TEMA 6 Polimorfismos genticos humanos. Su importancia en farmacologa y toxicologa. Asociacin con cncer.

Bases Bioqumicas de la Toxicologa Clnica

Ramiro Jover

Los medicamentos son metabolizados (biotransformados) en nuestro organismo

El hgado es el rgano ms importante en la metabolizacin

Metabolismo de medicamentos en el hgado

Los FRMACOS llegan al hgado por la vena porta

HEPATOCITOS

Los METABOLITOS salen por la vena cava inferior o por la bilis

Los medicamentos se metabolizan en los hepatocitos

METABOLITOS ESTABLES

FARMACO

FASE I

XENOBIOTICOS

ELIMINACION

FASE II

Metabolismo de Frmacos - Fase I y Fase II

Xenobitico Fase I
Hidroxilacin Epoxidacin Desalquilacin Desaminacin S- y N-oxidacin

Metabolito
+ polar + reactivo

Fase II
Glucuronidacin Glucosilacin Metilacin Acetilacin Conjugacin con Sulfato Conjugacin con GSH Conjugacin con AAs

CYP
&
MEH

Citotoxicidad DETOXIFICACION

Metabolismo de frmacos - Fase I y Fase II

5 4 3
NH Cl Cl Cl

6
COOH NH Cl Cl COOH NH Cl COOH

CYP 2 - C9
5' 4' 3'

Conj. Sulfato
OH -O O S O O

Metabolizacin del diclofenac (ruta principal)

Metabolismo de xenobiticos - bioactivacin

Estimacin del nmero de xenobiticos Pesticidas 1500 Medicamentos 6000 Aditivos de alimentos - con valor nutricional 2500 - conservantes 3000 Productos industriales 50000 Detoxification

Xenobiotic

Elimination

P450
Bioactivation Cytotoxicity Genotoxicity

Up to 80% of all human cancers are thought to arise from exposure to environmental agents (Doll & Peto, 1981)

XENOBIOTIC
BIOTRANSFORMATION Stable metabolite Reactive metabolite

GSH
CONJUGATION DEPLETION

Detoxification

Redox cycling Oxidative stress

Lipid peroxidation

Alteration of Ca2+ homeostasis

Covalent binding

Metabolic alterations

ELIMINATION

APOPTOSIS NECROSIS

IMMUNE RESPONSE & GENOTOXICITY

Metabolismo de xenobiticos - bioactivacin

Estimacin del nmero de xenobiticos Pesticidas 1500 Medicamentos 6000 Aditivos de alimentos - con valor nutricional 2500 - conservantes 3000 Productos industriales 50000 Detoxification

Xenobiotic

Elimination

P450
Bioactivation Cytotoxicity Genotoxicity

Up to 80% of all human cancers are thought to arise from exposure to environmental agents (Doll & Peto, 1981)

Funciones del citocromo P450 (CYP) en el metabolismo

Hormonas esteroides cidos grasos Bioactivacin. Carcinognesis qumica. Xenobiticos

Frmacos

CYP

Vitaminas Liposolubles AyD Sales biliares

Citocromo P450 (CYP) - Componentes del sistema

NADPH
Citocromo P450 reductasa

e-

eCitoplasma

FMN FAD

Fe P450
Citocromo b5

Retculo endoplsmico

RH + O2 + NADPH+ H+

ROH + H2O + NADP+

CYPs - Isoenzimas y nomenclatura

Familias > 40%

11

17

19

21

24 27

Subfamilias 1A1 1B1 > 55% 1A2

3A4 3A5 3A7 4A9

21A2 4B1 4F2 4F3 11A1 11B1 11B2

4A11

2A6 2B6 2C8 2D6 2E1 2F1 2C9 2C18 2C19

CYPs - Abundancia relativa y especificidad

SUBSTRATOS Coumarin Fadrozole Mephenytoin Diazepam Diclofenac Tolbutamide S-Warfarin Phenytoin Nifedipine Erythromycin Phenacetin Bufuralol Cyclosporine Caffeine Sparteine Chlorzoxazone Cortisol Theophylline Debrisoquine Alcohols

2A6

2C19

2C8 9 -

3A4 5 -

1A2

2D6

2E1

INHIBIDORES

Sulphaphenazole

Ketoconazole

Furafylline

Quinidine

Tenemos todos el mismo patrn isoenzimtico de CYPs?

Variabilidad interindividual : Causas

succinil Co-A + glicina ALA sintetasa cido d-aminolevulnico ALA deshidratasa porfobilingeno PBG desaminasa Porfirias Co++, Pb++ protoporfirina IX

Gen-CYP

POLIMORFISMOS Inductores qumicos Seales inflamatorias Hormonas Dieta, etc.

mRNA

Citocromo P450 apoprotena

Fe

Ferroquelatasa

HEMO

CYP

Inhibidores

Variabilidad interindividual: consecuencias

Efecto txico Efecto teraputico Fallo teraputico

2D CYP

2D6 CYP

CYP

2D6

LENTO

NORMAL

RAPIDO

Variabilidad interindividual : Consecuencias

Benzo-a pyrene B-a -pepoxide CYP1A1 Benzo-a -pyreneSG
El benzo-a-pireno se elimina

GSTM1

Benzo-apyrene

M
CYP1A1 +++ activo

GSTM1 null genotype

Benzo-apyrene-SG

El benzo-a-pireno se convierte en un epxido reactivo que no se elimina

POLIMORFISMO Genetic variations (difference in DNA sequence) occurring in more than 1% of a population. The term defines monogenetic traits that exist in the normal population in at least two phenotypes, for example the ABO blood groups. In the context of pharmacology, genetic polymorphism of drug metabolising enzymes gives rise to distinct subgroups in the population that differ in their ability to perform a certain drug biotransformation.

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POLIMORFISMO

Variacin gentica

Cambio en la secuencia del DNA

Mutaciones

Las mutaciones, o variaciones en la expresin de los genes, pueden ocurrir con relativa facilidad en las distintas fases del flujo de informacin gentica (replicacin-transcripcin-traduccin) Causas Factores endgenos: Errores en la maquinaria molecular. Factores ambientales: Radiaciones ultravioleta, alteraciones qumicas producidas por sustancias txicas, etc. Tipos de mutaciones puntuales : Sustitucin: Adicin (Insercin) Delecin - Silenciosas - De cambio de sentido - Sin sentido - Desplazamiento de la pauta de lectura

El cdigo gentico

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Mutaciones del DNA. Puntuales

Silenciosas

De cambio de sentido

Sin sentido

Mutaciones del DNA. Deleccin, adicin y cambio en la pauta de lectura

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Mutaciones del DNA. Alteracin en corte y empalme (splicing)

Introduccin de mutaciones puntuales por accin de sulfonato de etilmentano (EMS), un agente mutagnico de uso comn.

Sustitucin G

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POLIMORFISMOS FENOTIPACIN Y GENOTIPACIN

MTODOS de FENOTIPACIN

Medida directa de la actividad en tejido (biopsia heptica). Mtodos ex vivo. Medida de actividad en cultivo de linfocitos. Mtodos in vivo. Medida de un metabolito, relacin metablica (Sustrato / Producto), o velocidad de eliminacin, de un frmaco modelo: CYP1A2 Cafena (?) CYP2C9 Tolbutamida, warfarina CYP2C19 S-mefenitoina, omeprazol CYP2D6 Dextrometorfan CYP2E1 Cloroxazona

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Fenotipo polimrfico: Hidroxilacin de debrisoquina

Debrisoquine CYP 4-Hydroxydebrisoquine

Genotipacin. Deteccin de mutaciones puntuales. RFLP

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RFLP (Southern blot analysis)

Genotipacin. Single-strand conformation polymorphism (SSCP)

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Citocromos P450 polimrficos con relevancia en el metabolismo de xenobiticos

CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcingenos

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CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcingenos

CYP1A1 CYP1A2 CYP2A6 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4/5

Hidrocarburos aromticos policclicos (benzo(a)pireno & dimetilbenzantraceno) Nitrosaminas, aminas heterocclicas Nitrosaminas, aflatoxina B1 NNK (nitrosamina derivado en humo tabaco) Benzeno, tetracloruro de carbono, cloruro de vinilo Aflatoxina B1, benzo(a)pireno, 6-aminocriseno

Polimorfismo del CYP2D6 Polimorfismo de la debrisoquina / esparteina El 7% de la poblacin presenta un metabolismo deficiente Herencia autosomal recesiva Influye en la metabolizacin de mas de 25 frmacos de uso comn:
-bloqueantes, antiarrtmicos, antidepresivos tricclicos, antipsicticos, analgsicos, antihistamnicos, etc
Debrisoquine CYP2D6 4-Hydroxydebrisoquine

Number of people

Extensive metabolizers

Poor metabolizers

Debrisoquine / 4-hydroxydebrisoquine

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Polimorfismo del CYP2D6

CYP2D6 allele Detrimental mutation A2637 deleted G1934 A Consequence Frequency in Caucasian 5-10 70-80 10-15

2D6-A A 2D6-B B 2D6-D D

Reading frame disruption Defect splicing No-enzyme

Gene deletion

2D6-E E 2D6-T T

A3023

T1795 deleted

His324 Pro nonfunctional prot. Reading frame disruption

1-5 5-10

Polimorfismo del CYP2D6

Cys

2D6-wt wt

C (497)
SRS1 SRS2 SRS3 SRS4 SRS5 SRS6

signal anchor

2D6-T T
N

C (152)
SRS1 Pro (324) Cys

2D6-E E

C (497)
SRS1 SRS2 SRS3 SRS4 SRS5 SRS6

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Polimorfismo del CYP2D6 y cncer de pulmn

NNK (4 (metilnitrosamina) 1 (3 p - 1 b - - - iridil) - utanona) Nitrosamina identificada en el humo del tabaco (Crespi et al. 1991) Es activada (bioactivada) por CYP2D6 Menos aductos DNA n - itrosamina en metabolizadores pobres 2D6 Metabolizador pobre fenotipo protector Nicotina es sustrato del CYP2D6. Nicotina cotinina Mas nicotina en el plasma de metabolizadores pobres 2D6 Menos necesidad (mayor duracin efecto) menos cigarrillos Menos riesgo de cancer Metabolizador pobre fenotipo protector

Polimorfismos del CYP1A1 y del receptor AhR

P
Ah
p9 Hs

AhR
Hs p9

P
Cytochrome Endoplasmic P450 1A1 Reticulum Enhancer Promoter

mRNA

Nuclear RNA

AhR Arnt
TFIIX
TBP

AhR

TATA

Arnt

TCDD

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Polimorfismo del CYP1A1

CYP1A1

Polimorfismo del CYP1A1: Estudios fenotpicos Actividad: hidroxilacin de hidrocarburos aromticos (benzo(a)pireno 3-hidroxi-benzo(a)pireno) Tejido: linfocitos perifricos inducidos con 3 M o TCDD C

En estudios poblacionales la actividad CYP1A1 muestra una distribucin trimodal Fenotipos: Baja, media y alta actividad / inducibilidad

Asociacin fenotipos 1A1 con carcinoma bronquial Alta actividad % Controles: 10.9 % Pacientes: 30.6 Baja actividad 42.2 5.0

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Polimorfismo del CYP1A1: Estudios genotpicos

Ile / Val(462) polymorphic site MspI polymorphic site

Exon 1

3 4 5

AA-MspI polymorphic site

Alelos m2 MspI + Val 462

Genotipo m2/m2 Val/Val

Fenotipo Alta Induccin Alta Actividad

Controles 10.6 4.7

Cncer pulmn 22.9 12.5

Enzimas de Fase II implicadas en carcingenesis GSTs NATs Sulfotransferasas Otras enzimas implicadas en el metabolismo de carcingenos
Alcohol deshidrogenasa Microsomal epoxido hidrolasa Mieloperoxidasa NAD(P)H:quinona oxidoreductasa Aldehido deshidrogenasa

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Glutation S - -transferasas GST S (centro electrfilo) + GSH- ---------- >S S - G

Multifamilia de enzimas citslicos mayoritariamente hepticos. Presente en la mayora de seres vivos. Proteccin contra compuestos nocivos. SUSTRATOS: Endgenos: Productos del estrs oxidativo
Peroxidacin lipdica Oxidacin del DNA cumene hydroperoxide, 4-hidroxinonenal Propenales bsicos de timina y uracilo

Exgenos: Carcingenos ambientales

HAP bioactivados por P450 ( epxidos, trans-4-fenil-3-buten-2-ona, benzo(a)pireno-diolepoxido) acroleina (humo tabaco), agentes metilantes (cloruro de metilo) pesticidas, disolventes industriales (oxido de etileno).

Conjugacin con glutation y su metabolismo

GSH (-Glu -- Cys --Gly)

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Glutation-S-transferasas humanas

Familias

alpha

mu

theta
M1*2 (57%) M1*A M1*B GSTT1 M3*1 M3*2 GSTT2

pi
GSTP1 T1*1 T1*2 (20%)

GSTM1

Isoenzimas

GSTA1 GSTA2

GSTM2 GSTM3 GSTM4 GSTM5

Glutation S - -transferasas humanas : Polimorfismos y cncer

Cutaneous basal cell carcinoma (BCC): UV ROS mutations GSTM1, GSTM3 y GSTT1 conjugan compuestos resultantes del estrs oxidativo inducido por UV. GST se expresa en la epidermis y en la lamina basal de la piel (que incluye las stem cells) Nmero promedio de BBCs SI NO Skin type 1 2.99 2.12 +GSTM1*2 (null) 4.57 2.00 +GSTM3*1 (AA) 3.57 2.08

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- cetil N a - transferasas (NATs) NAT C oA--------------------> S a - cetilado

Sustrato + Ac SUSTRATOS:

Endgenos: Aminas aromticas endgenas como serotonina. Transferencia de grupos acetilo entre arilaminas endgenas (sin Ac-CoA). Son denominadas: Arilamina N-acetiltransferasas Exgenos: Carcingenos ambientales (Procesos industriales y combustion tabaco o alimentos). Aminas e hidrazinas aromticas y heterocclicas.

- cetil N a - transferasas humanas: variantes allicas

NAT1 (7 alelos)
Genes

1*4 1*10 1*14 1*11 1*15 2*4 2*5A 2*6A 2*7A 2*14A

wt Alternat polyA Arg187Gln Val149Ile Arg187Stop wt Ile114Thr Arg197Gln Gly286Glu Arg64Gln

( level) rapid ( affinity) slow ( Vmax) rapid (no NAT1) slow ( ( ( ( NAT2) slow stability) slow stability) slow stability) slow

NAT2 (15 alelos)

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- cetil N a - transferasas humanas y cncer

NAT1 % (n) OR 29 (112) 1.0 44 (202) 1.9 Lento 56 (170) 1.0 66 (148) 1.9 Lento 54 (258) 1.0 68 (100) 1.8 NAT2 % (n) OR

Cncer Colon: Bell et al. (1995) Controles Enfermos Pulmn: Bouchardy et al. (1998) Controles Enfermos Hgado: Agndez et al. (1996) Controles Enfermos

Genotipo Rpido

ESTUDIOS EPIDEMIOLGICOS. Medidas de asociacin. ODDS RATIO: ODDS control = 1.04 ODDS india = 1.70 (63/37) OR= 1.70 / 1.04 =1.63 RELATIVE RISK RISK control = 0.51 RISK india = 0.63 (63/100) RR= 0.63 / 0.51 =1.24

ODDS de que nazca un nio: n nios 51 / n nias 49 = 1.04 RISK de que nazca un nio: n nios 51 / (tot 100) = 0.51

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