Aproximadamente el 99.

9% de la secuencia del ADN el cual se encuentra en el ncleo de todas las clulas y, debido a su gran diversidad, es el responsable de las caractersticas propias de cada individuo. Una proporcin significativa de las diferencias encontradas en los individuos, es decir, sus diferencias fenotpicas y/o susceptibilidades a ciertas enfermedades, radica en el 1% de variacin; este tipo de variaciones genticas reflejadas por marcadores moleculares que se les conoce como polimorfismos, los cuales representan diferentes formas en las secuencias de ADN. El estudio de estas variaciones tiene diversas aplicaciones en el campo de la medicina as como en el desarrollo de investigaciones biolgicas y de evolucin. Esta revisin describe los diferentes tipos de variaciones genticas que presenta el genoma humano, as como su importancia y posible aplicacin en la medicina y en las enfermedades. El Proyecto del Genoma Humano, cuyo objetivo era descifrar su secuencia completa; en el ao 2001 y con la ayuda de algunos pases desarrollados se public el primer borrador de la secuencia del genoma humano; ms tarde se present un nuevo borrador que contena el 99% de la secuencia del genoma. A partir de este proyecto se conoce que el genoma humano contiene entre 30,000 y 35,000 genes, lejos de los 100,000 postulados en un principio, y que slo alrededor del 5% participa en la codificacin de informacin, mientras que la funcin del resto es hasta ahora desconocida. Por otra parte dando como informacin esencial, se revel la existencia de aproximadamente 6 millones de polimorfismos de nucletido sencillo (PNS o SNP). Las aplicaciones del estudio de los polimorfismos son diversas; por un lado sirven para tratar de explicar el origen de las poblaciones y as reconstruir parte de la historia evolutiva. Por otro, tienen gran aplicacin en campos como la medicina forense y en el estudio de las enfermedades multignicas. Su estudio ha servido de pauta para la creacin de nuevas disciplinas como la ecogentica y la farmacogentica; la primera define las bases genticas de las diferencias individuales en respuesta a los factores ambientales, mientras que la segunda se centra en la definicin de las diferencias individuales en respuesta a un tratamiento farmacolgico.

POLIMORFISMO Polimorfismo significa literalmente muchas formas. As pues, el polimorfismo gentico, cromosmico o de secuencia del ADN es el responsable de la gran variabilidad existente entre los individuos de una misma especie. La diversidad del genoma entre especies es obvia, mientras que la diversidad del genoma dentro de una misma especie hace que cada individuo sea nico e irrepetible. Esta diversidad es la responsable de fenmenos a gran escala como la evolucin de las especies y de otros de trascendencia menor pero no menos importantes como las caractersticas diferenciales entre individuos de una misma especie. Los polimorfismos pueden encontrarse en las regiones codificantes del genoma (regiones que codifican para una protena), recibiendo el nombre de polimorfismos gnicos. Tambin podemos encontrarlos en las regiones no codificantes (regiones que no codifican para ningn producto gnico, pero que pueden tener una funcin reguladora o simplemente estructural); entonces reciben el nombre de polimorfismos genticos. En trminos cientficos, el polimorfismo se define como la existencia simultnea en una poblacin de genomas con distintos alelos para un locus determinado. Los alelos son variaciones de la secuencia del ADN presentes en una posicin definida (locus) en un cromosoma. Consecuentemente, en una clula diploide cada locus est ocupado por dos alelos, uno de origen materno y otro de origen paterno, situados en sendos cromosomas homlogos. La variabilidad gentica se origina ya durante el proceso de la morfognesis, es decir, desde el cigoto, durante el desarrollo de los tejidos, transformacin en rganos y tambin durante la vida del individuo. Existen numerosos mecanismos moleculares bien conocidos que pueden originar los polimorfismos, como la recombinacin homloga, la segregacin de cromosomas, las mutaciones, las duplicaciones y las transposiciones.

VARIACIONES EN LOS POLIMORFISMOS

La variabilidad fenotpica de cada individuo, as como la susceptibilidad o la resistencia individual a distintas enfermedades radica principalmente en los SNPs, y en menor grado a inserciones, deleciones, secuencias repetidas y/o re-arreglos cromosmicos, debido a que el genoma humano no es una estructura pasiva; al contrario, el ADN est expuesto a un sin nmero de alteraciones que pueden dar como resultado la aparicin de enfermedades. Estas alteraciones genticas

pueden ser grandes reorganizaciones cromosmicas, as como duplicaciones o deleciones de fragmentos y hasta de cromosomas enteros. Por otra parte, las modificaciones ms frecuentes son llevadas a cabo en uno o en pocos nucletidos. Estos cambios en el ADN son llamados mutaciones, los cuales pueden ser originados por errores en los mecanismos de replicacin y reparacin del DNA, as como por factores ambientales. As, las mutaciones pueden tener efectos deletreos y causar enfermedades, 5 mutaciones que dan lugar a lo que se conoce como polimorfismos, los cuales proveen variacin allica entre individuos y diversidad de la misma especie. Un polimorfismo es considerado como tal cuando la frecuencia de uno de sus alelos en la poblacin es superior al 1%. Hay varios tipos de polimorfismos (inserciones, deleciones, cambios en el nmero de secuencias repetidas), pero los ms frecuentes son los SNPs. Las aplicaciones del estudio de los polimorfismos son diversas; por un lado sirven para tratar de explicar el origen de las poblaciones y as reconstruir parte de la historia evolutiva. Por otro, tienen gran aplicacin en campos como la medicina forense y en el estudio de las enfermedades multignicas. Su estudio ha servido de pauta para la creacin de nuevas disciplinas como la eco-gentica y la farmacogentica; la primera define las bases genticas de las diferencias individuales en respuesta a los factores ambientales, mientras que la segunda se centra en la definicin de las diferencias individuales en respuesta a un tratamiento farmacolgico.

POLIMORFISMOS DE NUCLETIDO SENCILLO (SNP)

Es un tipo de polimorfismo simple basado en el cambio de una base nucleotidica por otra. Estos marcadores, algunas veces son referidos como polimorfismos de evento nico porque tiene una tasa de mutacin muy baja, aproximadamente 10 -8 mutaciones/ generacin. Adems los SNPs, otro tipo importante de marcadores binarios son los Indels, que consisten en inserciones/delecciones de un nucletido o varios. Un sitio en el genoma en el cual los miembros individuales de una especie difieren en un solo par de bases se llama polimorfismo de un solo nucletido nico (SNP, por una sigla en ingles que se pronuncia snip) al haber surgido de una mutacin, los SNP se heredan en variantes alelica (al igual que los alelos que producen diferencias fenotpicas, como los de los grupos sanguneos) aunque en general no

producen una diferencia fenotpica. Los polimorfismos de un nucletido nico son numerosos y estn presentes a lo largo de todo el genoma. Al comparar el mismo cromosoma en dos individuos diferentes, podr encontrarse un SNP aproximadamente cada 1000 pb. La mayora de los SNP presentes en una poblacin surgieron alguna vez de una mutacin simple que ocurri en un cromosoma particular, y que posteriormente se propago por toda la poblacin. As, cada SNP se asocia inicialmente con otros SNP (as como con otros tipos de variantes genticas o alelos) que estaban presentes en los cromosoma particular en el cual se produjo la mutacin. El grupo especifico de SNP y de otras variantes genticas que se observan en un mismo cromosoma o en parte de este se llamo haplotipo. Los SNP dentro del haplotipos estn fsicamente ligados y por ello tienden a heredarse juntos. Pueden aparecer nuevos haplotipos debido a mutaciones o a entrecruzamientos, que interrumpen as el conjunto particular de SNP en un haplotipo. Como la tasa de entrecruzamiento es proporcional a la distancia fsica entre los genes, los SNP y otras variantes genticas que estn ubicados cerca uno de los otros en el cromosoma, estarn fuertemente asociados como haplotipos. Las asociaciones que no son aleatorias entre las variantes genticas dentro del haplotipo se llaman desequilibrios de ligamiento. Como los SNP de un haplotipo se eran juntos, un haplotipo que consiste en miles de SNP puede identificarse con tan solo unos pocos de ellos. Los pocos SNP utilizados para identificar un haplotipo se llaman marcas de polimorfismo de un nucletido nico. Hay aproximadamente 10 millones de SNP en la poblacin humana pero, debido al desequilibrio de ligamento, estos SNP estn presentes en un nmero mucho menor de haplotipos. Esto significa que pueden utilizarse un nmero relativamente menor de SNP (quizs solamente 100000) para identificar la mayora de los haplotipos en los seres humanos. Debido a la variabilidad y a su diseminacin en todo el genoma, los SNP son valiosos como marcadores en los estudios genticos. Bsicamente los procesos que generan este tipo de polimorfismo son: errores de incorporacin de nucletidos durante la replicacin y, mutagenesis causada por la modificacin qumica de las bases o por daos fsicos producidos por radiacin ionizante o ultravioleta. Se estima que aparecen con una frecuencia de 1 de cada 500-100 pares de bases en el genoma humano y la mayora se encuentran en regiones no codificantes, que no tienen ningn efecto conocido sobre el fenotipo del individuo. Estos SNPs son muy tiles como marcadores de gentica poblacional y en estudios evolutivos, pero tambin pueden servir como marcadores genticos para identificar enfermedades genticas: mediante estudios de ligamiento en familias, observando el desequilibrio de ligamento en

poblaciones aisladas, estudios de prdida de heterozigosidad en tumores y por anlisis de asociacin entre pacientes y controles. A pesar de que los SNPs, individualmente, son menos informativos que otros marcadores genticos usados frecuentemente, presentan la ventaja de la mayor abundancia y su gran potencial para la automatizacin. Como se mencion, los polimorfismos se distinguen terminolgicamente de las mutaciones por su frecuencia. Las diferentes formas de los polimorfismos (llamados alelos) son ms frecuentes que las mutaciones, esto es, en una frecuencia mayor al 1%. La gran mayora de los SNPs tienen dos alelos los cuales estn representados por una sustitucin de base por otra. En las poblaciones, este tipo de alelos se clasifican en alelo principal o silvestre y alelo raro o mutante, clasificacin basada en la frecuencia observada en las poblaciones. Debido a que los humanos son diploides, un individuo puede tener uno de tres genotipos: homocigoto para el alelo ms frecuente, heterocigoto, u homocigoto para el alelo menos frecuente. Actualmente, en el dbSNP (base pblica de datos de PNS, dbSNPs por sus siglas en ingls) se han catalogado ms de 9 millones de variantes en la secuencia de ADN. Se describe que los SNPs se presentan uno cada 200 pares de bases en el genoma humano. Basados en ello, se esperara que existieran aproximadamente 6 millones de SNPs en el genoma humano, muchos de lo s cuales ya han sido descritos en el dbSNP. Los SNPs pueden estar presentes en regiones codificantes y provocar un cambio en un aminocido; a este tipo de SNPs les conoce como no sinnimos. Puesto que este tipo de SNPs afecta directamente la funcin de la protena, muchos investigadores han centrado su atencin en estudios de asociacin gentica en este tipo de variaciones. Asimismo, existen variaciones funcionales que pueden producir alguna enfermedad o susceptibilidad a sta, pueden estar localizados en la regin promotora del gen, influenciando la actividad transcripcional del gen (modulando la unin de factores de transcripcin), en intrones (modulando la estabilidad de la protena), en sitios de splicing (sitios donde ocurre la eliminacin de int rones y unin de exones) o en regiones intragnicas. Otro tipo de SNPs son los llamados sinnimos (o silenciosos) los cuales no alteran la conformacin del gen; sin embargo, se ha descrito que algunos de estos polimorfismos pueden tener consecuencias funcionales por algn tipo de mecanismo an desconocido. Segn su localizacin en el genoma, los SNPs se clasifican en: iSNP, si estn localizados en regiones intrnicas; cSNP, en regiones codificantes (exones);

rSNP, en regiones reguladoras, y gSNP, localizados en regiones intergenmicas. Los cSNP pueden estar representados por SNPs sinnimos (sSNP) o no sinnimos (nsSNP) Un dato interesante de los SNPs es que, a diferencia de otro tipo de marcadores como los micro-satelitales, presentan una tasa menor de mutacin por lo que son de gran ayuda en estudios de gentica de poblaciones para tratar de explicar fenmenos biolgicos como la evolucin de la raza humana. Caractersticas de SNPs 1. Los SNPs forman hasta el 90% de todas las variaciones genmicas humanas, y aparecen aproximadamente cada 300 bases, a lo largo del genoma humano. Cada una de las formas de un gen o marcador como un SNP se denomina alelo y estos diferentes alelos producen variaciones en las caractersticas hereditarias. En principio, no alteran el fenotipo de un individuo pero en determinadas condiciones ambientales pueden afectar a la funcin gnica. Los SNPs genotipados en estudios de asociacin se denominan tagSNP.

2. Los SNPs pueden encontrarse en regiones codificantes pudiendo alterar la estructura de la protena y por tanto, su funcin, contribuyendo al desarrollo de una enfermedad o a cambios en la respuesta a determinados medicamentos. Tambin los SNPs pueden encontrarse en regiones no codificantes, las cuales estn conservadas a travs de las especies y pueden representar regiones reguladoras funcionalmente importantes. Tambin pueden ser tiles en estudios comparativos o de evolucin. 3. A pesar de que los SNPs, individualmente, son menos informativos que otros marcadores genticos usados frecuentemente, presentan la ventaja de la mayor abundancia y su gran potencial para la automatizacin.

Bsqueda de SNP

Teniendo en cuenta la gran cantidad de SNPs que han sido descritos en la actualidad, lo mejor sera comenzar la bsqueda del SNP o SNPs a estudiar en alguna de las bases de datos existentes con el NCBI (national center for

biotechnology information) dbSNP. Los SNPs de esta base de datos fueron descubiertos en parte por la secuencia de libreras BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y por el SNP consortium.

METODOS DE GENOTIPADO DE SNPS

La rapidez a la que se descubren nuevos SNPs y la necesidad de estudiarlos en un gran nmero de muestras lleva asociada la bsqueda de nuevas tecnologas de alto rendimiento para el genotipado. Para llevar a cabo el genotipado es interesante diferenciar el mtodo de deteccin del principio de reaccin. El principio de reaccin se basa en la propiedad bioqumica del mtodo de genotipado y bsicamente podemos hablar de 6 principios diferentes:

Enzimas de restriccin (RFLPs) las endonucleasas de restriccin se usan para producir cortes alelo especficos en un punto del ADN en algunos casos, un SNP puede alterar la secuencia que es reconocida por un enzima de restriccin, por tanto, tendremos molculas de ADN con su secuencia inalterada que sern cortadas, mientras que las molculas de ADN que presenten la variante del SNP no sern cortadas y viceversa.

Hibridacin con sondas oligonucleotidicas alelo especficos (ASOS) Diseamos dos sondas, cada una contiene en el medio de la secuencia unos de los nucletidos complementarios a la variante alelica del SNP. Solo en el caso de que se produzca la unin correcta de la sonda con el nucletido correspondiente a la variante alelica, generara un hibrido estable.

Extensin de primer alelo especifica Se basa en el diseo de dos primers que se unirn a la secuencia inmediatamente adyacente al SNP; cada uno de los primers tie ne en su extremo 3 uno de los nucletidos complementarios a la variante alelica. Solo cuando se produzca una

unin correcta en el etremo 3 del primer con el SON, se llevara a cabo la extensin por la polimerasa que cataliza la reaccin

Minisecuenciacion

Ha sido la tcnica escogida en esta tesis para llevar a cabo el estudio de SNPs. Es un proceso similar a la extensin de primer alelo especfico pero con pequeos matices. La principal diferencia es que las sondas diseadas no llevan la posible variante alelica en el extremo 3 , por lo que el extremo 3 de la sonda acaba justo en el nucletido situado antes de SNP. Ahora bien, cuando se lleva a cabo la extensin por la polimerasa, lo que tenemos son unos didesoxinucleotidos marcados que se unirn en funcin de la variante alelica presente. El termino didesoxi indica que la ribosa que forma parte del nucletido carece de OH en los carbonos 2 y 3. Sin el 3 OH un didesoxinucleotido no puede intervenir en la continuacin de la polimerizacin ya que queda impedida la unin con el siguiente didesoxinucleotido o desoxinucleotido. Asi, tendremos sondas de un tamao determinado y con distinta fluorescencia en funcin del didesoxinucleotidos aadido.

Oligonucleotide ligation (OLA)

Necesitamos crear un par de sondas alelo especificas que presentaran en uno de sus extremos (en el 3 o 5 dependiendo como se diseen) un nucletido u otro, en funcin de la variante alelica. Tambin se disea una sonda que se unir a las sondas alelo especficas solo cuando se produzca la unin correcta entre el nucletido del extremo de la sonda y la variante alelica

Invaside cleavage

Diseamos dos sondas alelo especificas en las cuales a partir del extremo 5 del SNP la secuencia de la sonda no coincide con la secuencia del blanco. Tambin

se disea una sonda invasora que si es complementaria a la secuencia 5 del SNP. Cuando la sonda alelo especifica se une a la variante correcta del SNP, entran en accin unas enzimas denominadas FLAP endonucleasas que cortan la sonda alelo especifica por la zona donde est la variante alelica en 5, y se une a continuacin de la sonda alelo especifica la sonda invasiva.

Para poder analizar el resultado de estos principios de reaccin recurrimos a una serie de mtodos de deteccin que se basan en aprovechar las propiedades fisicoqumicas del producto que queremos genotipar, entre estos mtodos cabe destacar.

ANLISIS DE HIBRIDACIN DE OLIGONUCLETIDOS

Hay posiciones de un genoma en las que algunos individuos tienen un nucletido ej.: Guanina (G) y otros tienen un nucletido diferente ej. Citosina (C). En todo genoma hay grandes cantidades de SNP (ms de cuatro millones en el genoma humano), algunos de los cuales tambin dan origen a RFLP, pero muchos no porque la secuencia en la que residen no es reconocida por ninguna enzima de restriccin. Como cualquiera de los nucletidos podra estar presente en cualquier posicin del genoma, cabria imaginar que cada SNP debera tener cuatro alelos. Si bien esto es posible en teora, en la prctica la mayora de los SNP existen solo dos variantes alelicas. Esto se debe a que cada SNP se origina cuando ocurre una mutacin puntiforme en un genoma, que convierte un nucletido en otro. Si la Mutacin afecta las clulas reproductivas del individuo, uno o ms de sus descendientes podran heredar la mutacin y despus de muchas generaciones, el SNP puede quedar establecido en la poblacin. Pero hay solo dos Alelos: La secuencia original y la versin mutada. Para que surja un tercer alelo debe tener lugar una nueva mutacin en la misma posicin del genoma de otro individuo y ste y su descendencia se deben reproducir de manera que el nuevo alelo quede establecido. Este cuadro no es imposible. Pero es improbable: en consecuencia, la vasta mayora de los SNP son biallicos. Esta desventaja es ms que superada por la enorme cantidad de SNP presentes en cada genoma: en la mayora de los eucariontes, por los menos uno de cada 10 Kb de DNA. Por lo tanto, los SNP permiten construir mapas muy detallados del genoma.

La importancia que han cobrado los SNP en la investigacin de los genomas ha estimulado el desarrollo de mtodos rpidos para su tipificacin. Varios de los cuales se basan en el anlisis de hibridacin de oligonucletidos. Un Oligonucletido es una molcula de DNA de una sola cadena corta, en general de menos de 50 nucletidos de longitud, que es sintetizada en un tubo de ensayo. Si las condiciones son correctas, entonces un oligonucletido se hibridara con otra molcula de DNA, solo si el oligonucletido forma una estructura totalmente apareada por bases con la segunda molcula. Si hay un error de apareamientouna sola posicin dentro del oligonucletido que no forme un par de bases no tiene lugar la hibridacin. Por lo tanto, la hibridacin de oligonucletidos discrimina entre dos alelos de un SNP. Se han elaborado varias estrategias de investigacin basadas en la hibridacin de oligonucletidos entre ellas:

Tcnicas de Chips de DNA. Utiliza una oblea de vidrio de silicona de 2cm2 o menos que contiene muchos oligonucletidos diferentes en una matriz de alta densidad. Se marca el DNA que va a ser investigado con una sustancia fluorescente y se lo pipetea sobre la superficie del Chip. La hibridacin se detecta examinando el chip con un microscopio de fluorescencia y las posiciones que emiten la seal fluorescente indican que oligonucletidos se han hibridado con el DNA investigado. Por lo tanto, es posible estudiar muchos SNP en un solo experimento.

Tcnicas de hibridacin en Solucin. Se practican en los pocillos de una bandeja de micro titulacin. Cada uno con un oligonucletido diferente: utilizan una sola cadena. No hibridado, y el producto de doble cadena que se origina cuando un oligonucletido se hibrida con el DNA investigado, se han creado varios sistemas, uno de los cuales utilizan un par de marcadores que consisten en un colorante fluorescente y un compuesto que extingue la seal fluorescente cuando se aproxima mucho al colorante. El colorante se un extremo del oligonucletido y el compuesto extintor, al otro. Por lo general no hay fluorescencia, porque el oligonucletido est diseado de modo que en los extremos aparean sus bases entre s, lo que aproxima el extintor al colorante. La hibridacin entre el oligonucletido y el DNA investigado rompe este apareamiento de bases, lo que aleja al extintor del colorante y permite que se genere la seal Fluorescente.

Otro mtodo de tipificacin utilizan un oligonucletido cuyo error de apareamiento con el SNP se produce en su extremo 5 y 3. En condiciones apropiadas, un oligonucletido de este tipo se hibridar al DNA molde con error de apareamiento mediante una cola corta sin bases apareadas. Esta caracterstica se utiliza de dos maneras:

Anlisis de ligamento de oligonucletidos. Se utilizan dos nucletidos que se hibridan, adyacentes entre s, con el extremo 3de uno de los oligonucletidos ubicados exactamente en el SNP. Este formara una estructura completamente apareada por bases si hay una versin del SPN en el DNA molde, y cuando esto ocurre el oligonucletido se puede ligar a su compaero. Si el DNA examinado contiene el otro alelo del SNP, el nucletido 3del oligonucletido de prueba no se hibridara al molde y no habr ligamiento. En general por corrida de mezcla posreaccin en un sistema de electroforesis capilar.

Sistema de Mutacin refractario a la amplificacin o Prueba ARMS. Basado en el mismos principio que el OLA. Pero emplea como oligonucletido de prueba uno de un par de cebadores del PCR. Si el cebador de prueba se hibrida al SNP, puede ser extendido por la Taq Polimerasa y se puede tener lugar la PCR. Pero si no se hibrida, porque est presente la versin alternativa del SNP, no se genera ningn producto de la PCR.

APLICACIN DE LOS POLIMORFISMOS

El estudio de los polimorfismos tiene muchas aplicaciones en medicina, investigaciones biolgicas y procesos jurdicos. En algunos casos las enfermedades genticas pueden ser causadas por polimorfismos. De esta forma, los investigadores pueden usar los polimorfismos como marcadores de ciertas enfermedades, por ejemplo, si el presentar ciertos polimorfismos puede ser causal de riesgo para el desarrollo o progresin de alguna enfermedad. Los polimorfismos localizados cerca de un gen candidato pueden ser usados para hallar el gen por s mismo a travs de un mapeo gentico. En este proceso el investigador est en bsqueda de polimorfismos que son heredados junto con la

enfermedad, tratando de delimitar estos polimorfismos en regiones ms y ms pequeas del cromosoma. As, la regin del cromosoma implicada en la enfermedad puede ser progresivamente delimitada, y el gen responsable finalmente puede ser localizado. Los polimorfismos genticos pueden ser usados como marcadores para ayudar a esclarecer ciertos patrones y/o procesos biolgicos; adems, pueden establecer parentescos. Tambin se puede determinar la cantidad de entrecruzamiento entre diferentes grupos de la misma especie (flujo gentico), y la informacin ser usada para identificar poblaciones nicas, potencialmente importante para la sobrevivencia de la especie. Puede no ser claro si dos grupos distintos de organismos deben ser clasificados como de diferentes especies y el comparar los polimorfismos genticos de los dos grupos puede ayudar a su clasificacin.

SNP Y ESTUDIOS DE ASOCIACION A ENFERMEDADES Cuando los polimorfismos afectan a las clulas somticas, las clulas no reproductoras no se transmiten a la descendencia, es decir, no son hereditarias (es el caso de la mayora de los cnceres).Los polimorfismos fisiolgicos que no se asocian a una patologa son de inters en estudios familiares y en la identificacin de individuos, as como en investigaciones criminales o biolgicas de paternidad. Tambin son de inters en la expresin diferencial de protenas fisiolgicas y para el anlisis de ligamiento que conduce al mapeo gentico. Los polimorfismos patolgicos asociados a una patologa son de inters en el mundo de la medicina para el diagnstico pre-sintomtico y prenatal de enfermedades gnicas, para la deteccin de individuos portadores o para determinar la compatibilidad en trasplantes. Tambin son de inters para definir riesgos a presentar determinadas enfermedades como Alzheimer o diabetes, y condicionar la respuesta a frmacos. Los estudios de asociacin permiten identificar genes relacionados con distintas enfermedades; a partir de esto han surgido pruebas directas e indirectas para el estudio de prueba directa, el supuesto SNP responsable de una enfermedad es genotipificado directamente. El reto de este tipo de estudios es predecir o determinar a priori cuales SNPS son los responsables del fenotipo de inters muchas de las veces se sospecha de un SNP si este es uno no sinnimo (nsSNP) es decir, si el cSNP cambia el aminocido en la protena del gen de inters. Los estudios indirectos de asociacin gentica difieren de las pruebas directamente, pues este tipo de estudios se basa en un anlisis de ligamento gentico el cual utiliza marcadores neutrales. Y no hace predicciones so bre la

localizacin del gen responsable de la enfermedad en estudio. Los estudios de asociacin indirecta son ms frecuentes en estudios de casos- control. A partir de las pruebas indirectas existen dos estrategias que han sido utilizadas para identificar los genes y polimorfismos que estn implicados con el desarrollo de ciertas enfermedades: el anlisis de ligamiento y estudios de asociacin de genes candidatos. El anlisis de ligamento requiere el reclutamiento de familias afectadas, mientras que el estudio de genes candidatos es probado por estudios de asociacin de sujetos no relacionados. Los estudios de polimorfismos pueden ser utilizados para detectar la predisposicin de presentar una enfermedad, e incluso detectarla antes de su desarrollo. Esto es de gran inters en el diagnstico prenatal de enfermedades congnitas. As pues, la enfermedad de origen gentico es la ilustracin ms obvia de una variacin gentica que afecta a la salud. La identificacin precoz de este tipo de enfermedades puede permitir el inicio de un tratamiento preventivo y ms eficaz para atenuar las manifestaciones clnicas de la enfermedad en cuestin. Anlisis de ligamiento El anlisis de ligamiento o escaneo genmico es un mtodo en el cual se hace una bsqueda aleatoria en el genoma para tratar de encontrar los genes asociados a una enfermedad. Este tipo de estudios requiere de cuando menos dos generaciones de las familias afectadas. Posteriormente cada miembro de la familia es geno-tipificado para marcadores de ADN (polimorfismos) que estn esparcidos a lo largo del genoma; a partir de esto se determina cules marcadores son heredados ms frecuentemente con la enfermedad. Los genes son identificados por separado y se determina su posicin en el genoma; al aproximarse a la regin del genoma identificado, el reto es encontrar las mutaciones responsables del fenotipo. Una ventaja de este mtodo es que se pueden encontrar nuevos genes implicados en la patognesis de la enfermedad y no se limita a la bsqueda de polimorfismos en genes que se sabe son causantes de ella. A la fecha, el desarrollo de estos estudios es vasto; entre ellos, encontramos los realizados en artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria, sistmica y crnica con un componente gentico complejo, donde se cree que la enfermedad tiene una patognesis autoinmune, aunque la etiologa precisa se desconoce an. La asociacin de HLA (human leucocyte antige por sus siglas en ingles) con este padecimiento es conocida y se ha confirmado en mltiples estudios de mapeo genmico; asimismo, se han buscado y encontrado nuevos genes involucrados en la susceptibilidad a la enfermedad, que no pertenezcan al HLA. Otro ejemplo son los estudios realizados recientemente sobre la predisposicin gentica a

tuberculosis pulmonar. Se ha realizado un nmero considerable de estudios de asociacin gentica, pero slo algunos son reproducibles. Los resultados ms consistentes son los que implican HLA de clase II y alelos de NRAMP1 y MCP1. Debido a esto, recin se llev a cabo un estudio de mapeo geonmico donde se encontr una fuerte asociacin en la regin cromosmica 8q12-q13.

Estudios de asociacin gentica En stos se buscan polimorfismos individuales de genes implicados en la patognesis de la enfermedad y, as, determinar si existe algn tipo de relacin con ella (riesgo de enfermedad, respuesta a un determinado tratamiento, etc.), para lo que primero se deben identificar genes candidatos que se crea o se sepa es importante en la patognesis de una condicin. Este tipo de genes pueden ser candidatos debido a un extenso estudio de la enfermedad y/o comparando los niveles de expresin gnica en tejidos normales y enfermos (a travs de microarreglos de RNA mensajero o PCR en tiempo real); el siguiente paso es identificar los diferentes polimorfismos sobre el gen que pudieran estar afectando su funcin, y finalmente examinar si los polimorfismos elegidos ocurren ms frecuentemente en individuos que tienen la enfermedad con respecto a una poblacin control, o si este tipo de variacin predice el desarrollo de la enfermedad en un estudio de cohorte. La regresin logstica es el mtodo clsico para la combinacin lineal de varios genotipos y su interaccin pero cuando el nmero de SNPs seleccionado es elevado, estos mtodos requieren la enumeracin de varios trminos de interaccin que dificultan su interpretacin y aplicacin. En estos casos, la alternativa es un modelo computacional ms complejo que soporte mayor nmero de interacciones. Los estudios de asociacin gentica de rasgos complejos a menudo son mal interpretados y pobremente reproducibles.

Habitualmente los SNPs se utilizan por tanto como marcadores genticos. Estas variaciones pueden ser en s mismas funcionales y estar relacionadas con la fisiopatologa de la enfermedad. Los dos acercamientos posibles son el del gen candidato cuando existe evidencia previa de la funcionalidad de la variante, o el de asociacin indirecta que consiste en evaluar un mapa denso de SNPs para la asociacin. Tambin existen estudios denominados de ligamiento (linkage) que genotipan una serie de polimorfismos repartidos por todo el genoma en familias grandes con varios miembros afectados y sus anlisis permiten identificar zonas

del genoma de inters pero tienen poca resolucin. Actualmente, la tcnica de asociacin genmica amplia (GWA, wide genome association) est siendo utilizada para la realizacin de un cribado del genoma completo con el fin de establecer posibles sitios de asociacin. Los estudios de GWA genotipan miles de SNPs marcadores para estudiar las bases genticas de las enfermedades complejas, validan los SNPs ms significativos por genotipado en nuevas cohortes y realizan un mapeo fino de los SNPs adyacentes a los validados.

Una de las ventajas en este tipo de estudios de asociacin es que los sujetos de estudio son individuos no relacionados, y no se requieren datos fenotpicos ni genotpicos de mltiples generaciones; sin embargo, una asociacin positiva puede no ser debida siempre a un papel causal del polimorfismo. Por ejemplo, puede haber asociaciones de falsos-positivos si un grupo tnico diferente (con distinta frecuencia del polimorfismo) est sobre representado en el grupo de casos o control.

APLICACIONES DE SNPS EN RELACIN CON LA HEPATITIS C CRNICA Los factores genticos heredables influyen en el riesgo de desarrollo o curso clnico de una variedad de enfermedades y pueden afectar a la respuesta al tratamiento. En el caso de hepatitis C crnica, gran cantidad de publicaciones han sugerido que un nmero de polimorfismos genticos pueden influir en la progresin de la infeccin de hepatitis C crnica o en la respuesta de pacientes a la terapia antiviral.

SNPs y su valor pronstico en la progresin de la hepatitis C crnica En la infeccin por el VHC, algunos pacientes presentan una mnima progresin de la enfermedad mientras que otros desarrollan un estado de enfermedad heptica grave caracterizada por niveles altos y persistentes de transaminasas, fibrosis heptica, cirrosis y CHC. Muchas investigaciones se estn encaminando a la bsqueda de factores del husped que puedan predecir el curso de la enfermedad. Existen muchas caractersticas como la edad, el sexo masculino y el consumo de alcohol que ya se sabe que son factores de riesgo asociados con la progresin de enfermedad heptica. Sin embargo, incluso para pacientes de la misma edad, sexo y similar consumo de alcohol existen diferentes estilos de

progresin de enfermedad. Por ello, es interesante proceder al estudio de factores genticos del husped para determinar si polimorfismos especficos estn asociados con la progresin de la hepatitis C [12] y poder saber de antemano qu pacientes son los que probablemente desarrollarn la enfermedad heptica. Esto permitira un uso ms racional de la terapia, y potencialmente ayudara a la identificacin de nuevas dianas teraputicas. Hasta la fecha, se han realizado numerosos estudios para examinar una amplia variedad de genes candidatos en la progresin de la enfermedad heptica y, aunque se han identificado algunas asociaciones importantes, los resultados son difciles de interpretar por la ausencia de significado biolgico en algunos casos [13]. Debido a la importancia que tiene el efecto del sistema inmune en el resultado de la infeccin por el VHC, se ha estudiado profusamente el efecto de polimorfismos presentes en el CMH en la progresin de la enfermedad. Uno de los hallazgos ms significativos ha sido la asociacin de haplotipos de DRB1 con niveles ms bajos de ALT y con un curso de enfermedad ms leve [14, 15]. Numerosos polimorfismos en genes de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento se han relacionado con la replicacin del VHC, la persistencia de la infeccin por el VHC, la gravedad de la enfermedad y el dao heptico. Valgan como ejemplos los polimorfismos en IL-2, IFN-gamma, IL-10 y TNF-alfa [16, 17]. Tambin, se ha estudiado la relacin de polimorfismos en diferentes componentes de la ruta del IFN con la progresin de la enfermedad.

Farmacogenmica: SNPs como predictores de la respuesta al tratamiento en la hepatitis C crnica La infeccin crnica por el VHC es un gran problema tanto a nivel mundial como a nivel del paciente individualizado. Parte del problema se relaciona con el hecho de que el tratamiento actual del VHC es caro, se encuentra asociado a importantes efectos secundarios y la respuesta virolgica sostenida se limita a un bajo porcentaje de pacientes. Por ello, sera muy til predecir la probabilidad de respuesta al tratamiento antes de iniciar el mismo (o poco tiempo despus) ya que esto podra orientar la decisin terapetica. Actualmente, las herramientas disponibles para la prediccin de la respuesta al tratamiento estn basadas en las caractersticas clnicas y serolgicas, pero no se dispone de indicadores clnicos que aseguren la eficacia real de estas terapias a largo plazo. La identificacin de genes de susceptibilidad permite una mejor comprensin de los mecanismos de los procesos de las enfermedades y facilita el descubrimiento de nuevos y ms eficaces medicamentos. Los mapas de SNPs de todo el genoma tambin permiten

la creacin de perfiles de SNPs abreviados para ser utilizados en aplicaciones farmacogenticas, permitiendo a los clnicos adaptar los regmenes teraputicos (por ejemplo, identificar los pacientes susceptibles de recibir un beneficio teraputico y no sufrir reacciones adversas). Una gran cantidad de los trabajos recientemente publicados examinan la capacidad de diferentes SNPs para predecir la respuesta al tratamiento. La mayora de ellos estudian polimorfismos presentes en CMH, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y otros componentes que participan en rutas de inmunidad innata y adaptativa.

SNPs en el gen OASL como predictores de respuesta al tratamiento La familia de protenas OAS contiene OAS1, OAS2, OAS3 y OASL. El 2 -5 oligoadenilato sintetasa (2-5 OAS) es inducido por el IFN y juega un papel antiviral clave por su actividad cataltica en el aclaramiento viral. OASL es reconocido como una molcula importante en la respuesta antiviral.

Genes estimulados por el IFN y familia de genes OAS La unin de IFN-alfa/IFN-beta e IFN-gamma a sus receptores lleva a la formacin de factor gnico 3 estimulado por IFN (ISGF3), una protena que activa la transcripcin del gen STAT1 e induce la formacin de heterodmeros entre STAT1, STAT2 y p48 (o homodmeros de STAT1) respectivamente. Estos complejos homodimricos se traslocan al ncleo y producen una regulacin transcripcional de los miembros de la familia OAS, de la protena quinasa dependiente de dsARN (PKR) y de la protena MxA entre otras [24, 25]. La enzima 2 -5 oligoadenilato sintetasa (2-5 OAS) fue una de las primeras protenas antivirales caracterizada. Es producida como una enzima latente en las clulas estimuladas con IFN y su actividad enzimtica es inducida por unin al dsARN proveniente principalmente de la replicacin viral. El complejo activo OAS-ARN convierte ATP en PPi llevando a la formacin de 2-5 oligoadenilatos (2-5A). 2-5A se une a una endorribonucleasa latente, RNasa L, desencadenando la formacin de la enzima dimrica RNasa L activa la cual degrada dsARN (figura 8). Por lo tanto, el sistema 2-5 A constituye una ruta regulada y activada en respuesta a la infeccin viral disminuyendo la produccin de protenas virales .

Las protenas OAS pertenecen a una familia altamente conservada, y no guardan homologa de secuencia con otras protenas. OAS1, OAS2, OAS3 presentan 1, 2 y 3 repeticiones de la unidad basal OAS. OASL por su parte se compone de una unidad OAS y un dominio C-terminal homlogo a una repeticin de ubiquitina en tndem [26]. OASL es una protena con actividad antiviral frente a ARN de cadena simple actuando a travs de mecanismos diferentes a otras protenas OAS [27]. El gen de OASL produce una protena que es capaz de unirse a dsARN pero que es enzimticamente inactiva [28] porque no posee 2 de los 3 residuos de cido asprtico en algunas cadenas beta que son importantes para su actividad cataltica y adems, posee mutaciones en el asa P que participan en la unin al ATP. OASL interfiere con el sistema 2-5 A bloqueando la activacin de otras OAS quiz por su unin a dsARN .