UNIVERSITE VICTOR SEGALEN BORDEAUX II

U.F.R DES SCIENCES DE LA VIE

DEPARTEMENT SCIENCE, TECHNOLOGIES, SANTE
146 RUE LEO SAIGNAT
33076 BORDEAUX CEDEX

LICENCE SCIENCE DE LA VIE ET DE LA SANTE

RAPPORT DE STAGE

Présenté par

Prongsagorn SANVITTAYAGUL

Sujet : Rôle de l’AICAR et l’interaction entre AICAR et l’autre facteur de

transcription chez Saccharomyces cerevisiae

Lieu de stage : Institut de Biochimie et Génétique Cellulaire

CNRS UMR 5095
1, rue Camille Saint Saëns
33077 Bordeaux cedex

Maître de stage : Bertrand Daignan-Fornier

Durée de stage : un mois et demi

 REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier Bertrand Daignan-Fornier, mon maître de

stage, pour ses aides, ses conseils pertinents, sa confiance, de m’avoir motivé à
poursuivre mes manipulations et mes travaux quand je n’ai pas eu de la chance
pour mes résultats ainsi que pour son support lors des moments difficiles.

Je voudrais également dire « merci » très fort à toute l’équipe du GRM pour le
chaleureux accueil, pour sa bonne humeur, et pour ses conseils sur les
démarches de manipulation à effectuer durant le stage.

1
 SOMMAIRE
I. INTRODUCTION :.............................................................................................................................................3

II. RESUME………….............................................................................................................................................3

III. PRESENTATION DE L’ETUDE……..………………………………………………………………..…...4

A. Biosynthèse des nucléotides puriques........................................................................................................5
- 1. voie de novo………....................................................................................................5
- 2. voie de recyclage ………………………………………….......................................6
IV. RESULTATS :……………….……………………………………………………………………..…...……6
- Partie I : La fonction de SAICAR sur les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p….6
- Partie II : A la recherche un ou des gène permettant à utiliser mieux AICAR…….. 10

V. DISSCUSION…………………………………………………………………………….11
- Partie I : La fonction de SAICAR sur les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p...11
- Partie II : A la recherche un ou des gène permettant à utiliser mieux AICAR……...12

VI. MATERIEL ET METHODE………………………………………………………..…13

- I. Plasmide et souche de levure……………………………………………………..13
A. Souche de levure…………………………………………………………...13
B. Plasmide……………………………………………………………………13
- II. Manipulation d’E. coli...........................................................................................14
- III. Manipulation de S.cerevisae…………………………………………………….14
A. Milieux de cultures………………………………………………………...14
B. Transformation de S.cerevisae…………………………………………....14
- IV. PCR mutagenèse et «GAP repair » ……………………………………………15

VII.BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………...15

2
 I. INTRODUCTION

Ce rapport a pour objectif de conclure la totalité de mon stage de Licence

Science de la vie, qui s'est déroulé à l’Institut de Biochimie et Génétique
Cellulaire (IBGC). Ce stage a été prolongé, et a duré un mois et demi au lieu de
un mois.

Le but de ce stage a été de compléter le travail réalisé jusqu’à l’heure actuelle.

Mon travail a été de revisiter une partie de la voie de biosynthèse d’AMP dans
de l’utilisation d’AICAR et de SAICAR, deux intermédiaires qui sont
synthétisés par cette voie et qui jouent plusieurs rôles importants dans la
régulation de la voie de biosynthèse de l’AMP. Les stratégies utilisées ici,
consiste à utiliser plusieurs mutants en les transformant avec les plasmides
d’intérêt suivit par des cribles génétiques sur les milieux de sélections.

II. RESUME :
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’expression des gènes de biosynthèse
de l’AMP (gène ADE) est transcriptionnellement réprimée par l’adénine extracellulaire
et activé par les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p.
L’activation de l’expression des gènes ADE nécessite la présence d’un
intermédiaire métabolique de la voie de biosynthèse de l’AMP : le 5’-phosphoribosyl
4-succinocarboxamide 5-aminoimidazole (SAICAR). Le SAICAR module in vivo
l’interaction entre les protéines Bas1p et Bas2p et joue aussi le rôle de signal pour
l’interaction de la protéine Bas2p.
Le 5’-phosphoribosyl 4-carboamide 5-aminoimidazole (AICAR), un autre
intermédiaire de la voie de biosynthèse de l’AMP, peut également activer l’expression
de gène ADE. Il joue donc aussi un rôle important dans la régulation de cette voie.
Le facteur de transcription Bas1p est déjà normalement fixé sur l’opérateur du
gène ADE (ici ADE17). C’est elle qui va recruter le facteur de transcription Bas2p au
moment approprié, c’est-à-dire quand les deux molécules intermédias (SAICAR et
AICAR) sont présentes au bon endroit et au bon moment.
J’ai essayé de mettre en évidence la région de fixation de l’AICAR sur la
protéine Bas2p en utilisant un mutant ade1∆ et en créant un nouveau transformant
avec un plasmide qui porte le gène muté synthétisant la protéine Bas2p qui va se fixer
sur CAIR au lieu d’ AICAR.
J’ai ensuite essayé de trouver un nouveau gène qui permettra au mutant une
meilleure utilisation d’AICAR.

3
III. PRESENTATION DE L’ETUDE

Figure 1 : Schéma de la voie de biosynthèse des nucléotides puriques chez la

levure, des co-substrats et des gènes impliqués
ADE4,… : nom des gènes
PRPP,… : nom des intermédiaires

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A. Biosynthèse des nucléotides puriques

Les nucléotides puriques sont synthétisés sous forme mono phosphate (AMP et
GMP), et ceci, par deux voies de biosynthèse. D’une part, la cellule peut utiliser les
nucléotides et les bases puriques déjà formés et les transformer en nucléotides par la
voie de recyclage. D’autre part, elle peut synthétiser ces nucléotides à partir du
phosphoribosyl-pyrophosphate (PRPP) via la voie de novo.
(Voir figure 1)
Ces deux voies de biosynthèse existent chez la plupart des organismes à
l’exception des parasites qui ne possède pas d’équipement enzymatique nécessaire
pour la voie de novo. Ils peuvent uniquement utiliser la voie de recyclage et sont donc
dépendants de leur organisme hôte, qui leur fournit les précurseurs nécessaires pour la
synthèse des nucléotides puriques dont ils ont besoin.
Lors du fonctionnement normal d’une cellule, la voie de recyclage semble être
suffisante pour assurer l’essentiel des besoins en nucléotides puriques. Par contre, lors
de la division cellulaire, elle doit doubler son pool de nucléotides et la voie de novo
devient alors nécessaire. Dans des fibroblastes en culture, il a ainsi été montré que la
biosynthèse de novo des nucléotides puriques augmente lorsque les cellules entrent en
phase G1, ce qui suggère que cette voie est important lorsque les cellules sont en
prolifération.

1. voie de novo : (voir figure 1)

La biosynthèse de novo des nucléotides puriques consiste en une succession de

dix étapes enzymatiques permettant la transformation du phosphoribosyl-
pyrophosphate (PRPP) en inosine 5’-monophosphate (IMP). L’IMP sera ensuite
transformé soit en AMP, soit en GMP par deux étapes enzymatiques supplémentaires
(Voir la figure 1).
La particularité de cette voie de biosynthèse est que les deux cycles de noyau
purique sont formé directement sur le ribose 5-phosphate du PRPP, contrairement à la
biosynthèse des nucléotides pyrimidiques où il y a d’abord la formation de base
azotée, puis l’addition du ribose 5-phosphate.
Cette voie de biosynthèse est coûteuse, puisque la formation d’une molécule
d’IMP va nécessiter, en plus du PRPP, deux molécules de glutamine, deux molécules
de 10-formyltétrahydrofolate (THF), une molécule d’aspartate, quatre molécules
d’ATP, qui sont hydrolysées en ADP et phosphate, en une molécule de dioxyde de
carbone
Les dix étapes de la biosynthèse de novo des nucléotides puriques ainsi que les
enzymes qui les catalysent sont très conservées entre les différents organismes.
Certains organismes présentent néanmoins quelques particularités. Chez certaines
bactéries, par exemple chez Escherichia coli, la conversion de l’AIR en CAIR se
déroule en deux étapes, avec formation d’un intermédiaire supplémentaire : le N5-
CAIR, alors que chez d’autres organismes, cette réaction se fait en une seule étape.
Une autre particularité de cette voie de biosynthèse chez E.coli est l’existence d’une

5
GAR transformylase supplémentaire capable d’utiliser le formate dans des conditions
de carence en 10-formyl tétrahydrofolate, le substrat habituel de GAR transformylase.

2. Voie de recyclage : (voir figure 1)

Cette voie permet à la cellule d’utiliser les précurseurs purique, bases ou

nucléosides, provenant de la dégradation des acides nucléiques ou présents dans le
milieu extracellulaire. Un grand nombre d’activités enzymatiques existent dans les
organismes. Sur la figure 1 sont représentées les activités enzymatiques permettant la
transformation des bases puriques en nucléotides chez la levure, où seules les bases
peuvent entrer dans la cellule.

IV. RESULTATS

Partie I

La fonction de l’AICAR sur les facteurs de transcription

Bas1p et Bas2p

Les gènes BAS1 et BAS2 ont été isolés et ont été caractérisés comme régulateur
du niveau de transcription du gène HIS4 et par ailleurs, il a été montré que l’expression
de tous les gènes de biosynthèse de l’IMP, à l’exception du gène ADE16, est activée
par les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p et réprimé par l’adénine
extracellulaire.
Au niveau moléculaire, SAICAR et AICAR sont connus comme les activateurs
de l'expression de gène d'ADE en favorisant l'interaction entre Bas1p et Bas2p, deux
facteurs de transcription nécessaires pour l'expression des gènes ADE.
Bas2p va aller se fixer sur Bas1p au moment où elle réagit avec AICAR et
l’ensemble du complexe pourra activer la transcription du gène ADE (ici ADE17). Or,
comme nous ne savons pas encore comment AICAR réagit sur Bas2p, j’ai donc
entrepris, pour élucider cette question, de caractériser la zone de fixation de l’AICAR
sur Bas2p afin de confirmer cette fixation et de trouver la séquence de la zone de
fixation.

Pour cela la stratégie est basée sur l’hypothèse suivant:

Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place
d’AICAR va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le
mutant ade1 qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR

Le principe de l’ensemble des stratégies et des techniques utilisées ici est de

trouver le gène muté sur lequel se fixera le CAIR au lieu de l’AICAR en testant le
niveau de l’expression du gène ADE17 fusionné avec LACZ.

6
 La souche qui va être utilisée ici est ade1∆ et bas2∆ : elle va donc accumuler
le CAIR. Le plasmide qui porte la construction ADE17-LACZ existe déjà dans cette
souche. Le plasmide qui porte le gène BAS2 muté va être reconstruit dans la souche
par le « GAP repair » et le niveau de l’expression du gène ADE17 va être révélé par le
test X-Gal : celui qui donne la couleur bleue foncée est un candidat du gène muté.
Si l’hypothèse est correcte, le gène BAS2 muté va être et peut être obtenu. La
région de fixation de CAIR peut nous indiquer et nous confirmer la région de fixation
de l’AICAR du facteur de transcription Bas2p.

Schéma bilan des démarches et des manipulations

7
 Résumé des résultats de la partie I

Le plasmide P3455 (voir matériel et méthode) avec le gène BAS2 sauvage

intégré a été isolé puis a été coupé par 3 types enzymes : Pfl232 qui coupe à
l’intérieur vers la partie 5’ du gène, Pst1 qui coupe à l’intérieur vers la partie 3’ du
gène et BamH1 qui coupe en dehors mais à coté vers la partie 3’ du gène. Deux
types de plasmides coupés ont été donc obtenus.
Le PCR mutagenèse a été fait à partir du plasmide P3455 pour obtenir 2
régions mutées. Soit au niveau de la partie 5’du gène BAS2 ou soit au niveau de la
partie 3’du gène BAS2. Les amorces utilisées ne correspondent pas aux sites des
enzymes de restrictions mais à la région homologue en amont et en aval à coté des
différents sites.

Figure 2. A : Les 2 types de plasmides P3455 coupées par les enzymes, Pst1 avec
BamH1 et Pst1 avec Pfl232. B : Deux types de séquences du PCR mutagenèse
traité par 4 types d’amorce correspondent à deux régions du gène BAS2. Dans
chaque région, deux types de dNTP sont réduits : soit en Guanine, soit en
Adénine

Les séquences obtenues à partir du PCR et des plasmides coupés sont transformés
ensemble selon leurs régions dans la souche Y3165 (voir matériel et méthode) et dans
Y4254 (contrôle). Précisons que les deux souches possèdent déjà le plasmide avec
ADE17-LACZ intégré. Les transformants ont été étalés sur le milieu sélection SC –
Leu –Ura.
Après deux jours, toutes les souches ont été répliquées et laissées pousser pendant
une nuit de plus. Le test X-gal a ensuite été effectué sur toutes les répliques. Un
candidat parmi les transformants a été détecté par la couleur bleu foncé.

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Figure 3. A : Le candidat de la souche Y3165 transformé par le PCR (1880-1881)
et le plasmide digéré (Pfl232+Pst1) B : La strie du candidat
Le candidat a été pris puis strié sur le même milieu, il a poussé pendant une nuit
puis la totalité du candidat a été conservé dans du glycérol. Une partie a été transférée
dans le même milieu de sélection en liquide. J’ai isolé le plasmide de ce candidat puis
transformé dans E.Coli et étalé sur le milieu LBA en présence X-Gal. Les clones qui
ne sont pas bleu ont été choisit puis elles ont été incubées dans le milieu LBA liquide.

Figure4. A:La transformation des bactéries E. coli sur le milieu LBA en présence
X-gal, les clones bleu et blanc ont été isolés B : Les clones blanc qui sont isolés

J’ai isolé le plasmide à partir de ces clones, je l’ai retransformé dans la même
souche Y3165 et j’ai refait le test X-gal. Le résultat obtenu n’est pas conclusif. Les
souches obtenues après la re-transformation n’étaient pas bleues. La souche bleue qui
avait été détectée avant pourrait être un faux positif.

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 Partie II
À la recherche d’un ou des gènes permettant à mieux
utiliser l’AICAR

Chez levure, AICAR riboside du milieu extérieur peux entrer en petite quantité
à travers la membrane.
La suite du travail est de chercher un ou des gènes qui permet(tent) à la souche
Y4268 (voir matériel et méthode) de mieux utiliser AICAR.
La stratégie du travail est basée sur l’hypothèse suivant :

L’entrée de l’AICAR est contrôlée par un ou des gènes. Si ce ou ces gène(s)

existe(ent) il va donc favoriser l’entrée de l’AICAR et enfin augmenter le taux de
croissant de levure qui possède ce ou ces gène(s).

La souche Y4268 va être transformée par la banque d’ADN puis le taux de

croissance des transformants va être observé, celui qui pousse le mieux sur le milieu
de sélection va être isolé comme candidat d’un nouveau gène.

Résumé des résultats de la partie 2

La souche Y4268 a été transformé par la banque d’ADN sur le milieu SC-Leu,
elle a été laissée pousser pendant 2 jours puis les transformants ont été répliqués
sur 3 milieux de sélections : SC –Leu –Ade +AICARr, SC –Leu –Ade (contrôle
négative) et SC –Leu (contrôle positive). Deux souches qui ont bien poussé sur le
milieu SC -Leu-Ade+AICARr ont été isolées, striées puis faites pousser dans le
milieu SC-Leu en liquide.

Figure 5. A et B : Les deux candidats qui ont été isolés

10
Les plasmides ont ensuite été isolés à partir de ces deux souches et retransformés dans
la bactérie E.coli. Les plasmides, isolés à partir de ces clones, ont été digérés puis
vérifiés sur le gel d’agarose par électrophorèse.

Figure 6. La transformation des bactéries E.coli sur le milieu LBA en présence X-

gal et les clones ont été isolés.

Figure 7. Vérification par électrophorèse des plasmides candidats à partir des E-

coli transformé, le plasmide P240 a été utilisé comme un contrôle.

Le résultat obtenu à partir du gel d’électrophorèse montre que ce plasmide

qu’on a isolé est bel et bien le plasmide qui vient de la banque d’ADN qui n’a as été
inséré. Ceci veut dire que les gènes ne sont pas présents dans ce plasmide et que les
souches qui ont été isolées sont peut-être des souches qui ont subit une mutation
génomique au cours de la transformation. Le gène qui permet à la levure de mieux
faire rentrer AICAR n’a donc pas encore été trouvé.

V. DISCUSSION

I. La fonction de AICAR sur les facteurs de transcription

Bas1p et Bas2p

J’ai obtenu beaucoup de transformants sur le milieu sélection. Cela montre que
le système « GAP repair » ainsi que la transformation chez ces 2 souches de levure a
bien fonctionné. Le plasmide s’est reformé et s’est bien exprimé.
Après la réplique sur le milieu de sélection et le test X-gal, une souche bleu
foncé a été isolée. Ceci est un mauvais signe car parmi des milliers de transformants
seulement une souche a été détectée. Le plasmide de cette dernière a quand même été
vérifié.

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 Le résultat par gel d’électrophorèse (pas montré ici) montre que le plasmide
isolé est bien le P3455. Plusieurs problèmes se posent. Tout d’abord, l’étape de
vérification est délicate. Le plasmide risque d’être contaminé par d’autres plasmides
car c’est une manipulation avec des bactéries. Ensuite, la récupération du plasmide de
la levure reste difficile à réaliser car la quantité obtenue est très faible et doit être faite
plusieurs fois. Après la re-transformation de ce plasmide et le test X-gal, toutes les
colonies sont blanches. Ceci veut donc dire que la souche qui était bleue est un faux
positif.
Je ne suis donc pas encore arrivé à mettre en évidence la fonction de AICAR
sur Bas2p, le résultat obtenu n’est pas conclusif. Il y a une forte probabilité que la
souche bleue foncée qui a été détectée est un faux positif, c’est-à-dire qu’il soit
possible que cette souche bleu foncée ait subit une mutation pendant la transformation
dans le plasmide P753 : sur la partie de l’opérateur du gène ADE17 de la construction
ADE17-LACZ, qui permet l’expression constitutivement de cette protéine de fusion par
exemple. C’est pour cela qu’on a obtenu une souche bleue foncée qui après
vérification n’y été plus. Pour refaire, il va falloir plusieurs colonies bleues pour avoir
plus de candidats.

II. À la recherche d’un ou des gènes qui permettent à

mieux utiliser l’AICAR

Cette partie du travail consiste à rechercher le gène qui permet à la levure de

mieux faire rentrer l’AICARr.
Comme la souche Y4268 est ADE4∆ et ADE8∆, elle ne va plus produire
l’AICAR et la voie de recyclage sera interrompue.
Après toutes les manipulations, parmi des milliers de transformants, seulement
deux candidats ont été détectés. J’ai donc isolé ces plasmides puis vérifié une partie de
plasmide par gel d’électrophorèse.
Le résultat montre que ces deux plasmides, selon le contrôle P240, sont bien les
plasmides appartenant à la banque d’ADN. Cependant, sans inserts : il n’y a pas de
gène dedans. Or, le plasmide vide a permis à la levure de pousser. La réponse possible
est qu’il y a eu une mutation génomique dans la souche de départ.
On ne sait cependant pas de qu’elle mutation il s’agit. La mutation peut être soit
située au niveau du gène qui contrôle l’entrée de l’AICAR ou s’agir d’autres
hypothèses multiples. Il nous faudra plus de temps pour vérifier cela.
Le fait que je n’ai pas trouvé ce gène peut être aussi dû à l’absence de celui-ci.
L’entrée de l’AICARr peut être contrôlée par plusieurs procédures et non pas
seulement par un seul gène.

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 VI. MATERIEL ET METHODE
I. Plasmide et souches de levure :
A. souches de levure :

Les souches de levure utilisées lors de ce travail sont répertoriées dans le

tableau suivant :

Souche Génotype Origine

Y3165 MATa ade1∆ bas2∆ his3∆ leu2∆ met15∆ ura3∆ Collection du
laboratoire
Y4254 MATα ade8∆ bas2∆ his1-2 leu2∆ ura3∆ Collection du
laboratoire
Y4268 MATα ade4∆ ade8∆ his1∆ his6∆ Collection du
laboratoire

B. Plasmide :

Le plasmide P753 est un plasmide à 2 microns (multi copie) LEU2 exprimant la

fusion ADE17-LacZ qui existe déjà dans la souche Y3165 et Y4254.
Le plasmide P3455 est un plasmide URA3 centromérique, exprimant le gène
BAS2. Ce plasmide complémente un mutant bas2.
La banque ADN YEp13 est la banque à 2 microns (multi copie) LEU2
exprimant un insert entre BamHI 6684 et SalI 6970.

Sur touts les plasmides utilisés, une cassette de résistance à l’ampicilline ont été
insérée.

Les oligonucléotides utilisés pour le PCR mutagenèse dans ce travail sont

répertoriés dans le tableau suivant :

Nom Séquence
1880 5’-CGGACGATGCGGCATATCC-3’
1881 5’-CATCCTTGCTAGCTTGACG-3’
1882 5’-GGTAGACAGGTAAATGACG-3’
1883 5’-GGACTTCCACACCAACTAG-3’

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 II. Manipulation d’E. coli :
La souche d’E. coli utilisée lors de ce travail est la HH5α : supE44, ∆lacU169
(Ф80lacZ∆M15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1.
Les bactérie sont cultivé en milieu complet LB Broth, qui contient : 1% (p/v) de
bactotryptone, 0,5% (p/v) d’extrait de levure et 0,5% (p/v) de NaCl. Les composés
suivants sont ajoutés au milieu LB lorsque cela est nécessaire : ampicilline à 100
µg/ml, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoptranoside).
La transformation de bactérie est effectuée à partir de bactéries compétentes au
chlorure de calcium, ou par électroporation, d’après les protocoles décrits dans
« Molecular Cloning » (116). Inclure un témoin positif (plasmide réplicatif de levure
portant le même marqueur de sélection que celui des transformations à effectuer) et un
témoin négative sans ADN.

III. Manipulation de S. cerevisae :

Les levures sont cultivées à 30°C, en milieu solide, ou en milieu liquide avec
agitation. Les milieux solides sont obtenus par addition de 20g/L d’Agar.

A. Milieux de culture :

- milieu complet YPD (yeast, peptone, dextrose) : 1% (p/v) d’extrait de levure,

1% (p/v) de bactopeptone, et 2% (p/v) de glucose. Ce milieu peut être
supplémenté en base azotée : adénine (20 mg/l).
- milieu SC (synthétique complet) : milieu SC contenant un cocktail d’acides
aminés aux concentrations finales suivantes : L-arginine à 0,1 mM, L-acide
asparitque à 0,6 mM, L-acide glutamique à 0,6 mM, L-méthionine à 0,1 mM, L
phénylalnine à 0,3 mM, L-sérine à 3,6 mM, L-thréonine à 1,7 mM, L-tyrosie à
0,1 mM et L-valine à 1,3 mM. Ce milieu peut être supplémenté en acides
aminés aux concentrations finales suivantes : L-lysine 10 mg/l, L-leucine 60
mg/l, L-tryptophane 40 mg/l ou L-histidine 10 mg/l, L-leucine 60 mg/l, L-
tryptophane 40 mg/l ou L-histidine 10 mg/l ou en bases azotées : uracile 20
mg/l et adénine 20 mg/l. L’AICAR (5’-phosphoribosyl 4-carboamide 5-
aminoimidazole) à 0,25 mM est ajouté lorsque cela est nécessaire.

B. Transformation de S. cerevisiae :

Les transformations de levure sont effectuées par l’acétate de lithium qui sert à
décaper la membrane des levures puis elles subissent un choc thermique. Cette
méthode s’applique à de petits plasmides circulaires réplicatifs et à des
fragments linéaires intégratifs. Inclure un témoin positif (plasmide réplicatif de
levure portant le même marqueur de sélection que celui des transformations à
effectuer) et un témoin négative sans ADN. Pour la transformation avec des
fragments de PCR, le témoin positif est plasmide sauvage P3455, les témoins

14
 négatifs sont des plasmides sans ADN, des plasmides digérés et des fragments
de PCR.

IV. PCR mutagenèse et « GAP repair » :

- PCR mutagenèse : Cette méthode utilise 2 amorces, on fait une amplification
en utilisant trois dNTP soit G ou C ou soit A ou T qui ne sont pas présents dans
la solution. L’enzyme utilisé ici est la Taq polymérase car elle peut faire des
erreurs et elle ne répare pas le fragment. La programme utilisée est : 1er cycle
95°C 3 minutes puis 95°C 30 secondes, hybridation 50°C 30 secondes puis
68°C (Tm Taq) 1 minutes 45 secondes. Répété 29 fois. Dernier cycle 68°C
(permet à finir tous les fragments) 10 minutes puis la température va diminuer
jusqu’à 4°C.
Inclure un témoin négatif sans ADN.

- « GAP repair » : Cette méthode est adaptée à ce travail en utilisant des

fragments ou des transgénèses composés d’une nouvelle séquence (séquence
mutée) bordée par des séquences homologues (les amorces utilisées dans PCR
mutagenèse). Ces fragments sont transformés avec les plasmides digérés, les
séquences homologues se recombinent et sont remplacées par un double
crossing-over au niveau du plasmide coupé.

VII. BIBLIOGRAPHIE
1. Thèse n° 1054 université Bordeaux II (2003), K. Rébora. Régulation de la voie de
biosynthèse de l’AMP et co-régulation avec la voie de biosynthèse de l’histidine chez la
levure Saccharomyces cerevisae.
2. K. Rébora, B. Laloo and B. Daignan-Fornier. 2005. Revisiting Purine-Histidine
Cross-Pathway Regulation in Saccharomyces cerevisae: A central Role for a small
molecule. Genet. 170: 61-70.
3. Nucleic Acids Research, Vol. 20. No. 14, K. Robzyk, Y. Kassir. 1992. A simple and
highly efficient procedure for rescuing autonomous plasmids from yeast.
4. A. Oulmouden, D. Delourme, A. Maftah, Jean-Michel. P., R. Julien. Génétique,
DUNOD.

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