ISSN 1980-3540

02.02, 25-29 (2007) www.sbg.org.br

Clulas-tronco: fatos, fico e futuro.

Nance Beyer Nardi Departamento de Gentica, UFRGS, nardi@ufrgs.br

O conceito bsico de clulas-tronco Nosso organismo pode ser visto como um conjunto de rgos - corao, pulmes, fgado etc - que, interagindo entre si e com o meio ambiente, garantem o bom funcionamento do todo. Cada um destes rgos, por outro lado, formado a partir da interao de vrios tipos de clulas, que constituem assim a unidade funcional do organismo. So reconhecidos mais de 200 tipos de clulas no corpo humano colaborando entre si para formar os tecidos. As clulas tm uma vida dinmica no organismo, surgindo pela diviso de uma clula precursora, desenvolvendo-se e morrendo. Uma clula pode assim, em dado momento, seguir um entre trs diferentes destinos, que dependem da resposta que ela d a estmulos que chegam do microambiente onde vive. Em primeiro lugar, a clula pode proliferar, isto , dividir-se pelo processo de mitose originando outras duas clulas. Ela pode tambm mudar de tamanho e forma, passando a realizar alguma funo mais especializada, processo denominado diferenciao. Finalmente, a clula pode morrer, num processo que planejado pelo organismo e designado morte celular programada. A morte celular um processo muito importante para a manuteno adequada do organismo e, praticamente, todas as clulas em espcies de vida mais longa, como o homem, so programadas para uma substituio peridica. Para a grande maioria das clulas, a morte acontece, por um mecanismo fisiolgico denominado apoptose, por um prazo que pode variar entre alguns dias e alguns meses aps sua formao. Este processo muito acentuado para alguns tipos de clulas como as sanguneas (que so repostas aos milhes a cada hora) ou, como se torna mais visvel para ns no vero, para as clulas que formam a pele. Outras clulas, como as que compem o sistema nervoso, so consideradas permanentes, apesar de que, mais recentemente, mesmo para estas foi observada a existncia de renovao celular. Vemos assim que, mesmo aps concludo o perodo de crescimento, quando o nmero de clulas necessariamente aumenta, o organismo deve continuar a produzir novas clulas. Para a maioria das clulas do organismo,

a renovao ocorre a partir de clulas-tronco (CTs) que existem nos diferentes tecidos. Chegamos assim ao conceito bsico de clula-tronco, apesar desse conceito - ao menos para as CTs presentes no organismo adulto - ainda no estar completamente definido. Geralmente aceito que elas so as nicas a apresentarem simultaneamente duas propriedades. Em primeiro lugar, elas so capazes de proliferar originando, por mitose, duas clulas filhas exatamente iguais entre si e iguais clula original. Para todas as outras clulas do organismo, a proliferao acompanhada de diferenciao, de modo que a mitose origina duas clulas j um pouco mais maduras que a original. Em segundo lugar, as CTs so capazes de, quando submetidas aos estmulos adequados, originar um ou mais tipos de clulas maduras. Todos esses conceitos so muito recentes. As clulastronco, em si, foram inicialmente descritas em camundongos na dcada de 1970. Estudos em roedores progrediram, revelando a grande diversidade e plasticidade dessas clulas pluripotentes, at que, em 1998, elas foram isoladas pela primeira vez no homem, pelos pesquisadores James Thomson (Universidade de Wisconsin) e John Gearhart (Universidade Johns Hopkins), nos EUA e, a partir desses estudos, os conhecimentos a respeito do assunto tm crescido em velocidade extraordinria. Para continuar a descrever as caractersticas das clulastronco e suas aplicaes, importante que se faa uma distino. At agora foram apresentadas as clulas presentes no organismo adulto, responsveis pela manuteno dos tecidos. Existe, entretanto, uma outra categoria de CTs, que so aquelas presentes no embrio. As duas categorias de clulas-tronco - embrionrias e do adulto - exibem diferenas em caractersticas biolgicas, na metodologia de obteno e manuteno, no potencial de aplicao teraputica e nas implicaes ticas e legais de sua manipulao. A clula-tronco embrionria Verifica-se, algumas vezes, certa confuso na compre25

enso do conceito de clula-tronco embrionria (CTE). Para compreender a identidade desta clula, importante localizarmos o estgio de desenvolvimento em que ela ocorre. A CTE coletada do embrio em seus estgios bem iniciais de formao, cerca de 5 dias aps sua formao, quando o embrio se encontra no estgio de blastocisto, formado por dois grupos principais de clulas. O mais externo denominado trofoblasto e compe-se de clulas que formaro a placenta e outros tecidos que iro nutrir o embrio propriamente dito. O segundo, denominado massa celular interna ou boto interno, composto por menos de 100 clulas, originar o embrio propriamente dito. Quando nos referimos clula-tronco embrionria, estamos falando de uma dessas clulas do boto interno. As clulas do boto interno do blastocisto so muito semelhantes. Se separarmos qualquer uma delas e as colocarmos nas condies apropriadas, elas sero capazes de originar qualquer dos mltiplos tipos celulares de um organismo completo - epitlio, msculo, neurnio etc. Como uma dessas clulas capaz de gerar qualquer um dos tipos de clulas que compem o organismo adulto, elas so ditas pluripotentes. A clula-tronco do adulto O conceito de CT inicialmente apresentado referia-se principalmente clula-tronco do adulto (CTA), que se encontra assim parcialmente definida. O termo mais adequado para essa categoria seria clula-tronco no embrionria, j que nela esto includas todas as clulastronco existentes aps a fase de blastocisto. As pesquisas desenvolvidas nos ltimos poucos anos resultaram na descoberta de uma grande variedade de tipos de clulas-tronco do adulto. As clulas-tronco hematopoiticas, que originam todos os tipos de clulas sanguneas, so as CTAs conhecidas h mais tempo. Como a maioria dos outros tipos de CTAs, elas so raras, constituindo uma pequena frao (0,01 - 0,1%) do total de clulas; no apresentam caractersticas morfolgicas que as diferenciem das demais clulas, e dividem-se em uma taxa muito baixa. Muitos outros tipos de clulas-tronco do adulto so conhecidos epitelial, muscular, neuronal, mesenquimal etc e se acredita que todos os tecidos tm seu prprio compartimento de clulas-tronco. O papel fundamental dessas clulas , como citado anteriormente, repor aquelas que morrem por morte celular programada, fenmeno principalmente visvel em tecidos como a pele e o sangue. Uma outra funo das clulas-tronco envolve a recuperao de leses no fisiolgicas, isto , morte de clulas por acidentes ou agentes patognicos. A plasticidade das clulas-tronco refere-se capacidade das mesmas de originar diferentes tipos de clulas maduras. Sabe-se hoje que a plasticidade das CTAs, que originalmente era considerada muito restrita, bastante

considervel. Diferentes tipos de CTA apresentam diferentes graus de plasticidade, desde muito baixo (como as CT epiteliais) at muito altos (como as clulas-tronco mesenquimais). Os mecanismos responsveis por essa plasticidade no so ainda bem determinados. Diferentes grupos de pesquisa tm encontrado diferentes resultados, dando origem assim a uma controvrsia ainda no resolvida. Enquanto alguns sugerem que CTAs podem realmente transdiferenciar-se (isto , originar tipos celulares diferentes dos que constituem o rgo onde residem), outros afirmam que esses resultados so artefatos da metodologia empregada ou originam-se da fuso das clulas-tronco com clulas j diferenciadas presentes nos rgos alvo. Obteno das clulas-tronco A adequada coleta e o tratamento de CTs so importantes para que se faa uma anlise das mesmas sob diferentes aspectos. As clulas podem ser colocadas em cultura in vitro, em placas ou frascos plsticos e com meio de cultivo adequado, para que sofram expanso ou para que se provoque diferenciao das mesmas em clulas maduras. Alm disto, podem ser utilizadas em estudos in vivo, quando elas so injetadas em animais para a avaliao da distribuio e colonizao de rgos. Com freqncia cada vez maior, elas esto sendo aplicadas em estudos clnicos, visando a regenerao de tecidos e rgos em vrios tipos de doenas. A coleta e o tratamento so procedimentos realizados de forma muito diferente, caso estejam em considerao as CTEs ou as CTAs. A forma mais comumente utilizada para obteno das CTEs a sua coleta do prprio embrio, isto , do boto interno do blastocisto, conforme detalhado anteriormente. O embrio produzido in vitro, no processo empregado para a produo dos bebs de proveta. As clulas do boto interno so separadas entre si e colocadas em placas ou garrafas, com meio de cultura apropriado e passam a dividir-se continuamente originando grandes nmeros que podem ser utilizados em diversos tipos de pesquisas. Dessa forma, originam-se linhagens de clulas-tronco embrionrias, que geralmente so compartilhadas entre os grupos de pesquisa interessados no assunto. O embrio deve ser obrigatoriamente destrudo para obteno das clulas-tronco. O processo legalmente permitido no Brasil, mas questes ticas esto envolvidas j que a cincia no pode provar se o blastocisto j deve ser considerado como tendo um potencial de ser humano suficiente para merecer proteo legal ou no. Um avano importante que se espera no futuro o estabelecimento de um mtodo que permita a coleta das clulas do blastocisto sem destrui-lo. A obteno das clulas-tronco do adulto apresenta algumas dificuldades tcnicas, j que elas so raras e no apresentam caractersticas que permitam sua fcil identificao. Entretanto, vrios mtodos foram estabelecidos,

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envolvendo, por exemplo, o uso de anticorpos que identificam protenas de membrana marcadoras dessas clulas, ou propriedades como as de aderncia ao substrato. H ainda uma terceira maneira de se obter clulas-tronco e, nesse caso, classificadas como embrionrias uma obteno de clulas troncos que envolve a metodologia de transferncia nuclear, at h pouco tempo denominada clonagem teraputica. O mtodo envolve tambm a formao do blastocisto, com a diferena de que, ao invs da fecundao de um vulo por um espermatozide, realizada a transferncia do ncleo de uma clula adulta, obtida do indivduo em tratamento, para um vulo anucleado. Uma vez formado o blastocisto, os procedimentos podem ser: a) se ele for implantado no tero de uma fmea resultar na formao de um novo indivduo, sendo o processo denominado clonagem reprodutiva (processo que originou a famosa ovelha Dolly e vrios outros tipos de mamferos); b) se for destrudo para coleta de clulas-tronco, o processo denominado transferncia nuclear. As CTEs resultantes do processo apresentam as mesmas caractersticas daquelas obtidas a partir de embries convencionais. A vantagem do processo originar clulas-tronco embrionrias geneticamente idnticas s do indivduo no qual elas sero utilizadas em procedimento teraputico, o que elimina o problema da rejeio de um transplante que, de outro modo, tem as mesmas restries exibidas por qualquer transplante de rgos convencional. O processo, descrito com tanta simplicidade, , na verdade, metodologicamente muito complexo e apresenta ainda baixo grau de sucesso. O problema principal que o material gentico do ncleo de uma clula adulta j passou por processos que dificultam sua interao com o citoplasma do vulo, e essa interao necessria para possibilitar as primeiras divises celulares e formao do embrio. No Brasil, o procedimento no permitido por lei. As notcias divulgadas por pesquisadores sul-coreanos, h pouco mais de um ano, sobre a produo de embries humanos pelo processo de clonagem, foram comprovadas como fraude. At o momento, nenhum grupo pode produzir embries humanos clonados. Manuteno e expanso in vitro das clulas-tronco Aps a coleta das clulas-tronco embrionrias (a partir do blastocisto) ou de adultos (a partir do rgo e com o sistema de isolamento apropriados), o material destinado pesquisa deve ser cultivado em frascos ou placas. Para sua manuteno e expanso in vitro, clulas animais necessitam de um meio de cultivo adequado, que geralmente contm mltiplos componentes tais, como: aminocidos, sais minerais e outras substncias como glicose e bicarbonato de sdio. Freqentemente, adicionado ao material pesquisado soro fetal bovino, que contm outros nutrientes. Suspensas nesse meio, as clulas so colocadas em placas ou frascos plsticos apro-

priados para o cultivo e mantidas em estufas a 37C, em uma atmosfera com 5% de CO2 para evitar alteraes no pH do meio, que tende a se tornar alcalino devido atividade metablica das clulas. Como as clulas aumentam em nmero, uma ou duas vezes por semana, necessitam ser transferidas (repicadas) para novas placas ou frascos com meio fresco. As clulas-tronco embrionrias tm uma capacidade aparentemente ilimitada de expanso quando cultivadas em condies adequadas. Aps isoladas a partir do blastocisto, passam a proliferar intensamente, gerando grande nmero de novas clulas; podem ser congeladas, descongeladas mantendo suas caractersticas originais e transportadas entre laboratrios, at mesmo entre laboratrios de diferentes pases. A maior parte dos grupos que trabalham com as CTEs no desenvolvem suas prprias linhagens, mas recebem amostras dos pesquisadores que as produziram e estabelecem as culturas em seus prprios laboratrios. A manuteno e expanso das clulas-tronco de adultos seguem os mesmos princpios bsicos, mas algumas diferenas importantes so observadas. A principal delas refere-se ao fato de que, na maioria dos casos, o cultivo no permanente. As CTAs tendem a se diferenciar em linhagens especficas, que dependem do tipo de clulatronco, ou a morrer depois de alguns repiques. Alguns tipos de CTAs, como as clulas-tronco mesenquimais de camundongos, podem ser mantidas durante longo tempo; as bases biolgicas dessas diferenas no so ainda bem conhecidas. Na verdade, expandir clulas-tronco adultas in vitro constitui o objetivo de muitos projetos de pesquisa. Para clulas-tronco hematopoiticas derivadas do sangue de cordo umbilical, por exemplo, o procedimento seria muito til, j que o nmero relativamente pequeno de CTHs presentes em cada unidade de sangue coletada impede seu transplante para adultos. Como no conveniente misturar duas ou mais unidades de sangue de cordo umbilical, geralmente o transplante pode ser feito apenas em crianas. No existem ainda, entretanto, procedimentos perfeitamente estabelecidos para a expanso sem a diferenciao das clulas-tronco hematopoiticas. Diferenciao das clulas-tronco in vitro ou em sistemas experimentais in vivo Manter e expandir as clulas-tronco um aspecto importante deste tipo de pesquisa, mas a possibilidade de manipular sua diferenciao nos tipos de clulas e tecidos de interesse tambm fundamental. Em alguns casos isso pode ser importante para averiguar se as clulas em cultura continuam a manter a plasticidade, isto , o potencial para originar vrios tipos de clulas maduras. Em outros casos, pode interessar, particularmente, para formar essas clulas in vitro para um tratamento especfico. Assim, conforme anteriormente citado, a maior parte dos

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projetos de pesquisa com CTEs objetivam estabelecer as condies de cultivo que permitem sua diferenciao em clulas musculares, neuronais, epiteliais etc. Uma parte considervel das pesquisas com clulas tronco dedica-se a definir as condies que induzem diferentes tipos a darem origem a clulas maduras de diferentes linhagens. Basicamente, essas condies envolvem a adio de vrios tipos de substncias ao meio de cultivo. Assim, a produo de clulas hematopoiticas a partir das CTHs depende da adio de fatores de crescimento e diferenciao (CSF, colony stimulating factor) j bem definidos: G-CSF para granulcitos, M-CSF para megacaricitos etc. A eritropoietina o fator que estimula a formao de eritrcitos. Para clulas-tronco mesenquimais ou MAPCs, que apresentam grande plasticidade, fatores como beta-glicerofosfato ou dexametasona induzem a diferenciao em osteoblastos; insulina, em adipcitos; 5-azacitina, em mioblastos, e assim por diante. Como no se pode ter certeza sobre a fidelidade das informaes fornecidas pelos sistemas de cultivo in vitro, importante que elas sejam complementadas por estudos in vivo. Para tal, as clulas-tronco podem ser administradas a animais como camundongos. Algumas ferramentas biolgicas importantes so empregadas nestes estudos: (a) Camundongos transgnicos. Linhagens de camundongos endocruzados (a mais comumente empregada nestes estudos a C57Bl/6) foram modificadas com a introduo de genes reprter, atravs de mtodos de transferncia gnica. Esses genes codificam protenas facilmente reconhecveis nas clulas que os expressam. Um dos mais utilizados codifica uma protena verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein), que torna as clulas - e o animal como um todo - fluorescentes quando submetidos luz ultra-violeta. Outro gene codifica a enzima beta-galactosidase de origem bacteriana que, ao reagir com seu substrato (X-gal), origina uma cor azul na clula. Camundongos com esse gene so chamados Rosa26. Clulas-tronco originadas desses animais so assim identificadas pela fluorescncia ou pela reao enzimtica, respectivamente. Elas podem ser administradas, em nmeros variveis e por diferentes vias, a camundongos que tm a mesma base gentica (C57Bl/6), mas que no expressam o gene reprter. Esses animais receptores podem ser normais ou podem representar algum modelo de doena. Anlises posteriores informam se as clulas transplantadas - facilmente identificveis pela fluorescncia ou cor (ou ainda com anticorpos especficos) - esto presentes no receptor e originaram clulas diferenciadas; (b) Camundongos imunodeficientes. Animais portadores de mutaes gnicas, que os tornam completamente imunodeficientes, podem ser utilizados para o transplante de clulas-tronco de outras espcies, como o homem, servindo assim como tubos de ensaio vivos que permitem estudar a distribuio e biologia das clulas em condi-

es menos artificiais que o cultivo in vitro. Princpios bsicos da terapia com clulas-tronco A terapia celular pode ser definida como um conjunto de mtodos que visam a reparao de tecidos ou de rgos danificados, com substituio das clulas no funcionais por clulas normais. Conforme anteriormente descrito, uma das funes naturais das clulas-tronco justamente a de reparar leses que ocorrem no organismo. Acredita-se que pequenas leses nos tecidos ocorram freqentemente devido, por exemplo, ao corte do suprimento sanguneo causado por acidente vascular, ou a mecanismos inflamatrios. Essas leses so reparadas por clulas-tronco sem que apaream sintomas clnicos. Quando as leses so mais extensas, entretanto, as CTs no so capazes de corrigi-las e a doena se estabelece. Nesses casos, a terapia celular visa a amplificao do mecanismo natural de correo, concentrando as clulas-tronco no local da leso para que possam agir mais eficientemente. O processo mais utilizado envolve um transplante autlogo, com coleta das clulas-tronco seguida ou no de sua expanso in vitro, e administrao ao paciente de forma sistmica (injeo endovenosa) ou diretamente no rgo a ser tratado. As clulas-tronco mais amplamente utilizadas so as clulas mononucleares da medula ssea, onde esto includas as CTHs, as clulas-tronco mesenquimais, precursores endoteliais e talvez outros tipos de clulas-tronco ainda no identificadas. No processo, a medula ssea coletada (em geral por puno da crista ilaca), a frao mononuclear isolada por centrifugao em Ficoll-Hypaque e administrada ao paciente. Uma fonte alternativa, cujo emprego est se difundindo, o lipoaspirado, a partir da qual isolada uma frao que contm as clulas-tronco adiposo-derivadas, que pertencem famlia das clulas-tronco mesenquimais e tem se mostrado muito eficiente em vrios tipos de terapias. Apesar de ter sua eficincia comprovada em vrios tipos de doenas, os mecanismos responsveis pelo sucesso da terapia com CT ainda so muito pobremente compreendidos. Para que as clulas possam atuar no local da leso, o primeiro passo seu estabelecimento no local - isto , as CTs devem fazer o homing no stio adequado, e no se dispersarem pelo organismo ou ficarem retidas em outros rgos. Em segundo lugar, elas devem ser estimuladas a exercerem suas funes de reparo. Novamente, a questo do microambiente adquire importncia fundamental. So conhecidos hoje vrios tipos de fatores solveis, liberados por clulas presentes no stio da leso, que atraem e estimulam as clulas-tronco. Esse conhecimento tem sido base, inclusive, para propostas de terapia gnica associada terapia celular: as clulas-tronco recebem genes que induzem a produo aumentada de receptores para esses fatores solveis, aumentando assim sua capacidade de aquerenciamento e atuao no local.

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O mecanismo responsvel pelo reparo propriamente dito tambm no completamente compreendido em muitos dos casos. Dvidas muito bsicas ainda persistem - por exemplo, so as clulas-tronco transplantadas que originam as clulas maduras que iro reparar a leso, ou o que as clulas transplantadas fazem na verdade criar um microambiente que recruta clulas-tronco do prprio tecido, que ento reparam a leso? Quando se considera a questo da terapia com clulastronco,uma questo que se impe : qual o melhor tipo a ser empregado, as clulas-tronco embrionrias ou as de adulto? Apesar das CTEs apresentarem a grande vantagem da plasticidade, j que so, em princpio, capazes de originar qualquer um dos mais de duzentos tipos de clulas presentes no organismo, por motivos de segurana no podem ainda ser utilizadas em pacientes. A terapia com clulas-tronco foi iniciada com os transplantes de medula ssea para o tratamento de doenas hematolgicas (como leucemias e anemias) e, ainda hoje, o procedimento mais bem sucedido. Um grande nmero de grupos tem investigado a possibilidade de utilizar clulas-tronco para o tratamento de doenas no hematolgicas. Essas pesquisas so feitas em estudo pr-clnico (com modelos animais) e clnicos (em seres humanos). As doenas so muito variadas, incluindo problemas cardacos, musculares, sseos, epiteliais, hepticos, neuronais etc. Os resultados ainda no so suficientes para dizer definitivamente se a terapia com clulas-tronco ou no eficiente para a maioria dessas doenas. Um dos maiores mitos atuais sobre as clulas-tronco, muito incentivado pela mdia, envolve seu super-poder de cura. O que sabemos como fato, hoje, que as CTs apresentam grande potencial de reparo para muitos tipos de tecidos e rgos. O que esperamos que o futuro nos traga, atravs de pesquisas srias e controladas, a concretizao das esperanas desse potencial. Referncias: 1. No existe traduo adequada para o termo homing. A autora tem proposto o verbo aquerenciar, que no RS significa acostumar a determinado lugar que no o de seu pouso habitual ou de seu nascimento (Novo Aurlio). Bibliografia Caplan AI. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213(2):341-7. 2007 Covas, Dimas Tadeu e Zago, Marco Antonio orgs . Clulas- tronco: A nova fronteira da medicina. Editora Atheneu 2006. Metcalf D. Concise Review: Hematopoietic Stem Cells and Tissue Stem Cells: Current Concepts and Unanswered Questions. Stem Cells. 2007 Aug 9; [Epub ahead of print]. Morales, Marcelo M. org. Terapias Avanadas . Clulas-

tronco, terapia gnica e nanotecnologia aplicada a sade. Editora Atheneu 2007. Pgina do NIH http://stemcells.nih.gov/

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