UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

FACULTAD DE MEDICINA ALBERTO HURTADO DEPARTAMENTO ACADEMICO DE TECNOLOGA MDICA PREGRADO EN TECNOLOGA MDICA
INSTRUMENTOS Y EQUIPOS DE LABORATORIO II

GUIA DE PRACTICAS DE INSTRUMENTOS Y EQUIPOS DE LABORATORIO II

2013-I LIMA-PER

INTRODUCCION
El laboratorio clnico contribuye en la prevencin, diagnstico y tratamiento de diversas patologas. En el se congregan disciplinas como, Qumica Clnica, Hematologa, Inmunologa y Microbiologa, cada una de las cuales se vale de una serie de principios, procedimientos, tcnicas, metodologas, empleando diferentes materiales, instrumentos y equipos que aplicados a cabalidad llevan a resultados que constituyen valiosos recursos en la atencin mdica. No nos extraa entonces que el curso de instrumentacin y equipos en laboratorio, se incluya en la currcula por ser uno clave en la formacin de los futuros tecnlogos mdicos, el cual busque por sobre todo la familiarizacin con los instrumentos y equipos de uso en el laboratorio, as como el desarrollo de un pensamiento critico, fomentando a la vez el trabajo en equipo. En este curso se expone el por que y como se emplean los materiales, reactivos e instrumentos en un ensayo o determinacin de un analito, las potencialidades y limitaciones de los diferentes equipos para que as los alumnos logren asumir con criterio los problemas analticos, basndose en la aplicacin de fundamentos tericos que se consoliden en la experiencia durante las practicas. En la actualidad contamos con instrumentos algunos mas complejos que otros y la automatizacin ya es una realidad en las diferentes reas del laboratorio, sin embargo no se puede trabajar con equipos automatizados si no se comprende las bases de su funcionamiento. Si bien es cierto en el siglo XXI, las pruebas de laboratorio pueden resultar sencillas, lo complejo e interesante es comprender la esencia de la tecnologa, los principios fsicos, qumicos, biolgicos que se aplican en cada anlisis, dado que la tecnologa no es mas que la aplicacin de la ciencia.

l que no sabe lo que est buscando no comprender lo que encuentra Claude Bernard

INDICE
Prctica N 1: Espectrofotometra. Equipos automatizados Microlab 200 Prctica N 2: Espectrofotometra. Preparacin de curvas de calibracin. Parte I Prctica N3: Espectrofotometra. Preparacin de curvas de calibracin. Parte II Prctica N 4: Automatizacin en Hematologa Prctica N 5: Automatizacin en Qumica Clnica Prctica N 6: Espectrofotometra. Casos prcticos y aplicaciones Prctica N 7: Automatizacin en Banco de Sangre Prctica N 8: Automatizacin en coagulacin Prctica N 9: Potenciometra Prctica N 10: Inmunocromatografia Prctica N 11: Enzimoinmunoensayos: ELISA no competitivo Prctica N 12: Enzimoinmunoensayos: ELISA competitivo Prctica N 13: Fijaciones y coloraciones en el laboratorio clnico y anatoma patolgica Prctica N 14: Cromatografia em papel /TLC Prctica N 15: Electroforesis de protenas

PAUTAS PARA EL INFORME DE PRACTICA DE LABORATORIO

Hoja de datos o cartula
Contiene al menos el nombre completo, cdigo del alumno, titulo de la prctica, nombre del curso, ciclo y ao.

Introduccin
Contiene los principios tericos, entre otros conceptos generales, y resumir los fundamentos lgicos para la realizacin del mismo y se indicara el objetivo y se presenta el tema de la prctica.

Material y Mtodos
Se identificarn los mtodos, aparatos (resear el nombre del fabricante y su direccin entre parntesis), y los procedimientos utilizados con detalle suficiente como para permitir a otros profesionales reproducir los ensayos. Se facilitarn las referencias de los mtodos, incluidos los mtodos estadsticos (consultar en referencias bibliograficas) y se suministrarn referencias y breves descripciones de los mtodos que aunque ya estn publicados no sean muy conocidos; se describirn los mtodos nuevos o sustancialmente modificados y se darn las razones para utilizarlos, evaluando sus limitaciones. Se identificarn con precisin todos los reactivos y productos qumicos utilizados, incluyendo los nombres genricos y concentracin utilizados. As mismo se describirn como fueron realizados los ejercicios durante la sesin prctica, la forma de realizar los clculos y como se obtuvieron los resultados para cada variable cuando amerite.

Resultados
En el texto, las tablas y las figuras, los resultados se presentarn en un orden lgico. No se debe repetir en el texto la informacin de las tablas o figuras; se destacarn o resumirn slo las observaciones relevantes obtenidas durante la prctica.

Discusin y conclusiones
Se comenta lo aprendido, se discuten los resultados obtenidos. En este se destacarn los aspectos nuevos y relevantes de la prctica, as como las conclusiones que de ellos se derivan. Hay que evitar repetir de forma detallada informacin u otro material ya facilitado en la Introduccin o en el apartado de resultados.

Las conclusiones se vincularn a los objetivos de la prctica y se evitar realizar afirmaciones no cualificadas y conclusiones que no estn plenamente respaldadas por los datos. Se deber evitar en particular hacer declaraciones sobre los beneficios econmicos y los gastos, a menos que su prctica incluya informacin y anlisis econmicos. Hay que evitar reclamar prioridad y aludir a un trabajo que an no est terminado. Se establecern nuevas hiptesis cuando estn claramente justificadas. Cuando sea conveniente se incluirn recomendaciones.

Cuestionario
Desarrolle adecuadamente las preguntas indicadas en la gua o en prctica.

Referencias bibliogrficas.
Indique el material consultado. Las referencias bibliogrficas se redactarn siguiendo las Normas de Vancouver. http://www. upch.edu.pe/vrinve/doc/nvanco.htm Artculos: Primero debe aparecer el nombre del autor o autor corporativo, colocando el apellido de cada autor seguido de la inicial del nombre, pueden citarse hasta seis autores, separados por comas; si son mas de seis se anotarn los tres primeros y se agregar "et al", se debe colocar un punto al final de la inicial del nombre del ltimo autor y a continuacin se citar el ttulo del artculo en el idioma de origen terminando en punto seguido. A continuacin el nombre de la Revista (en abreviatura reconocida internacionalmente) y el ao de publicacin seguido de un punto y coma, luego el nmero del volumen seguido del nmero de la publicacin entre parntesis luego dos puntos, finalizando con las pginas en que aparece el artculo y un punto final. Ejemplo

Rey de Castro J, Vizcarra D. Frecuencia de sntomas del Sndrome Apnea

hipopnea del sueo e insomnio en mdicos de una clnica privada peruana. Rev Med Hered 2003; 14(2):53-58. Opcionalmente, se admite la omisin del nmero en las revistas con

paginacin consecutiva para los nmeros dentro de un volumen Ejemplo:

Rey de Castro J, Vizcarra D. Frecuencia de sntomas del Sndrome Apnea

hipopnea del sueo e insomnio en mdicos de una clnica privada peruana. Rev Med Hered 2003; 14:53-58.

Libros: Autor y/o coautores (presentados en igual forma que para los artculos originales), ttulo del libro, nombre de la ciudad donde se edit el libro, nombre de la Editorial, punto y coma, ao de publicacin, punto, colocar letra P, dos puntos y el nmero de las pginas consultadas. Ejemplo:

Jimnez SA. Interpretacin clnica del electrocardiograma. 3ra edicin.

Bucaramanga. Publicaciones UIS; 1995. P: 87. Captulos de libros, folletos o similares: Primero debe aparecer el nombre del autor o autor corporativo, colocando el apellido de cada autor seguido de la inicial del nombre, pueden citarse hasta seis autores, separados por comas; si son mas de seis se anotarn los tres primeros y se agregar "et al", se debe colocar un punto al final de la inicial del nombre del ltimo autor y a continuacin se citar el ttulo del artculo en el idioma de origen terminando en punto seguido y luego la preposicin " En: ", seguida del nombre del Autor y/o coautores (presentados en igual forma que para los artculos originales), ttulo del libro, ciudad donde se edit el libro, nombre de la Editorial, punto y coma, ao de publicacin, punto, colocar letra P, dos puntos y el nmero de las pginas consultadas Ejemplo:

Addison RG, Blonsky ER. Pain. En: Conn's Current Therapy, Rakel ER.

W.B. Saunders Company, Philadelphia; 1988. P: 1-5. Tesis: Nombre del autor en igual forma que para los artculos. Ttulo del trabajo, punto seguido, especificar el grado optado, punto seguido. Ciudad y pas donde se sustent, separados por una coma, dos puntos y la Universidad de procedencia, una coma, el ao, punto seguido, luego el nmero de pginas, seguido de la abreviatura pp.

Ejemplo:

Duda F. Gota: Morbilidad y Mortalidad. Estudio retrospectivo en pacientes

hospitalizados del Hospital Cayetano Heredia. Tesis de Bachiller. Lima, Per. Universidad Peruana Cayetano Heredia, 1990. 59 pp.

Pginas Web: Las pginas electrnicas nombradas en las referencias bibliogrficas deben estar acompaadas de la fecha en la cual se consultaron.

Family Health International. Los hombres y la salud de la reproduccin. En: 1998 Volumen 18. http://www.fhi.org/sp/networks/sv18-

Network en Espaol

3/index.html (Acceso el 17 de noviembre de 2003).

La presentacin del informe, orden, limpieza, apreciacin critica y discusin de sus resultados sern consideradas en la calificacin. Las hojas deben estar numeradas, ser iguales y estar correctamente editadas. Todos los informes deben de ser subidos en el EVD dentro del plazo establecido. NO se recibirn informes impresos ni fuera de fecha.

PARA TENER EN CUENTA:

Las prcticas se iniciaran a la hora indicada en los horarios con una tolerancia de 5 minutos una vez iniciada la misma. No se permitir el ingreso al laboratorio a los alumnos que no tengan mandil ni guantes.

El alumno deber de traer su gua de prctica en cada sesin del laboratorio que se imparta. Se deber mantener una adecuada disciplina durante la estancia en el laboratorio. Se debe asistir a la prctica en el grupo al que corresponde A o B. Todos los objetos personales deben quitarse de la mesa de trabajo. Esta prohibido comer, beber, fumar y en general llevarse cosas a la boca en el laboratorio.

Estar atento a las instrucciones del docente. Los materiales se entregaran a cada mesa de trabajo y los integrantes se harn responsables por l. En el caso de que el experimento no resultara como est planeado, el alumno deber investigar, consultar y agotar todas las posibilidades para lograr un desarrollo correcto. Si no se lograra el objetivo de la prctica, debe preguntar al docente, l le explicara en donde est la falla y la manera de corregirla. De esta forma se lograr desarrollar una actitud crtica hacia la materia, un mejor aprovechamiento de clase prctica y un apoyo mayor a la clase terica.

Cualquier accidente debe ser notificado de inmediato al docente o al auxiliar del laboratorio Si alguna sustancia entra en contacto con tu piel u ojos, lava la zona con abundante agua y avisa al profesor. Si tienes el pelo largo, recgelo para evitar que se prenda con las llamas o se enrede en los aparatos. Dejar ordenadas y limpias las mesas al terminar la practica. Una vez culminada la prctica se presentaran los informes en la siguiente sesin prctica. No se aceptaran informes fuera de fecha.. Todos los informes de prctica se suben al EVD. NO SE ACEPTARAN INFORMES IMPRESOS.

PRACTICA N 1 ESPECTROFOTOMETRIA: Microlab 200 y Hera

I COMPETENCIAS Al culminar la practica el alumno: Maneja e identificara los componentes del Espectrofotmetro y fotocolormetro Programa el fotocolormetro y el espectrofotmetro. Aplica y conocer la importancia de la Ley de Lambert y Beer. II GENERALIDADES Las tcnicas analticas y la instrumentacin representan las bases de todas las mediciones hechas en un laboratorio moderno de qumica clnica. La mayor parte de las tcnicas se ubican en una de las disciplinas bsicas: Espectrofotometra Luminiscencia Mtodos electro analticos Cromatografa El primer trmino: Espectrofotometra sugiere la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de la longitud de onda de la radiacin. Regiones del Espectro ptico: Regin UV Visible IR cercano IR medio Intervalo de longitud de onda 180 380 nm 380 780 nm 0.78 2.5 um 2.5 50 um

Disciplinas que se irn revisando a lo largo del curso.

Todo analito molecular es capaz de absorber ciertas longitudes de onda caracterstica de la radiacin electromagntica. LEYES FUNDAMENTALES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA Ley de Lambert.- Cuando un rayo de luz monocromtica atraviesa un medio absorbente, su intensidad (I) decrece en forma exponencial al espesor del medio (b).

Ley de Beer.- La intensidad de un rayo de luz monocromtica

(I) disminuye

exponencialmente conforme aumenta la concentracin (c) del material absorbente. Ambas leyes pueden fusionarse en una sola ley conocida como la Ley de Lambert y Beer Log I0 / I = A = a bc Log Io/I = (A) = Absorbancia o Densidad ptica (O.D.). I0 = rayo incidente I = rayo trasmitido a = constante: ndice de absorbancia o "coeficiente de extincin" para el compuesto particular b = Longitud de la cubeta c = Concentracin La absorbancia de una solucin 1 M de una sustancia a una longitud de onda determinada, medida en una cubeta de 1 cm de paso, sera numricamente igual a am. Ntese que la absorbancia es funcin lineal de la concentracin: A = amcl Nota: La ley de Beer no se cumple en todas las sustancias, especialmente a concentraciones elevadas. Absorbancia: Cantidad de luz que es absorbida por la sustancia a determinar y que se mide en unidades de absorbancia. Transmitancia Log %T = 2 Absorbancia

III PARTE PRCTICA 1) Cada mesa recibir un recuadro en el cual este escrito un componente del espectrofotmetro. Entre los grupos colocaran cada componente en un esquema de funcionamiento en la pizarra, y comentaran acerca del elemento que aportaron. 2) Por mesas se revisara el Microlab 200 y el Hera componentes, caractersticas tcnicas, programacin.

IV REFERENCIAS

Bishop M, Fod y P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. Mxico; 2007.P: 91-96

Universidad Nacional de Colombia. Instrumentos para la medida de Absorcin de luz. Se encuentra en Network en Ingls: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Cap05/05_01 _01.htm (Acceso 25 de Noviembre del 2009)

New Mexico State University Department of Chemistry and Biochemistry. Spectronic. 20. Se encuentra en Network en Ingls: http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/Spectronic_20.html (Acceso del 08 de diciembre del 2009)

Thermospectronic. Operators Manual Spectronic 20+. Se encuentra en Network en ingls: http://www.cienytec.com/PDFS/Espec_SPEC20_OpMan_ing.pdf. (Acceso el 20 de Noviembre del 2009)

Universidad de Cdiz. Determinacin espectrofotomtrica. Se encuentra en network en Espaol: http://www2.uca.es/grup-invest/corrosion/integrado/P2.pdf. (Acceso el 20 de febrero del 2010) ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS
ava

Austin Community College. Laboratory Manual. 12

edicin. 2006.

Absorbance measurements with Spectronic 20D. En network en Ingls: http://www.austincc.edu/biology/labmanuals/140612th/12th1406labappD.pdf Camp U, Seely O. Operating instructions for the Spectronic 20 D. Se encuentra en network en Ingls: http://www.csudh.edu/oliver/che230/labmanual/spec20d.htm

Wellesley College.

The standard curve and Analog Spec instructions. Se

encuentra en network en Espaol: http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/standardcurve.html http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/analogspec20instructions.ht

Universidad Nacional de la Plata. Colimetra visual. Mtodos pticos de anlisis. Se encuentra en network en Espaol:

http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/instrumental/2009/tp5_visual-spectronic.pdf

PRCTICA N 2 y 3 CURVAS DE CALIBRACIN

I COMPETENCIAS: Al finalizar la practica el alumno:

Aplica y conoce la importancia de la Ley de Lambert y Beer, y la cintica de Michaelis y Menten. Elabora curvas de calibracin: enzimas, metabolitos. Realiza el clculo de regresin lineal manual y con software Comprende la aplicacin de la regresin lineal Determina la linealidad de un mtodo.

II GENERALIDADES Una curva de calibracin se construye a partir de diferentes concentraciones o actividades de un analito y su respuesta frente a una reaccin. Las curvas de calibracin pueden ser lineales o no lineales. Este grfico tiende a ser lineal, mientras progrese segn la ley de Lambert-Beer. Aplicando la ley de Lambert- Beer, la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin. Por ejemplo: en muchas determinaciones colorimtricas se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y la cantidad o actividad del analito que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 2.5 g/dl de protenas en una solucin genera la aparicin de un color azul plido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 5.0 g/dl de protena dar lugar a que la solucin se torne azul ms oscuro y as sucesivamente. Entonces la relacin entre intensidad de color y concentracin de la sustancia es proporcional y as, si se grafica el valor de intensidad de color medido con un espectrofotmetro o fotocolormetro que nos dan datos de absorbancia en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia obtentremos una recta que sigue la ley de Lambert-Beer. Como para la elaboracin de curvas de calibracin se trabaja con datos reales, los grficos que se obtienen no son tan ideales, pero esta situacin no es un obstculo ya que dentro de ciertos valores es posible trazar la recta ms probable que une una serie de puntos. Para definir la curva de calibracin que mejor representa la relacin entre absorbancia (A) y la concentracin se pueden usar clculos de regresin lineal,

determinando la ecuacin de la recta:

y= mx+b
En donde: y= Absorbancia m= Pendiente x= Concentracin b= intercepto.

La determinacin de estos valores puede realizarse manualmente, o utilizando softwares como Microsoft Excel o una calculadora que tenga incluida la funcin de regresin lineal para ajustar la recta la cual tambin se conoce como curva de trabajo.

III PARTE PRCTICA: 1.- Para elaborar una curva de calibracin con las siguientes concentraciones:

5x107 ng/dl 250 mg/L 8 x 105 ug/L 0.0125 g/dl 100 mg/dl 2 mg/ml tratando de

Usted dispone 5500ul del estndar de 4 g/l. Prepare las diluciones, diluciones de 4 ml.

emplear en lo posible diluciones seriadas buscando tener volumen final en todas las Lea en el espectrofotmetro a la longitud de onda apropiada. Elabore la curva de calibracin y haga el clculo de regresin lineal. Por ultimo, determine la concentracin para una muestra desconocida que posee una absorbancia de 0.250 2.- Para la elaboracin de la curva de calibracin de protenas Biuret, se realizaron diluciones del estndar obtenindose las siguientes concentraciones. Se ley a 540 nm y se obtuvo: Concentracin ( g/dl) 0 2.5 5.0 7.5 10 15 Absorbancia 0.025 0.065 0.127 0.186 0.244 0.293

a) Graficar la curva de calibracin de protenas b) Calcular la linealidad c) Calcular la pendiente d) Calcular el factor e) Calcular la Concentracin de las siguientes muestras, que fueron leidas a 540nm Utilizando el factor y utilizando la pendiente a. 0.124 b.0.155 c.0.210 c.0.104

3.- Para la elaboracin de la curva de calibracin de un analito X, se realizaron diluciones del estndar obtenindose las siguientes concentraciones. Se ley a 405 nm y se obtuvo los datos en el recuadro.

Concentracin g/L

Absorbancia 0.032 0.128 0.240 0.331 0.426 0.587 0.618 0.724 0.759

Graficar la curva de calibracin del analito Calcular la linealidad Calcular la pendiente Calcular el factor Calcular la Concentracin de las siguientes muestras, que fueron leidas a 405nm Mencione el color de la solucin en estudio Utilizando el factor y utilizando la pendiente a.0.13 d.0.754 b.0.185 c.0.298

0.0 20 40 60 80 100 120 140 160

3.- Construya una curva de calibracin de glucosa en suero con los siguientes datos: Concentracin (mg/dl) 0 50 100 150 250 500 800 Absorbancia 0 0.05 0.1 0.150 0.250 0.500 0.600

A partir de ella: a) Calcule la concentracin de glucosa en un suero que da una lectura de 0.125 b) Qu hara con un suero que diera una lectura de 0.7? Interpolara la Lectura sin ms o lo diluiras? c) Cul se considerara el limite de linealidad con arreglo a esta curva de calibracin? Por qu? 4.- Tiene 5 tubos que muestran las siguientes actividades de una enzima X, lea en el fotocolormetro a 505 nm , anote la absorbancia y conviertala a transmitancia.

Actividad (U/L) 0 10 40 100 150

Absorbancia

% Transmitancia

a) Mencione el color de la reaccin b) Elabore la curva de calibracin en papel milimetrado (Abs vs act) y en semilogarimico (%T vs Act) c) Que observa en los grficos? A que se debe la diferencia? IV REFERENCIAS

Bishop M, Fody P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. Mxico; 2007.P: 91-96

Universidad de Cdiz. Determinacin espectrofotomtrica. Se encuentra en network en Espaol: http://www2.uca.es/grup-invest/corrosion/integrado/P2.pdf. (Acceso el 20 de febrero del 2011) Coto E. Facultad de Ciencias exactas. Universidad de buenos Aires. Curvas de calibracin.Se encuentra en network en Espanol: http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm

( Acceso el 03 de marzo del 2011)

ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS

Wellesley College. The standard curve and Analog Spec instructions. Se

encuentra en network en Espaol: http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/standardcurve.html http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/analogspec20instructions.ht

PRACTICA N 4

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA
I COMPETENCIAS Al concluir la practica el alumno:

Reconoce los principios de medicin que emplean los autoanalizadores hematolgicos de 3 y 5 diferenciales. Interpreta los parmetros del CBC, dispersogramas e histogramas medidos y calculados por los autoanalizadores hematolgicos de uso ms frecuente (Coulter, ADVIA, Cell Dyn y Sysmex).

Relaciona los datos proporcionados por el autoanalizador vs la revisin del frotis sanguneo. Discute sobre los criterios para la validacin automtica de los resultados obtenidos por los autoanalizadores hematolgicos.

II GENERALIDADES El trmino automatizacin es la tcnica, mtodo o sistema para hacer funcionar o controlar un proceso mecnico o productivo por medios automticos como dispositivos electrnicos. Cuando se aplica al laboratorio se refiere a un mtodo mecnico para llevar a cabo procesos analticos, es as que muchas etapas que se llevaban a cabo de forma manual ahora se pueden realizar automticamente, lo que permite al profesional centrarse en tareas que no posibles automatizar incrementando de esta manera tanto la eficiencia como la capacidad. En el laboratorio clnico el avance de la automatizacin se traduce en: Resultados ms rpidos Menores errores Datos altamente reproducibles Sistemas prcticos para el control de la calidad Contribucin a la bioseguridad Utilizacin de la informtica En el rea de hematologa, como sucede en las otras reas, la etapa analtica es la ms automatizada. El inicio del camino a la hematologa automatizada se remonta a la dcada de los 50 con el desarrollo de instrumentos para realizar hemogramas, cuando los hermanos Coulter, Wallace y Joseph, patentan su equipo basado en el mtodo de la impedancia elctrica, nicamente para contar leucocitos y eritrocitos. Desde entonces diversas casas comerciales fueron mejorando y aadiendo nuevas metodologas para la medicin de los distintos parmetros hematolgicos y en la actualidad, en nuestro pas se cuenta con una variedad de

instrumentos que han llegado a los laboratorios, desde hace unos 15 aos, y contamos tanto con equipos de tres partes en su diferencial, como algunos de los ms desarrollados de la industria, con 23 parmetros, incluyendo un diferencial de cinco partes, obtenido con luz lser. Existen diversos modelos con principios los cuales utilizan como mtodo de anlisis la impedancia, la radiofrecuencia, cuya evaluacin no ha sido ampliamente conocida, como tambin algunos con canales de lobularidad, citoqumica, dispersin y fluorescencia. Tambin presentan diferentes sistemas de alarmas de sospecha por hallazgos anormales en las muestras, adems la posibilidad de incluir sistemas de control de calidad intralaboratoriales que permiten manipulacin de datos por anlisis estadstico, en muestras y controles. PRINCIPIOS Los sistemas de recuento clulas en estos analizadores se basa en la medida del tamao, complejidad, propiedades fsicas de las clulas suspendidas en medio liquido de acuerdo con uno de siguientes principios. Impedancia - Conductividad elctrica Citometra de flujo - Lser - Fluorescencia - Foco hidrodinmico y Absorcin. III PARTE PRACTICA 1.- Revisaremos los principios de medicin de cuatro autoanalizadores: Coulter Gen-S, Advia 120, Sysmex XE-2100 y Cell Dyn 3700. 2.- Analizaremos los histogramas de RBC, WBC, plaquetas y los patrones de dispersogramas de los equipos Advia 120, Sysmex XE 2100y Cell Dyn 3700.

IV CUESTIONARIO
1. Haga un comentario respecto a las limitaciones de los actuales analizadores hematolgicos. 2. Seale cuales pueden ser las causas de error en el recuento automatizado. 3. Cuales serian las consideraciones primarias que tendra en la seleccin de un autoanalizador hematolgico para su laboratorio?

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Lehner, J., Greve, B., (2007). Automation in Hematology [versin electrnica]. Review Article. Transfus Med Hemother, 34, 328339. 2. CLSI. (2007). Document H20 A2: Reference Leukocyte (WBC) Differential Count (Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods, second edition. Pennsylvania. 3. Villarrubia, J. (2002). Avances en el diferencial leucocitario automatizado. Criterios para la revisin del hemograma y sistemas expertos de validacin automtica [versin electrnica]. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl.1. 4. Molero, T., Castellano, L., De la iglesia, S., Santana, A. (2002). Nuevos ndices Plaquetarios: Valor en el Diagnstico y trascendencia en las decisiones teraputicas [versin electrnica]. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 1. 5. Jou, J.M. Anlisis automatizado de las poblaciones eritrocitarias: Su aplicacin en el diagnstico de las anemias. (2002). Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl.1. 6. Katsuyasu S, Yasuyuki S, Yukako M et al. Clinical utility of new parameters provided by XE 2100 RET channel. Sysmex Journal International .2007;7 (2): 81-94

Manuales:
Gua preparatoria para entrenamiento de los analizadores hematolgicos automatizados Sysmex Serie XE. (2005). Beckman Coulter. ACV Differential Technology. (2000).

ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS

Citometra de Flujo. http://www.citometriadeflujo.com/

PRACTICA N 5

AUTOMATIZACIN EN QUIMICA CLINICA

I COMPETENCIAS Al finalizar la practica el alumno:

Entiende las fuerzas impulsadoras detrs del desarrollo de los analizadores automatizados. Explica los pasos en el anlisis automatizado. Nombra mtodos bsicos para el anlisis de muestras que se emplean en los analizadores automatizados en Qumica clnica. Proporciona ejemplos de analizadores en Qumica clnica. Compara los enfoques de los instrumentos. Comprende automatizado. las consideraciones en la seleccin de un analizador

II GENERALIDADES En el laboratorio moderno de Qumica Clnica se emplea un alto grado de automatizacin, es as que muchos procedimientos que antes se realizaban manualmente ahora ya estn automatizados, permitiendo que los profesionales se enfoquen en puntos clave en los que la automatizacin no ha calado, como la fase preanaltica: preparacin de paciente, transporte y conservacin de los especimenes, dado que ningn resultado; por mas instrumento de ltima generacin que se emplee en su anlisis, tendr mas calidad de la que posee la muestra con la que se trabajo. El control de calidad y la validacin que forman parte de la fase posanalitica son tambien puntos cruciales en los que es imperante el juicio de un profesional. De las tres fases del proceso analtico es la fase analtica la ms automatizada en la actualidad haciendo creciente el inters en incrementar la automatizacin de los otras fases. Ya conocemos que en el anlisis clnico, la automatizacin es al mecanizacin de los pasos en un procedimiento analtico. Los fabricantes disean sus instrumentos para imitar tcnicas manuales. III PARTE PRCTICA 1.-El anlisis automatizado comprende una serie de etapas que se pueden listar, para esto por grupos recibir un sobre con tarjetas en las que figuran en desorden los pasos del anlisis automatizado. Con los integrantes de su equipo, arme un flujograma con el material proporcionado. En el mismo sobre se adjuntan imgenes que debe de asociar cada paso. 2.- Cada equipo tomando como base el flujograma armado, comentara los aspectos observados en sus rotaciones hospitalarias en cada uno de los pasos del anlisis

automatizado. Por ejemplo: Como se lleva acabo la identificacin de muestras en el laboratorio de su sede de prctica, este proceso, esta automzatizado o no. 3.-Se comentara cada paso del anlisis automatizado, las caractersticas, principios, para la obtencin de una medicin y en ultima instancia el resultado en los analizadores elegidos ya que tienen componentes que representan ya sea caractersticas comunes empleadas en la instrumentacin en Qumica Clnica o un mtodo nico de automatizar un paso.

IV CUESTIONARIO 1. Elabore un cuadro resumen de las caractersticas de por lo menos 5

analizadores de Quimica clnica.

2. Menciones las consideracines primarias en la seleccin de un analizador de

qumica automatizado. 3. Qu tipo de analizadores ofrecen capacidad de acceso aleatorio? 4. Elabore un cuadro que contenga la siguiente informacin de un proceso laboratorial: Sistema de ingreso de solicitudes, identificacin de la muestra, Sistemas de preparacin y entrega de la muestra Manejo y transporte del espcimen desde la preanalitica al instrumento, Detallar marca del instrumento, modelo, serie Ingreso, transporte y cargado de la muestra en el equipo Sistema de cargado, transporte y almacenamiento de reactivos en el equipo. Fase de reaccin qumica y mtodos de medicin Sistema de validacin de resultados, control de calidad Transmisin de resultados e impresin del reporte.

Seale en cada punto si el proceso es automatizado o manual. 5.- En relacin al articulo Modelo informtico para la gestin de los sistemas analticos del laboratorio clnico, seale que elementos serian necesarios para aplicarlo en un laboratorio de qumica clnica.

V REFERENCIAS

Bishop M, Fody P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. 2007. Henry, John Bernard, El laboratorio en el diagnstico clnico, Madrid; Marbn; 2005. 2 v.

Anderson, Shauna C; Cockayne, Susan, Qumica clnica, Mxico, D.F; Interamericana McGraw-Hill.

ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS

http://www.sysmex-europe.com https://www.mylabonline.com/products/ http://www.orthoclinical.com http://www.irisdiagnostics.com http://www.medical.siemens.com http://www.sediglac.org/congresos/11congreso-7/textos/PerezMartinezA01ii.pdf

PRACTICA N 6 ESPECTROFOTOMETRIA: CASOS PRACTICOS Y APLICACIONES

I COMPETENCIAS

Comprende las aplicaciones de la espectrofotomtrica en el laboratorio clnico. Aplica los conocimientos previos en espectrofotometra en la resolucin de casos prcticos.

II GENERALIDADES La espectrometra de Absorcin molecular UV-visible tiene mltiples usos en el mbito de la bioqumica clnica, entre otros: La medida de las molculas en disolucin. Identificacin de longitudes de onda tiles. Valoracin de reacciones qumicas. Determinacin de caractersticas estructurales de macromolculas. Medicin de concentraciones. la aplicacin ms importante y frecuente, puede realizarse de

Esta ltima es diferentes maneras:

1) Se pueden representar los valores de absorbancia de distintos calibradores en funcin de su concentracin que es conocida. La grafica resultante es la curva de calibracin. Una vez medida la absorbancia de la muestra analizada. La curva permite hallar la concentracin correspondiente. Es un procedimiento grfico, aunque tambin hay ajustes electrnicos. 2) Segn la ley de Lambert Beer la absorbancia es funcin de la concentracin mediante el coeficiente de absorcin molar () y el recorrido de la radiacin (l) entonces tenemos: A= .l.c
donde . l es la pendiente de la curva de calibracin.

3) Identificacin de longitudes de onda tiles 4) Valoracin de reacciones qumicas. 5) Determinacin de las caractersticas estructurales de las macromolculas. III PARTE PRACTICA EJERCICIOS A.- Se presentarn algunos ejercicios de repaso, para despus resolver algunos casos prcticos. 1.-Convertir los siguientes valores de absorbancia en tanto por ciento de transmitancia

a. 0.375 absorbancias. a. 33.6

b. 1.325

c. 0.012

2.-Convertir los siguientes valores de tanto por ciento de transmitancia en valores de b. 92.1 c. 1.75 Calcule:

3.-Una solucin acuosa de KMnO4 (pM 157) de concentracin 7.5 x 10 -5M tiene una absorbancia de 0.502 medida a 485 nm en celda de 1.5 cm. unidades respectivas. 4.-Del anlisis de los siguientes resultados experimentales, compruebe si hay o no cumplimiento de la ley de Beer, C (M) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 %T 30 40 50 60 70 a) la absortividad expresada en dos formas diferentes, indicando en cada caso las

5.-Una solucin de una muestra coloreada que responde a la ley de Beer, muestra una transmitancia de 80.0% cuando se mide en una celda de 1,00 cm de longitud. a) Calcule el % T para una solucin de doble concentracin en la misma celda. b) Cul debe ser la longitud de la celda para obtener la misma transmitancia (80%) en el caso de una solucin cuya concentracin es dos veces la original? 6.- En la preparacin de una curva de calibracin para anlisis espectrofotomtrico, se obtuvieron los siguientes datos Concentracin (mgL-1) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Io 98 97 100 99.5 100 100 100 99.0 98.2 100 100 I 98 77.2 63.5 50 41.3 33.5 27.9 23.4 20.3 18.1 16.4

Se sigue la ley Beer? Que concentracin corresponde a una absorbancia de 0.42? 7,- Una disolucin que contiene 10,0 ppm (1 ppm = 1 mg / litro) de cierto material coloreado que es medida con un espesor ptico de 1,00 cm, presenta la absorbancia y

el porcentaje de transmitancia (% T) que se muestran en la tabla. Calcular los valores que faltan en la tabla. Se supone que el sistema sigue la ley de Beer. Concentracin (ppm) 10 Paso ptico (cm) 1 4 B.- Durante la practica se le proporcionara una serie de casos a desarrollar. V REFERENCIAS %T 38.9 0.410 Absorbancia

Fuente X, Castieiras M, Queralto J. Bioqumica clnica y patologa molecular. Vol I , Editorial Reverte. 1998. 214-216 Bishop M, Fody P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. Mxico; 2007.P: 91-96

Universidad de Cdiz. Determinacin espectrofotomtrica. Se encuentra en network en Espaol: http://www2.uca.es/grup-invest/corrosion/integrado/P2.pdf. (Acceso el 20 de febrero del 2010)

Universidad de chile. Espectofotometria aplicada. Se encuentra en network en espaol: http://www1.ciq.uchile.cl/login/index.php ( Acceso el 28 de Marzo del 2010)

PRACTICA N 7
AUTOMATIZACIN EN BANCO DE SANGRE

I COMPETENCIAS Al finalizar la practica el alumno:

Conoce la organizacin por reas de un Banco de sangre. Proporciona ejemplos de analizadores empleados en banco de sangre. Compara los enfoques de los instrumentos. Comprende la base del funcionamiento de separadores celulares.

II GENERALIDADES Un banco de sangre, es el establecimiento autorizado para obtener, recolectar, analizar, conservar, aplicar y proveer los componentes de la sangre humana. Los centros de Hemoterapia y banco de sangre pueden ser de tipo I o II, estos ltimos cuentan con las siguientes reas:

rea de recepcin y atencin de solicitudes transfusionales. rea de reconocimiento de donantes y extraccin de sangre (rea de captacin de donantes; rea de seleccin de donantes). rea de anlisis de sangre (inmunoserologa e inmunohematologa) rea de produccin de componentes sanguneos. rea de conservacin de componentes. Seroteca. rea de preparacin de medios y reactivos para control de calidad.

La automatizacin ya se ha abierto campo en este campo y con la validacin adecuada, las tcnicas y procedimientos, todas las tareas rutinarias de los bancos de sangre eventualmente sern automatizadas, como ya ha sucedido en laboratorio de Bioqumica o hematologa. Es as, que la automatizacin de cada eslabn contribuir en reducir el riesgo de un error. III PARTE PRCTICA 1) Se dar a conocer los principios de la automatizacin en cada rea del Banco de Sangre.

CUESTIONARIO Buscar 2 artculos relacionados con el tema y elaborar un cuadro sinptico de cada uno.

V REFERENCIAS

Ministerio de Salud. Resolucin Ministerial N 1191-2006. Mol J, Fernandez V, Suarez D, Nuez C. Sistema automatizado para el control de donantes de sangre. Rev cubana hematol inmunol hemoter 1998;14(2):107-110

Benavides ME. 2000. Optisystem: Manual de operaciones. Grfica y Cientfica Ltda., Bogot, Colombia. Hurtado C, S Bonard, M Soler, V Mirabet, I Blasco, M Planelles, A De Miguel. 2000. Quality analysis of blood components obtained by automated buffy-coat layer removal with a Top and Bottom system (Optipress II). Haematolgica 85, 390-395.

Del Rey-Pineda G. Aplicacin de nuevas tcnicas de biologa molecular a la virologa. Deteccin de tamizaje en bancos de sangre Gac Md Mx Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004 Malomgr W, Neumeister B. Recent and future trends in blood group typing.Anal Bioanal Chem (2009) 393:14431451 PAGINAS WEB RECOMENDADAS

www.galileoecho.com www.beckmancoulter.com www.inmucor.cor http://www.orthoclinical.com

PRACTICA N 8

AUTOMATIZACIN EN COAGULACIN I COMPETENCIAS Al finalizar la practica el alumno:

Conoce los principios para el desarrollo de analizadores automatizados en el laboratorio de coagulacin. Construye curvas de calibracin para el dosaje de factores de la coagulacin. Conoce ejemplos de Autoanalizadores disponibles en el mercado.

II GENERALIDADES En el rea de Hematolgia: hemostasia del laboratorio clnico realizar pruebas tales como: Perfil de Coagulacin ( TP, TTP, TT, Fib, Plaquetas ) Pruebas de Funcionalidad Plaquetaria (Recuentos, agregacin se pueden

plaquetaria, adhesividad plaquetaria ) Perfil Trombtico ( PC, PS, AT III, Plasmingeno, t PA, PAI, 2 antiplasmina, RPC, Anticoagulante Lpico ) Determinacin de Factores de la Coagulacin ( VI VE )

Pruebas de Biologa Molecular ( FVL, protrombina 20210, CF )

Estas se pueden llevar acabo a travs de diferentes tipos de ensayos: - Actividad Funcional Coagulmetrico (ptico y mecnico) Cromognico - Inmunolgico / Antignico Nefelometra Electroforesis ELISA - Biologa molecular: PCR CROMOGENICO VS COAGULOMETRICO Los ensayos cromognicos son ms especficos, exactos, precisos; son menos susceptibles a las variables preanalticas. Los ensayos coagulomtricos son ms rpidos y baratos. Estn sujetos a interferencia por los niveles de los factores de coagulacin, heparina, warfarina, otros anticoagulantes, as como la presencia del anticoagulante lpico. La dilucin relativamente alta utilizada en los ensayos cromognicos, son considerados como una preocupacin.

Ambos

ensayos

pueden

ser

fcilmente

instalados

en

analizadores

automatizados. III PARTE PRCTICA 1) Se desarrollara un taller que se proporcionara durante la prctica.

IV REFERENCIAS 1. Kordich, Blanco, Cerrato (et al) (2003). Fundamentos para el Manejo Prctico en el Laboratorio de Hemostasia. Grupo CAHT 2. Kitchen, Olson, Preston (2009). Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis. Primera ed. Ed. Wiley Blackwell.

PRACTICA N 9 TOMA DE MUESTRA DE GASES ARTERIALES

I COMPETENCIAS Al finalizar la practica el alumno:

Conoce las condiciones prenaliticas en el estudio de gases arteriales. Comprende las principales fuentes de error en AGA

II GENERALIDADES La medicin de los gases arteriales proporciona informacin til para evaluar y controlar el tratamiento de los pacientes con trastornos metablicos y respiratorios; como todas las mediciones en el laboratorio tambin estn sujetas a errores preanalticos, analticos y posanalticos, una gran parte de estos errores se concentran en la fase pre-analtica, sobretodo durante la toma de muestra, transporte y conservacin. La toma de muestra de sangre arterial se puede llevar a cabo por puncin directa o a travs de catter arterial.
TOMA DE GASES ARTERIALES POR PUNCIN DIRECTA MATERIALES

Jeringa de tuberculina desechable,Tapon de goma. Aguja 25 o 24 g Gasas estriles Anticoagulante ( Heparina de Litio) Guantes de proteccin Solucin antisptica (alcohol)

ZONAS DE PUNCIN

Radial, braquial, femoral, pedia.

PREPARACIN DEL PACIENTE: CIRCULACIN COLATERAL (PRUEBA DE ALLEN) Hay que tener en cuenta que durante la toma de sangre arterial ya sea obtenida por puncin directa o mediante la utilizacin de un catter arterial se puede producir la invasin de la luz arterial la cual puede provocar, formacin de un trombo intramural o aparicin de un hematoma periarterial. Cualquiera de estas complicaciones puede implicar isquemia distal. En consecuencia, es recomendable verificar la viabilidad de la circulacin colateral si se pretende colocar un catter arterial. La prueba de Allen constituye un mtodo sencillo y fiable para comprobarla en la arteria radial. Se pide al enfermo que abra y cierre vigorosamente el puo tras haber

localizado y comprimido la onda de pulso radial y cubital. Tras 5-10 flexiones suele aparecer palidez isqumica palmar. Con la mano del enfermo extendida, se liberar la compresin cubital y se registrar el tiempo necesario para que reaparezca la coloracin palmar habitual. En general, se considera que la circulacin colateral cubital es adecuada si sta reaparece en menos de 15 s.
TCNICA DEL EXAMEN:

Preparar los materiales, si no se cuenta con una jeringa para gasometria es decir ya heparinizada, proceder a cubrir el interior de la jeringa de tuberculina con heparina de Litio, la relacin es 0.1cc de Anticoagulante con cada 1cc de sangre. El paciente realiza una hiperextensin de mueca aproximadamente de 45 grados utilizando algn soporte o apoyo en la mueca por ejemplo una toalla o una almohada. Localizar el sitio exacto de la puncin mediante la palpacin de la arteria elegida con los dedos de la mano. Desinfectar la zona de puncin. Se contina con la palpacin de la arteria con una mano y utilizando la otra para introducir la aguja y avanzar lentamente segn la necesidad del bisel, penetrando la piel a un ngulo de aproximadamente 45 grados en la arteria radial, 60 en la arteria humeral, en 90 en arteria femoral. La penetracin de la arteria puede ser sensible al tacto. La sangre arterial impulsara por si sola el embolo. Retirar la aguja rpidamente despus que la muestra de sangre haya sido obtenida. Hacer presin por lo menos durante 5 minutos para evitar hematoma post puncin. Especial precaucin en pacientes con terapia de anticoagulacin.
PUNCIN CAPILAR

La puncin capilar constituye una forma alternativa de obtener una muestra sangunea susceptible de ser interpretada como si se tratase de una muestra arterial. Suele emplearse en lactantes y nios
TRANSPORTE Y DEPSITO

Entre la extraccin de la muestra sangunea y su anlisis no deben pasar, en condiciones habituales, ms de 10-15 min. En todo momento es imprescindible mantener un hermetismo absoluto. Si se prev que dicho lapso de tiempo ser superior, la muestra arterial debe guardarse en hielo triturado. ANALISIS DE LA MUESTRA La muestra debe analizarse, de ser posible, inmediatamente despus de su obtencin. La variabilidad de los actuales equipos de gases permite realizar una sola

lectura, siempre que la muestra haya sido extrada, manipulada y procesada correctamente, dada la gran reproducibilidad de la tcnica. Se recomienda anotar los resultados obtenidos inmediatamente despus de cada lectura. Para ello, se dispondr de una libreta junto al propio aparato, con objeto de evitar posibles errores de transcripcin posterior. Junto a esto, es muy til, adems, disponer de otra libreta en la que se har constar el mantenimiento efectuado, as como las posibles averas u otras incidencias que pudieran presentarse.

IV CUESTIONARIO 1. Mencione las probables fuentes de error en un AGA 2. Por qu es importante conservar las muestras en hielo, en caso el AGA demore? 3. Describa el principio en el que se basan los analizadores de gases arteriales V REFERENCIAS Bishop M, Fody P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. 2007.Pags.354-360 Wilson K. and Walker J. (eds) (1994). Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 4 Ed. Cambridge University Press.

PRACTICA N 10 INMUNOCROMATOGRAFA
I COMPETENCIAS Al finalizar la practica: Comprende el fundamento del mtodo Conoce las aplicaciones de las pruebas inmunocromatogrficas en el laboratorio clnico. II GENERALIDADES La inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test. Cada vez son ms las aplicaciones de esta tcnica.

En el siguiente esquema se resume el fundamento del mtodo: 1.- La muestra se pone en contacto con la zona del conjugado. Esta lleva impregnada un conjugado formado por un anticuerpo especfico contra uno de los eptopos del antgeno a detectar y un reactivo de deteccin. Si la muestra contiene el antgeno a detectar, ste se unir al conjugado formando un complejo y empezarn a migrar a travs de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarn el conjugado y la muestra sin unirse. 2.- La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo especfico contra otro eptopo del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unin del antgeno y conjugado quedarn retenidos y la lnea se colorear (muestras positivas). Si la muestra no contena el antgeno, el segundo anticuerpo no captura nada y la lnea queda trasparente (muestras negativas). 3.- La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de deteccin. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unir al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta lnea

es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas. TIPOS DE INMUNOCROMATOGRAFIA Competitivo No competitivo

IV CUESTIONARIO 1. Grafique que sucede en una prueba inmunocromatografica para deteccin Ab VIH 2. Elabore un cuadro con las ventajas y desventajas de los test inmunocromatograficos. 3. Comente el article A rapid review of rapid HIV Antibody test

PRACTICA N 11 ENZIMOINMUNOENSAYO NO COMPETITIVO

I COMPETENCIA Al finalizar la practica el alumno: Comprende el principio de los enzimoinmunoensayos, clasificacin, aplicaciones y limitantes en el laboratorio clnico. II GENERALIDADES Desde su presentacin en 1971, los ensayos inmunoenzimticos se han aplicado ampliamente en investigacin bsica, diagnstico clnico y en el campo de la biotecnologa. La adaptacin de la tcnica de ELISA a las placas de microtiter ha sido clave para el desarrollo contnuo de numerosas aplicaciones. Tanto antgenos como anticuerpos pueden ser detectados y cuantificados de forma rpida y especfica. Paralelamente, se ha ido desarrollando la instrumentacin necesaria para poder automatizar al mximo estos ensayos, de forma que se pueden realizar un nmero muy alto de anlisis, en un tiempo corto y con un coste mucho menor al de otras tcnicas analticas. Principio bsico E.L.I.S.A. Al suero problema se le agrega un conjugado que son anticuerpos dirigidos contra anticuerpos humanos o antgenos, los cuales se unirn a una enzima. Las enzimas son capaces de modificar un sustrato en presencia de un cromgeno produciendo un producto coloreado que es detectado visualmente o por un espectrofotmetro. Clasificacin ELISA no competitivo Directo Indirecto Tipo sndwich o captura de Ag Elisa competitivo.

ELISA NO COMPETITIVO Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color. Pasos generales de un ELISA 1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos

3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el posillo. 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del sustrato 9. Unin del sustrato a la enzima 10. Desarrollo del color III PARTE PRCTICA En la sesin prctica se realizara un inmunoensayo no competitivo. 1.- Llenar los siguientes datos dependiendo el ensayo a realizar teniendo como base la explicacin dada al comienzo de la clase: ELISA: Clasificacin: En base a esto se describa: Reactivos a necesitar: Material requerido Muestra: Pasos de la tcnica:

2.- Compare lo descrito por su mesa de trabajo con lo sealado en el inserto del Kit de ELISA con el que se trabajara. 3.- Elabore un flujograma de trabajo para realizar el enzimoinmunoensayo correspondiente. 4.- Ejecute el enzimoinmunoensayo. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Calculo del Cut-off Muestras no reactivas: Se consideran aquellas con absorbancia menores que el lmite inferior de la zona de indeterminacin Muestras reactivas: Se consideran aquellas con absorbancia mayores que el lmite superior de la zona de indeterminacin. Muestras indeterminadas: Se consideran aquellas con absorbancia que caen dentro de la zona de indeterminacin. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

CURVA DOSIS RESPUESTA:

Elisa No competitivo

AUTOMATIZACIN Existen equipos electrnicos que permiten la automatizacin de los procedimientos y el anlisis computacional de los resultados. La lectura y medida de los Ags-Ac se hace mediante colormetros, fluormetros, fotmetros, facilitando la reproducibilidad de las tcnicas, mayor precisin de registro de los resultados, mejor cuantificacin y valoracin de los mismos, a la vez disminuye los errores y permite un mejor control de calidad. IV CUESTIONARIO 1. Que enzimas se pueden utilizar para los enzimoinmunoensayos? 2. Grafique la curva dosis respuesta en un inmunoensayo no competitivo 3. Describa un ensayo homogneo y uno heterogneo 4. Comente las variables que intervienen en un enzimoinmunoensayo

V REFERENCIAS Crocker J, Burnett D. The Science of Laboratory Diagnosis. Second edition. Wiley; 2005.542p.

Lequin R. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2415 - 2418. Van Weemen B. The Rise of EIA/ELISA Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2226.

Bishop M, Fody P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. 2007.

Wilson K. and Walker J. (eds) (1994). Principles and Techniques of Practical

Biochemistry. 4 Ed. Cambridge University Press.

PRACTICA N 12 ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO

I COMPETENCIAS Al finalizar la practica el alumno:

Comprende el principio de los enzimoinmunoensayos competitivos. Conoce diferentes cromgenos que se pueden emplear en un ELISA. Elabora curva de dosis respuesta en enzimoinmunoensayos Conoce en principio de analizadores de inmunoensayos. Los ELISA en fase slida, competitivos se utilizan para determinar antgenos,

II GENERALIDADES haptenos o anticuerpos. Aqu el ligando no marcado compite con un ligando conjugado con enzima por un nmero limitado de sitios de enlace con el anticuerpo inmovilizado, y siguiendo el protocolo se retira el ligando no reactante, para as poder relacionar inversamente la cantidad de producto que se forma con la concentracin del ligando no marcado en la muestra problema. Pongamos un ejemplo para la deteccin de anticuerpos en un enzimoinmunoensayo competitivo el anticuerpo que se busca en la muestra compite con el conjugado (que es un anticuerpo tambin dirigido contra el antgeno para el cual esta dirigi el anticuerpo problema) para ocupar sitios reactivos en el antgeno fijado en la base el pocillo. As, en este tipo de prueba, tanto la muestra que contiene el anticuerpo, como el conjugado se agregan a la fase slida (conteniendo el antgeno) al mismo tiempo. Si la concentracin de anticuerpos en la muestra es alta, muy poco del conjugado puede fijarse a los antgenos inmovilizados, ya que muestra y conjugado compiten por los mismos lugares del antgeno. Habr ausencia de coloracin dado que no habr fijacin de la enzima como para unirse al sustrato. Inversamente, con muestras que contienen poco o ningn anticuerpo, se fijar ms conjugado al antgeno en la fase slida y la consiguiente adicin de sustrato provocar la presencia de color. Por esto, la cantidad de anticuerpos desconocidos en la muestra analizada es inversamente proporcional a la cantidad de coloracin que aparezca. Por otro lado, para la deteccin de antgenos en el formato competitivo se presentan los siguientes pasos:

III CUESTIONARIO 1. En que se basan las generaciones de los Enzimoinmunoensayo. Ponga un ejemplo.

2. Describa y grafique el principio del Axsym (MEIA), mencione otros analizadores

que se basen en la misma tecnologa 3. Elabore un cuadro de comparacin en el desempeo de las enzimas: peroxidasa, -galactosidasa y fosfatasa alcalina

4. Describa el principio de los enzimoinmunoensayos fluorescentes. Mencione

algunos equipos que se basen en ELFIA. IV REFERENCIAS Crocker J, Burnett D. The Science of Laboratory Diagnosis. Second edition. Wiley; 2005.542p.

Lequin R. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2415 - 2418. Van Weemen B. The Rise of EIA/ELISA Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2226.

Bishop M, Fody P, Schoeff L. Qumica clnica: Principios procedimientos y correlaciones. Quinta edicin. 2007.Pags.151-158.

PRACTICA N 13 FIJACIONES Y COLORACIONES EN EL LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

I COMPETENCIAS Al finalizar la practica el alumno:

Comprende el fundamento de la coloracin Gram y realizarla, Comprende el fundamento de la coloracin de papanicolau entre otras coloraciones muy empleadas en el laboratorio clnico y anatoma patolgica. Conoce las pruebas bsicas de control de calidad de insumos: colorantes Identifica los fijadores mas empleados.

II GENERALIDADES COLORANTES Son compuestos qumicos que poseen un grupo cromforo, conjunto de tomos de una molcula que le otorga color, y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolticamente y por lo tanto formar sales facilitando la unin del colorante a otras sustancias con carga elctrica. Clasificacin de los colorantes segn los Grupos Auxocrmos y Apetencia Tisular.

Los colorantes cidos son aninicos y la porcin cromognica tiene carga (-), por lo tanto tienen alta afinidad de unin por constituyentes de carga (+) en la clula.

En los colorantes bsicos el grupo cromforo es catinico y tiene carga (+), por ende el colorante tiene mayor afinidad por los constituyentes (-) de las clulas. Colorantes Neutros: unin de colorantes cido y bsico para formar un precipitado comnmente insoluble en agua y muy estable en disolucin alcohlica. Colorantes Indiferentes: En condiciones normales colorean los tejidos por un mecanismo de impregnacin fsica no poseen carcter cido, bsico o salino definido.

Colorantes Metacromticos : Azul de toluidina

Ejemplos de colorantes:

Anaranjado de metilo, Sudan R, Sudan 4, Safranina , Azul de metileno, Cristal violeta, Verde de metilo, Hematoxilina- Eosina, Giemsa, Fucsina Acida

Principales coloraciones usadas en el Laboratorio Clnico Microbiologa

Coloracin de Gram, Acido alcohol resistente ( Ziehl Neelsen), de Hiss, Tinta china, de Leifson, de Vago.

Hematologa

Coloracin de Wright, Giemsa, Azul cresil brillante

Anatoma patolgica Coloracin de Hematoxilina y Eosina, Papanicolau, Tricromica de Masson, de Mallory, Tricromica de Van Gison. FIJACIN La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin intima. Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agente fsicos que se utilizan para tal fin. Cualidades que debe tener un fijador

Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post- mortem (autolisis, desintegracin, etc) Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas mas profundas de la pieza a fijar. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vitro. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc) Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella

No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

Fijadores simples:

a) Formol del 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los

casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histlogicos topogrficos.

b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica c) Alcohol metlico, se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc). d) cido smico al 1 o 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5% Fijadores compuestos: En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.

a) Liquido de Fleming : mezcla de cromo-osmio-actica b) Liquido de Zenker, mezcla de bicromato-sublimado-actica c) Liquido de Helly , mezcla de Zenker formol d) Liquido de Bouin, mezcla de picro-formol-actica. e) Liquido de Duboscq- Brasil , o Bouin alcohlico
Fijadores Fsicos a) Desecacin b) Calor Seco c) Calor Hmedo d) Fro e) Congelacin y desecacin

III PARTE PRACTICA

1) Coloracin de Wright (en base a las indicaciones del profesor) Tcnica de coloracin

1. Hacer un frotis de sangre venosa. Dejar secar. 2. Cubrir el frotis con varias gotas del colorante Wright (segn indicacin)
3. Agregar el agua tamponada (segn instrucciones) 4. Enjuagar, escurrrir y dejar secar al aire. 5. Observar al microscopio

Dejar secar

2) Reconocer las bateras de coloraciones microbiolgicas y realizar la coloracin Gram. 1. Preparar el frotis

2. Fijar a la flama

3. Colorear: colocando suficiente cantidad de colorante cristal violeta o violeta de

genciana, sobre la muestra, dejar por 1 minuto

4. Lavar con agua corriente 5. Crubir con lugol ( mordiente) por 1 minuto
6. Decolorar con alcohol acetona

7. Lavar con agua 8. Cubrir con safranina (contraste) por 20 segundos

9. Lavar, secar y observar al microscopio

IV CUESTIONARIO

1. Qu otro tipo de coloraciones microbiolgicas conoces? 2. Cul es la diferencia entre bacterias Gram negativas y Gram positivas? 3. Averiguar como se prepara la coloracin de Zielh Neelsen
4. Mencione ejemplos de colorantes cidos, bsicos, indiferentes, neutros y meta cromticos 5. Defina coloracin progresiva y coloracin regresiva 6. De que otra forma se puede clasificar a los colorantes.

7.

Cual es la funcin del mordiente?

8. Por qu se fijan a la flama los frotices microbiolgicos?

9. Describa la naturaleza y caractersticas tintoriales cada uno de los colorantes que se utilizan en la coloracin de papanicolau.

V REFERENCIAS

Koneman E, Washington W. Diagnstico microbiolgico. Sexta edicin. Mxico; 2006 . P: 59-61. 102, 279, 280. Atlas Virtual de medicina. Bacilos Gram Negativos. Se encuentre en network en espaol: diciembre del 2009) http://www.telmeds.net/AVIM/Abacterio/bacilos%20gram (Acceso el 21 de %20negativos/bacilos_gram_negativos_fermentad.htm