http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/01historia.htm 1546 Fracastoro propone que las enfermedades estn causadas por organismos invisibles.

1590-1608 Jansen desarrolla el primer microscopio til compuesto. 1676 Leeuwenhoek descubre "animlculos". 1688 Redi publica su trabajo sobre la generacin espontnea de los gusanos. 1765-1776 Spallanzani refuta la teora de la generacin espontanea 1786 Mller describe la primera clasificacin de bacterias. 1798 Jenner prepara una vacuna contra la viruela humana a partir de viruela vacuna. 1838-1839 Schwann y Schleiden desarrollan la teora celular. 1835-1844 Bassi descubre que una enfermedad del gusano de seda est causada por un hongo y propone que muchas enfermedades son de origen microbiano. 1847-1850 Semmelweis demuestra que la fiebre puerperal est causada por los mdicos e introduce el uso de antispticos para evitarla. 1849 Snow estudia la epidemiologa de una epidemia de clera en Londres. 1857 Pasteur demuestra que la fermentacin del cido lctico se debe a un microorganismo. 1858 Virchow afirma que todas las clulas proceden de clulas. 1861 Pasteur demuestra que los microorganismos no se originan por generacin espontnea. 1867 Lister publica su trabajo sobre ciruga antisptica 1869 Miescher descubre los cidos nucleicos. 1876-1877 Koch demuestra que el carbunco est causado por Bacillus anthracis. 1881 Koch cultiva bacterias sobre gelatina. Pasteur prepara la vacuna contra el carbunco. 1882 Koch descubre el bacilo de la tuberculosis. 1884 Se publican por primera vez los postulados de Koch. Metchnikoff describe la fagocitosis. Se desarrolla el autoclave. Se desarrolla la tincin de Gram. 1885 Pasteur prepara la vacuna contra la rabia. 1887 Richard Petri disea la placa de Petri. 1887-1890 Winogradsky estudia las bacterias sulfatorreductoras y fijadoras del nitrgeno. 1888 Beijerinck asla bacterias de los ndulos radiculares. 1890 Von Behring prepara antitoxinas para la difteria y el ttanos. 1892 Ivanowsky presenta pruebas de la relacin causal entre un virus y la enfermedad del mosaico del tabaco. 1895 Bordet descubre el complemento. 1897 Buchner prepara un extracto de levadura que fermenta. Ross demuestra que el parsito del paludismo es transportado por un mosquito 1899 Beijerinck demuestra que una partcula viral causa la enfermedad del mosaico del tabaco. 1900 Reed demuestra que la fiebre amarilla es transmitida por los mosquitos. 1902 Landsteiner descubre los grupos sanguneos. 1903 Wright y otros investigadores descubren anticuerpos en la sangre de animales inmunizados. 1906 Schaudinn y Hoffmann demuestran que Treponema pallidum causa la sfilis .Wassermann desarrolla la prueba de fijacin del complemento para detectar la sfilis. Ricketts demuestra que la fiebre manchada de las Montaas Rocosas es transmitida por garrapatas. 1910 Ehrlich desarrolla un agente quimioteraputico frente a la sfilis. 1915-1917 D'Herelle y Twort descubren virus bacterianos. 1921 Fleming descubre la lisozima. 1923 Se publica la primera edicin del Manual de Bergey. 1928 Griffith descubre la transformacin bacteriana. 1929 Fleming descubre la penicilina. 1933 Ruska desarrolla el primer microscopio electrnico de transmisin. 1935 Stanley cristaliza el virus del mosaico del tabaco Domagk descubre las sulfamidas. 1937 Chatton clasifica los organismos vivos en procariotas y eucariotas. 1941 Beadle y Tatum establecen la hiptesis de "un gen-una enzima". 1944 Avery demuestra que el DNA transporta informacin durante la transformacin.Waksman descubre la estreptomicina. 1946 Lederberg y Tatum describen la conjugacin bacteriana. 1950 Lwoff induce bacterifagos lisognicos. 1952 Hershey y Chase muestran que los bacterifagos introducen DNA en las clulas husped Zinder y Lederberg descubren la transduccin generalizada. 1953 Se desarrolla el microscopio de contraste de fases Medawar descubre la tolerancia inmunitaria Watson y Crick proponen la estructura de doble hlice para el DNA.1955 Jacob y Wollman descubren

que el factor F es un plsmido. Jerne y Burnet proponen la teora de la seleccin clonal. 1959 Yalow desarrolla la tcnica del radioimmunoanlisis. 1961 Jacob y Monod proponen el modelo opern de regulacin de genes 1961-1966 Nirenberg, Khorana ,Severo Ochoa y otros investigadores aclaran el cdigo gentico. 1962 Porter propone la estructura bsica de la inmunoglobulina G. Se sintetiza la primera quinolona antimicrobiana (cido nalidxico). 1970 Arber y Smith descubren las endonucleasas de restriccin.Temin y Baltimore descubren la transcriptasa inversa en retrovirus 1973 Ames desarrolla un ensayo bacteriano para detectar sustancias mutgenas y carcingenas. 1975 Kohler y Milstein desarrollan una tcnica para producir anticuerpos monoclonales. Se descubre la enfermedad de Lyme. 1977 Reconocimiento de las arqueobacterias como un grupo microbiano claro. 1979 Se sintetiza la insulina por tcnicas de DNA recombinante. 1980 Desarrollo del microscopio de tnel de barrido. 1982 Se desarrolla la vacuna recombinante contra la hepatitis B. 1982-1983 Descubrimiento de RNA cataltico por Cech y Altman. 1983-1984 Gallo y Montagnier aslan e identifican el virus de la inmunodeficiencia humana. Mullis desarrolla la reaccin en cadena de la polimerasa. 1986 Se aprueba el uso en los seres humanos de la primera vacuna producida por ingeniera gentica (contra la hepatitis B). 1990 Comienzan los primeros anlisis en genoterapia humana. 1992 Primeros ensayos humanos con terapia gnica antisentido. 1995 Se aprueba la vacuna de la varicela para su uso en EE UU. Se obtiene la secuencia del genoma de Haemophilus influenzae. 1996 Se obtiene la secuencia del genoma de Methanococcus jannaschii.

CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS

I.- DEFINICIONES Y CONCEPTOS Esterilizacin : eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas. Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos. Antisepsia: operaciones o tcnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el desarrollo de los microorganismos e incluso pueda matarlos. Asepsia: tcnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos al campo de trabajo. Antibiosis: fenmeno biolgico en el que existe una detencin o destruccin del crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo. Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos (antibacterianos, antifngicos, etc.). Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida, etc.). Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos (bacteriostticos, fungistticos, etc.). Antispticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo. Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados. Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones. Agentes quimioteraputicos: sustancias qumicas empleadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferacin de clulas malignas.

Antibiticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo.

II.- MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE SUPERVIVENCIA Criterio de muerte de un microorganismo : prdida irreversible de la capacidad de reproduccin en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microorganismos) se utilizan tcnicas que descubran a los sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse estn muertos. Esto se determina generalmente mediante mtodos cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias. Cuando una poblacin microbiana se expone a un agente letal, la cintica de la muerte es casi siempre exponencial ya que el nmero de supervivientes disminuye de forma geomtrica con el tiempo. Si representamos grficamente el logaritmo del nmero de supervivientes frente al tiempo se obtiene una lnea recta cuya pendiente negativa define la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice slamente que fraccin de la poblacin inicial sobrevive a un determinado perodo de tratamiento. Para determinar el nmero real de sobrevivientes es necesario conocer adems el tamao inicial de la poblacin. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilizacin hay que tener en consideracin dos factores: la tasa de mortalidad y el tamao de la poblacin inicial. En la prctica de la esterilizacin la poblacin microbiana que ha de ser destruida es mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamao de la poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms resistentes de la poblacin mixta. Para asegurar la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin se utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de esterilizacin se disean siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

III.- CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA Temperatura : a mayor temperatura mayor accin. Tipo de microorganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms susceptibles que las esporas. Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables que las viejas. Ambiente:

El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetracin del agente. Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia trmica de los organismos.

La presencia de materia orgnica extraa reduce notablemente la eficacia de los agentes qumicos antimicrobianos por inactivar stos o proteger al microorganismo.

IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS 1.- Altas Temperaturas La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los mtodos ms efectivos para destruir microorganismos. Hay que distinguir entre calor hmedo y calor seco. El hmedo mata los microorganismos porque coagula sus protenas siendo ms rpido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes qumicos. La accin letal del calor es una relacin de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120 C en calor hmedo, mientras que se necesitan alrededor de 2 horas de exposicin al calor seco para obtener los mismos resultados. A.- Esterilizacin por calor hmedo: (se utiliza para soluciones acuosas) Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agente ms prctico para esterilizar ya que el vapor a presin proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullicin. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presin interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la presin atmosfrica lo cual corresponde a una temperatura de 120 C. El tiempo de exposicin depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor emplendose en estos casos otros mtodos de esterilizacin. Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse por encima de 100 C sin que resulten daadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 das con sucesivos perodos de incubacin. Las esporas resistentes germinarn durante los perodos de incubacin y en la siguiente exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas. Pasteurizacin: La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas (cerveza y vino) se someten a tratamientos de calor controlado que slo matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estril. La temperatura seleccionada para la pasteurizacin se basa en el tiempo trmico mortal de microorganismos patgenos (es el tiempo ms corto necesario para matar una suspensin de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microorganismos patgenos ms resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60 C. Posteriormente se descubri que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es ms resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurizacin de la leche se realiza a 62,8 C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7 C durante 15 segundos (Flash-Pasteurizacin). B.- Esterilizacin por calor seco: (se utiliza para materiales slidos estables al calor)

Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposicin a 160 C. Incineracin: La destruccin de los microorganismos por incineracin es una prctica rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineracin tambin se utiliza en la eliminacin de residuos hospitalarios.

2.- Bajas Temperaturas En general, el metabolismo de las bacterias est inhibido a temperaturas por debajo de 0 C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos perodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por los microbilogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70 C o incluso mejor en tanques de nitrgeno lquido a -196 C.

3.- Radiaciones A.- Radiaciones ionizantes Rayos gamma : Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas por ciertos istopos radiactivos como es el Co60 pero son difciles de controlar ya que este istopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y despus esterilizar. Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones): Se usan para esterilizar material quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar despus de empacado (ya que stas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente. B.- Radiaciones no ionizantes Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la poblacin microbiana en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin de la luz UV son susceptibles de ser destrudos.

4.- Filtracin Algunos materiales como los lquidos biolgicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibiticos) son termolbiles. Otros agentes fsicos como las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprcticos para esterilizarlos,

por lo que se recurre a la filtracin a travs de filtros capaces de retener los microorganismos. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeo tamao de los poros del filtro y en parte por adsorcin a las paredes del poro durante su paso a travs del filtro debido a la carga elctrica del filtro y de los microorganismos. Debido al pequeo tamao de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los mtodos de filtracin que dejan libre de bacterias una solucin, se van a eliminar tambin los virus. A.- Filtros de membrana Los filtros de membranas son discos de steres de celulosa con poros tan pequeos que previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volmenes de agua. B.- Filtros HEPA Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.

5.- Desecacin La desecacin de las clulas vegetativas microbianas paraliza su actividad metablica. Este proceso fsico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeracin. El tiempo de supervivencia de los microorganismos despus de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son ms susceptibles a la desecacin que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecacin pudiendo permanecer viables indefinidamente.

V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS 1.- Oxido de etileno : El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es que sea voltil as como txico para los microorganismos, de manera que pueda ser fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. Normalmente se utiliza el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H). 2.- Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.

VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Esterilizacin : es el proceso de destruccin de todas las formas de vida microbiana. Desinfeccin: es el proceso de destruccin de los agentes infecciosos. Desinfectantes: son aquellas sustancias qumicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos patgenos. Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados. Antispticos: son aquellas sustancias qumicas que previenen el crecimiento o accin de los microorganismos ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

A.- INORGANICOS 1.- Metales : Los ms efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actan inactivando las protenas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antispticos en heridas superficiales de la piel y mucosas estn el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antispticos est el nitrato de plata (AgNO3) que en solucin al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonoccicas en los ojos de los recin nacidos aunque actualmente se est reemplazando por antibiticos como la penicilina. Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. Tambin es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Los compuestos de zinc tambin son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pi de atleta. 2.- Acidos y lcalis: Actan alterando la permeabilidad y coagulando las protenas. En general los cidos son ms eficaces que los lcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran el sulfrico (H2SO4), ntrico (HNO3), hidrxido sdico (NaOH) e hidrxido potsico (KOH). Tienen aplicacin limitada debido a su naturaleza custica y corrosiva. An as el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera. 3.- Compuestos inorgnicos oxidantes: actan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volmenes) se utiliza como antisptico en pequeas heridas de la piel. 4.- Halgenos: Los halgenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halgenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las clulas microbianas. Cloro: La muerte de los microorganismos por accin del cloro se debe en parte a la combinacin directa del cloro con las protenas de las membranas celulares y los enzimas. As mismo en presencia de agua desprende oxgeno naciente (O) que oxida la materia orgnica: Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (cido hipocloroso) HClO ----------------> HCl + O (oxgeno naciente) El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfeccin del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sdico (leja) al 1% se puede utilizar como desinfectante domstico. Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su accin antimicrobiana es debido a su accin oxidante. Adems la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el

aminocido tirosina resulta en la inactivacin de enzimas y otras protenas. El iodo se puede utilizar como antisptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solucin alcohlica (tintura) de iodo (I2) ms ioduro potsico (KI) o ioduro sdico (NaI). ii) iodforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actan como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona (PVP). Los iodforos tienen la ventaja de que no tien la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel as como en la desinfeccin de pequeas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.

B.- ORGANICOS 1.- Alcoholes : El alcohol metlico (1C) es menos bactericida que el etlico (2C) y adems es altamente txico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior al del proplico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actan desnaturalizando las protenas, disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antisptico de la piel y como desinfectante en los termmetros clnicos orales y algunos instrumentos quirrgicos. 2.- Fenol y compuestos fenlicos: Una solucin acuosa al 5% de fenol mata rpidamente a las clulas vegetativas de los microorganismos. Sin embargo, las esporas son mucho ms resistentes al fenol. Debido a que el fenol es txico y tiene un olor desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antisptico, siendo reemplazado por compuestos fenlicos que son sustancias derivadas del fenol menos txicas y ms activas frente a los microorganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenlicos que se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y compuestos fenlicos actan alterando la permeabilidad de la membrana citoplsmica as como desnaturalizando protenas.

VII.- EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS 1.- Tcnica de dilucin en tubo : Primero se realizan diferentes diluciones del agente qumico. El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en tubos estriles. A cada tubo se le aade la misma cantidad de una suspensin del microorganismo utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alcuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura ptima de crecimiento del microorganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la aparicin de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilucin a la cual ese agente qumico mata al microorganismo utilizado como prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente qumico durante ese perodo de tiempo. 2.- Tcnica de la difusin en placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo slido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente qumico se

coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibicin (crecimiento -) alrededor del agente qumico. Una modificacin de esta tcnica es la incorporacin del agente qumico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano. 3.- Tcnica del coeficiente fenlico: Es una tcnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder desinfectante de un agente qumico frente al del fenol. Es una modificacin de la tcnica de dilucin en tubo tal como se describe a continuacin: (i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba (cepas especficas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparicin de turbidez). (vi) La mayor dilucin del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos resultados. El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese desinfectante.