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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

11 N umero de publicaci on: 51

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k kInt. Cl. : A61L 27/00

A61K 38/18 A61P 19/00

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kN umero de solicitud europea: 94930410.9 kFecha de presentaci on: 02.09.1994 kN umero de publicaci on de la solicitud: 0 724 459 kFecha de publicaci on de la solicitud: 07.08.1996

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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54 T tulo: Formulaciones para la administraci on de prote nas osteog enicas.

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30 Prioridad: 10.09.1993 US 119772

73 Titular/es: Genetics Institute, LLC

k k k

87 Cambridge Park Drive Cambridge, MA 02140, US

45 Fecha de la publicaci on de la menci on BOPI:

72 Inventor/es: Yim, Kalvin W. K.;

16.12.2003

45 Fecha de la publicaci on del folleto de patente:

16.12.2003

Huberty, Michael C.; Northey, Richard P., Jr.; Kenley, Richard A.; Schrier, Jay A.; Smith, Jennifer L.; Steckert, John J.; Philbrook, C. Michael y Desouza, Patrick Joseph 74 Agente: Curell Su nol, Marcelino

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Aviso:

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci on en el Bolet n europeo de patentes, de la menci on de concesi on de la patente europea, cualquier persona podr a oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici on deber a formularse por escrito y estar motivada; s olo se considerar a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi on de Patentes Europeas).
Venta de fasc culos: Ocina Espa nola de Patentes y Marcas. C/Panam a, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCION Formulaciones para la administraci on de prote nas osteog enicas.
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Fundamento de la invenci on La presente invenci on se reere al campo de las prote nas osteog enicas y a formulaciones farmac euticas de las mismas. M as particularmente, la presente invenci on involucra formulaciones farmac euticas dise nadas para secuestrar prote na osteog enica in situ durante un tiempo suciente para permitir que la prote na induzca la formaci on de cart lago y/o de hueso. Las prote nas osteog enicas son aquellas prote nas capaces de inducir, o ayudar en la inducci on de, la formaci on de cart lago y/o de hueso. En los u ltimos a nos se han aislado y caracterizado muchas de tales prote nas osteog enicas, y algunas se han producido por m etodos recombinantes. Por ejemplo, las denominadas prote nas morfog enicas del hueso (BMP) se han aislado a partir de tejido o seo desmineralizado nas BMP se han producido (v ease, por ejemplo, Urist, patente US n 4.455.256); varias de tales prote por t ecnicas recombinantes (v ease, por ejemplo, Wang et al., patente US n 4.877.864 y Wang et al., patente US n 5.013.549); una familia de factores de crecimiento transformantes (TGF- y TGF- ) se ha identicado como potencialmente u til en el tratamiento de la oste tis deformante (v ease, por ejemplo, Derynck et al., documento EP 154.434); se ha hallado que una prote na designada Vgr-1 se expresa a elevados niveles en las c elulas osteog enicas (v ease Lyons et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, nas designadas OP-1, COP-5 y COP-7 han mostrado supuestamente actividad 86, 4554-4558); y prote osteoinductora (v ease Oppermann et al., patente US n 5.001.691). Se han llevado a cabo varios intentos para desarrollar formulaciones dise nadas para ceder prote nas osteog enicas en un sitio en el que se desea la inducci on de la formaci on de hueso. Por ejemplo, se han utilizado ciertas matrices polim ericas tales como un pol mero de ester acr lico (Urist, patente US n 4.526.909) y un pol mero de a cido l actico (Urist, patente US n 4.563.489), pero estas formulaciones no secuestran la prote na osteog enica durante un tiempo suciente para inducir o ptimamente la formaci on de hueso y, adem as, se ha hallado que se erosionan demasiado despacio para una formaci on o ptima de hueso. Una matriz biodegradable de part culas porosas para la administraci on de una prote na osteog enica, designada como OP, se da a conocer en Kuberasampath, patente US n 5.108.753. Si bien la patente US exito, debe ligar la prote na, n 5.108.753 da a conocer que un portador para la OP, con posibilidades de actuar como un sistema de administraci on de acci on retardada, acomodarse a cada etapa de la respuesta celular durante el desarrollo del hueso y proteger la prote na de una prote olisis no espec ca, no se sugiere ninguna formulaci on que contenga componentes que secuestren espec camente la OP en el sitio en el que se desea la formaci on de hueso. area supercial media por part cula porosa Ron et al., patente US n 5.171.579, da a conocer que el es cr tica para optimizar la formaci on de hueso. Okada et al., patentes US n 4.652.441, n 4.711,782, n 4.917.893 y n 5.061.492, y Yamamoto et al., apsula de administraci on retardada que comprende patente US n 4.954.298, dan a conocer una microc un f armaco polipept dico y una sustancia que retiene f armacos, encapsulados en una capa acuosa interior rodeada por una sustancia que act ua como pared polim erica en una capa exterior aceitosa. Aunque la prote na morfog enica del hueso se dene como un polip eptido capaz de una formaci on tal, la microencapsulaci on de prote nas osteog enicas evita que la administraci on controlada de tal prote na sea suciente para la o ptima formaci on de hueso. Yamazaki et al., Clin. Orthop. and Related Research, 234: 240-249 (1988) dan a conocer la utilizaci on de implantes que comprenden 1 mg de prote na morfogen etica osea puricada a partir de hueso y 5 mg de yeso mate (yeso de Par s). La patente US n 4.645.503 da a conocer materiales compuestos consistentes en hidroxiapatito y yeso mate como materiales para el implante de huesos. Tambi en se han utilizado matrices de col ageno como veh culos de administraci on para las prote nas ageno frecuentemente proosteog enicas (v ease, por ejemplo, Jeries, patente US n 4.394.370), pero el col voca reacciones antig enicas indeseables en los pacientes. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de una formulaci on farmac eutica capaz de secuestrar prote nas osteog enicas en un sitio donde se desea la inducci on de la formaci on de hueso, durante un tiempo suciente para permitir una inducci on segura y ecaz de tal formaci on de hueso.

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Sumario de la invenci on Sorprendentemente, el Solicitante ha hallado que se puede conseguir una formulaci on mejorada de BMPs, particularmente de BMP-2, que posee unas caracter sticas de solubilidad y estabilidad mejoradas, utilizando una composici on de glicina, sacarosa y clorhidrato de a cido glut amico, a un pH menor de 6,0. En una realizaci on preferida de la invenci on, esta formulaci on comprende aproximadamente un 2,5 % de glicina (g/100 ml (p/v)), aproximadamente un 0,5 % de sacarosa (p/v), clorhidrato de a cido glut amico aproximadamente 5 mM (aproximadamente 0,1 % p/v) y aproximadamente un 0,01 % (p/v) de polisorbato 80, a un pH de alrededor de 4,5. Las composiciones de la presente invenci on son u tiles para la preparaci on de formulaciones de prote nas osteoinductoras que se pueden emplear, entre otras utilizaciones, para promover la formaci on de cart lago y/o de hueso en la reparaci on de una lesi on producida en los tejidos y de fracturas.
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Descripci on detallada de la invenci on nas osteog enicas se pueden secuestrar en En la patente US n 5.171.579 se da a conocer que las prote un sitio donde se desea una actividad osteoinductora utilizando sangre aut ogena, sin tener que emplear agentes antifbrinol ticos, con tal que en la formulaci on se incorpore una matriz polim erica en forma de part culas porosas. Las prote nas osteog enicas u tiles en la pr actica de la presente invenci on son bien conocidas por los expertos en la materia, e incluyen aqu ellas anteriormente discutidas. Las prote nas osteog enicas preferidas para la utilizaci on en la presente invenci on son las de la clase BMP identicadas como BMP-1 a BMP-10 en las patentes US n 4.877.864 y n 5.013.649 y en el documento WO 90/11366 publicado el 4 de octubre de 1990, el documento WO 91/18098 publicado el 28 de noviembre de 1991 y el documento WO 93/00432 publicado el 7 de enero de 1993. La m as preferida es la BMP-2, cuya secuencia completa de ADNc se describe con detalle en la patente 5.013.649. Por supuesto, se pueden utilizar combinaciones de dos o m as de tales prote nas osteog enicas, as como fragmentos de tales prote nas que tambi en presenten actividad osteog enica. Se sabe que tales prote nas osteog enicas son especies homodim ericas, pero tambi en presentan actividad en forma de heterod meros mixtos. En la pr actica de la presente invenci on tambi en se pueden utilizar formas heterodim ericas de prote nas osteog enicas. Heterod meros de las BMPs vienen descritos en el documento WO93/09229. Se preeren las prote nas recombinantes sobre las prote nas aisladas de origen natural. La cantidad de prote na osteog enica u til aqu es aquella cantidad ecaz para estimular una actividad osteog enica aumentada de las c elulas progenitoras que se inltran, y depender a del tama no y la naturaleza del defecto que se est a tratando, tal como se discute con mayor detalle m as adelante Las prote nas osteog enicas se pueden utilizar en forma de una disoluci on farmac euticamente aceptable (incluida la reconstituci on a partir de una forma liolizada). Resulta o ptimo solubilizar la prote na osteog enica a concentraciones de por lo menos alrededor de 1 mg/ml, preferentemente alrededor de 2 a 8 mg/ml, para que se pueda ceder una cantidad farmac euticamente ecaz de prote na sin que sean necesarios vol umenes inadecuados de portador. Para algunas aplicaciones, pueden ser deseables concentraciones por encima de 2 mg/ml. El clorhidrato (HCl) del a cido glut amico es el agente solubilizante. Se utiliza a concentraciones de alrededor de 1 a alrededor de 20 mM (de alrededor del 0,02 a alrededor del 0,37 % p/v), preferentemente de alrededor de 5 a alrededor de 10 mM (de alrededor del 0,1 a alrededor del 1,8 % p/v), y a un pH de menos de alrededor de 6,0, preferentemente de alrededor de 3,5 a alrededor de 5,25, lo m as preferentemente de alrededor de 4,5. La composici on tambi en incluye de alrededor del 0,1 a alrededor del 5,0 % (p/v), preferentemente de alrededor del 0,5 a alrededor del 2,5 %, de un az ucar; lo m as preferentemente alrededor del 0,5 % de sacarosa; y de alrededor del 0,5 a alrededor del 10,0 % (p/v) de glicina, preferentemente de alrededor del 2,0 a alrededor del 2,5 %. A n de prevenir la formaci on de material en forma de part culas, la composici on de clorhidrato del a cido glut amico puede incluir opcionalmente de alrededor del 0,01 a alrededor del 0,1 % (p/v) de un tensioactivo no i onico, tal como un polioxi ester, por ejemplo on sacarosa/glicina se puede variar para polisorbato R 80, polisorbato R 20 o Pluronic R F-68. La proporci proporcionar caracter sticas adecuadas de contenido en humedad y de masa a la composici on. En las composiciones de la presente invenci on se pueden sustituir otros componentes. Por ejemplo, en lugar del oximo a 4,5, tal como el acido ac etico. Se acido glut amico se puede utilizar un mono acido con un pKa pr puede utilizar un di acido, tal como el a cido succ nico, pero a una concentraci on inferior (de preferencia aproximadamente 1 mM en lugar de aproximadamente 5 mM). Cuando se utiliza clorhidrato del a cido glut amico, se puede emplear a cido glut amico/clorhidrato, o bien mezclas de a cido glut amico y HCl. El 3

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clorhidrato del a cido glut amico tambi en se puede utilizar en forma hidratada, tal como el monohidrato del clorhidrato de a cido glut amico. Introduciendo modicaciones de menor importancia, en lugar del clorhidrato del a cido glut amico se pueden utilizar acido glut amico o glutamatos, por ejemplo glutamato s odico. La glicina se puede reemplazar en su totalidad o en parte por otros amino acidos con carga similar. Adem as, se pueden agregar otros componentes opcionales tales como alb umina, glicerina, manitol y otros az ucares. As pues, la presente invenci on incluye composiciones que emplean componentes sustituidos, tal como se ha descrito anteriormente, tales como, por ejemplo, composiciones que utilizan acido glut amico o glutamato s odico en lugar de clorhidrato del a cido glut amico. Otras modicaciones ser an evidentes a los expertos en la materia, y tambi en quedan abarcadas por la presente invenci on. Las formulaciones anteriores se pueden liolizar y reconstituir con agua, lo que proporciona ventajas en el almacenamiento, el env o y la estabilidad. Las formulaciones liolizadas de la presente invenci on pueden comprender la siguiente composici on: de alrededor del 3,12 % a alrededor del 24,38 % en peso de BMP; de alrededor del 0,52 % a alrededor del 10,27 %, preferentemente de alrededor del 1,84 % al 5,27 % (p/p), de clorhidrato del a cido glut amico; de alrededor del 38,4 % a alrededor del 75,7 % en peso de glicina; de alrededor del 14,28 % a alrededor del 47,15 % en peso de sacarosa; y, opcionalmente, de alrededor del 0,15 % a alrededor del 2,94 % en peso de polisorbato 80. A t tulo de ejemplo, en la Tabla 1, que se incluye a continuaci on, se listan dos composiciones preferidas de la formulaci on liolizada: TABLA 1 a.
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b.
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Formulaci on a 4,0 mg/ml BMP-2 Acido glut amico HCl Glicina Sacarosa Polisorbato 80 Formulaci on de 2,0 mg/ml BMP-2 Acido glut amico HCl Glicina Sacarosa Polisorbato 80

4,0 0,918 25 5 0,1 2,0 0,918 25 5 0,1

mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml

(11,42 % en peso) (2,62 % en peso) (71,39 % en peso) (14,28 % en peso) (0,29 % en peso) (6,06 % en peso) (2,78 % en peso) (75,72 % en peso) (15,14 % en peso) (0,30 % en peso)

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Las formulaciones anteriores se pueden liolizar de manera reproducible en menos de 40 horas, con un nivel de humedad bien controlado. Las formulaciones proporcionan una buena estabilidad frente al almacenamiento a una variedad de temperaturas. Las formulaciones anteriores proporcionan, adem as, una solubilidad m as elevada de la BMP, lo que facilita la administraci on de dosis m as elevadas de BMP, y muestran una buena compatibilidad con los dispositivos anteriormente descritos. Con peque nas variaciones y modicaciones dentro de la presente invenci on, la formulaci on anterior se puede utilizar para preparar disoluciones de concentraciones m as elevadas, de por lo menos aproximadamente 4 mg/ml de BMP-2 u otras BMPs. Se pueden utilizar diversos m etodos bien conocidos para formular la prote na osteog enica y los agentes solubilizantes a utilizar aqu , incluidos, aunque no limitados a, la ultraltraci on, la di alisis, la ltraci on sobre gel y la cromatograf a hidr of obica.

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area supercial media por part cula porosa es cr tica La patente US n 5.171.579 da a conocer que el para optimizar la formaci on de hueso. Espec camente, las part culas porosas u tiles en la formaci on de hueso, de acuerdo con la presente invenci on, deben tener un a rea supercial media de aproximadamente as, que es posible producir part culas 0,02 a 4 m2 /g. El documento WO 93/06872 da a conocer, adem porosas que tienen el area supercial deseada introduciendo un poros geno (una composici on capaz de conferir porosidad aumentando el a rea supercial de las part culas) en la disoluci on utilizada para producir las part culas porosas. Las descripciones de las publicaciones anteriores se incorporan aqu a modo de referencia. Tambi en es posible controlar la velocidad de bioerosi on sometiendo las part culas porosas a dosis esterilizantes de radiaci on . Cuanto m as elevada sea la dosis de radiaci on tanto m as r apido ser a la bioerosi on. Las part culas u tiles aqu tienen una porosidad tal que el a rea supercial de las part culas est a aumentada aproximadamente de 2 a 250 veces sobre el a rea supercial de part culas no porosas de tama no comparable.

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Las formulaciones de la presente invenci on proporcionan implantes maleables que permiten ceder cantidades terap euticamente ecaces de prote na osteoinductora a un sitio lesionado en el que se desea la formaci on de cart lago y/o de hueso. Un implante tal se puede utilizar como un sustituto para un injerto aut ologo de hueso en fracturas recientes y no articulares, en fusiones espinales y en la reparaci on de defectos oseos en el campo ortop edico; en las reconstrucciones cr aneo/maxilofaciales; para la integraci on de pr otesis; especialmente en forma de una supercie cubriente para mejorar la jaci on de implantes prot esicos, tales como las pr otesis recubiertas de hidroxilapatito; en la osteomielitis para la regeneraci on del hueso; y en el campo dental para el aumento del reborde alveolar y tratar los defectos periodontales y las cavidades de enucleaci on en la extracci on de dientes. Cuando se emplea para tratar la osteomielitis o para la reparaci on del hueso con un m nimo de infecci on, la prote na osteog enica se puede utilizar en combinaci on con micropart culas porosas y antibi oticos, con la adici on de agentes secuestrantes de prote nas tales como el alginato, productos celul osicos, especialmente carboximetilcelulosa, diluidos utilizando glicerina acuosa. El antibi otico se selecciona por su capacidad de disminuir la infecci on al tiempo que teniendo efectos adversos m nimos sobre la formaci on de hueso. Los antibi oticos preferidos para la utilizaci on en los dispositivos de la presente invenci on incluyen la vancomicina y la gentamicina. El antibi otico puede estar en cualquier forma farmac euticamente aceptable, tal como vancomicina HCl o sulfato de gentamicina. El antibi otico est a preferentemente presente a una concentraci on desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10,0 mg/ml. Las formulaciones de menor viscosidad tambi en se pueden utilizar en forma de inyecci on percut anea para acelerar la curaci on de fracturas cerradas. En algunas de estas utilizaciones, las composiciones de la presente invenci on se pueden emplear en combinaci on con varios cementos para huesos, incluidos los cementos oseos erosionables tales como el poli(cofumarato de propileno) y ciertos cementos de hidroxiapatito. Adem as, algunas de estas utilizaciones emplear an piezas met alicas bioerosionables tales como placas, tornillos, etc., erosionables. Tal como se ha aludido anteriormente, el r egimen de dosicaci on vendr a determinado por la indicaci on cl nica a la que va dirigido, as como por diversas variables inherentes al paciente (por ejemplo, el peso, la edad, el sexo) y la manifestaci on cl nica (por ejemplo, la magnitud de la lesi on, el sitio de la lesi on, etc.). En general, la dosis de la prote na osteog enica estar a en el intervalo de aproximadamente 10 a 1000 g, de preferencia de aproximadamente 10 a 100 g. Los ejemplos que se aportan a continuaci on son ilustrativos de la presente invenci on y no tienen, en modo alguno, un car acter limitativo. Cabe contemplar peque nas modicaciones, variaciones y mejoras, las cuales caen dentro de la presente invenci on.
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Ejemplo 1 Formulaci on de una bmp utilizando a cido glut amico HCl BMP-2 producida recombinantemente se solubiliza (2 mg/ml) en una composici on constituida por el 2,5 % (p/v) de glicina, el 0,5 % (p/v) de sacarosa, el 0,01 % (p/v) de polisorbato 80 y a cido glut amico HCl 5 mM (aproximadamente al 0,092 % p/v), a pH=4,5. Ejemplo 2

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Solubilidad y estabilidad de formulaciones de BMPs que utilizan acido glut amico hcl como agente solubilizante Las composiciones anteriores del Ejemplo 1 se liolizan y se guardan a -80, 4, 30, y 40C. Las muestras liolizadas se examinan para determinar su aspecto antes de la reconstituci on. Todas aparec an en forma de tortas blancas excelentes, y no cambiaron con el tiempo ni la temperatura. Las composiciones se reconstituyen al cabo de 2 semanas, 1 mes, 3 meses y 4,5 meses despu es de la liolizaci on, y se estudian para determinar el tiempo de reconstituci on, la formaci on de material en forma de part culas, el pH despu es de la reconstituci on, el contenido porcentual de humedad, la concentraci on de BMP-2 despu es de la reconstituci on, el porcentaje de formaci on de agregados y la actividad espec ca en el bioensayo W-20 para la determinaci on de la actividad de BMP. Las composiciones anteriores se reconstituyeron en aproximadamente 10-30 segundos, incluso despu es de 4,5 meses de almacenamiento. Al efectuar la reconstituci on, las composiciones no muestran ning un material en forma de part culas visible, muestran poco o ning un cambio en el contenido en humedad, poca o ninguna p erdida de prote na, niveles bajos de agregados y son activas en el bioensayo con c elulas W20. 5

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Ejemplo 3 Bioensayos con c elulas W-20

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A. Descripci on de las c elulas W-20 La utilizaci on de las c elulas estromales de la m edula o sea, W-20, como linaje de c elulas indicadoras se basa en la transformaci on de estas c elulas en c elulas semejantes a los osteoblastos despu es del tratamiento con una prote na BMP (Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research, 5: 305 (1990); y Thies et al., Endocrinology, 130: 1318 (1992)]. Espec camente, las c elulas W-20 son un linaje de c elulas estromales de la m edula o sea, clonales, derivadas de ratones adultos por investigadores en el laboratorio del Dr. D. Nathan, Childrens Hospital, Boston, MA. El tratamiento de las c elulas W-20 con ciertas prote nas BMP da como resultado: (1) una producci on aumentada de fosfatasa alcalina, (2) una inducci on de cAMP estimulado por PTH y (3) una inducci on de la s ntesis de osteocalcina por las c elulas. Mientras que (1) y (2) representan caracter sticas asociadas con el fenotipo de los osteoblastos, la capacidad de sintetizar osteocalcina es una propiedad fenot pica s olo puesta de maniesto por los osteoblastos maduros. Adem as, hasta el momento, hemos observado la transformaci on de las c elulas estromales W-20 en c elulas semejantes a los osteoblastos solamente por tratamiento con BMPs. De esta manera, las actividades in vitro puestas de maniesto por las c elulas W-20 tratadas con BMP est an relacionadas con la actividad formadora de hueso in vivo conocida para las BMPs. A continuaci on se describen dos ensayos in vitro u tiles en la comparaci on de actividades de BMP de formulaciones de BMPs con la actividad de BMPs conocidas.
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B. Protocolo del ensayo de la fosfatasa alcalina con c elulas W-20 Las c elulas W-20 se siembran en placas para cultivo de tejidos, de 96 pocillos, a una densidad de 10.000 c elulas por pocillo, en 200 l de medio (DME con un 10 % de suero fetal de ternera inactivado por el calor, glutamina 2 mM y 100 unidades/ml de penicilina + 100 g/ml de estreptomicina. Las c elulas se dejan juntar toda la noche en un incubador con un 95 % de aire y un 5 % de CO2 , a 37 C. Los 200 l de medio se eliminan de cada uno de los pocillos con una pipeta de v as m ultiples y se reemplazan por un volumen igual de muestra de ensayo aportada en DME con un 10 % de suero fetal de ternera inactivado por el calor, glutamina 2 mM y un 1 % de penicilina-estreptomicina. Las sustancias de prueba se ensayan por triplicado. Las muestras de ensayo y los est andares se dejan durante un per odo de incubaci on de 24 horas con las c elulas indicadoras W-20. Despu es de las 24 horas, se quitan las placas del incubador a 37 C, y los medios de ensayo se eliminan de las c elulas. Las capas de c elulas W-20 se lavan 3 veces con 200 l por pocillo de soluci on salina tamponada con fosfatos exenta de calcio/magnesio, y estos lavados se desechan.
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A cada uno de los pocillos se agregan 50 l de agua destilada sobre vidrio y las placas de ensayo se colocan luego sobre un ba no de hielo seco/etanol para que se congelen r apidamente. Una vez congeladas, las placas de ensayo se retiran del ba no de hielo seco/etanol y se descongelan a 37 C. Esta etapa se repite dos veces m as por un total de tres procesos de congelaci on-descongelaci on. Una vez terminado el proceso, la fosfatasa alcalina unida a la membrana queda disponible para la medici on. A cada uno de los pocillos de prueba se agregan 50 l de la mezcla de ensayo (glicina 50 mM, 0,05 % de Trit on X-100, MgCl2 4 mM, fosfato de p-nitrofenol 5 mM, pH = 10,3), y las placas de ensayo se incuban no de agua vibratorio a 60 oscilaciones por minuto. luego durante 30 minutos, a 37 C, en un ba

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Al nal del per odo de incubaci on de 30 minutos, la reacci on se detiene agregando 100 l de NaOH 0,2 N a cada pocillo y poniendo las placas de ensayo sobre hielo. La absorbancia espectrofotom etrica para cada pocillo se lee a una longitud de onda de 405 nan ometros. Estos valores se comparan luego con los de est andares conocidos para obtener una estimaci on de la actividad de fosfatasa alcalina en cada una de las muestras. Por ejemplo, se generan valores de la absorbancia utilizando cantidades conocidas de fosfato de p-nitrofenol. Esto se muestra en la Tabla 3.

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TABLA 3 Valores de la absorbancia para est andares conocidos de fosfato de p-nitrofenol
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Fosfato de p-nitrofenol, moles 0,000 0,006

Absorbancia media (405 nm) 0 0,261 0,024 0,521 0,031 0,797 0,063 1,074 0,061 1,305 0,083

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Los valores de la absorbancia para cantidades conocidas de BMPs se pueden determinar y transformar en moles de fosfato de p-nitrofenol desdoblado por unidad de tiempo, tal como se muestra en la Tabla 4. TABLA 4 Valores de la fosfatasa alcalina para las c elulas W-20 tratadas con BMP-2

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Concentraci on de BMP-2 ng/ml 0 1,56 3,12 6,25 12,50 25,0 50,0 100,0

Lectura de la absorbancia 405 nan ometros 0,645 0,696 0,765 0,923 1,121 1,457 1,662 1,977

moles de sustrato por hora 0,024 0,026 0,029 0,036 0,044 0,058 0,067 0,080

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Estos valores se utilizan luego para comparar las actividades de cantidades conocidas de nuevas formulaciones de BMPs con las de las formulaciones de BMPs activas conocidas. C. Protocolo RIA para la osteocalcina elulas por pocillo en platos multipocillo para el cultivo Las c elulas W-20 se siembran a raz on de 106 c de tejidos, de 24 pocillos, en 2 ml de DME que contiene un 10 % de suero fetal de ternera inactivado por el calor y glutamina 2 mM. Las c elulas se dejan unir toda la noche en una atm osfera de un 95 % de aire y un 5 % de CO2 , a 37C. Al d a siguiente, el medio se cambia a DME que contiene un 10 % de suero fetal de ternera, glutamina 2 mM y la sustancia de ensayo, en un volumen total de 2 ml. Cada sustancia de ensayo se aplica a pocillos triplicados. Las sustancias de ensayo se incuban con las c elulas W-20 durante un total de 96 horas, efectu andose la sustituci on por los mismos medios de ensayo a las 48 horas. Al cabo de las 96 horas, se extraen 50 l de medio de ensayo de cada uno de los pocillos y se ensayan para determinar la producci on de osteocalcina utilizando un radioinmunoensayo para la osteocalcina de rat on. Los detalles del ensayo se describen en el equipo (kit) fabricado por Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072. Los reactivos para el ensayo se encuentran como los n umeros de producto BT-431 (est andar de osteocalcina de rat on), BT-432 (osteocalcina anti-rat on de cabra), BT431R (osteocalcina de rat on yodada), BT-415 (suero normal de cabra) y BT-414 (IgG anti-cabra de asno). El RIA para la osteocalcina sintetizada por las c elulas W-20 en respuesta al tratamiento con BMPs se lleva a cabo tal como se describe en el protocolo suministrado por el fabricante.

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REIVINDICACIONES 1. Composici on que comprende una prote na osteog enica, de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 5,0 % (p/v) de un az ucar, de aproximadamente el 1,0 a aproximadamente el 10,0 % (p/v) de glicina y clorhidrato del a cido glut amico entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, en la que tal formulaci on tiene un pH de alrededor de 4,5. 2. Composici on seg un la reivindicaci on 1, que, adicionalmente, comprende de alrededor del 0,01 a alrededor del 0,1 % (p/v) de un tensioactivo no i onico.
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3. Composici on que comprende una prote na osteog enica, de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 10 % (p/v) de glicina, de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 5,0 % (p/v) de sacarosa, de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,1 % (p/v) de un tensioactivo no i onico y clorhidrato de acido glut amico entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 mM, en la que tal formulaci on tiene un pH menor de alrededor de 6,0. 4. Composici on que comprende una prote na osteog enica, aproximadamente el 2,5 % (p/v) de glicina, aproximadamente el 0,5 % (p/v) de sacarosa, clorhidrato del a cido glut amico aproximadamente 5 mM y aproximadamente el 0,01 % (p/v) de polisorbato 80, en la que tal formulaci on tiene un pH de alrededor de 4,5. 5. Composici on que comprende una formulaci on liolizada de aproximadamente el 3,12 % a aproximadamente el 24,38 % (p/p) de prote na morfogen etica de hueso (BMP); de aproximadamente el 0,52 % a aproximadamente el 10,27 % (p/p) de clorhidrato del acido glut amico; de aproximadamente el 38,4 % a aproximadamente el 75,7 % (p/p) de glicina; de aproximadamente el 14,28 % a aproximadamente el 47,15 % (p/p) de sacarosa; y, opcionalmente, de alrededor del 0,15 % a alrededor del 2,94 % (p/p) de polisorbato 80. 6. Composici on seg un la reivindicaci on 5, en la que la formulaci on comprende cantidades ponderales relativas de aproximadamente 4,0 mg/ml de BMP-2; aproximadamente 0,918 mg/ml de clorhidrato del acido glut amico; aproximadamente 25 mg/ml de glicina; aproximadamente 5 mg/ml de sacarosa; y, opcionalmente, alrededor de 0,1 mg/ml de polisorbato 80. 7. Composici on seg un la reivindicaci on 5, en la que la formulaci on comprende cantidades ponderales relativas de aproximadamente 2,0 mg/ml de BMP-2; aproximadamente 0,918 mg/ml de clorhidrato del acido glut amico; aproximadamente 25 mg/ml de glicina; aproximadamente 5 mg/ml de sacarosa; y, opcionalmente, alrededor de 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir an ning un efecto en Espa na en la medida en que coneran protecci on a productos qu micos y farmac euticos como tales. Esta informaci on no prejuzga que la patente est e o no inclu da en la mencionada reserva.

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