PALESTRA Noes bsicas de cromatografia.

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NOES BSICAS DE CROMATOGRAFIA

Terezinha Bonanho Peres Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteo Ambiental-Instituto Biolgico So Paulo - SP E-mail: peres@biologico.sp.gov.br
RESUMO Cromatografia uma tcnica utilizada para a separao dos componentes de uma mistura. A separao cromatogrfica baseada na distribuio dos componentes entre uma fase estacionria e uma fase mvel. Esta separao resulta das diferenas de velocidade dos componentes arrastados pela fase mvel devido s diferentes interaes com a fase estacionria. Os principais mtodos cromatogrficos so: cromatografia em papel (CP), cromatografia de camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). A seleo do mtodo a ser empregado depende do material a ser utilizado. PALAVRAS-CHAVE: Cromatografia em papel, cromatografia em camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia lquida de alta eficincia. ABSTRACT BASIC NOTIONS OF CHROMATOGRAPHY. Chromatography is an analytical method for the separation of mixture components. The cromatographic separation is based on the different partition of the components to be separeted between the mobile phase and the stationary phase. The principal chromatographic forms are: paper chromatography (PC), thin layer chromatography (TLC), gas liquid chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC). The chromatographic form is selected in accordance to the material to be analysed KEY WORD: Paper chromatography, thin layer chromatography, gas liquid chromatography and higt performance liquid chromatography.

Cromatografia um processo fsico de separao, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionria e fase mvel. A fase estacionria pode ser um slido ou um lquido dispostos sobre um suporte slido com grande rea superficial. A fase mvel, que pode ser gasosa, lquida ou ainda um fluido supercrtico, passa sobre a fase estacionria, arrastando consigo os diversos componentes da mistura. Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia em papel, cromatografia de camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia lquida de alta eficiuncia. A seleo do tipo de cromatografia adequada depende do material a ser isolado e, freqentemente, diversos mtodos cromatogrficos podem ser usados seqencialmente para que seja obtido um composto na forma pura.

Cromatografia em papel A cromatografia em papel (CP) uma das tcnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realizao, porm a que apresenta as maiores restries para sua utilizao em termos analticos. Neste tipo de cromatografia, uma amostra lquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. O papel composto por molculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionria aquosa (polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui atravs do papel, uma partio deste composto ocorre entre entre a fase mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Quan-

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do a fase mvel alcana uma seo do papel que no contm soluto, o fenmeno de partio ocorre novamente, s que agora o soluto transferido da fase mvel para a fase estacionria. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre a fases mvel e estacionria possibilita a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao no papel, para um outro ponto localizado a alguma distncia do local de aplicao no sentido do fluxo de solvente. CAMADA DELGADA Na cromatografia em camada delgada (TLC), a fase estacionria uma camada fina formada por um slido granulado (slica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumnio ou outro suporte inerte. Pequenas gotas de soluo das amostras a serem analisadas so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa secar e, ento coloca-se a mesma em um recepiente contendo a fase mvel (solvente ou mistura de solventes). A polaridade do solvente dever ser de acordo com a substncia que se deseja separar. Como somente a base da placa fica submersa, o solvente comea a molhar a fase estacionria e sob por capilaridade. Deixa-se secar a placa aps o deslocamento da fase mvel sobre ela. A revelao da placa feita com a aplicao de um reativo que de cor s substncias de interesse. CROMATOGRAFIA GASOSA A cromatografia gasosa (CG) uma tcnica com poder de resoluo excelente, possibilitando a anlise de vrias substncias em uma mesma amostra. Dependendo do tipo de substncia a ser analisada e do detector empregado, consegue-se detectar cerca de 10 -12g do composto mL -1 de soluo. Essa sensibilidade permite que pequenas quantidades de amostra possam ser analisadas. A fase estacionria da cromatografia gasosa um material, lquido ou slido, que propicia a separao da mistura atravs de processos fsicos e qumicos. A fase estacionria lquida um lquido pouco voltil que recobre um suporte slido, separando as substancias presentes na amostra atravs das diferenas de solubilidade e volatilidade. Como fase mvel utilizado um gs, denominado gs de arraste, que transporta a amostra atravs da coluna de separao at o detector, onde os compostos separados so detectados. Os gases mais utilizados so o hlio (He), hidrognio (H), nitrognio (N) e argnio (Ar). Como o He de difcil obteno e alto custo pouco utilizado no Brasil. A pureza do gs de arraste interfere no resultado,

acusando impurezas na ordem de partes por milho (ppm) ou partes por bilho (ppb). As colunas cromatogrficas utilizadas podem ser de nquel, ao inox ou de vidro. De acordo com o aparelho, as colunas variam de formato, mas na maioria das vezes elas so espirais. O comprimento e o dimetro da coluna a ser usada ir depender do material a ser analisado. As colunas recheadas analticas possuem dimetro interno (d.i.) de cerca de 1,0 a 4,0 mm e comprimento de 1,0 a 3,0 m, enquanto que as colunas recheadas preparativas apresentam d.i. de 5,0 a 100,0 mm, possibilitando a injeo de maior volume de amostra. J, as colunas capilares tm d.i. variando de 0,15 a 0,75 mm e comprimento de 10,0 a 100,0 m, sendo as mais utilizadas as de slica fundida, pois esta altamente inerte e flexvel. Os detectores so dispositivos que transformam as variaes na composio do gs de arraste em sinais eltricos. Existe diferentes tipos de detectores: 1) detector de condutividade trmica (DCT), usado para compostos orgnicos, inorgnicos, derivados de petrleo etc. Os DCT possuem dois ou quatro filamentos de platina (Pt), tungstnio (W), nquel (Ni) ou Pt - W, os quais so aquecidos por corrente eltrica. Conforme o gs passa pelos filamentos h transferncia de calor e, o tempo da passagem do gs, juntamente com a condutividade trmica so registrados, efetuan do-se assim, a anlise. Esta anlise feita comparando-se o gs de arraste puro (que passa por um conjunto de filamentos) com o gs de arraste com a amostra (que passa por outro conjunto de filamentos). 2) detector de ionizao de chama (DIC), utilizados apenas para compostos orgniocos com baixa sensibilidade para formaldedo e cido frmico, consiste de um campo eltrico (200 - 300 v) e uma chama onde a amostra queimada. A combusto resulta em radicais livres que so ionizados pelo campo eltrico, aumentando a corrente nos eletrodos. 3) detector de captura de eltrons (DCE), usado principalmente na deteco de pesticidas e drogas. Neste detector h uma fonte de radiao beta em corrente constante. O gs de arraste passa com uma amostra onde h substituio de um eltron por um on negativo, o que diminui a corrente eltrica. O gs de arraste com a amostra comparado com o gs de arraste puro (corrente de fundo), que quanto maior seu valor maior a sensibilidade do detector. A diminuio do valor da corrente de fundo sinal de impureza, vazamento da fonte, sujeira ou coluna mal condicionada. O gs de arraste usado o N2 livre de H2 e O2, isto , gs N2 ultra puro. 5) detector fotomtrico de chama (DFC) apresenta alta estabilidade para compostos sulfurados e fosforados. H uma combusto no campo eltrico com emisso de

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luz de diversos comprimentos de ondas. Filtros eliminam as radiaes desneces-srias, selecionando as de interesse, em especial as que tenham enxofre (S) e fsforo (P). O gs de arraste o N2 e da chama o H2 com ar ultra puro e seco.A pureza dos reagentes deve ser na ordem de partes por trilho (ppt). Cromatografia lquida de alta eficincia A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) se desenvolveu muito nos ltimos anos, recebendo o nome de cromatografia lquida por que a sua fase mvel um solvente. Os componentes de um cromatgrafo lquido so: bomba, coluna cromatogrfica, detector e o registrador. um mtodo utilizado para separao de espcies inicas ou macromolculas e compostos termolbeis. A fase mvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas caractersticas impostas por esse mtodo analtico. A principal caracterstica que a fase mvel dissolva a amostra sem qualquer interao qumica entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fcil purificao, para que se possa fazer anlises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na deteco do analito por ultravioleta (UV). A fase mvel deve ser compatvel com o detector empregado e, tambm possuir polaridade adequada para permitir uma separao conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vrios solventes, trs deles so mais utilizados: gua, metanol e acetonitrila. Como fase estacionria utiliza-se slidos ou semirgidos, cujas partculas porosas esfricas ou irregulares apresentam diferentes dimetros e suportam presso at 350 bar. A coluna cromatogrfica feita de um material inerte que resiste a todas as presses em que ela vai ser usa-

da. A capacidade da coluna determinada pelo comprimento, dimetro e pelo material de recheio. As colunas geralmente utilizada so: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina). Quanto aos detectores, no existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. No so versteis, ou universais, mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicaes. A sensibilidade de um detector determinada a partir da relao entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. A linearidade a faixa linear do sistema, onde o sinal do detector diretamente proporcional concentrao do soluto. Os detectores mais usadas na CLAE so os fotomtricos, baseados na absorvncia no ultra-violeta e no visvel. Os detectors de fluorescncia, utilizados como mtodo de deteco especfica, so sensveis para substncias que fluorescem. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. Tambm so utilizados detectores por ndice de refrao, os quais acompanham continuamente a diferena no ndice de refrao entre a fase mvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector moderada, geralmente de ordem micrograma.

BIBLIOGRAFIA C ONSULTADA C OLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos . 6. Ed. Canpinas: Editora UNICANP, 1995. C IOLA, R. Introduo cromatografia em fase gasosa. So Paulo: Edgard Blcher, 1973. C IOLA R. Fundamentos da cromatografia a lquido de alto desempenho HPLC. 1. Ed. So Paulo: Edgard Blcher, 1998.

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