Biologia Molecular Bsica Mdulo II: Intermedirio

Organizao gnica Aula 2

Biologia Molecular Bsica

Mdulo II Intermedirio

Aula 2 Organizao gnica em eucariotos

Os eucariotos, clulas nucleadas e com organelas, teriam surgido de eventos de endossimbiose (simbiognese) entre uma clula hospedeira e clulas procariticas, que deram origem s mitocndrias e aos cloroplastos. A principal implicao da simbiognese que os eucariotos so, de fato, quimeras produzidas pela combinao de diversos genomas. Nesta aula voc estudar a organizao do genoma de eucariotos, como o da clula em anfase que est no alto desta pgina. Os objetivos desta aula so: Descrever a organizao do material gentico, apresentando a estrutura dos cromossomos em eucariotos. Citar os diferentes componentes do cromossomo eucaritico. Descrever a importncia do empacotamento do DNA na fidelidade da transferncia das informaes genticas para as geraes seguintes.

1. Conhecendo os eucariotos
Os eucariotos tm importantes diferenas em relao aos procariotos. A principal delas a presena de membrana nuclear, mas existem muitas outras. Por exemplo: diferentemente dos procariontes, que sintetizam RNA com um nico tipo de RNA polimerase, os eucariontes possuem trs tipos dessa enzima que diferem em especificidade de molde, localizao e susceptibilidade a inibidores. Ao contrrio dos procariotos, a maioria dos eucariotos diplide, ou seja, seu genoma contm duas cpias; cada uma proveniente de cada um dos pais. Alm do mais, algumas plantas so poliplides (possuem mais de duas cpias do genoma). Outra diferena importante est relacionada quantidade de material gentico. Em geral os eucariotos apresentam uma quantidade de DNA muito maior que os procariotos, embora a diferena na quantidade de genes no seja muitas vezes to significativa.

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Espermatozide

vulo

Figura 1: Genoma haplide.

Os eucariotos, da mesma forma que os procariotos, apresentam DNA extranuclear. Esses DNAs so encontrados na mitocndria (em todas as clulas) e no cloroplasto (clulas vegetais). Ento o genoma dos eucariotos consiste no DNA encontrado no ncleo mais o DNA das organelas. Da mesma forma que o DNA plasmidial, essas molculas so independentes do DNA nuclear. Outro fato interessante que o DNA nuclear dos eucariotos est organizado em cromossomos, e o nmero de cromossomos varia entre as espcies. Dentro de uma determinada espcie, o tamanho dos cromossomos tambm varia. Aproveite e d uma olhada nas animaes deste mdulo! Voc vai gostar! A cromatina formada principalmente por DNA, protenas e RNA. As protenas podem ser divididas em duas classes: protenas bsicas, carregadas positivamente em pH neutro,

chamadas histonas, e

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um

grupo

heterogneo

de

protenas

cidas,

carregadas

negativamente em pH neutro, chamadas genericamente protenas cromossomais no histonas. As histonas desempenham um papel estrutural importante na

cromatina. Elas esto presentes em todos os eucariotos em quantidades equivalentes quantidade do DNA. As histonas de animais e plantas esto divididas em cinco classes: H1, H2a, H2b, H3 e H4. estruturais conhecidas como nucleossomos. As histonas se ligam ao DNA, permitindo a formao de subunidades

Figura 2: Nucleossomo Histonas.

O que esta imagem lembra a voc? Pensou em nucleide? Voc consegue traar pontos em comum entre o nucleide e o nucleossomo? De que maneira as histonas interagem com o DNA? Como j foi dito, essas protenas so bsicas porque cerca de 20 a 30% de seus aminocidos so a arginina e a lisina. Como voc deve se lembrar do que estudou em Bioqumica, esses dois aminocidos so carregados positivamente. Os grupamentos NH3+ expostos na arginina e na lisina permitem que as histonas atuem como polictions, o que importante para sua interao com o DNA, que polianinico devido aos grupamentos fosfato carregados negativamente.

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2. Empacotamento de DNA em cromossomos eucariticos

O maior cromossomo no genoma humano mede cerca de 90mm (85.000m ou 8,5 X 107nm) de uma molcula gigante de DNA dupla fita. De alguma forma essa molcula de DNA se empacota em uma estrutura encontrada na metfase que tem 0,5m de dimetro e 10m de comprimento, uma condensao da ordem de 104 em relao ao tamanho da molcula de DNA esticada. A partir dessa observao, podemos elaborar muitas perguntas: Como ocorre essa condensao? Quais componentes dos cromossomos esto envolvidos no processo de empacotamento? As molculas de DNA dos cromossomos diferentes so empacotadas de maneiras diversas ou existe um mecanismo universal de empacotamento? Existem diferentes nveis de empacotamento? Voc se lembra do ciclo celular? No? No perca tempo: d uma olhada agora nas animaes deste mdulo. Voc vai gostar! Os cromossomos metafsicos esto muito mais condensados do que os cromossomos encontrados na intrfase. Que nveis adicionais de condensao ocorrem nessas estruturas especiais planejadas para garantir a segregao correta do material gentico durante a diviso celular? As seqncias de DNA de genes que esto sendo expressos so empacotadas diferentemente daqueles genes que no esto sendo expressos? Quando a cromatina isolada de clulas de eucariotos foi examinada por microscopia eletrnica, observou-se que ela composta por muitas estruturas elipsoidais (medindo 11nm de dimetro e 6nm de altura) que esto ligadas entre si por regies mais finas. Deu-se o nome de estrutura de colar de contas, pois semelhante aparncia da estrutura (Figura 3).

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Figura 3: (a) Representao esquemtica da cromatina analisada por ME (colar de contas). (b) Esquema de uma regio do colar contendo quatro contas.

Para descobrir a natureza dessa estrutura apresentada pelo DNA, foram feitos estudos tratando a cromatina com endonucleases. Aps o tratamento da cromatina, foi observado que segmentos de DNA de 200 pares de nucleotdeos eram de alguma forma protegidos da degradao com a endonuclease.

Nucleases so enzimas que degradam cidos nuclicos. Podem ser ribonucleases (RNases), que degradam RNA em ribonucleotdeos, ou desoxirribonucleases (DNases), que degradam DNA em desoxirribonucleotdeos. As nucleases podem ser classificadas como endonuclease (quando degradam o cido nuclico internamente) ou exonuclease (quando degradam os cidos nuclicos a partir da suas extremidades), podendo ainda ser exonuclease 5' - 3', quando iniciam a degradao na extremidade contendo o nucleotdeo 5', ou exonuclease 3' - 5', quando iniciam a degradao a partir da extremidade 3' do cido nuclico. Existe, ainda, outro tipo de endonuclease, chamado endonuclease de restrio ou enzima de restrio. Essa enzima reconhece seqncias especficas no DNA dupla fita. Existe um nmero muito grande de enzimas de restrio que so amplamente utilizadas em laboratrios de Biologia Molecular para cortar molculas de DNA em locais especficos.

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A digesto parcial da cromatina com quantidades de nucleases e tempos menores do que aqueles necessrios para que haja degradao completa usado com muita freqncia nos laboratrios de Biologia Molecular. Assim, a digesto parcial da cromatina com nucleases resulta na produo de fragmentos de DNA em uma srie de tamanhos especficos que eram mltiplos integrais dos fragmentos menores, ou seja, mltiplos de 200. Foram observados fragmentos de 200, 400, 600, 800 pares de nucleotdeos e assim por diante. Observe a Figura 4.

Figura 4: Esquema representando o resultado da digesto parcial da cromatina. O DNA foi separado por eletroforese em gel de agarose com brometo de etdeo e visualizado com luz ultravioleta. Observe o tamanho dos fragmentos todos mltiplos de 200!

Voc j deve estar imaginando por que isso foi observado, pois, baseando-se nas informaes anteriores, ao tratar a cromatina com nuclease foram encontrados fragmentos de 200 pares de nucleotdeos. J na digesto parcial, que menos eficiente, observa-se o aparecimento supostamente eletrnica. De alguma forma, o DNA presente nas contas est protegido do ataque da nuclease, enquanto o DNA que une uma conta outra justamente o local suscetvel ao ataque da nuclease. Ento podemos dizer que o colar de contas composto por DNA na forma de contas e DNA na forma de cordo. A conta ou subunidade da cromatina chamada nucleossomo, de acordo com o conceito atual da estrutura da cromatina, e as conexes ou cordes de DNA entre as contas constituem as regies suscetveis ao ataque da nuclease. de as mltiplos contas de do 200. colar Isso implica na a seguinte concluso: a cromatina apresenta uma estrutura repetitiva, observadas microscopia

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Como o nucleossomo formado? No incio desta aula, falamos dos diferentes componentes do cromossomo e das histonas. Se voc no estiver se lembrando, releia o incio desta aula para poder compreender os prximos tpicos. O centro do nucleossomo formado por 146 pares de

nucleotdeos e duas molculas de cada uma das histonas H2a, H2b, H3 e H4. As histonas se organizam na forma compacta de um octmero. Estudos fsicos (difrao de raios-X e anlises semelhantes) de cristais do centro do nucleossomo mostram que o DNA (146 pares de nucleotdeos) est enrolado em torno do octmero de histonas na forma de uma superespira com orientao de mo esquerda, realizando uma volta completa mais trs quartos de uma segunda volta. Observe a Figura 5 e voc compreender melhor.

Figura 5: Esquema representando os 146 pares de nucleotdeos enrolados em torno do octmero de histonas.

A anlise criteriosa dessa estrutura revela por que o DNA eucaritico est subenrolado. Para que o DNA seja enrolado fortemente nas histonas, necessria a remoo de cerca de uma volta da hlice do DNA. Observe a Figura 6 e acompanhe a explicao. Quando o ncleo protico de um nucleossomo (octmero de histonas) liga-se in vitro a um DNA circular fechado e relaxado, a ligao introduzir uma superespira negativa. Essa ligao no provoca quebra na molcula de DNA nem altera o nmero de ligao, mas a formao de uma espira solenoidal negativa ir provocar a formao de uma 7

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superespira positiva em algum lugar da molcula para acomodar a tenso. Nesse ponto, entra a topoisomerase que relaxa a superespira positiva.

Figura 6: Montagem da cromatina. (a) Octmero de histonas e o DNA circular separados. (b) Ao se ligar ao DNA na estrutura solenoidal (superespira negativa), ocorre a formao de uma superespira positiva para acomodar a tenso. (c) A topoisomerase rompe a superespira positiva, relaxando novamente o DNA.

As

histonas

protegem o segmento do DNA da clivagem pela nuclease. A

no centro do estrutura do

nucleossomo

nucleossomo , na essncia, invarivel em todos os cromossomos. Dizemos na essncia porque pode haver alguma variao no nmero de nucleotdeos que compem o centro do nucleossomo e as conexes. O nucleossomo , ento, a subunidade da cromatina. Cada subunidade composta pelo centro do nucleossomo (146 pares de nucleotdeos mais o octmero de histonas), o DNA de conexo, uma molcula de Histona H1 e protenas cromossomais no histonas. As evidncias sugerem que o nucleossomo completo contm uma molcula de Histona H1, que estabiliza duas voltas completas de superhlices de DNA, na superfcie do octmero de histonas. A Figura 7 ilustra o que foi descrito. O tamanho da DNA de conexo varia de espcie para espcie e de um tipo celular para outro. J foram descritos conectores que variam de 8 a 114 pares de nucleotdeos.

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Figura 7: Formao de solenide.

Ficou claro que o nucleossomo o componente bsico estrutural da cromatina de eucariotos, mas, como foi visto anteriormente, o DNA deve estar empacotado para caber dentro do ncleo da clula eucaritica e somente a organizao em nucleossomos no seria suficiente, pois esse tipo de estrutura reduz o tamanho do DNA na ordem de sete vezes, muito menos do que o nmero visto no incio da nossa aula, em que a reduo da ordem de 104, ou seja, 10.000 vezes. Voc ver a seguir o que ocorre com os nucleossomos. Voc observou na Figura 7 que, quando os cromossomos metafsicos so observados por microscopia eletrnica, eles se apresentam como massas de fibras altamente dobradas ou enroladas. Essas fibras de cromatina tm dimetro mdio de 30nm; a estrutura da cromatina conhecida como fibra de 30nm. Durante os estgios iniciais da mitose ou meiose, s possvel visualizar as regies onde as fibras de 30nm esto fortemente empacotadas ou condensadas.

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Figura 8: Cromossomo metafsico, baseado na imagem obtida por microscpio eletrnico. Note a presena de um emaranhado de fibras. Cada uma dessas fibras corresponde a uma estrutura de 30nm.

O que so as fibras de 30nm observadas em cromossomos meiticos e mitticos? Apesar de no existir uma resposta definitiva para essa pergunta, voc j viu que o DNA enrolado como uma superespira em um octmero de histonas para formar a estrutura de 10nm do nucleossomo. O que ocorre provavelmente que os nucleossomos esto em justaposio direta uns com os outros, escondendo as regies conectoras, formando uma fibra de nucleossomos de 10nm. Se a fibra de 10nm, por sua vez, for dobrada em uma ordem maior de espiralamento (solenoidal), pode ser formada uma fibra de 30nm. Embora os cientistas no entendam todos os detalhes da estrutura da fibra de 30nm da cromatina, existem boas evidncias de que elas representam uma estrutura solenide como a mostrada na Figura 9. As fibras de 30nm fornecem um grau de compactao de aproximadamente 100 vezes.

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Figura 9: (a) O esquema apresenta um possvel mecanismo de formao da fibra de 30nm. (b) O esquema apresenta a forma como a fibra encontrada na cromatina, baseado em observaes feitas por microscpio eletrnico (ME).

Por que os cromossomos metafsicos so to condensados? Para responder a essa questo, precisamos recordar o que ocorre na diviso celular. Na metfase, os cromossomos duplicados (um par de cromtides-irms) so alinhados no fuso para que ocorra a separao de metade para cada clula-filha. Parece lgico que essa organizao em uma estrutura to compacta facilite essa separao, no mesmo? O papel desses cromossomos altamente condensados organizar e empacotar o DNA em estruturas que facilitaro a segregao para os ncleos das clulas-filhas sem que as molculas de DNA dos diferentes cromossomos se tornem emaranhadas e, como resultado, possam ser quebradas durante a separao das cromtides-irms. Ento, voc pode concluir que a estrutura bsica do cromossomo metafsico a fibra de cromatina de 30nm, que, por sua vez, formada pela fibra de 10nm composta pelos nucleossomos. A maneira como essas fibras se condensam mais ainda at atingir a estrutura observada na metfase ainda no muito bem conhecida, mas parece que certas regies do DNA associam-se a um andaime nuclear. A Figura 10 ilustra um esquema desse andaime, que pde ser observado quando o cromossomo metafsico foi tratado com proteases. O resultado foi a Prof. Christina Gaspar Villela Extenso de Biologia Fundao CECIERJ/CEDERJ 11

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formao de um halo de DNA associado ao andaime. As regies associadas aos andaimes esto separadas por alas de DNA de talvez 20.000 a 100.000 pares de bases. O andaime contm vrias protenas, grande quantidade de histonas H1 (interior da fibra) e a topoisomerase II, o que nos remete novamente ao papel dessa enzima no subenrolamento do DNA e na montagem da cromatina.

Figura 10: Cromossomo metafsico tratado com proteases observado por microscopia eletrnica. Observe que o andaime nuclear lembra o formato da estrutura observada na Figura 8. Em torno do andaime, nota-se um halo de DNA formado por muitas alas.

3. Centrmero e telmeros
Voc deve ter notado, nas animaes deste mdulo, que os cromossomos metafsicos duplicados (cada um contendo duas

cromtides-irms) de cada um dos pares de cromossomos em um indivduo diplide se separam para plos opostos no fuso meitico durante a anfase I da meiose. De modo semelhante, durante a anfase II da meiose e na nica anfase da mitose, as cromtides-irms de cada cromossomo se movem para plos opostos e se tornam cromossomos-filhos. Esses movimentos durante a anfase dependem da ligao dos microtbulos que compem o fuso, as regies especficas dos cromossomos, os centrmeros. O centrmero de um cromossomo metafsico (veja a Figura 11) pode ser reconhecido como uma constrio na qual ainda no houve duplicao do cromossomo nessa regio.

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Na verdade, a produo de dois centrmeros funcionais a partir de um centrmero parental um passo-chave na transio da metfase para a anfase. Um centrmero funcional deve estar presente em cada cromossomo-filho para evitar efeitos deletrios, como a no-disjuno (dois cromossomos migram para uma mesma extremidade, gerando clulas-filhas com alterao no nmero de cromossomos. Uma delas ir conter 2 cromossomos e a outra conter 0 cromossomo daquele par).

Figura 11: (A) Representao esquemtica de um cromossomo metafsico. (B) microfotografia de um cromossomo.

Voc viu, at agora, que o cromossomo um filamento longo de DNA que sofre um empacotamento para atingir a estrutura observada no cromossomo metafsico. Voc viu tambm que isso importante na separao dos cromossomos para as clulas-filhas e que essa separao ocorre atravs de uma estrutura especial, permitindo a ligao de protenas que formaro o fuso. A seguir voc ver que os cromossomos eucariticos apresentam ainda outra particularidade essencial para a sua conservao e estrutura: uma estrutura chamada telmero.

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Centrmero

Telmero Cromtide

Os

telmeros

ou

extremidades

dos

cromossomos

eucariticos

apresentam propriedades nicas. Os cromossomos com as extremidades quebradas se tornam "grudentos" e tendem a se fundir com outros. As extremidades de cromossomos normais, ao contrrio, so estveis e no apresentam tendncia de fuso com outros cromossomos. Outra razo para acreditar que os telmeros apresentam estruturas nicas o fato de o mecanismo conhecido de replicao de molculas lineares de DNA no permitir a duplicao completa das duas fitas. Assim, os telmeros devem conter estruturas nicas que permitam a replicao ou deve existir alguma enzima que resolva esse problema. Esse assunto ser estudado mais detalhadamente nas aulas sobre replicao do DNA. Qualquer que seja sua estrutura, os telmeros devem prover trs funes importantes: impedir que as nucleases degradem as extremidades da molcula de DNA linear; impedir que molculas lineares de diferentes cromossomos se fundam e facilitar a replicao das extremidades da molcula linear, para que no ocorra perda de material gentico. Os nucleotdeos terminais das extremidades da fita simples geralmente exibem padres nicos de metilao (ligao covalente de grupamentos metila) que, sem dvida, contribuem para a estrutura do telmero. As regies dos telmeros com seqncias ricas em guanina apresentam capacidade de formar numerosas pontes de 14

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hidrognio, diferentes daquelas produzidas pelo pareamento das bases de Watson e Crick no DNA. Por exemplo: quatro resduos de guanina podem formar um quarteto G atravs de um tipo especial de ponte de hidrognio chamado pareamento de Hoogstein. A Figura 12 ilustra a estrutura do quarteto G.

Figura 12: Estrutura do quarteto G formado em soluo utilizando oligonucleotdeos contendo as seqncias repetitivas encontradas nos telmeros.

Trs modelos da estrutura dos telmeros humanos so mostrados na Figura 13. Uma sugesto de que os quartetos G bimoleculares (Figura 13c) podem desempenhar uma funo durante a iniciao do pareamento dos cromossomos na meiose.

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Figura 13: Trs modelos para a estrutura do telmero humano.

4. Resumo
Nesta aula voc teve oportunidade de aprender que os cromossomos dos eucariotos sofrem diferentes nveis de compactao. O superespiralamento do DNA essencial para seu empacotamento. Nos eucariotos, o primeiro nvel de compactao ocorre atravs da interao do DNA com octmeros de histonas, formando os nucleossomos. Na cromatina, o DNA encontrado na forma de fibras de 30nm, como resultado do superespiralamento solenoidal da fibra de 10nm formada pelos nucleossomos. Os nveis superiores de compactao no so bem conhecidos; no entanto, o mecanismo mais provvel que seja dependente da formao de espiras sobre espiras. Voc viu ainda que os cromossomos de eucariotos apresentam estruturas especiais. Uma delas, o centrmero, est envolvida na formao do fuso e garante a separao das cromtides-irms; a outra, o telmero, est localizada nas extremidades dos cromossomos e desempenha importante funo relacionada estrutura e integridade dos cromossomos. Com todas essas informaes, voc j pode tirar algumas concluses. Ns temos algumas: Quanto mais complexo o organismo, mais coordenado e preciso o mecanismo de organizao e empacotamento do material gentico; Prof. Christina Gaspar Villela Extenso de Biologia Fundao CECIERJ/CEDERJ 16

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Essa organizao est diretamente relacionada necessidade de transmitir essas informaes contidas no DNA e RNA para as prximas geraes, de maneira intacta; Em todos os organismos, o material gentico sofre alteraes na sua estrutura que resultam no superespiralamento; No caso dos eucariotos, o DNA contido nos cromossomos passa por diferentes nveis de organizao e apresenta regies que so essenciais para a manuteno da sua integridade. Voc deve ter em mente que a Biologia Molecular uma cincia relativamente recente: foi em 1953 que a estrutura do DNA foi determinada por Watson e Crick. Podemos deduzir que todas essas informaes foram obtidas nos ltimos 50 anos e dependeram do desenvolvimento de equipamentos e tcnicas especializadas. No prximo mdulo, voc vai estudar o controle da expresso gnica de procariotos e eucariotos. Bons estudos!

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