UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMIRIDO DEPARTAMENTO DE CINCIAS ANIMAIS DCAN BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA: ENZIMOLOGIA E TECNOLOGIA DA FERMENTAO DOCENTE:

: PROF. KAROLINE SOARES

MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES NA SNTESE DE PRODUTOS

LU REIS DOS SANTOS MOTA

MOSSOR MARO DE 2013

LU REIS DOS SANTOS MOTA

MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES NA SNTESE DE PRODUTOS

MOSSOR MARO DE 2013

1 REVISO DE LITERATURA

1.1 INTRODUO A utilizao de um microrganismo em um processo biotecnolgico envolve geralmente a produo de algum composto de interesse. No entanto, as espcies que so encontradas na natureza normalmente no produzem grandes quantidades de metablitos, somente o necessrio para a sobrevivncia. Por isso, cabe ao biotecnologista melhorar essa produo para poder aplic-la em escala industrial. Para atingir esse objetivo, podem-se utilizar dois mtodos. O primeiro seria definido como a biotecnologia convencional, ou seja, a otimizao das condies fisiolgicas e nutricionais do meio de cultivo onde o microrganismo cresce. Essa tcnica pode apresentar bons resultados, mas s vezes no suficiente, pois h a limitao da capacidade mxima de sntese do microrganismo. Poucas indstrias utilizam cepas silvestres nos seus processos de produo. A produo de mutantes mais adaptados para processos uma busca constante na pesquisa de melhoramento de microrganismos. Isso se deve principalmente ao valor econmico de aumento da produo, chegando s vezes at a 100 vezes mais. Processos que envolvem produtos oriundos de um ou poucos genes, como a produo de enzimas, podem ser incrementados somente com o aumento da dose gnica, ou seja, aumento da quantidade do mesmo gene presente na clula e aumento do seu nvel de expresso. J para metablitos secundrios, o processo de melhoramento j mais complicado, pois, como so produtos finais de vias biossintticas, envolve vrias etapas reacionais, e a modificao delas mais trabalhosa. Algumas vezes o objetivo desejado no o melhoramento do produto, mas sim a capacidade de desenvolvimento do microrganismo em determinadas condies ambientais. Podem-se melhorar cepas de forma a obter microrganismos que necessitam tempos de fermentao mais curtos, que no produzam metablitos indesejveis (barateando o custo de recuperao do produto), que necessitam de menos oxignio ou que so capazes de utilizar determinados substratos como resduos agroindustriais. A manipulao gentica pode ser muito utilizada pela biotecnologia, pois uma ferramenta muito til para aumentar o rendimento da produo, melhorar a qualidade do processo de produo, melhorar as caractersticas do produto (como na melhoria de enzimas conferindo maior especificidade e termoestabilidade), produzir produtos j existentes por outras vias alternativas, e produtos novos produtos no encontrados na natureza. A modificao do material gentico pode ser feita de duas formas: ao de agentes mutagnicos ou a produo de DNA recombinante. A mutagnese de microrganismos permite a criao de gentipos diferentes da clula original atravs da alterao aleatria dos genes. J a recombinao permite um rearranjo de genes que permite a insero de material gentico de vrias fontes em um s microrganismo. A mudana qumica no DNA, independente de ser por mutagnese ou recombinao, um fator necessrio, mas muitas vezes insuficiente para a produo de um mutante, pois antes de se observar uma populao de clulas modificadas capazes de passar o novo

material gentico para as futuras geraes necessrio lidar com os mecanismos de reparo da clula, a transcrio e traduo da informao, e tambm o enriquecimento do meio de cultura com os mutantes desejados. Mutaes favorveis para a produo de determinado produto muitas vezes podem acarretar na modificao das necessidades ambientais da clula. Portanto, aps a seleo de um mutante necessrio determinar os novos parmetros de cultivo necessrios para o melhor aproveitamento das potencialidades do microrganismo atravs da biotecnologia bsica. Ao mesmo tempo pode-se tentar melhorar ainda mais a cepa mutante atravs do outras mutaes, ou seja, o processo de melhoramento de uma cepa envolve a modificao gentica contnua da cultura e determinao dos novos parmetros operacionais. 1.2 A GENTICA MICROBIANA A gentica microbiana comeou a ser elucidada com Fred Griffith em 1928, quando se observou a transferncia da virulncia de cepas de Streptococcus pneumoniae. Ele percebeu que quando uma cepa no virulenta da bactria entrava em contato com constituintes da clula inativada de uma cepa virulenta, havia a transformao da cepa no-virulenta, e esta passava tambm a causar a doena. Oswald T. Avery foi quem descobriu que a cepa se transformava devido incorporao de material gentico da bactria inativada, provando que o DNA carregava a informao gentica. Em 1952, Alfred D. Hershey e Martha Chase mostraram que o DNA o material gentico de bacterifagos T2. Eles utilizaram fsforo radioativo para observar se era o material do DNA que penetrava na clula bacteriana e transferia as informaes do fago. Aps esses estudos, vrios outros foram feitos, o que contribuiu muito para o desenvolvimento da biologia molecular, propiciando a obteno de organismos mutantes e de recombinantes. 1.3 A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Desde a elucidao da complexa estrutura da molcula de DNA, em 1953, segundo modelo proposto por Francis Crick e James Watson, a Cincia nunca mais foi a mesma. Mais tarde, em 1958, Crick relaciona o DNA, o RNA e as protenas, salientando o fluxo unidirecional da informao, do DNA protena. Apesar destas descobertas e dos avanos obtidos, de acordo com Nascimento et al (2003) at o incio da dcada de 70 o material gentico dos organismos era o componente qumico mais difcil de ser analisado, quando ento comearam a surgir as primeiras tcnicas de isolamento e purificao de genes especficos, atravs do processo de clonagem gnica. Muitas dessas tcnicas eram provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a molcula de DNA ganhasse um novo enfoque. A partir da tornaram o DNA mais fcil de ser analisado, possibilitando o isolamento de regies especficas da molcula, obt-las em grandes quantidades e determinar a sua

sequncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia (NASCI MENT O et al, 2003; PI ERCE, 2004). Em conjunto, estas descobertas foram decisivas e de fundamental importncia para o surgimento de uma nova rea de pesquisa dentro do campo da Biologia: a Tecnologia do DNA Recombinante. Segundo Pierce (2004), a Tecnologia do DNA Recombinante, tambm chamada engenharia gentica ou simplesmente biotecnologia, um conjunto de tcnicas para localizar, isolar, alterar e estudar segmentos de DNA. O termo recombinante devido frequentemente tais tcnicas serem usadas para combinar o material gentico de fontes distintas, tornando-o bem sugestivo. Atualmente, so em grande nmero os objetivos prticos da pesquisa biotecnolgica, desde a satisfao da curiosidade humana sobre a origem da vida ate ao controle e eliminao de doenas humanas, de outros animais e de plantas, enfim, melhoria da qualidade de vida. Mesmo desconhecidos, ainda, os limites da aplicao prtica da engenharia gentica, sem dvida agora dispomos de tecnologias para soluo de problemas de natureza variada (CANDEI AS, 1991). 1.3.1 O DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Em ltima anlise, a Tecnologia do DNA Recombinante consiste na tcnica de reunio de DNAs derivados de fontes biologicamente diferentes. De acordo com BURNS & BOTTINO (1991), o processo geral baseia-se em trs enfoques experimentais principais: 1.Produo de fragmentos de DNA de fontes diferentes que contenham as seqncias gnicas de interesse; 2.Reunio desses segmentos em uma molcula de DNA capaz de se replicar, normalmente um plasmdeo bacteriano chamado vetor; 3.Transformao de clulas bacterianas com a molcula recombinante de modo que elas se repliquem e ento se expressem. O desenvolvimento desta nova tecnologia s foi possvel pela descoberta, no final dos anos 1960, das enzimas ou endonucleases de restrio. Este tipo de enzima atua como uma espcie de "tesoura biolgica" que, aps reconhecer determinada seqncia nucleotdica, faz corte bifilamentar na ligao acar-fosfato da molcula de DNA, produzindo fragmentos. Elas so produzidas naturalmente por bactrias como forma de defesa contra infeco viral, onde clivam em diversos fragmentos o material gentico dos vrus, impedindo sua reproduo na clula bacteriana. Em contrapartida, a bactria protege seu prprio DNA dessa degradao, modificando sua seqncia de reconhecimento pela adio de grupos metila, fenmeno conhecido como metilao (PIERCE, 1994).

Interessante notar que cada bactria tem suas prprias enzimas de restrio e cada enzima reconhece apenas um tipo de sequncia, independente da fonte de DNA. As enzimas de restrio so de vrios tipos, dependendo da sua estrutura, da sua atividade e de seus stios de reconhecimento e clivagem. Para a Tecnologia do DNA Recombinante as mais importantes e mais usadas so as do Tipo II. Segundo Nascimento et al (2003), atualmente mais de 1000 enzimas de restrio diferentes j identificadas e isoladas de bactrias. A nomenclatura baseada na abreviao do nome do micro-organismo de onde a enzima foi isolada. A primeira letra refere-se ao gnero e as outras duas espcie, seguido deum algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de resistncia RI. Burns & Bottino (1991) afirmam que o stio de reconhecimento das enzimas de restrio do Tipo II normalmente uma sequncia palindrmica, ou seja, apresenta a mesma leitura nos dois filamentos, mas em direes opostas. Assim se a sequncia em um filamento GAATTC lida no sentido 5'3', a sequncia no sentido oposto CTTAAG lida no sentido 3' 5', mas quando ambos os filamentos so lidos no sentido 5' 3' a sequncia a mesma. Portanto, segundo eles, o palndromo apresenta-se da seguinte forma: 5' G A A T T C 3' 3' C T T A A G 5' Estas enzimas reconhecem sequncias especficas de 4 a 8 pares de bases (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Os cortes podem ocorrer no eixo de simetria da sequncia especfica, gerando extremidades abruptas (nodesencontrada), ou fora do eixo de simetria, mas simetricamente, gerando extremidades coesivas (desencontradas, complementares). De acordo com Burns & Bottino (1991), estas ltimas so as de maior importncia para a tcnica do DNA recombinante. Pierce (2004) resume a relevncia das enzimas de restrio para a Tecnologia do DNA Recombinante da seguinte forma: As enzimas de restrio so as operrias da Tecnologia do DNA Recombinante e so usadas sempre que os fragmentos de DNA devem ser cortados ou unidos. Em uma reao tpica de restrio, uma soluo concentrada de DNA purificado colocada em um pequeno tubo com uma soluo tampo e uma pequena quantidade de enzima de restrio. A mistura da reao ento aquecida na temperatura tima para a enzima, geralmente 37 C. Dentro de algumas horas, a enzima corta todos os stios de restrio no DNA, produzindo um conjunto de fragmentos de DNA (PI ERCE, 2004, p. 493). A famlia de fragmentos gerados pela digesto com enzima geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os

fragmentos migram no gel em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente. Depois disso, as bandas de DNA obtidas so visualizadas atravs da tcnica de corao com brometo de etdio, um tipo de corante que fluoresce em laranja brilhante quando iluminada com luz ultravioleta (NASCI MENT O et al, 2003; PI ERCE, 2004). 1.3.2 A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE E SUA VASTA APLICAO

Nas ltimas dcadas, a Tecnologia do DNA Recombinante tem sido aplicada em diversas reas, em todas elas somando grandes benefcios. Segundo Pierce (2004), alm de dar valiosas informaes sobre os genes, sua estrutura, natureza e funo, tem sido utilizada para produo de substncias teis (farmacuticas ou no), cultivo de bactrias especializadas e melhoramento gentico artificial de plantas e animais importantes sob ponto de vista econmico. Sua aplicao tambm se estende rea mdica, onde pode ser usada at mesmo para corrigir at mesmo defeitos genticos humanos. Uma das grandes novidades do uso da tecnologia a sua utilizao na percia forense, onde tem sido um instrumento de investigao criminal e para identificao de restos humanos. FARMACOLOGIA A Tecnologia do DNA Recombinante tem grande aplicao na fabricao de produtos farmacuticos. Desde sua descoberta, j foram desenvolvidas diversas alternativas melhores e mais eficazes para o tratamento de doenas e distrbios humanos. Um delas a produo de insulina humana em escala comercial a partir de bactrias transformadas por plasmdeos portadores do gene humano codificador da referida protena. Antes disso a insulina usada no tratamento de diabticos era isolada do pncreas de animais utilizados na pecuria de corte, mas no funcionava em todas as pessoas, pois algumas delas apresentavam incompatibilidade com a protena exgena. Outros frmacos que tambm so produzidos incluem o hormnio de crescimento humano (para crianas com problemas de crescimento), fatores de coagulao (para hemoflicos), ativador de plaminognio (usado para dissolver cogulos sanguneos em pacientes com ataques cardacos) e atualmente esto sendo testadas drogas oligonucleotdicas para o tratamento de AIDS e cncer (PI ERCE, 2004; BURNS e BOT T I NO, 1991). Conforme Burns & Bottino (1991), uma das primeiras das tcnicas do DNA Recombinante foi provavelmente a combinao de vrios genes para metabolizar petrleo em um nico plasmdeo e introduzi-lo em bactria marinha, tornando este organismo capaz de limpar mancha de petrleo nos oceanos. Alm disso, muitas bactrias podem ser modificadas por meio da engenharia gentica de maneira que funcionem mais eficientemente em diversos processos industriais e no desempenho de

papeis importantes, tais como a produo de etanol a partir de material vegetal, lixvia de minrios, tratamento de esgotos e detritos, dentre outros (PI ERCE, 1994). 1.4 MICRO-ORGANISMOS PRODUTOS RECOMBINANTES NA SNTESE DE

Com o advento da Biotecnologia e da Engenharia Gentica, tornou-se possvel a produo de substncias de relevncia econmica de forma mais eficiente e produtiva. A utilizao de micro-organismos como produtores dessas substncias vem ganhando espao nos ltimos anos e a tecnologia do DNA recombinante surge como uma soluo aos problemas encontrados nessa adoo de micro-organismos em processos de fermentao industrial para a produo desses insumos de relevncia econmica. Atualmente, a indstria j utiliza diversas cepas oriundas da tecnologia do DNA recombinantes para a gerao de produtos, tais como enzimas, hormnios, cidos orgnicos, dentre outros. A tabela 1 apresenta alguns produtos oriundos de microorganismos recombinantes e suas respectivas empresas produtoras.

1.4.1 PRODUO DE INSULINA POR BACTRIA RECOMBINANTE A tecnologia do rDNA permitiu a expresso de protenas heterlogas em microrganismos e clulas hospedeiras, como a E. coli. A insulina artificial ou recombinante foi o primeiro produto da tecnologia do rDNA comercializado mundialmente. A construo do gene sinttico para a pr-insulina humana foi iniciada a partir da sequncia de aminocidos dessa protena. Utilizando-se os cdons genticos para E. coli para uma melhor expresso do gene nessa bactria, foi montado um gene codificando a protena humana. Esse gene contm 18,6% de bases de cdons substitudas, porm nenhuma das modificaes feitas nos cdons alterou o aminocido de correspondncia (Lima, 2001). O gene da pr-insulina humana foi clonado em um vetor para realizao do sequenciamento de DNA e a confirmao da sequncia nucleotdica correta do gene e posteriormente subclonado no vetor de expresso e o plasmdeo foi utilizado para transformao. A clula transformada deve ser submetida s condies que facilitem a expresso do rDNA, resultando em grandes quantidades de insulina, que antes de serem

comercializadas devero passar pelo processo de purificao (Lima, 2001). A insulina produzida pela tecnologia do DNA recombinante apresenta a vantagem de eliminar a possibilidade de contaminantes ou agentes infecciosos que podem estar presentes nas protenas purificadas de animais. Uma das maiores expectativas neste campo a possibilidade de se obter mutantes com atividade muito superior ao da protena nativa e sem certos efeitos adversos. A determinao e caracterizao da estrutura de protenas ganham maior impacto pela possibilidade de expresso/purificao de protena recombinante em larga escala (Rodrigues et al, 2003). 1.4.2 PROTENAS RECOMBINANTES PRODUZIDAS EM LEVEDURAS 1.4.2.1 - A LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae As leveduras so fungos que tm sido utilizados pelo homem h milhares de anos e cuja manipulao causou um grande impacto na produo de alimentos e, por conseguinte, influenciando o prprio processo de desenvolvimento socioeconmico da humanidade. O po, a cerveja e o vinho representam os produtos mais expressivos do processo de manipulao desses microrganismos ao longo do tempo. Em todos esses processos, a levedura Saccharomyces cerevisiae teve um papel de destaque. Alm de ser considerado um dos micro-organismos mais teis ao homem, essa levedura um dos sistemas eucariticos mais bem conhecidos. Sua gentica bem dominada e seu genoma foi totalmente sequenciado, fato este que representou uma das maiores conquistas da Biologia no sculo XX. Aps o advento da tecnologia do DNA recombinante, a levedura S. cerevisiae pde ser empregada em estudos de gentica molecular a partir do final dos anos 70, quando ela foi geneticamente transformada pela primeira vez. No campo da pesquisa aplicada, a levedura S. cerevisiae logo se destacou como um interessante candidato para a expresso de genes heterlogos de interesse biotecnolgico. Embora a bactria Escherichia coli represente uns dos mais poderosos sistemas de expresso heterloga, vrias protenas eucariticas de interesse comercial no puderam ser expressas eficientemente nesse microrganismo. Entre as razes para esses insucessos poderamos citar: conformao incorreta, ausncia de modificaes ps-traducionais e baixos nveis de expresso. Alguns desses problemas puderam ser resolvidos quando as mesmas protenas foram expressas em S. cerevisiae. O ambiente intracelular da levedura adequado para a ocorrncia de vrias reaes que normalmente ocorrem em clulas de mamferos. Alm do mais, S. cerevisiae goza do status de microrganismo GRAS (Generally Recognized As Safe) o que de suma importncia no que se refere produo de biofrmacos por engenharia gentica. No entanto, vrias protenas humanas sofrem hiperglicosilao quando secretadas por S. cerevisiae o que ser discutido mais adiante.

1.4.2.2 A LEVEDURA Pichia pastoris

Ao longo das ltimas duas dcadas, outras leveduras tm sido apresentadas como sistemas alternativos de expresso por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae. Entre esses novos sistemas, destaca-se Pichia pastoris, uma levedura metilotrfica, ou seja, que capaz de crescer em meio de cultura contendo metanol como nica fonte de carbono. A levedura P. pastoris apresenta duas caractersticas que a tornam uma atraente hospedeira para a produo de protenas heterlogas. A primeira o forte promotor usado para transcrever genes heterlogos, o qual derivado do gene da lcool oxidase (AOX1) de P. pastoris. Esse promotor regulado transcricionalmente por metanol, um indutor relativamente barato. Em clulas expostas a metanol como nica fonte de carbono, o incio da transcrio no promotor AOX1 altamente eficiente e comparvel aos promotores derivados dos genes altamente expressos da via glicoltica. No entanto, ao contrrio dos promotores glicolticos, o promotor AOX1 firmemente regulado e reprimido sob condies de crescimento sem metanol. Uma vez que a maioria das protenas heterlogas de alguma forma deletria para a clula, quando expressas em altos nveis, a habilidade de manter a cultura em um estado reprimido ou desligado altamente desejvel. Trata-se de uma importante precauo para minimizar a seleo de mutantes que no expressam o produto heterlogo durante o crescimento da cultura. Para ser ativado, o promotor AOX1 requer a presena de metanol e, na ausncia desse indutor, ele se torna reprimido. Alm de metanol, o sistema AOX1 necessita da ausncia de glicose para ser plenamente ativado. Uma vez que o promotor AOX1 controlado pela manipulao da fonte de carbono adicionado ao meio de cultura, o crescimento e a induo de cepas de P. pastoris, que expressam protenas heterlogas, so facilmente obtidos em todas as escalas, desde frascos at grandes fermentadores. A segunda caracterstica importante de P. pastoris que esta levedura no considerada uma forte fermentadora, como S. cerevisiae. A fermentao realizada por leveduras gera etanol, o qual, em culturas de alta densidade, pode rapidamente atingir nveis txicos (efeito Crabtree). Para uma produo economicamente vivel de protenas recombinantes a concentrao de protenas no meio deve ser proporcional quantidade de clulas. necessrio, pois, atingir nveis de alta densidade celular os quais no so facilmente obtidos com S. cerevisiae. Em contraste, as cepas produtoras de P. pastoris so facilmente cultivadas a densidades celulares de aproximadamente 100 g/L de peso seco, ou at maiores. Vrios genes de diferentes procedncias (bactrias, fungos, invertebrados , plantas e humanos) j foram expressos em P. pastoris sob o controle do promotor AOX1. A maioria dos genes expressos tiveram seus produtos secretados para o meio extracelular e alguns, como o fator de necrose tumoral humano, foi produzido no ambiente intracelular. Os vetores de expresso em P. pastoris so geralmente do tipo integrativo. Esses vetores possuem um cassete de expresso formado pelo promotor e

pela regio terminadora de transcrio do gene AOX1 alm de uma marca de seleo, sendo a mais utilizada o gene histidinol desidrogenase (HIS4) de P. pastoris. Essa marca permite a seleo de transformantes prototrficos His+ a partir de uma linhagem hospedeira his4. Um dos vetores mais utilizados o plasmdio pPIC9 desenvolvido e patenteado pela empresa Invitrogen. O gene de interesse clonado na regio do cassete de expresso em um dos stios de clonagem que se localizam logo aps o sinal de secreo, nesse caso, o peptdeo sinal do fator de S. cerevisiae. O cassete de expresso liberado pela digesto do plasmdio com a enzima de restrio BglII, e uma cepa his4 de P. pastoris transformada por eletroporao. Como em S. cerevisiae, o DNA linearizado pode gerar transformantes estveis quando se integra no genoma por recombinao homloga. Esses transformantes podem se originar pela integrao do cassete de expresso tanto no locus AOX1 quanto no his4. No primeiro caso, pode haver uma substituio completa do gene AOX1 pelo cassete de expresso, o que resulta em um fentipo denominado Muts, caracterizado por um crescimento lento na presena de metanol. Ocasionalmente, o cassete de expresso pode se integrar vrias vezes no lcus AOX1, o que pode ser confirmado por anlise de Southern blotting. Outros vetores, semelhantes ao pPIC9, no possuem sinais de secreo e, portanto, so empregados para a expresso intracelular. Existem variantes do pPIC9 que no possuem o sinal de secreo no cassete de expresso sendo, portanto, ideais para expresso intracelular. Embora muito utilizados, os vetores descritos anteriormente tm como desvantagens o grande tamanho (cerca de 8 Kb) e a presena de poucos stios de restrio para a clonagem do gene heterlogo. H uma famlia de vetores de P. pastoris que contm o gene Shble, que confere resistncia droga zeocina tanto em E. coli quanto em P. pastoris. Embora esses vetores sejam bem menores que o pPIC9, o preo proibitivo da droga de seleo inibe o uso desse sistema em escala industrial. Recentemente, novos plasmdios com pro motores alternativos se tornaram disponveis. Esses vetores contm o promotor GAP, um forte promotor constitutivo derivado do gene gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase (GAP). Em culturas crescidas em glicose, os nveis de expresso obtidos pelo promotor GAP so similares queles obtidos com o promotor AOX1 em culturas crescidas com metanol em frascos. Uma das vantagens do promotor GAP com relao ao promotor AOX1 que, por ser constitutivo, no necessrio mudar a cultura de um meio para outro para induzir expresso. No entanto, o uso do promotor GAP apropriado somente para genes cujo produto no seja deletrio para a clula. Alm do mais, os nveis de expresso a partir do promotor AOX1 so geralmente aumentados quando o metanol adicionado culturas com taxas de crescimento limitantes em fermentadores. O mesmo fenmeno no observado com o promotor GAP. A levedura P. pastoris ganhou grande aceitao com organismo hospedeiro para a produo de protenas heterlogas de interesse farmacolgico. Entre essas protenas, destacam-se: a albumina srica humana - que j esta em testes clnicos para seu uso como produto de substituio de plasma -, e o antgeno de superfcie da hepatite B - que foi aprovado para se fazer uma vacina contra esse vrus. Em nosso laboratrio, temos empregado o sistema de expresso em P. pastoris para a expresso de vrias

protenas de interesse biotecnolgico. Algumas protenas recombinantes sero utilizadas para fins farmacuticos e outras para processos de converso de biomassa. Dentre as protenas j expressas por nosso grupo, destacam-se: 1) -amilase de Bacillus subtilis (sozinha ou fusionada a uma glicoamilase de Aspergillus awamori); 2) um fragmento de anticorpo (scFv) anti-Z-DNA; 3) celobiohidrolase I.2 de Humicola grisea var thermoidea.. No caso da protena de fuso formada pelo gene da -amilase de Bacillus subtilis e o cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori, a expresso foi realizada em duas linhagens de P. pastoris: uma protease negativa e a outra protease positiva. Os resultados preliminares mostraram que a melhor condio de expresso foi obtida quando a linhagem protease positiva foi usada e quando 3 cpias em sequncia haviam sido integradas (Figuras 2 e 3). Aparentemente, o uso da linhagem protease negativa no o ideal quando a expresso ocorre em altos nveis devido necessidade de processamento ps-traducional da protena de fuso. Por outro lado, no caso da expresso do fragmento de anticorpo scFv, o melhor resultado foi obtido com uma linhagem protease negativa j que a protena recombinante mostrou ser suscetvel ao das proteases produzidas por P. pastoris. Como no caso da protena de fuso, a expresso da clobiohidrolase I.1 de Humicola grisea var. thermoidea, o melhor resultado foi obtido com uma linhagem protease positiva. Experimentos preliminares demonstraram baixos nveis de expresso em frasco (cerca de 10 mg/L para a fuso e 1 mg/L para o fragmento scFv). No entanto, o rendimento poder ser sensivelmente maior quando as condies de expresso em fermentador forem ajustadas. Com a finalidade de reduzir os custos das etapas downstream de produo de protenas recombinantes a partir de P. pastoris, estamos construindo novos vetores que possibilitem a rpida purificao da protena de interesse. Estamos tambm desenvolvendo novas estratgias que permitam a co-expresso de duas subunidades proticas que formariam, ento, uma protena heterodimrica funcional. Essa estratgia seria til para a expresso de alguns hormnios proteicos. A longo prazo, pretendemos isolar, a partir da biodiversidade do cerrado, novas espcies de levedura que possam ser empregadas como hospedeiras alternativas para expresso heterloga. Esses novos sistemas podero, eventualmente, reduzir os custos de produo com o pagamento de royalties ao exterior quando so utilizados sistemas de expresso j patenteados.

2 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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