**#ñ-*ffñ-

ADSORCION PARTICION

activa polar lipófila apolar

ripóf¡ta ripotiru
J niorotira
Yhidrófitu

Fr"#""*[*l fs*a"."b"*l,-|

de las condicionesapropiadasde separación(extraídode

Fig.13: Esquemaparaladeterminación
n8D.

a - Hexano

Tetracloruro
o de carbono Poder de elu-
ción crec¡ente

rs
del eluyente
- Benceno

Clorurode
@ - metileno

o
2.5 c m
-
Cloroformo
(+ 1 % etanol) Fig. 14: Pruebade la manchapara la determi-
nación del eluyente adecuado (extraído de
tlel).

ajuste.Graciasa los esquemascitadosno hacefalta probara ciegas.¿Quéeluyentedebe

elegirse?
Unagranayudala proporciona la sencilla"pruebade la mancha"(Fig.14)[19].Seaplicavarias
veces,de manerapuntualy a distancias la disolución
de pocoscentímetros, de lassustancias
a separarsobre el sorbentedeseado.Trasdejar evaporarel disolvente,se apoya sobre el
centrode cada manchaun capilardelgadollenode eluyente.El podercapilardel sorbente
haceque el fluídose extiendaen formacircular,separandoeventualmente las sustanciasen
forma de cromatogramacircular.Por comparaciónde estas pruebas rápidas pueden
estimarseel eluyentey el sorbentemás favorables.En el ejemplo mostrado en la Fig. 14 el
benceno*es el más apropiado.Paraotrastareasde optimización puede utilizarse la cubeta
Vario-KS(verFig. 35 en el Capítulo3).
El CapÍtulo3, a continuación,nos va a presentarlas etapasdel trabajopráctico.

* por razonesde seguridad,el benceno deberíareemplazareactualmentepor tolueno.

25
3 Parte práctica

El desarrollopráctico de la cromatografía
de capa fina consta esencialmente
de un
procedimientoprincipal,un procedimientofacultativoy medidascomplementarias(Fig.
t5l.

Las etapasdel procedimiento principal- aplicaciónde la muestra,desarrollo,

deteccióny
evaluación - son componentes irrenunciablesde toda cromatografía.Las medidasfaculta-
tivas(prelavado de la capa,derivatizaciónpre-y postcromatográfica,
preacondicionamiento)
permiten,en muchoscasos,influireficazy favorablemente la
en sensibilidad, selectividad,
separación y su reproducibilidad.
Lasmedidascomplementarias incluyenla preparaciónde la
muestraantesde su aplicación, de maneraadecuadaa laseparación,y laelecciónde lacapay
el eluyente.
A menudo,tambiénse incluyenen estasmedidascomplementarias el examende
la separaciónpor luz UV y la documentación del cromatogramal2O).

3.1 Fabricaciónde las capas

El usuariotiene hoy en día a su disposiciónuna multitudde sorbentesy tipos de capas
preparadaspara cromatografíade capa fina. La oferla es por lo generalsuficientemente
completa,por lo que la mayoríade las vecesno es necesarioque el usuariofabriquesus
propiascapas.
de lasplacasde CCFcuandolasquese precisenno
Sóloconvieneefectuarel revestimiento
estén disponiblesen el mercado.Como ejemplospuedenconsiderarselas capas que
contienensustanciastampón,reactivosespecialesu otrosligantes,o biencapasformadas
por mezclasde sorbentes.
En generalel revestimientose efectúasobre
placasde vidrio(detamaño5 x 20 cm, 10x 20
cm o 20 x 20 cm). Las placasse limpian
previamentea conciencia(con polvos de
fregar o detergente)y se aclarancon agua
destilada.A continuación
se introducenenfila
en una plantillay se revistenmedianteun
extendedor(Fig.16).Este procedimiento se
puede automatizar(extendedorautomático
de capas CAMAG).El espesor de la capa
puedeser fijadoarbitrariamenteentre0.1 y 2
mm [21].

Fig. 16: Revestimiento

medianteuna plantilla.

26
- @ >l l t{\
F .=::.l

t-
@t<
W -
W
ffi
Fig. 15: Procedimiento de capa fina.
de trabajoen cromatogr.afía

27
Indicacionesy sugerencias:
- La superficie
de lasplacasde vidriodebeestarlimpiade grasaparaque la capase adhiera
correctamente.flras desengrasar,manejarlassólo con guanteslimpios).
- El revestimientodebe realizarse
rápidamente.
En caso contrariono quedarÍauna capa
homogénea, debidoalarapidezcon quese endurece(p.ej.,pocosminutosen el casode
las placas"G").
- La aplicacióndebe realizarse
a velocidadconstante.
- Debenevitarselascorrientesde aireduranteel procesode secado,puespodrÍanprovocar
la apariciónde grietas.
- Debenseguirsemuycuidadosamente lasindicaciones
de losfabricantes,
ya quecualquier
errorrepercutirá
en peorescapacidadde separación
y reproducibilidad.
- La calidady reproducibilidad
de las capasfabricadaspor el usuarioson generalmente
peoresque la de las preparadas.
La adherencia
de las capases peory su grosormenos
constante.

3.2 Preparaciónde las capas

3.2.1 Activación
Enla superficie
de un sorbentese encuentraun elevadonúmerode centrosactivosen losque
puedenadsorbersesustancias.La cantidadde sustanciaadsorbiday la estabilidadde ra
adsorcióndependen(siendolos demás factoresconstantes)de la fuerza de los centros
activos(energía por unidadde superficie)
superficial y su número(superficie por unidadde
peso).Cuantomayoresseanambosparámetrosmayores la actividaddel sorbentey portanto
el poder de retenciónde la fase estacionaria.Cuandola actividades alta el eouilibno
adsorción-desorciónse desplazahaciala adsorción,
lo queen la prácticasignificarecorridos
más corlos y R¡smenores.
El prerecubrimiento de la capacon desactivadores (generalmente
sustanciaspolares)rebala
su actividad.Enla desactivación de lasplacasconvencionales de CCFinfluyeespecialmente
el vaporde aguadel aire.Las moléculasde agua,muy polares,se acumulanen los centros
activos,disminuyendo la superficiedel sorbente.En pocosminutos(2 a 5) se estableceun
equilibrioentreel aguade la capay el aguadel aire,quedependeúnicamente de la humedad
del aire.
La preparaciónde la placay la aplicación
de muestraacostumbrana durarvariosminutos,por
lo que la actividaddel sorbentereflejageneralmente la humedadrelativadel aire del
laboratorio.
La preactivación de la capasóloseránecesaria
en contadasocasiones,yaqueen
cualquiercaso la actividadvendrádeterminadapor la humedaddel aire de la sala o
laboratorio.
Paraobtenerresultadoscromatográficos se precisancondicionesconstantesy
reproducibles
reproducibles.
Existenunas cubetasespecialesque ofrecenla posibilidadde ajustarla
actividad(acondicionamiento)
congranprecisión
(p.ej.la cubetaCAMAGVarioKSo lacubeta
de dobledeposito,Cap.3.5.3122,231).

28
Indicacionesy sugerencias:
tener una actividadalta para obteneruna elevadaeficaciade
- No es imorescindible
separación.
- El equilibriode adsorción(y por consiguiente depende,comotodo equilibrio,
la actividad)
de la presióny de la temperatura.Lasvariacionesde presióny de temperaturaprovocano
bien la acumulación de aguao su cesiónal ambiente.
- Durantela aplicaciónde la muestrael vaporde aguadel alientopuedehacerdisminuir
localmentela actividad.
- En generalno es necesariopreactivarla capa.
- A veces,sin embargo,se debe activar.En paísestropicalespuede llegara ser incluso
rndispensableparapoderreproducirlas separaciones.
del equitibrio(actividadconstante)dependedel espesorde la
- Eltiempode establecimiento
capay aumentacon éste.
- En general,el efectocatalíticode la capa aumentaal aumentarla actividad.Algunos
eluyentespuedendesproporcionar o condensaral estar en contacto con superficies
act¡vas(p. ej. la acetona).
- Las sustanciaspatróndebenser cromatografiadassobrela mismaplacaque la muestra'
de entradamantienenla influenciade la
- Las salasclimatizadascon compartimentos
constante.
actividadconsiderablemente

3.2.2 Conservacióny Prelavado.

Los sorbentesde gransuperficieadsorbenno sólo el aguasinotambiéntodos los demás
vaporesquese encuentren en el airedel laboratorio.Si se utilizancapasquehanestadolargo
tiempoexpuestasal airedel laboratorio sin ningunaprotección, aparecenextensasregiones
de suciedad(generalmente cerca del frente del eluyenteo del frente F) que impidenla
obtenciónde resultadosreproducibles.
Elenvoltorio de plásticode lasplacascomerciales es permeable a losgases,por lo quesólo
lasaíslahastaun ciertolímitede lasinfluencias del ambiente. La conservaciónen soportesde
placas(p. ej. soportede placasCAMAG)protegedel airedel laboratorioy, por tanto, de las
rmpurezas.
Debidoa su capacidadde adsorcióny según las condicionesde fabricación(duranteel
envasadoestán en contactocon grandescantidadesde aire),los sorbentescontienen
siemprepequeñascantidadesde impurezasprocedentesdel medio ambiente(p. ej.
etc.).
pesticidas,suavizantes,
Porello,en algunoscasospuedellegara ser necesarioprelavarlas capas.
para el prelavadose eluye la capa generalmenteuna vez con una mezclade cloroformo-
El recorridose hace
metanol(1+ 1)o biencon el eluyentequese va a utilizarposteriormente.
más largoque el previstopara el frentedel eluyentedel cromatogramaulterior[24].
lndicacionesy sugerencias:
debe evitarsela
- Si se almacenanlas placas en recipientesde vidrio (desecadores)
de grasade cierre.
utilización
- No sueleser necesarioalmacenarsobreagentesdesecantes'

29
3.3 Preparaciónde las muestras.
En algunoscasos,p. ej. en análisisde trazaso en muestrascon matricescomplejas,no se
puedenaplicarlas muestrasdirectamente sobrela placa,sino que es necesariauna etapa
previade purificacióny/ode enriquecimiento (clean-up).
A partirde la muestraa investigarse
obtieneun crudo,p. ej.medianteextracción, destilación,
sublimación o precipitación
(sólose
citanlos procedimientos de separación más imporlantes). Estecrudopuedesersometidoa
otrasetapasde clean-upantesde la separación definitivapor cromatografía. Estasetapas
deberían, en la medidade lo posible,separarlalssustancia/sa investigarespecíficamente por
gruposo tipos de sustancias[25].
La Tabla2 agrupalos procesosde clean-upmás impofiantes.

Tabla2: Pasosde clean-up.

Denominación Descripción
Disolución Separacióndirecta por solubilizaciónde - Al finalizar debe eliminarse el disol-
los componentesprincipales(extracción
simple).
Extracción La muestra se reparte entre dos disol-
líquido-líquido ventes no misciblesen un embudo de
decantación.La malriz de la muestrase
concentraen un disolventey la sustanciaa
analizaren el otro.
Extracciónen a) Extraccióncon columnasExtrelut[26].
fasesólida (Columnasrellenasde tierra de diato-
meas.) La muestra (hasta 20 ml) se
¡ntroducedirectamente en la columna.
La elucióncon disolventesorgánicos
provoca la separación de todas las
sustanc¡as lipófilas. La fase acuosa
puedefinalmenteser eiuídacon disol-
ventespolares-
y sugerencias
Indicaciones
vente
- El método hace preciso tener buenos
conoc¡mientosquímrcos
- Los componentesde la muestradeben
ser conocidos
- Todos los procedimentosusuales de
extracciónsontransferibles
a esteméto-
oo
- Se evita la formaciónde emulsiones
- Se ahorraneluyentes,materialy tiem-
po
- Los eluatosson puros
- Los factoresde recuperación,así como
la sensibilidadde la detección son
mejores que en la extracciónconven-
cional

b) Extraccióncon columnasadsorbex(co- - lntroducciónde muestra y extracción

lumnas comerciales empaquetadas con disolventeadecuadocomo en a
con fases modificadasquímicamente
que ret¡enenselectivamente
lassustan-
cias).
Placas Las placas con zona de concentración - El estrechamientotiene lugar especial-
espec¡ales procuranconcentrarlas mezclasaplicadas mente en s¡stemasde adsorción
en una banda estrecha.Ocasionalmente
ejercentambiénla funciónde un clean-up,
en la que se separan sustancias inter-
ferentes[271.

Derivatización Transformaciones ouímicasadecuadasal - Es ventajosa cuando trabajar con el

problemapara modificarlas propiedades derivado es más sencillo que con la
cromatográficas[28,29]. oroo¡amuestra
Cromatografía Preseparación de una muestrapor croma- - El trabajo posteriordepende del grado
oe columna tografíade intercambioiónico, de adsor- oe pureza
ción,de particióno afinidaden columnas - Es posible el acoplamiento directo
convenc¡ona¡es. segúnse requiera. HPLC/CCF

30
lndicacionesy sugerencias:
debenhallarsey optimizarse
- Muchosde los procesosde preparación empíricamente.
- Cualquiererrorcometidoen la preparación
se arrastrahastala evaluación
del cromato-
gramaterminado.
- Los utensiliosy disolventesnecesariospara la preparación
de la muestradebenestar
absolutamente limoios.
- Deberíaprepararsesuficientesustanciaparapoderefectuarmedidasde control(determt-
nacionesdobleso múltiples),
- Despuésde la preparación,lasmuestras(especialmente
laslábiles)
deberíancromatogra-
duranteunanochedebeutilizarse
fiarsetan ráoidocomofueraoosible.Paraalmacenar una
nevera.Paraalmacenamientos más largosdebe usarseun congelador.

3.4 Aplicación de las muestras.

3.4.1 Generalidades
(verCap.
En generalse aplicanmuestrasque han sido sometidasa algunapreparación
J.ó1.

La aplicaciónpuedehacersepuntualmente o en formade banda(Fig.17).En general,la

aplicación en formade bandaproduceun menoralargamiento de la manchaen la dirección
del flujo,comparadocon la aplicaciónpuntual.Poreste procedimiento se eliminanen gran
parte las sobrecargas de la capa que pueden conducir a la formación de colas (tailing).
Ademáslas mezclasaplicadasen formade banda se separan mejor y se evalúancon mayor
exactitud.La desventaja resideen que se pueden aplicarpocas bandas por capa [30].
La eleccióndel disolventede la muestraes determinanteparael tamañode la manchade
partida.Algunosdisolventescromatografían en formacircularsobreel mismo
lassustancias
puntode partida,mientrasque otrosno (Fig.18).

n-Hexano

9*

o Toluono áE
-^
oo.

o
o-c
Cloroformo

o Acetona

Fig.17: Comparación puntualy

entreaplicación del disolventesobreel tama-
Fig.18: Influencia
en forma de banda. ño de la manchade partida.

JI
La muestray la sustanciapatróndeberíandisolverseen el mismodisolventeo mezclade
disolventes.
Despuésde la aplicaciónse eliminacompletamente este disolvente
o mezcta,
pudiéndose aumentarla velocidadde evaporación En estecasohay que
con un ventilador.
tener en cuenta que puede alterarselocalmentela concentraciónen la mancha por
evaporaciónasimétricadel disolvente.
En aplicacionespuntualesel volumende muestraaplicadoes, por lo general,de 1 a 5 ul en
cromatografÍade capafinay de 100a 500nl en cromatografía
de capafinade altaresolución
(HPTLC). La concentraciónde la muestrasueleoscilarentre0.01 o/oy 1.OOo/o.
Eldiámetrode lasmanchasde partidano deberíasersuperiora unos5 mm en CCFy 1-2mm
en HPTLC.Hayque evitaren lo posiblela aplicaciónen variasfracciones, dadoque en cada
aplicación sucesivase cromatografíala manchaaplicadaanteriormente (loque se reconoce
por la formade huesoen el cromatograma final).Pesea todo,si es necesario
aplicaren veces
sucesivas, se evaporará el disolventeentrecada aplicación.
Las disolucionesde muestray patrónempleadasen estudioscuantitativos deben,en ro
posible,contenerla mismamalriz.Eventualmente se debeañadirlamalrizde la muestraa las
disolucionespatrónen proporciones
comparables,ya quela presencia
de otroscomponentes
puedealterarlos R1sde las sustanciasde referencia.

3.4.2 Preparaciónde las placas

Normalmente, en primerlugarse marcala líneade comienzoa 1.5cm del bordeinferioren
CCF(aprox.1 cm en HPTLC). A una distanciade 10 a 15 cm (aprox.5-7 cm en HPTLC)se
acota el recorridoprevistodel frentedel eluyente.Las marcasdeben hacersecon un lápiz
blandoy en los bordesexterioresde la placaparaevitard añarla capa.Los puntosde partida
se marcancuidadosamente separados entresí por unadistanciadel a2 cm (aprox.5 mm en
HPTLC)y, empezando desdeel bordede la placa,siguiendola líneade partidaimaginada
(Fig.
19).Las plantillasde aplicaciónhacenmás sencillaestatarea(Fig.20).
La regióncomprendida entrela marcadelfrentey el bordesuperiorde la placapuedeutilizarse
para escribirotros datos adicionalescomo la fecha,las condicionesexoerimentales o la
descripciónde las disoluciones aplicadas(característicasde la aplicación)(Fig.19).
se aplicanpatronesde comparación
En análisiscuantitativos de concentraciónconocidaal
lado de las franjas de análisis.La aplicaciónse realizasegún distintos esquemas,
dependiendo de quesetrabajeconel métodode un patrónde variospatroneso con latécnica
del data-pair[32].
Las cromatografías preparativasse realizanla mayoríade las vecessobreplacasde 20 x20
cm con capasde unos2 mm de espesor.La líneade partidase marcaa 2 o 3 cm por encima
delbordeinferiorde la placa.Sobreestalíneade partidase aplicanhasta200mg de sustancia
disueltosayudándose de unareglay medianteun capilaro unajeringa.Tambiénen estecaso
debeevitarseen lo posibleaplicaren vecessucesivas.Elúnicoprocedimiento adecuadopara
aplicacionesmúltipleses el de pulverización (CAMAGLinomatlV).

3.4.3 Métodos de aplicacióny aparatos.

Paraaplicarse utilizangeneralmente capilareso jeringas[34].Cuandose aplicamediante
capilaresbastael podercapilarde la capaparahacerfluirla solucióna ensayar.
La aplicación
por jeringaes una aplicaciónforzada:la muestrase expulsaal ejerceruna fuerzasobre la

32