritrocitaria proporciona importantes orientaciones para el diagnstico.

Figura 2.23 Forma en que se realiza una extensin o frotis. Se deposita una gota de sangre a aproximadamente 3 o 5 mm del borde de un porta objetos, el borde de un segundo cubre objetos se coloca sobre la gota de sangre, luego se realiza la extensin [3b].

2.2.1.2 Coloracin de los frotis. Los colorantes cidos se unen con los componentes bsicos de las clulas (citoplasma). Inversamente, los colorantes bsicos son atrados por los compuestos cidos de la clula y se combinan con ellos (cidos nucleicos y nucleoprotenas del ncleo). La eosina es un colorante cido, por lo que se pueden emplear indistintamente los trminos eosinfilo y acidfilo para describir las propiedades tintreas de los componentes celulares.
Colorantes de Romanowsky. Wright (1902). En su preparacin, la policroma del azul de metileno se obtiene por calentamiento con bicarbonato de sodio. Puede comprarse en solucin lista para el uso o
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CAPITULO I1

bajo forma de polvo, del cual se disuelve cuidadosamente 1.0 g en 600 m1 de alcohol metlico.

Mtodo de tincin con el colorante de Wright

1. El fi-Otis secado al aire, con la sangre haca arriba, se pone sobre una gradilla de tincin (dos varillas de vidrio paralelas separadas por 5 cm). La extensin se cubre con el colorante sin diluir, quesedejaactuarun 2. minuto. El alcohol metlico fija la sangre. 3. Se diluye el colorante con agua destilada (aproximadamente el mismo volumen) hasta que aparezca una escarcha metlica. Se deja actuar este colorante diluido durante dos horas y media a cinco minutos. 4. Sin mover el portaobjetos, se lava con agua destilada hasta que las partes ms delgadas del frotis tengan un color rosado. Muchas veces, el agua destilada no da una buena diferenciacin. En este caso, debe utilizarse un amortiguador de fosfato (pH 6.4 a 6.5), para el lavado cuando menos, pero puede resultar necesario tambin para diluir colorante (paso 3). Se prepara un amortiguador conveniente disolviendo 6.63 g de KH2P04 (fosfato dicido de potasio) y 2.56 g de fosfato monocido de sodio anhidro (Na2HP04) en agua destilada, aforando a 1 O00 m1 Existen otros tipos de tincines de Romanowsky, ellas son las de Leishman, Giemsa, Jenner-Giemsa y May-Griinwald-Giemsa. Pero se explica en detalle la tincin de Wright debido a que fuela tcnica utilizada para la realizacin de los frotis.

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Matreial v mtodos

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CAPITULO I1

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CAPITULO I11

3.1 Tcnicas de programacin para el procesamiento digital de las imgenes.

3. l. Contador de clulas sanguneas CONCELSAN. 1
Para el tratamiento digital de las imgenes de microscopa de contraste de fase, con las cuales se trabajo, hubo de disearse un procedimiento con el cual extraer toda la informacin necesaria para realizar, en trminos hematolgicos, un buen conteo. La tcnica deba no solo de considerar el simple conteo de objetos, sino estar enmarcada en un criterio especifico, en este caso, el criterio de conteo en una cmara de Neubauer (Esta forma de contar clulas sanguneas se explic en 1 captulo 2). Con objeto de llevar a cabo el conteo de clulas en base al criterio de conteo en una cmara de Neubauer, se disearon dos programas principales, estos son: Celcon y Concel.

3.1.1.1 Concel
El proceso que se lleva a cabo en el programa Concel, es la segmentacin de la imagen. Aqu la segmentacin tiene varios pasos, el primero es la umbralizacin [2b], lo cual permite separar los diferentes objetos que se encuentran en la imagen, como son las lneas de la cmara de Neubauer, la basura biolgica y las clulas, del fondo de la misma. Para llevar a cabo este procedimiento se observaron los histogramas de las imgenes de todas las muestras obtenidas, estos indican que cuando se guardan las condiciones optimas (dadas en el captulo 2), como la cantidad de luz o el tiempo de exposicin en la cmara de video, el umbral para binarizar cada una de las imgenes es constante e incluso permite un margen de error de aproximadamente kl O % en cuanto a la cantidad de luz que seutilice en la realizacin del experimento, reduciendo el problema a separar nicamente el rayado de la cmara, la basura biolgica y las clulas, que son los objetos de inters en este caso. Lo anterior podra parecer poco probable, pero al estudiar y trabajar ampliamente con este experimento, sesabeque el permitir a un algoritmo determinar el umbral ptimo (en trminos del error mnimo) por segmentacin de la imagen en dos regiones de brillo, no es una opcin que ofrezca grandes ventajas, para este caso en especial, pues al realizar el clculo de las medias de las dos zonas de brillo y de las desviaciones estndar, el tiempo

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Algoritmos cmputucionales

consumido en la realizacin de estos clculos es muy grande, por lo cual se prefiere utilizar un umbral fijo. Estos inconvenientes son por ejemplo: el tiempo tan grande que utiliza el algoritmo para hallar el umbral ptimo, esto es, alrededor de 19 minutos en una computadora con un microprocesador Pentium a 166 MHz con 32 Mb de memoria RAM,lo anterior es explicable pues la imagenque se procesa esmuy grande (972 X 1 136 pixeles), si se compara esto con el tiempo que ocupa un algoritmo que utilice un umbral fijo, este solo ocupa 1 minuto para umbralizar la misma imagen. La razn por la cual se utilizan imgenes de 972 X 1136 pixeles se debe a que entre mayor sea el rea de la imagen, mayor sern el nmero de clulas u objetos en la muestra, lo cual permite realizar un conteo ms fino. Otro inconveniente importante de utilizar el algoritmo que calcula automticamente el umbral ptimo, es que la imagen resultante tiene una mayor cantidad de componentes no deseados, es decir, se conservan algunas partes del rayado de la cmara de Neubauer y la basura biolgica, que pueden ser removidas con algunas operaciones morfolgicas, pero aqu el procesamiento se vuelve critico pues al utilizar, por ejemplo, varios ciclos de erosin, necesarios en este caso, se corre e riesgo de comenzar a eliminar, adems de los componentes no deseados, las partes de intus (en este caso las clulas sanguneas). Todas las operaciones adicionales (como la dilatacin de la que se habla posteriormente) tambin consumenmas tiempo, para ese entonces tras la aplicacin del algoritmo de clculo automtico del umbral ptimo, y posteriormente por lo menos un ciclo de erosin, ya ha transcurrido un promedio de 21 minutos, y an falta la aplicacin del programa concel para formar objetos y contarlos. Por otra parte cuando se utiliza el umbral fijo, los remanentes en la imagen resultante son mnimos (basura biolgica y rayado de la cmara de Neubauer) y pueden ser eliminados tambin a travs de algunas operaciones morfolgicas como es el caso de la erosin. En general este ultimo procedimiento utilizando umbral fijo es mucho ms veloz que el de utilizar el algoritmo de clculo automtico del umbral ptimo. Como en cualquier aplicacin diseada para el procesamiento de informacin, una buena parte de las consideraciones en cuanto al factor costo beneficio de un instrumento incluyen el tiempo utilizado para el procesamiento de los datos y resultados de los mismo, es por ello que aqu se ha escogido el algoritmo que utiliza un umbral fijo. La razn por la cual se utiliza una imagen tan grande (972 X 1136 pixeles) se debe a que entre mayor rea se obtenga en la imagen, el conteo de clulas se hace con mejor exactitud. En la figura 3.1 se muestran las imgenes de la muestra biologica antes y despus de la aplicacin de los fenmenos de aberracin y difi-accin. En la figura 3.2 se muestran los histogramas originales de las imgenes de clulas rojas y de clulas blancas. La figura 3.3 muestra los histogramas obtenidos de las clulas, tras la aplicacin del mtodode aberracin e interferencia (mtodo explicado en el captulo 11), as como tambin los umbrales fijos escogidos para la binarizacin de las imgenes. La figura 3.4 muestra la. imagen umbralizada despus de laaplicacin del umbral fijo.

70

CAPITULO I11

Figura 3.1 En (a) se muestra la imagen original de la muestra, (b) muestra la misma imagen que en (a) tras las aplicacin de los fenmenos de aberracin e interferencia de luz.

Figura 3.2 En (a) se muestra el histograma original obtenido de la imagen de clulas blancas previo a la aplicacin de los fenmeno de la aberracin y difraccin de luz. (b) muestra el histograma de la imagen de clulas rojas previo a la aplicacin de los fenmenos de aberracin e interferencia.

Figura 3.3 En (a) Se muestra el histograma de una imagen de clulas blancas, cuando se ha aplicado el mtodo de interferencia a la imagen de la muestra biolgica.[2d]. (b) Muestra histograma de una muestra de clulas rojas, cuando se ha aplicado el mtodo de interferencia a la imagen de la muestra biolgica.[3d]

71

Algoritmos cmputucionules

Figura 3.4 Imagen umbralizada a travs del umbral fijo propuesto

El paso siguiente dentro de concel, es la erosin, esto con el objetivo de eliminar o filtrar de la imagen pequeos puntos de ruido, los cuales pueden tener varias causas, una de ellas, el proceso de muestre0 y captura de la imagen, es decir el ruido que se produce en el dispositivo que capta la imagen en el momento de la adquisicin, otro, partculas de polvo ya sea, en los objetivos del microscopio o en la propia cmara de video, estos se pueden resumir como remanentes despus de la binarizacin. Una manera de definir a la erosin es a travs de la teora de conjuntos. Esta dice que para los conjuntos A y B (que representan a la imagen y al elemento esfructurante) de Z2 (que representa al espacio bidimensional en dondese encuentran las imgenes), la erosin de A por B representada por A O B, se define como

AOB = {xJ(B),

c A}

que dice que la erosin de A por B es el conjunto de todos los puntos x tzles que B, trasladado por x, esta contenido en A. Una manera grfica de observar esta definicin se muestra en la figura 3S .

CAPITULO I11

....

o
Figura 3.5 (a) Conjunto original A; (b) elemento estructurante B; (c) erosin de A por B, en sombreado; (d) prolongacin del elemento estructurante; (e) erosin de A por ese elemento.[9b]

Existen varias maneras formales de escoger un elemento estmcturante [ 14a,15a], basndose en la morfologa de los objetos que se desean separar y en la teora de conjuntos. Como se observa en la figura 3.5, el realizar la operacin de erosin entre dos cuadrados, tiende a conservar la forma de los mismos enel resultado final, otro ejemplo es que al erosionar un cuadrado con un circulo, la morfologa del cuadrado se va alterando con respecto al nmero de veces que se aplique la erosin, hasta llegar a una forma parecida a un hexgono. En el caso presente se probaron varios elementos estructurantes, figuras tales como crculos, en los cuales, se fue variando su radio en un rango de entre 3 a 8 pixeles, los resultados obtenidos no fueron satisfactorios, pues con radios pequeos se tena que erosionar la imagen mas de una vez y esto consume bastante tiempo, mientras que para radios grandes, 8 pixeles, durante la aplicacin del primer ciclo de erosin se eliminan algunas clulas. Entonces se probaron otras formas geomtricas como cuadrados, con estos los resultados no fueron nada alentadores, pues tambin se tenan que aplicar varios ciclos de erosin. Posteriormente se utilizaron rectngulos. Estos probaron mejores resultados, ya que los elementos en la imagen no eran deformados a tal grado de incluso perderlos. Se trabajaron varios rectngulos hasta llegar al rectngulo estructurante ideal. Visto como una matriz, es de 4 X 2 pixeles. Este elemento se prob tanto con las clulas rojas como con las blancas y los resultados son excelentes, pues aunque se aprecia una ligera deformacin de los objetos, la cual no es importante ya que lo que se desea es contarlos no importando su forma, estos no se eliminan de la imagen y quedan perfectamente bien separados (ver figura 3.6)

73

Algoritmos cmputucionales

Figura 3.6 Imagen erosionada, a partir de la imagen umbralizada de la figura 3.5.

Una vez concluida la erosin, se realiza una dilatacin, esta ayuda a recobrar en ciertas proporciones el tamao de los puntos brillantes. La dilatacin es el proceso inverso a la erosin, tambin puede ser explicada en base a la teora de conjuntos. Al igual que la erosin se define con A y B como conjuntos de Z2 y @ representando al conjunto vaco, la dilatacin de A por B, representada por A O B, se define como:

La dilatacin de A por B es entonces el conjunto de todos los desplazamientos x tales que B y A se traslapen en al menos un elemento distinto de cero. La dilatacin se llev a cabo con un elemento estructurante cuadrado, que visto comouna matriz es de 3 X 3 pixeles. Tras la dilatacin los objetos recobran casi por completo su tamao original aunque nunca llegan a tocarse. Obviamenteesto tiene un limite prctico para que funcione correctamente, estos limites estn dados por el factor de dilucin de la muestra sangunea, que para estos casos (clulas blancas y rojas) es el factor de dilucin normal discutido en el captulo 11. El objetivo principal de realizar la dilatacin en las imgenes se harealizado para poder en una etapa posterior realizar un conteo manual sobre esta imagen y de esta forma validar si el contador automtico cuenta correctamente y cuantos objetos se pierden en el proceso de erosin.

CAPITULO I11

Figura 3.7 La figura muestra la dilatacin de la imagen, despus del proceso de erosin.

3.1.1.2 Celcon

Celcon es un programa diseado para delimitar y contar objetos en una imagen, esto quiere decir que no importa que no sean clulas sanguneas. Celcon se basa en la teora de la vecindad entre pixeles. En este caso la vecindad inmediata (8 vecindad), para delimitar un objeto. Si observamos a un pixel como un punto en una matriz (como se muestra en la figura 3.4), este tendr 8 pixeles que lo circundan, (a menos que sean los pixeles que se encuentran en la primera y ltima columna y primera y ltima fila, estos tendrn tres o cinco vecinos segn sea el caso), si estos tienen el valor binario 1, esto indica que son parte de un mismo objeto. El programa comienza a delimitar objetos escudriando a partir de la segunda lnea de la matriz que pertenece a la imagen, de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo. El programa celcon acta de la siguiente manera: una imagen es barrida pixel a pixel, de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo, buscando componentes de vecindad inmediata (8 vecindad), si consideramos a P el pixel en cada paso del barrido y a r y t (ver figura 3.4) como los vecinos superior e izquierdo, y q y S los vecinos diagonales superiores de P, la secuencia de barrio asegura que cuando se llega a P, los puntos r, t, q y S ya hayan sido procesados. Si P es cero ser necesario moverse a la siguiente posicin de barrido. Si P es 1 y los restantes cuatro vecinos son todos cero, se asigna una nueva etiqueta a P. Si nicamente uno de los vecinos es 1, se asigna la etiqueta de este a P. Si dos o mas vecinos son 1, entonces se asigna una de sus etiquetas a P yse realiza una anotacin de las equivalencias. Al terminar el barrido de la imagen, se convierten los pares de etiquetas equivalentes a clases de equivalencia, asignando una nica etiqueta para cada clase. Despus de terminado lo anterior se barre una segunda vez a la imagen, cambiando cada etiqueta por la que sele asign a su clase de equivalencia.

75

Algoritmos cmputacionules

Hasta este punto se han contado todos los objetos presentes en la imagen. Pero debido a que este conteo se debe de ajustar al criterio de conteo en una cmara de Nuebauer (explicado en el captulo 11) entonces todos los objetos quese encuentren en el borde derecho e inferior de la imagen son eliminados. La eliminacin de estos objetos se realiza de manera sencilla, pues como ya estn etiquetados y se conoce perfectamente la posicin decada uno de ellos, todas aquellas etiquetas quese encuentren tocando las partes mencionadas de la cmara son simplemente eliminadas. En este punto del programa se hace un ajuste en el conteo final. Esta misma operacin se repite 5 veces para las clulas rojas y 4 para lasblancas con diferentes imgenes adquiridas, luego se multiplica por una constante (calculada en el captulo 11), y se obtienen los resultados finales. Celcon tiene integrada en su cdigo una rutina que permite conocer el rea de cada uno de los objetos que se reconocen. Por el momento esta rutina permanece desactivada. Parece no tener ningn sentido el conocer el rea de los puntos brillantes producidos por el mtodo de interferencia, pero quiz estos puntos brillantes pueden contener informacin dependiendo del tamao de la clula que los produzca, de ser as, estos pueden ser de utilidad en el caso de deteccin a travs de su rea de algunos padecimientos que la alteren como es la esferocitosis.

Pixel central

Figura 3.4 El cuadro azul representa el pixel central, los cuadros verdes los cuatro vecinos asociados a ese pixel, que sumados a los cuadros grises representan los ocho vecinos de un pixel.[5d]

CAPITULO I11

3.2 Visor de morfologas MORFOLOG.

Para cualquier patlogo es de suma importancia conocer todos los parmetros de una clula, como por ejemplo su morfologa, dimetro (en el caso de que sean circulares) o su rea, o tambin poder conocer de manera exacta una medicin puntual en alguna clula en especial. Esto ltimo es lo ms importante, pues generalmente cuando se observa un frotis de sangre perifrica y se encuentra algn tipo de alteracin en las clulas estas cambian su morfologa y pueden ser desde simples esferas, hasta clulas en diana, en el caso de las clulas rojas o cambios morfolgicos en sus ncleos en las clulas blancas. Este visor, permite al usuario escoger quees lo quele interesa medir en la muestra, y seleccionarlo a travs de un cursor. La figura 3.5 muestra algunos casos, de los cuales es necesario obtener algunos parmetros. Todas las muestras, en este caso, pertenecen a clulas rojas y son frotis con tincin de Wright. En (a) se muestran clulas rojas normales, pero como se sabe estas pueden tener una variabilidad normal en su dimetro, en la parte superior media de (a) se observan 4 clulas ocluidas, de las cuales el usuario puede distinguir perfectamente sus limites, por lo tanto es fcil marcar a travs de los puntos un radio y obtener algunos parmetros adicionales con este. En la misma figura, (b) muestra clulas con una morfologa totalmente irregular, en este caso se trata de Macro ovalocitos y schistocitos, como resultado de anemia perniciosa, aqu la deformacin de las clulas no permite medir su dimetro, pues no son circunferencias, entonces se realizan mediciones de dos radios, con los que el patlogo puede cuantificar la deformacin de esa clula. En (c) se observa una muestra de clulas afectadas por Microcitosis e hipocromia resultado de enfermedad renal. En este caso conocer el rea de las clulas no es fundamental, su deformacin es tal que, es preferible conocer (como en (b)) ladeformacin de esta a travs de mediciones puntuales. En (d) se observa la formacin de rouleaux en los cuales como en (a) es posible observar perfectamente el contorno de cada clula que esta en la mencionada formacin, por lo anterior, es fcil escoger dos puntos y marcar un radio. Debido a los detalles mencionados de la figura 3.5 se ha preferido dejar abierta la posibilidad para que el patlogo de manera manual pueda realizar sus mediciones de acuerdo a su criterio e inters en algunas clulas.

77

Algoritmos cmputncionules

Figura 3.5 En (a) Clulas rojas normales, (b) Macro ovalocitos y schistocitos: anemia perniciosa, (d) Microcitosis, hipocromia: enfermedad renal, (e) Formacin de Rouleaux.[ 19b]

El objetivo principal de MORFOLOG es el ayudar, ya sea al mdico o al patlogo a observar de manera mas clara y cuidadosa, a travs de un monitor de computadora, la morfologa de las clulas de su inters. Podra pensarse de manera natural, el porque de no obtener automticamente los parmetros que se obtienen semiautomticamente con MORFOLOG (como radio, rea, distancia entre dos puntos), es decir por que no atacar el clculo de estos parmetros de manera automtica a travs de redes neuronales y procesamiento digital de imgenes, la razn por la cual no se ha realizado de dicha forma se debe a que se ha preferido dejar que el usuario (mdico o patlogo) tenga toda libertad de realizar mediciones como el radio o el rea de alguna clula en especfico y en otros casos como en la serie blanca de la sangre poder llevar a cabo mediciones puntuales escogiendo la parte de las estructuras celulares que a sucriterio parezcan de transcendencia para un estudio celular.

CAPITULO I11

3.2.1 Radio

Radio es un programa a travs del cual se calcula el radio, y en los casos que se le indique el rea de un objeto. La aplicacin de radio es muy sencilla, pues a travs de un cursor en la pantalla se seleccionan dos puntos. Primeramente se selecciona el centro, despus un punto cualquiera en la periferia del objeto (clula), de esta forma se han seleccionado dos puntos. Una vez seleccionados estos puntos se calcula la distancia entre ellos,

d = ,,/(y2 - y , )

+ (X,

-X,)

Ec. 3.1

y as se conoce el radio, luego se aplica la ecuacin para el clculo del rea de una circunferencia:

a = 7cr 2

Ec. 3.2

y se obtieneel rea, pero en pixeles. Basta simplemente multiplicar por el valor del rea de un pixel (en micras), y se conoce el rea en micras.

La utilizacin de MORFOLOG.

Se recomienda calibrar cada vez quese adquiera una imagen. Tomando como referencia una cmara de Neubauer sin muestra, debe colocarse un objetivo de 100 X y aceite de inmersin en la cmara (sin cubre objetos). Para un mejor aprovechamiento del visor de morfologas, se recomienda utilizar frotis de sangre, teidos a travs de la tcnica de Wright (explicada en la seccin 2.2. l . 1 de este capitulo) debido a las ventajas para poder visualizar de manera objetiva cada clula. Tambin es posible utilizar fiotis sin tincin, obviamente esto dificulta observar la morfologa celular, pero lo anterior no es tan importante cuando solo se desea saber el tamao de alguna clula.

3.3 Diseo y construccin de una interfase grfica.

Una caracterstica importante de cualquier software, sea cual sea su fin, es que este cuente con un conjunto de caractersticas amigables que faciliten la interaccin del usuario con el programa, aun cuando no se tenga la mnima experiencia en cuanto al manejo del mismo. Las caractersticas ms importantes para cualquier software son: su fcil entendimiento y manejo a travs de la incorporacin de botones, apuntadores de mouse,

79

Algoritrnos crnputacionales

teclas de acceso a mens en un medio grfico. Por otra parte, la claridad al poder visualizar los resultados de las operaciones realizadas debe de ser completamente transparente en una interfasemaquina-usuario. Es por ello quese dise un programa queincorporauna interfase grfica, la cual permite el fcil manejo del programa que controla, casi en su totalidad (a excepcin dela adquisicin), al contador de clulas sanguneas, llamado CONCELSAN. Por otra parte, contenidos en esta interfase grfica, se encuentran tres programas, que se encargan de diferentes tareas. Por ejemplo, el primer programa, llamado Conc, se ocupa del conteo de clulas rojas, el segundo, llamado Cobla, del conteo de clulas blancas y el tercero, llamado Morfolog, es un programa diseado para la visualizacin de las clulas sanguneas contenidas en una muestra. Cada uno de estos programas se encuentra concatenado con otras rutinas con las cuales se lleva a cabo el procesamiento digital de las imgenes.

Todo el diseo de la interfase grfica y los programas que realizan el procesamiento y conteo de objetos serealizaron primeramente en MATLAB 4.3, y despus se mejoraron y agregaron nuevas rutinas a travs de MATLAB 5.2. El programa esta desarrollado por completo para ambiente Windows. Este cuenta con apuntadores de mouse, teclas de fcil acceso a mens, y botones para realizar mltiples hnciones, como son el conteo de las clulas, calculo del numero total de clulas, etc.

El aspecto de la interfase grfica de CONCELSAN es el siguiente:

Figura 3.6 Pantalla principal del contador hematolgico, CONCELSAN.[6d]

CAPITULO I11

Por otra parte las pantallas de los tres programas que integran a CONCELSAN son: CONC, contador de clulas rojas.

Figura 3.7 Pantalla del programa contador declulas rojas, CONC.[7d]

COBLA, contador de clulas blancas.

Figura 3.3 Pantalla del programa contador de clulas blancas, COBLA.[8d]

81

Algoritmos cmputacionales

Y MORFOLOG, visor de morfologas.

Figura 3.9 Pantalla del programa visor de morfologas, MORFOLOG.[9d]

CAPITULO 111

83

Algoritmos cmputucionales

4.1 Resultados obtenidos 4.1.1 Validacin de los conteos automticos.

Con la intencin de validar los conteos logrados a travs del contador automtico y antes de aplicar el criterio de conteo que se utiliza en una cmara de Neubauer, se llevaron a cabo sesenta conteos de clulas sanguneas, el procedimiento para la validacin de estos fue el siguiente: 1. Se aplica el procedimiento de la aberracin y difraccin de luz a la muestra biolgica. 2. Se adquiere la imagen y se aplica el procesamiento descrito en la seccin 3.1 del captulo 111, realizado por los programas de cmputo celcon y concel. 3. Una vez obtenido el conteo automtico, se cuenta manualmente en el monitor de la computadora el nmero de clulas u objetos existentes en ella. Cabe recordar que la imagen utilizada para realizar este conteo manual sobre el monitor de la computadora es la imagen original de la muestra biolgica. Por otra parte la imagen utilizada por el programa de cmputo, para realizar el conteo de objetos (clulas), es la imagen resultante de la dilatacin generada a travs del programa de cmputo celcon. De este procedimiento de validacin se destaca lo siguiente: Con n = 60, (donde n es el nmero de imgenes utilizadas) el nmero total de clulas contadas a travs del contador manual es de 621 1 y el nmero total de clulas contadas a travs del conteo automtico es de 62 15, por lo que se calcula un error en el conteo de 0.61% para las clulas rojas, para las clulas blancas no se han observado diferencias. El error se atribuye al proceso de erosin, en donde es posible y no en todos los casos, perder algunas clulas en la imagen.

85

Resdfudos

4.1.2 Validacin de los conteos en las imgenes Como primer paso antes de comenzar la validacin de los recuentos celulares entre el software diseado y el conteo tradicional en la cmara de Neubauerse verificaron los conteos realizados por el programa de computo en cada una de las imgenes obtenidas, contando visualmente desde la imagen, aplicando el criterio de conteo de la cmara de Neubauer. Los resultados para cada una de las imgenes son los siguientes:
4.1.2.1 Conteos para clulas blancas

3 3

I
7

1 I

3
4

23 21 27 26 28 I2 21 13 31 31 12 4
14

23
?I
27

26

18
I2

21 I?
31
?I

I2
4 14 15 39
41

4 5

2
4

15 39
41

37 38
II 12 R 14

I 2

37 35 II I2 8
I4

4
1

36
40

i
8

zI

:S
27
25 31

2 3
4 I

4
10
I

3
4
II
17
I
7

28 18 17 13 12 33 37 29 34
23 17 ?I
19

36 40 77 33 27 25 31 28 IR
17
I ~3

12

33 37 29 3.1
19 23 21

4
I2
I
7

22 24
19

22 24
19

20

20

Tabla 4.1 Conteos manuales VS Conteos con COBLA

86

4.1.2.2 Conteos para clulas rojas

I
Conteo
97 91

CONC
97 86 91 88 I 00 87 x9

Manual
86

88 I 00
89

87

I;

I13

11.1
115 108 1 I4 117 117

I:
4

115

I08 I I4 117 117 123 I I6

ll3 121

113
121

91

83 85 94 80 91 I IO
IIb

X3
X5 94 X 0

I09 I I4 I o5 I I9
131

I: ;1

I I6

In

105 I I9
131 124 I I6 112

I24 I I6

I12
87 95

87 95

3
4

5
1
I

3
4

I I? I26
90

10

5 I
3

78 80
168 137

80 87 87 168 137

131

131

I2

I 1 2

I:
Tabla 4.2 Conteos manuales VS Conteos con CONC

87

Resultados

4.2 Resultados obtenidos, en el conteo de clulas rojas de rata.

Se realizaron cinco conteos de clulas rojas de ratas Wistar, obtenidas del bioterio de la UAM-I, dos de estas se sabe que estn desnutridas, las otras cuatro se encentran bien en apariencia. Esto se realiz con motivo de verificar que los conteos celulares sean lo mas cercanos a los reportados en la literatura, antes de proseguir con los humanos.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Contea
I

Manual
130

1 Total por m' CONC

I6371000

1 Total pormm' manual

107
4
7
7

110

1;;:
I

I21

3
4 5 I
7

I If;
91 98

133 137 143

Ii

6925000

6920000

122 I30

si

131 145 135 1O0 98

5185110

5 I S0000

5900000

5894560

3 4

125

Tabla 4.3 Conteos manuales VS Conteos con CONC De clulas de rata (Wistar)

4.3 Resultados obtenidos, comparacin y validacin del sistema CONCELSAN y el conteo clsico en una cmara de NeuBauer con clulas humanas.
Para validar los resultados obtenidos a travs del contador diseado (CONCELSAN), se compararon estos con los resultados obtenidos al contar las clulas en las mismas muestras, por medio de la tcnica tradicional de la cmara de Neubauer.
4.3.1 Conteo en cmara de Neubauer.
4.3.1.1 Conteo de clulas blancas
Conteo

29 Total

5700

3 4 5900 Total 3 3 4 Total I 2 3 4 Total I 2 3 4 Total I 2 3 4 Total

Observador I 26 27 28 25 5300 29 27 33
28 5850
31

I Obsexvador 2 I 26
27
25 5350 29 28 33 28

I Observador 3
I 25
28 28 25 5300 28 27 32 27
31 30 32 28 6050 30

Promedio
5316.66

30 32 28 6050 30

31 11 32 28 16100 I 30 29 5800 52 47

6066 66

I
I

5833 33

29 52 46

9783 33

2816 66
10

I
3 4 Total I 2
4 Total

9250

3250 7033.33 34 :9 7050 34 39 7050 34 7000

2 4 Total I 3 4 Total
II
I

?o
18

I::
3700 46 45 39 44 45

3750

3750

10

8450

8400 25

I 8450
I 25
5066 66

I 26

12

3 4 Total I 2 3 4 Total

5350
29

22

32 29 22

32 29 22

Tabla 4.4 Conteos manuales de clulas blancas.

89

4.3.1.2 Clulas rojas.

:onteo
Cuadro I
2

Observado1 1 I22
Y I)

Observador 2
121

Observador 3
I22

Promedm
5 I 06666.66

87
99 I 02

90
I O) I O? 98

3 4 5
Total

I on

I o2 9s 5 I20000
96

I 2 3 4 5
Total

I 2 3
4 5 Total

90 100 I02 98 4860000 I23 I22 I25 I28

]?(I

98 5080000 96 93 98 I07 93 4870000

122
I22 I25

5 I20000 96 90 99 I O5 93 4830000 I23 I22

1853333.37

6283333 33

6260000 6280000
175

I
7

6290000 135
l?l

132

4 5
Total

126 128 I13

I26 I 28
133

134 I32 I26

I28

6530000

I
2

3 4 5 Total I 2 3 4 5 Iotal
I

6530000 92 96 I 00 93 98 4790000 129 I I9 127 23 I I5 6 I io000

6530000 92

I32 6520000 92 4793333

33

I40
132
I 35 Iio

2 3

4
F

I28
6650000 95 91 I 02 105 99 4920000
135

I28 6666000
6670000

1 ntal I 2 3 4 5 Total
I

4977333 33

2
4
3

27 I 30 I31

Tntal

I 02 107 99 4950000 I35 I23 I ?O 131 I29 6480000 89

103 10: 98 3930000 135

I22

6416666.66

I30
131

o2

i
5 I

92 95

Total
II

97 4660000 I48 I55 Ihl

157

92 95 97 4650000 147

I29 6470000 86 93 92 95
97

4646666 66

46i0000
I48 I55
I61

7746666 66

I55
161

12

1
5
Total 1 2 3
4

158 7750000 I47 157 I50

I45 I51 7530000

153 158 7740000 I47 I57 I50

I45

153
I58

7750000 I47
157 I 50

~530000

145
I54

5
lotal

I54

Tabla 4.5 Conteos manuales de clulas rojas

90

4.4 Conteo a travs de CONCELSAN.

4.4.1 Conteo de clulas blancas

Contw
I

Cuadro
I

COBLA
20 20 23 21 21 26

Promedio
5312.50

3 4 I

S88 I .70

Tabla 4.6 Conteos de clulas rojas con CONC

91

Resultados

4.4.2 Conteo de clulas rojas

Canta, I Cuadro
I

cohc
37 36
?I

Promedlo
51 IS960

4 5 I
7 1

38
100

37 39

4864120

33
35 35 113 I15 108 114 117 117 123 116 I13
121

4 5
I 2
7

6252360

4 5
1
I

6537200

2
3

3 5 I 2
4

83 85
04

4797640

5
6
I
7

30 31 I10
I14 105 119 I31
I23 116 109

6 I83200

4 5 I 2
4

6670160

5 I 2 3 4
3

I
2

3 4
5

1I 6 1 12 87 95 83 91 90 I16 121 112

I26

3941680

6470710

In

I09 85

4653600

90
J

5
II
I

78 80 87
I65

7560000

137

3
I
3

I33
131

131
136
127

I2

7534400

2 3
4

136 147

Tabla 4.7 Conteos de clulas blancas con COBLA

92

4.5 Estadstica de los conteos. En toda validacin, de cualquier instrumento, es de suma importancia observar los resultados obtenidos por cada instrumento y compararlos. En una grfica de dispersin a travs de una regresin lineal, es posible observar como se comportan los conjuntos de datos obtenidos de cada instrumento. Por lo anterior todos los datos obtenidos se incluyen en las siguientes grficas, en donde se grafican los conteos promedio de tres observadores en la cmara de Neubauer contra los obtenidos por CONCELSAN.
Es de importancia primordial observar el resultado obtenido cuando se calcula el coeficiente de correlacin, ya que este indica que tanto se aproximan unos conteos con otros. Primeramente se muestra la grfica correspondiente a los glbulos rojos.

Curva de regresin ajustada CONCELSAN VS Cmara de Neubauer Clulas rojas, n = 12

4500000 5000000 5500000

6000000 6500000 7000000

7500000 8000000

Cmara de Neubauer

ConteodeCONCELSANConteo

con CmaradeNeubauer

Como resultado del anlisis estadstico aplicando la prueba T para muestras pareadas se obtuvieron los siguientes resultados: media, para los conteos realizados a travs de CONCELSAN igual a 5984170, para los conteos realizados en la cmara de Neubauer la media resultante tiene un valor de 5973333.33, donde las unidades son nmero de clulas por mm3. La desviacin estndar para el primer caso tiene un valor de 1085126.73 mientras que para el segundo 1085449.22, donde sus unidades son nmero de clulas por mm3. De lo anterior se puede observar que entre los parmetros como la media, y la desviacin estndar no existen grandes diferencias, pero lo mas importante en este caso es el valor de t (valor de significancia), que se obtiene al realizar la prueba, este es de 2.17 173129, cuando este valor se compara en la tabla de valores crticos de t indica que el mtodo se puede calificar como bueno, pues no existen diferencias significativas entre ambos mtodos de conteo. En este caso el valor de la tabla de valores crticos de t
93

Resultados

es igual a 2.201, por lo que al comparar ambos valores, el calculado, es menor queel de la tabla, por lo tanto el conteo de CONCELSAN para clulas rojas se puede calificar como bueno. El mismo procedimiento estadstico (prueba T) se practic para lasmuestras pareadas de clulas blancas, los resultados son los siguientes:

Curva de regresin ajustada CONCELSAN VS Cmara de Neubauer Clulas blancas, n = 12

I
+

2500

3500

4500

5500

6500

7500

8500

9500

10500

Cmara de Neubauer

Conteo de CONCELSAN L Conteo en Cmara de Neubauer

El valor de la media en el conteo a travs de CONCELSAN es de 62 15.45833, y para el conteo en la cmara de Neubauer la media arroj un valor igual a 6,311.1075. La desviacin estndar obtenida para CONCELSAN es de 207 1.79, mientras que para la cmara de Neubauer, este es de 2098.36, las unidades tanto de la media como de la desviacin estndar son nmero de clulas por mm3. En este caso el valor de t obtenido al realizar la prueba es igual a 0.53505023, que al compararlo con el valor de la tabla de valores crticos de t, que es el mismo valor que el utilizado para las clulas rojas, este mucho menor al valor de la tabla, lo cual indica que CONELSAN tambin realiza un buen conteo para clulas blancas.

94

DISCUSION

DISCUSI~N

Los mtodos y algoritmos utilizados para la elaboracin de este trabajo son ampliamente conocidos en sus respectivos mbitos. Es decir, las tcnicas de laboratorio utilizadas en este caso para la realizacin del conteo de clulas sanguneas son ampliamente conocidas (como el conteo en la cmara de Neubauer), y por otra parte los pasos para el procesamiento digital de imgenes (como conteo de objetos, ciclos de erosin y dilatacin, etc) tambin lo son.
Una de las partes primordiales de este trabajo, es entonces, realizar un acoplamiento delas tcnicas biolgicas y las tcnicas de procesamiento digital de imgenes para obtener un conteo con un alto grado de precisin. Para la realizacin de este trabajo se investigaron diversas tcnicas de procesamiento digital de imgenes con las cuales se pudiera disminuir en un grado importante la oclusin de las clulas sanguneas, mismo que se encuentra presente en el 95 % de las muestras biolgicas. En forma paralela se investigaron otras formas de evitar la oclusin. Se encontr entonces que al trabajar con la ptica del microscopio se poda separar a las clulas ocluidas por medio del efecto de interferencia de la luz que en este caso esta intimamente relaciona con la aberracin de las lentes del microscopio. El resultado en la aplicacin de estos efectos pticos, es que las clulas se observan como fuentes puntuales de luz que lucen separadas en un 98% una de otra, por lo tanto visto en una pantalla de computadora, los pixeles remanentes entre una y otra fuente de luz pueden ser fcilmente eliminados a travs de tcnicas de procesamiento digital de imgenes como se plante en el captulo I11 de este trabajo. Los lmites prcticos para la aplicacin de esta tcnica estn directamente asociados con el volumen habitual de disolucin que se ocupa cuando se realiza el conteo de clulas en la cmara de Nueubauer.

97

Discusin

Conclusiones

En este trabajo se realizaron diversos experimentos para el diseo y construccin de un contador de clulas sanguneas, eficaz yde bajo costo. Para ello fue indispensable conocer ampliamente que tipos de contadores existen, cuales son los problemas principales de cada uno de estos instrumentos, as como sus inconvenientes. A partir de la informacin recabada, se recurri a la forma tradicional de recuento de clulas sanguneas, el conteo en una cmara de Neubauer. Ya que este instrumento es el que se utiliza como patrn de validacin para todos los instrumentos que se desarrollan y conocen comercialmente, se trabajo ampliamente con l. Tomando imgenes de las muestras sanguneas depositadas en la cmara de Neubauer, se disearon diversos programas de cmputo para realizar el conteo de las clulas sanguneas. Sin embargo el problema mas importante para realizar un recuento celular a travs de imgenes esla oclusin o traslapamiento de lasmismas. Para resolver el problema de la oclusin, se diseo un mtodo basado en dos fenmenos de la ptica del microscopio; la aberracin y la difraccin o interferencia. El mtodo al que se le dio el nombre de clulas brillantes o fuera de foco, permite la separacin delas imgenes delas clulas sanguneas quese encuentran en la muestra, mismas que pueden o no estar ocluidas. Del conteo de clulas sanguneas a travs de este mtodo se concluye: i.
..

11.

111.

...

El fenmeno denominado clulas brillantes o fuera de foco, es perceptible para cualquier cmara de video a bajos niveles de iluminacin y con un tiempo de exposicin no menor a 100 ms. El conteo a travs de esta tcnica, se puede llevar a cabo con microscopios pticos o de contraste de fase, pues lo importante son las caractersticas de las lentes, y no las diferencias fundamentales entre dichos microscopios. El liquido para diluir las clulas blancas debe ser, una solucin de cido actico al 5%, pues una concentracin menor no permite la destruccin completa de las clulas rojas, que al estar presentes en gran nmero como grandes restos celulares, no permiten observar a las clulas blancas en un mismo plano de aproximacin. Por el contrario una concentracin mayor comienza a fracturar la membrana de las clulas blancas y se observarn menor nmero de ellas en el mismo volumen.
99

CONCLUSIONES

iv.

Es necesario tener el mximo cuidado al diluir la muestra de sangre con el liquido de disolucin, pues un mal manejo en la homogeneizacin de ambos produce hemlisis y esto impide el brillo celular.

De los resultados prcticos obtenidos en cuanto a los conteos tanto en clulas humanas como de rata, se concluye que: i. Las diferencias entre CONCELSAN y la tcnica de conteo manual en la cmara de Neubauer se deben al error humano al realizar el conteo en forma visual, error que no puede atribuirse al software diseado, pues su forma de conteo permite contar una sola vez cada clula. De acuerdo al estudio estadstico aplicado a los resultados de la muestras sanguneas, en este caso la prueba de T pareada, no existen diferencias significativas entre la forma tradicional de conteo (conteo en la cmara de Neubauer) y el conteo a travs de CONCELSAL.

11.

..

Por otra parte, del visor de morfologas (MORFOLOG) se puedeconcluir:

1.

Que MORFOLOG cumple con S propsito principal, el cual es ayudar de forma practica al mdico o al patlogo a observar de manera mas clara las diferentes morfologas celulares.

1O 0

COMENTARIOS Y RECOMENDACIONES

COMENTARIOS Y RECOMENDACIONES

El objetivo principal de este trabajo de tesis fue el realizar un contador de clulas sanguneas, que ofreciera un conteo rpido y a la vez confiable, y que su costo fuera el mnimo comparados con todos los sistemas comerciales disponibles hasta el momento. Sin embargo como en todo trabajo existen mejoras que pueden arrojar beneficios en pro del sistema. Esto permitir que el paquete de cmputo pudiera tener autonoma con respecto a la adquisicin de las imgenes, y no depender del paquete de adquisicin que ofrece el distribuidor de lacmara de video. A este software se le pueden incorporar nuevas pruebas. Como por ejemplo, una prueba propuesta es la deteccin de VIH. Esta prueba puede llevarse a cabo, agregando a la muestra sangunea, un agente que altere el color de la misma en presencia del virus. Computacionalmente, seria tanto como cuantificar el nivel de gris en una imagen. Otra prueba interesante para un contador de clulas sanguneas es el conteo diferencial de las clulas blancas. Esta clasificacin de clulas se puede llevar a cabo a travs de una red neuronal. Las recomendaciones que se presentan, estn enfocadas a realizar un conteo cada vez mas veloz, este se puede conseguir: i.
11.

..

m.

...

OUtilizando microprocesadores veloces, de uso comn (por ejemplo de 250 MHz en adelante). Incorporando a la computadora una amplia memoria RAM, de alrededor de 32 MB. Compilando las rutinas escritas en MATLAB, en algn lenguaje como por ejemplo C, esto conel propsito de evitar cargar el ambiente de MATLAB, y saturar a la memoria con el mismo.

101

Comenturios y Recomendaciones

REFERENCIAS

[ 1b] Leeson, Leeson, Paparo,Histologa, Interamericana,

[2b]Webster, Encyclopedia of medical devices and instrumentation, John Wiley and Sons, 1988. [3b] Lynch, Raphael, Mtodos de laboratorio, Interamericana, 1983. [4b] Russ J.C., Computer-Assisted Microscopy, Plenum Press, 1987. [5b] Russ, J.C., The image processing handbook, CRC Press, 1996. [6b] Delgado Buenrostro Norma Laura, Revuelta Miranda Maria Ester. Guia prctica para el manejo de animales de laboratorio, UNAM, 1994.

[7b] Rapaport, Introduccin a la hematologa, Salvat, 1977 [8b] Sears Semanski, Fsica Universitaria, Addison-Wesley, 1992 [9b] Gonzales C. Rafael, Woods E.Richard, Tratamiento Digital de Imgenes, Addison-WesleyIDiaz de Santos, 1996. [lob] Jain, A. K. Foundamentals of Digital Image Processing, Prentice Hall, Englewood Clifs, N.J., 1989.
[ 1 lb] Matlab V 4.3, Building a graphical User interface, The Math Works inc. 1996

[ 12b] Matlab V4.3, , Extrnal Interface Guide, The Math Works inc, 1996.
103

Referencias

[ 13b] MatlabV4.3, Reference Guide, The Math Works inc, 1996.

[ 14b] MatlabV4.3, Image proccesing toolbox, The Math Works inc, 1996.

[ 15b] Matlab V 5.2, Building a graphical User interface, The Math Works inc, 1998.

[ 16b] Matlab V5.2,

External Interface Guide, The Math Works inc, 1998.

[ 17b] Banks, William, Histologa Veterinaria Aplicada, Ed. Acribia, 1995.

[ 18b] WPI, Ultra high resolution digital imaging computer camera, International Trade Center, 175 Sarasota Center Boulevard, Sarasota FL, 1997.

[ 19b] Balcells, A. La clnica y el laboratorio, Marin, 1978.

[2Ob] Lee, Richard G., Wintrobes clinical Hematology, Lea & Febiger, 1993. [2 1b] Fu K.S., Applicattions of pattern recognition, CRC PRESS, 1982. [22b]Sena, J. Image analysis and Mathematical Morphjology, Academic Press, London, 1982.

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[2a] Abbot Instruments, Cell-Dyn, Abbot Park Illinois 60064. 1998.

[3a] dOnofrio Giuseppe, Chirillo Rosario, Zini Gina, Simultaneous Measuremente of reticulocyte and Red Blood Cell Indices, Blood, Vol 85, No3, 818:823, 1995.

[4a] Tichelli Andre, M.D., Alois Gratwohol, M.D., An automated Reticuloyte Analizer, Division of Hematology, Deparment of the Laboratory Medicine, University Hospital; Universitatsrechen fir zentrum, Institut fir Informatik; Basel, Switzerland., J. Clin Pathol, 70:78, 1989 [5a] Schulz, J., Thom, R. Electrical sizing and counting of patelets in whole blood. Med. Biol. Eng., 11:447, 1973. [6a] Wintrobe, M. M., Clasification of the anemias on the basis of diferences in the size and hemoglobin of the red corpuscles, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 27: 1071,1930. [7a] Langercrantz, C. Photo-electric counting of individual microscopic plant and animal cells. Nature (London), 161:25, 1950. [8a] Moldavan, A. Photo-electric technic counting of microscopical cells, Science, 80: 188, 1934. [9a] Dameshek, W. Method for simultaneous enumeration of blood patelets and reticulocytes with consideration of normal patelets counts in man and woman , Arch. Intern. Med., 50:579, 1932.

105

Referencias

[ 1 Oa] Groner, W., Tycko, D. Characterizing blood cells by biophysical measurements in flow. Blood Cells., 6: 141- 157,1980. [ 11a] Schulz, J., Thom, R. Electrical sizing and counting of patelets in whole blood. Med. Biol. Eng., 11 :447, 1973.
J.

[ 12a] Brecher, George,

M.D. Evaluation of electronic red blood cell counter, Am.

Physiol., 1439: 1449, 1997.

[ 13a] Prez, A. Gonzlez, R.C.An Iterative Thresholding Algorithm for Image Segmentation, IEEE Trans. Pattern Anal. Machine Intell., Vol. PAMI-9, 6, 742:751,

1987. [14a] Coster M., Chermant, J-L., Prcis Dnalse Dimage dition du centre National de la recherche scientofique, Paris. 1985. [lsa] E.C. Hildret, The detection of intensity changes by computer and biological vision systems. Comp. Vis. Graph. Image Proc. 22: 1-27. 1983

REFERENCIAS

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[2i]Becton Dickinson.

[3i] Somatic Cells Counters.

wiwebnz.com/

[5i] Gramidor Biomedical Services and Supplies.

httn:/'www.gramidoI-.co.uk;

107

Referencius

[ 1c] Cuadro sinptico, composicin de lafase celular de la sangre.

[Id] Forma en que se agita la sangre y el liquido de disolucin.

[2d] Histograma de clulas blancas, obtenido con MATLAB 5.2. [3d] Histograma de clulas rojas, obtenido con MATLAB 5.2.

[4d] Erosin de una imagen.

[5d] Vecindad inmediata de unpixel. [6d] Interfase grfica de CONCELSAN.

[7d] Interfase grfica de CONC.

[8d] Interfase grfica de COBLA. [9d] Interfase grfica de MORFOLOG.
[ 1fl Fotografias de tres regiones diferentes en un frotis. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[2fl Pipetas de Thomapara glbulos rojos y blancos. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[3fl Eritrocitos en la cmara de Neubauer. Laboratorio de Biofisica UAM-I

108

REFERENCIAS

[4fl Microscopio Microlux MTX. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[5fl Microjeringa. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[6fl Pipetas automticas. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[7fl Cmara de Nuebauer y cubre-objetos. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[8fl Cmara de video CCD. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[9fl Eritrocitos fuera de foco. Laboratorio de Biofisica UAM-I

[ 1O f ] Fotografa de todo el equipo necesario este trabajo. Laboratorio de Biofisica U A " 1 en

109

Refirencius

110