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Cara abierta rl thp

-UniversidadAutdnamaMetraealitana

PROYECTO DE INVESTIGACION

+'PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE UNA ENZIMAPECTINASAPRODUCIDA

POR

Aspergillus niger

POR

MEDIO DE LA TECNICA DE FERMENTACION SOLIDA \ J . A L U H N O :/LUIS E D U A R D O ~ I L A ZAMBRANO


ASESORES:

/
Viniegra

Dr. Gustavo

Gonzalez.

Dr. Gunasekaran

Paramasamy.

225794
*
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Mxico, D.F. a 24 de MAYO de 1

................INGENIERIA BIOQUIMICA INDUSTRIAL UNIDAD:. ...................... IZTAPAWA DIVISION:..... ................CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD TELEFONO:..... ................5-19-36-40
LICENCIATURA:. TRIMESTRE LECTIVO:

............96-1
........
LA

HORAS A LA SEMANA:............40 HORAS TITULO DEL PROYECTO:..


PtJRIFICACION Y CARAC ENZIMA PECTINASA PRODUCIDA POR AsRercrillus nicrer POR MEDIO DE TECNICA DE FERMENTACION SOLIDA.

NOMBRE

DEL ASESOR:......:.....Dr. GUSTAVO VINIEGRA GONZALEZ. PUESTO: PROFESOR TITULAR C ADSCRIPCION: MICROBIOLOGIA Dr. GUNASEKARAN PARAMASAMY PUESTO: PROFESOR TITULAR C ADSCRIPCION: MICROBIOLOGIA

LABORATORIO DE HONGOS FECHA DE INICIO:

BIOLOGIA

MOLECULAR

DE

FILAMENTOSOS. OCTUBRE DE 1995

................ 15

DE

FECHA DE TERMINACION:.........17 DE MAYO DE 1996 CLAVE :

FIRMA DEL ASESOR

MEXICO, D.F. a 2 4 DE MAYO-DE

1996.

Dr. JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA DIRECTOR


LA DIVISION DE

C.B.S.

P R E S E N T E Por medio Social a: LUIS EDUARDO DAVILA


la presente hago constar que asesor en su Servicio de
$

ZAMBRANO

con

matricula

91236383

de la

licenciaturadeINGENIERIABIOQUIMICAINDUSTRIAL

en el proyecto

denominado: PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE UNA ENZIMA PECTINASA PRODUCIDA POR


Asmrgi11us

nicrer

POR MEDIO DE

LA

TECNICA DE

FERMENTACION SOLIDA y despus de haber leido el contenido estoy de acuerdo con 01 por lo que con esta fech~a extieqdo la presente CARTA
DE LIBERACION

DE

SERVICIO

SOCIAL.

ATENTAMENTE:

* ? J p d
D Gustavo Vin ra Gonzdlez. Profesor Distinguido ie Biotecnologia. C . Profesor Titular Investigador Nacional.

casa &Sta al t m p o

\
I

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA


DR. PARAMASAMYOUNASEKARAN
Supo de Fennemtaci6n en Medio S6lido Departamento de Biotecnologla Divisi6n de Ciencias Biol6gicas y de la Salud

iI

MEXICO, D.F. a 2 4 D E ~ Y O DE 1996.

Dr. JOSE LUII

mEmm

FIGUEROA

DIRECTOR DE LA DIVIIIOI C . B . S . P R E S E N T E

Por medio de la presente hago constar que asesor6 en su Servicio Social a:


LUIS EDUARDO DAVILA licenciatura de
ZAMBRANO

con-. matri-cula

91236383

de

la

INGENIERIABIOOUIMICA

INDUSTRIAL enel

proyecto

denominado: PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE UNA ENZIMA PECTINASA PRODUCIDA POR


AsDerdIlUS

niaer

POR MEDIO

DE

LA
0 s

TECNICA

DE

FERMENTACION SOLIDA y despus de haber

ledo el contenido estoy de

acuerdo con 01 por lo que con esta fecha extiendo la presente CARTA DE LIBERACION DE SERVICIO SOCIAL.

ATENTAMENTE:

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA


DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
SERVICIO SOCIAL

LIC. JULIO DE IARA ISASSI COORDINADOR DE SISTEMAS ESCOLARES PRESENTE.

Por medio de la presentese hace constar queel alumno cuyos datos se describen a continuacin, concluy su Servicio Social:

NOMBRE: LUIS EDUARDO DAVILA ZAMBRANO MATRICULA:


91236383

LICENCIATURA: INGENIERIA BlOQUlMlCA INDUSTRIAL PROYECTO: PURlFlCAClON Y CARACTERIZACION DE UNA ENZIMA PECTINASA PRODUCIDA POR Aspergillus niger POR MEDIO DE LA TECNICA DE FERMENTACION SOLIDA Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, a los cuatro das del mes de Junio de mil novecientos noventa y seis. Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"

D D

& O

FIGUEROA

INDICE

...................................................... PROPIEDADES Y APLICACIONES COMERCIALES ............................ PECTINASAS ........................................................ APLICACIONES INDUSTRIALES ......................................... PRODUCCION ........................................................
INTRODUCCION REGULACION DE LA SINTESIS DE PECTINASAS

(1) (2) (3)


(6)

(7)

........................... (8) FERMENTACION EN MEDIO SOLIDO.(FsS) ............................... (11) FACTORES FISICOQUIMICOS:Importancia de la a , en la F s S ........... (11) COMPARACION ENTRE F s S y FmS ...................................... (12) MICROORGANISMOS UTILIZADOS Y USOS TRADICIONALES DE LA FsS ........ (13) (14) EL KOJI . APLICACIONES INDUSTRIALES ...............................
PURIFICACION

................................ METODOLOGIA UTILIZADA ............................................ APARATOS UTILIZADOS .............................................. REACTIVOS UTILIZADOS ............................................. RESULTADOS Y CONCLUSIONES ........................................ ACTIVIDADES REALIZADAS ........................................... RECOMENDACIONES ..................................................
OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS FIGURAS Y TABLAS BIBLIOGRAFIA

(17) (17) (19) (19)


(20)

(21) (21)

.....................................................

(22)

INTRODUCCION

Las substancias pcticas son heteropolisacridos estructurales que confieren rigidez a los tejidos vegetales, en los que actuan como substancia cementante intercelular (Badui,1988) y, como tales, estn ampliamente distribuidos en la naturaleza. Estas substancias son s por polmeros de molculas de cido D-Galacturnico unidas entre un enlace alpha-1,4-glucosdico (Lehninger,l979) (Fig A). Un comit de la Sociedad Qumica Americana, en 1944, reagrup a las diferentes "substancias pcticasll en cuatro categoras: Los cidos poligalacturnicos pcticos pectnicos

Los cidos
Los cidos

Las

protopectinas

Es costumbre, sin embargo, clasificar a las substancias pcticas

en tres grupos (Charley, 1987): i)Protopectina:Es el nombre que se ha dadoa las substancias pcticas insolubles que se encuentran en los tejidos vegetales inmaduros.Los grupos carboxilode la mayorade los residuos de cido galacturnico de la protopectina se encuentran esterificados con radicales ametilo lo largo de toda la cadena (Fig. A) , aunque la composicin qumica exacta de la protopectina se desconoce. ii)Pectinas(cido pectnico):Son ms solubles que las protopectinas y presentan un grado de esterificacin menor. De acuerdo con esto se handividido a su vezenpectinasdealtometoxiloconuna esterificacin entre el 50% y el 85%, y pectinas de b a j o metoxilo con 1980). menos del 50% de galacturonatos esterificados(1shii et al; El trmino aapectinaaa engloba tanto a los cidos pectnicos como a sus sales. Se les utiliza industrialmente como agentes gelificantes. Si el grado de metilacin D.M. es superior al 55%, gelifican en presencia de azcares y en medio cido a pH de 2.5 a 3 (Baron y Thibault;l985). Por el contrario, si el D.M. es inferior al 40%, la presencia de azcares y de cidos no es indispensable parasu gelificacin 2Y se Ca facilita en presencia de iones metlicos tales como los iones

iii)Acidos pcticos:En stas, los grupos carboxilo de los residuos de galacturonato no estn esterificados, pudiendo formar sales(pectatos) con el Calcio y el Magnesio. La proporcinde protopectinas, pectinasy pectatos en los tejidos vegetales vara de acuerdo con su grado de madurez (Charley;1987). La macromolcula natural de pectina contiene, adems, cantidades variables de azcaresneutros-comoramnosa,xilosa,fucosa, y arabinosa- que forman cadenas laterales en la estructura principal (Badu; 1988). Sin embargo, las pectinas comerciales se caracterizan de cido glacturnico,lo que ha sido integrado por un alto contenido
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en la definicin legal de I1pectinal1 que se maneja para propsitos de aditivos de alimentos y de frmacos (May; 1990). Los requerimientos tpicos son de al menos 65% de galacturonato en el anlisis de la substancia libre de humedad. Estos requerimientos limitan las fuentes farmacuticos (May; potenciales de pectinas para usos alimenticios
1990).

Las fuentes de pectina comercialmente aceptables son principalmente las cscaras de manzana de ctricos, que presentan un porcentaje de esterificacin de al menos el 75% u 80%, aunque existen otras fuentes que han sido aprovechadas, como la semilla de girasol el betabel, cuyas pectinas presentan algunos residuos de galacturonato esterificados con grupos acetilo, lo que les confiere de manzana y propiedades distintas a lqs de las pectinas ctricas 1990). permite su uso para aplicaciones muy diferentes (May;
PROPIEDADES Y APLICACIONES COMERCIALES

Est muy difundido el hecho de que la pectina, como otras llgomasll vegetales, forma soluciones acuosas muy viscosas aun a concentraciones tan bajas como el 1% (Badu; 1988). Sin embargo, la propiedad ms conocida de la pectina es que forma geles cuando se encuentraenpresenciadeazcar y 6cido.Enestosgeleslas molculas de pectina se estructuran formando una red tridimensional, en cuyos espacios capilares se encuentra jarabe inmobilizado (Whistler y Daniel; 1985). Aunque no se ha determinado el mecanismo molecular exacto por el cual la pectina forma el gel, se sabe que son H+ para que indispensables el cido -que probablemente aporta iones las cargas negativas de la pectina en solucin se neutralicen y, por tanto, las fuerzas de repulsin intermoleculares- y el azcar, que quizs intrervenga en la formacin del gel disminuyendo la actividad del agua ( a , ) (Charley, 1987). Las propledades caractersticas de los geles de pectina varan de acuerdo al tipo de pectina utilizado. Es posible formar geles en de iones divalentes, si se ausencia de cido, pero con presencia utilizan pectinas de bajo metoxilo (Whistler y Daniel, 1985). Otros factores fsicoqumicos importantes en la formacin de los geles de pectina son la temperatura, la concentraci de los diversos componentes y el pH. La mayor parte de los geles de pectina comienzan y de un pH = 3.5 (May, 1990). a formarse PO abajo de los 75OC El uso de pectina en las jaleas de frutas tradicionales es una de las aplicaciones industriales mejor conocidas y aun uno de los ms 1990). Las grandes mercados para las pectinas comerciales (May, pectinas de alto metoxilo son tiles en la manufactura de jaleas Vpicas1I, con un alto contenido de azcar (slidos solubles arriba del 6 0 % ) . Actualmente se producen, adems, jaleas lldietticasll con slidos ssolubles) bajo contenido de azcares (30% a 4 0 % de utilizando las pectinas de bajo metoxilo con excelentes resultados (Whistler y Daniel, 1985). Tambin se utilizan las pectinas en la elabolracin de flanes y llglacsll, los en que actan como espesantes, as como de coberturas y rellenos de repostera (Charley, 1987). Tambin se ha encontrado utilidad a estas macromolculas en el campo de los lcteos: las [pectinas de alto metoxilo pueden servir como estabilizantes en la leche y bebidas de yogourt tratadas por el

proceso de UHT al impedir la agregacin de los grnulos de caseina (May, 1 9 9 0 ) . Un rea de aplicacin creciente para las pectinas, es la produccin de bases de frutas para adicionar a yogourts y productos similares (May, 1 9 9 0 ) . Otros usos comerciales de las pectinas incluyen su accin como texturizantes en helados, salsas, refrescos y jarabes, y aun su intervencin como principio activo en algunas formulaciones farmacolgicas contra la diarrea y las tlceras pcticas (Charley, 1 9 8 7 ; May, 1 9 9 0 ) .
PECTINASAS

Las Pectinasas enzimas pectinoliticas se encuentran en plantas superiores y enmicroorganismos,peronosonsintetizadaspor animales superiores. La presencia y accin de las enzimas pectinolticas es importante tanto en las plantas vivas como en productos comercialmente importantes derivados de ellas. Las enzimas pectinoliticas obtenidas de ciertos microorganismos tienen diversas aplicaciones industriales. A los substratos de estas enzimas se les conoce como substancias pcticas- grupo de complejos polisacridos cidos que se presentan naturalmente en los materiales de las los polisacridos pcticos son importantes plantas. Tcnicamente, como agentes gelificantes en la industria alimentaria. El tamao, la densidad de carga, la distribucin y el grado de substitucin en los polisacridos pcticos puede modificarse fcilmente con enzimas u otros reactivos. Alteraciones muy pequeas en la constitucin de la molcula de pectina pueden ocasionar un profundo efecto en sus propiedades fisico-qumicas, hecho que ha sido utilizado para plantear esquemasde purificacin. ORIGEN Y CLASIFICACION. La degradacin enzimtica de la pectina, es un fenmeno asociado con numerosos procesos biolgicos. Se presenta durante el desarrollo normal de las plantas al elongarse los tejidos vegetales en el s rboles caducifoliosy en crecimiento, al escindirse las hojas l o en la maduracin de los frutos (Alabiy col. , 1 9 7 7 ; Rambouts y Pilnik, 1 9 8 0 ) , por dar s o l o unos ejemplos. Se degrada la pectina, junto con otros componentes de la pared celular de los vegetales, al establecerse ciertas asociaciones simbiticas de stos con algunos microorganismos,ascomodurantelosprocesosdeinfeccin e y col., 1 9 9 1 ) . infestacin por parsitos de las plantas (Mc Guire Cada ao existen considerables prdidas durante el transporte el almacenamiento de frutos, hortalizas y verduras frescas debido a infecciones y pudriciones causadas por hongos y bacterias capaces de degradar las paredes celulares de aquellas (Collmer y Keen, 1 9 8 6 ) . El fenmeno de pectolisis est implicado tambin en la digestin de los rumiantes, y en el ciclo de degradacin animales herbiboros, como de depsitos vegetales (humus) (Collmer y Keen, 1 9 8 6 ) . No es sorprendente, pues, que las enzimas encargadas de degradar la pectina, en conjunto denominadas comunmente como pectinasas, se encuentren ampliamente distribuidas en la naturaleza, siendo sintetizadas por numerosos organismos: bacterias, protozoarios, levaduras , hongos filamentosos e insectos, adems de los propios vegetales (Runliny col., 1 9 9 0 )

Siendo tan difundido el espectro de fenmenos en los que la pectolisis est implicada, el rango de enzimas pectinoliticas que ocurre en la naturaleza es similarmente amplio (Richardson y Hyslop, 1985). Parasuestudio,laspectinasashansidodivididasen diferentes tipos, clasificndolas de acuerdo al modo de ataque que cada una presenta hacia la molcula de pectina (Ward, 1 9 8 5 ) (Fig. B). Tenemos, as, una primera clasificacin en dos grandes grupos: las pectinesterasas, que son aquellas que atacan el enlace ster entre el metoxilo y el carbono 6 de cada Bcido galacturnicode la cadena de la pectina, y las depolimerasas, que ocacionan la ruptura del enlace entre dos residuos de cido galacturnico glicosidico A - 1 , 4 (liasas) por hidrlisis adyascentes, ya sea por A-eliminacin (hidrolasas) (Rambouts y Pilnik, 1 9 8 0 ) . Dentro de las depolimerasas encontramos, a su vez, las exopectinasas y las endopectinasas, de acuerdo de si atacan a la pectina slo a partir de los extremos, bien, si la atacan en 1985). cualquier punto al azar a lo largo de toda la cadena (Ward, En una clasificacin ms fina encontramos tipos ms precisos de y liberar enzimas, capaces de degradar molculas ms especficas ,diferentes productos: Las pectinesterasas, son formadas por las plantas superiores, hongos y levaduras, y algunas bacterias (Ward, 1 9 8 5 ; Barnby y col, 1 9 9 0 ) . Estas enzimas presentan una alta especificidad hacia el enlace ster del cido pctico, siendo ms efectivas a grados de polimerizacin de 1 0 ms (Rambout y Pilnik, 1 9 8 0 ) . Se ha reportado quelaspectinesterasasdeplantassuperiores,sommarcadamente influidas por los cationes divalentesy monovalentes, siendo, adems, inhibidas competitivamente por el pectato (inhibicin por el producto terminal) (Rambouts y Pilnik, 1 9 8 0 ) . Usualmente, la actividad de estas enzimas es medida, en ensayos de laboratorio que utilizan la titulacin continua de los grupos carboxilo liberados por su accin sobre la pectina (Kilara y Benchura, 1 9 9 0 ) . Las liasas tambin llamadas transeliminasas, al atacar a sus substratos por A-eleminacin, producen un doble enlace entre los carbonos 4 y 5 del extremo reductor recin formado (Richardson y Hyslop, 1 9 8 5 ) . Esto permite el ensayo de sus actividades por medio del monitoreo del aumento de la absorbancia a 2 3 5 nm (tom ndo el 4 6 0 0 y 5 5 0 0 cm 3 /nmol) coeficiente de extincin molar valores entre (Fogarty y Kelly, 1 9 8 3 ) . La exopectatoliasa (poli(1,I--D-galacturnido)exoliasa,EC. 4 . 2 . 2 . 9 ) liberadmerosinsaturados a partirdelextrremoreductordel pectato, que es el sustrato preferido sobre las pectinas para esta enzima (Richardson y Hyslop, 1 9 8 5 ) . Este tipo de enzimas pectinolticasessintetizadoporvariosgnerosbacterianos y fngicos (Ward, 1 9 8 5 ) , siendo en general no afectadas por los iones de pH divalentes (Rambouts y Pilnik, 1 9 8 0 ) . Se han reportado valores 8 . 5 y 9 . 5 ; y existen, ptimos muy elevados para estas enzimas: entre al parecer, algunos casos en que se encuentran fuertemente asociadas a modo de lnea de con pectinesterasas, conjugando sus acciones ensamblet1 de la pectina (Sicard.1 9 8 8 ) . Los pectatosy las pectinas de bajo grado de metoxilacin son los endopectatoliasa (poli(1,4-subsatratos de mayor prioridad para la D-galacturnido) liasa, E C . 4 . 2 . 2 . 2 . ) . Esta ltima enzima ataca al pectato en una forma aleatoria a lo largo de toda la molcula, produciendo una serie de oligogalacturonatos insaturados de distintos
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tamaos, a los que vuelve a atacar hasta producir una acumulacin de y Kelly, dmeros trmeros insaturados de galacturonato (Fogarty 1983; Richardson y Hyslop, 1985). Varios grupos de bacterias y de hongos patgenos para las plantas, producen endopectatoliasas, que presentan tambin valores ptimos de pH elevados y que tienen un requerimiento absoluto de iones Ca++ para funcionar adecuadamente (Durrands y Cooper, 1988). Un tercer tipo de liasas corresponde al de las endopectinliasas (poli(l,4-&D-galacturnido) glicano hidrolasa, EC. 3.2.1.15) atacan de modo preferencial al pectato, al cual hidrolizan aleatoriamente, provocando la acumulacin de dmeros y trmeros de galacturonato; su actividad disminuye al aumentar el grado de esterificacin del substrato y/o al disminuir su grado de polimerizacin. Numerosos hongosfitopatgenos y saprofticos,levaduras y bacteriasson capaces de sintetizarendopoligalacturonasas(Aguilar y Huitrn, 1987; Bailey y Pessa, 1990; Barnby y col, 1990). La mayoria de las enzimas de este tipo reportadas presentan pesos moleculares entre 30,000 y 35,000 daltons y se ha establecido una naturaleza glicoprotica para algunas de ellas (Sicard, 1988; Gillespie y col, 1990). Presentan valores de pH ptimos de entrew 4 . 0 y 6.0 (Sreekantiah y col, 1973 y 1975; Kotzekidou, 1991). Las endopoligalacturonasas provocan la rpida disminucin de la viscosidad de una solucin de pectina, por lo cual puede ensayarse experimentalmente su actividad de modo muy sensible por viscosimetra (Rambouts, y Pilnik, 1980; Fogarty y Kelly, 1983). Por otro lado, la exopoligalacturonasa (poli(l,4-A-D-galacturnido) galacturono hidrolasa. EC.3.2.1.67) ataca tambin preferencialmente a las cadenas de pectato, pero es tambin bastante activa degradando oligogalacturonatos e incluso digalacturonatos (Rambouts y Pilnik, 1980). Esta protena libara monogalacturonatos a partir de un extremo de la cadena de cido pctico; puede ser el extremo reductor el extremo no reductor, dependiendo del origen de la propia enzima (Ward, 1985). Las exopoligalacturonasas se pueden encontrar en las plantas superiores, en las bacterias, en hongosy en los tractos digestivos dealgunosinsectoshervboros(Runlin y Col, 1990). Presentan valores de pH ptimos en torno a 5. O y son estimuladas tambin por los iones divalentes (Durrands y Cooper, 1988). El mtodo ms usual de ensayo de la actividad exopoligalacturnica es por medio de la medicin de azcares reductores producidos por la liberacin de monogalacturonatos en un cierto tiempo (Fogarty y Kelly, 1983). Un ltimo tipo de enzimas pectinolticas est constituido por las oligogalacturonasas. Estas son enzimas unidas a la superficie de las clulas de ciertos hongos y bacterias que degradan muy activamente a unidades oligogalacturonatos, saturados 6 no, hasta reducirlos monomricas. El ataque se realiza a partir de uno u otro extremo, y Pilnik, 1980; Ward, 1985). La reductor 6 no reductor (Rambouts principaldiferenciaentreestasexoenzimas y lasexopectinasas descritas anteriormente es que las oligogalacturonasas atacan preferencialmente cadenas cortas de poligalacturonato, disminuyendo su tasa de actividad conforme la longitud del substrato se incrementa (Rambouts y Pilnik, 1980). La actividad de todas estas enzimas es expresada comunmente en vvunidadesvv. Desafortunadamente no existea f n un acuerdo generalizado
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entre los distintos investigadores sobre la definicin de tales I1unidades1*y existeunagranvariacinentrelasdefiniciones brindadas por los diferentes autores a lo largo de las comunicaciones publicadas al respecto. Una manera de definir una "unidad enzimtica de pectinasa" es: "la cantidad de enzima que rompe un microequivalente de enlaces, ya sea ster glicosidicos, en un minuto bajo ciertas condiciones experimentales "dadasv1 (Kilara y No obstante, es frecuente encontrar en las Benchura, 1990) publicaciones cientficas, definiciones ms pragmticas adaptadas ms al tipo de ensayo que el laboratorio en cuestin realiza; a s por las endopoligalacturonasas es frecuente ejemplo, en el casode definir una unidad como: Onla cantidad de enzima que disminuye en un

una solucin de pectina a cierta concentracin, en un volumen, temperatura y tiempo dados (Saval, 1985; Aguilar y Huitrn, 1987; Leuchtenberger y Mayer, 1992). El uso de definiciones pragmticas es estimulado tambin, al menos en parte, por el hecho de que en la prctica industrial, las preparaciones comerciales de enzimas pcticas utilizadas, consisten de varios tipos distintos de los descritos antes, de modo que result actividad de una de tales complicado definir la potencia preparaciones basndose en la accin de una enzima especifica (Barnby y col, 1990; Kotzekidou, 1991; Genecor Inc. Catlogo de informacin de procuctos enzimticos No P2C184. San Francisco, U.S.A. CA94080; Solvay eEnzyme Product Information. California, U.S.A.).
APLICACIONES INDUSTRIALES

50% la viscosidad de

Como se deduce de los prrafos anteriores, adems de la relevancia que tienen las pectinasas en la naturaleza, estas enzimas presentan una importancia econmica considerable debido a que se les utiliza ampliamente en ciertos procesos industriales, sobre todo en el rea de procesamiento de alimentos (Ghildyal y col., 1981; Sols, 1988; Larios y col., 1989; Sols y col. , 1990). Entre las aplicaciones ms importantes de las pectinasas en esta &rea estan:

- Clarificacin de iusos de frutas y vinos: El ms antiguo y extendido uso que se les ha dado a las pectinasas. Los jugos de frutas frescas recin estrados por presin presentan turbiedad y una viscosidadrelativamentealta.Ambascaracteristicasindeseables pueden ser fcilmente eliminadas por la accin de las pectinasas, que disminuyen la viscosidad e inducen la floculacin de las partculas en suspensin que provocan la turbidez, con lo cual pueden ser 1985; Kilara y Benchura, 1990). fcilmente separadas (Ward, - Extraccin de nctares de frutas tropicales: Las pectinasas, al provocar la ruptura de la substancia cementante entre las clulas de las plantas, producen la maceracin de los tejidos vegetales, pudindoseobtenerporsuactividadunasuspensin de clulas separadas. Estos hechos han sido utilizados en la manufactura de alimentos y papillas para bebs. Asi mismo, se han aprovechado en la produccin de nctares de ciertas frutas, como la guayaba, la papaya, el chabacano y la llamada "fruta de la pasin", e incluso en la I1extraccin de jugot1 de frutas como el pltano, ya que si las
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pectinasas se dejan actuar en conjuncin con las celulasas, el proceso puede llevarse prcticamente hasta la licuefaccin de los tejidos (Kilara y Benchura, 1 9 9 0 ) . El uso de las pectinasas es adecuado para cierto tipo de frutos tropicales para los cuales no se ha diseado ningn equipo especifico de extraccinde jugos (Ramboutsy Pilnik, 1 9 8 0 ) . Aumento del rendimiento en la extraccin de iuqos de citricos: En un sentido similar al anterior, las pectinasas han sido usadas para aumentar el rendimiento durante la extraccin de jugos de los citricos, en los ciertos frutos, especificamente del grupo de cuales el bagazo que queda despus de la accin de la maquinaria de prensado, an contiene un alto porcentaje de jugo y de slidos solubles (Ward, 1 9 8 5 ) . Valorizacin de desechos aqroindustriales Y obtencin de submoductos: Otro uso que se ha dado a las pectinasas es la valorizacin de desechos agroindustriales por medio de la obtencin, a partir de ellos, de subproductos tiles. De esta manera se extraen, por ejemplo, aceites esenciales y pigmentos carotenoides de las cscaras de los citricos, y existen estudios reportados para la obtencin de productos fungosos ttiles por el crecimiento de hongos pectinoliticos sobre bagazo de caa, fibra de trigo y otros desechos (Pealoza, y col., 1 9 8 5 ; Favela Torresy col., 1 9 8 9 ) . Fuera de la rama alimentaria tambin se les ha encontrado uso en la industria papelera y textil (Ghildyal y col , 1981; Baracat y col., 1 9 8 9 ) . Las pectinasas han sido usadas en la industria durante 50 aos; su aplicacin en estasy otras ramas seguramente continuar expandindose, pues constituyen una herramineta indispensable para el desarrollo de ciertas tecnologias (Rambouts y Pilnik, 1 9 8 0 ) .
PRODUCCION

Como puede verse, el mercado industrial de las pectinasas, aunque menor que el de las amilasas (que resulta ser el mayor de la industria alimentaria en cuantoa enzimas se refiere (Ward,1 9 8 5 ) ) , es de importancia econmica considerable. De acuerdo con Fogarty y 165 millones de libras Kelly ( 1 9 8 3 ) , existe un valor estimado de esterlinas por ao en el mercado de las pectinasas para procesos industriales. Otros autores estiman indirectamente el valor de las pectinasas en el comercio mundial de considerando que alrededor del 25% de la produccin mundial de enzimas para la industria alimentaria -unos 1 3 5 O 0 0 millones de pesos- se relaciona con aquellas (Rambouts y Pilnik, 1 9 8 0 ) . Las pectinasas son manufacturadas comercialmente por varas compaias en Europa, Estados Unidos y Japn (Raimbault,
1987). 1981;

Oriol,

Con el uso de las pectinasas extendindose, al tiempo que las regulaciones legales en materia alimenticia se hacen cada vez ms restrictivas (Kilara y Benchura, 1 9 9 0 ) , estas compaias enfrentan ahora el problema de hacer m6s eficiente su produccin, obteniendo
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preparaciones enzimticas ms puras, ms concentradas y de mayor calidad a ms bajos costos. Se intenta optimizar los procesos de produccin y se buscan substratos mds baratos para el crecimiento de microorganismos generadores de las enzimas de inters, ya que la pectina resultaria incosteable como substrato. En el presente, la sntsis microbiana de enzimas a nivel industrial requiere de los costos de microorganismos altamente productivos para reducir produccin (Sols y col:, 1990). Pese a lo anterior, no obstante la gran cantidad de microorganismos que producen pectinasas, las restricciones impuestas sobre el origen de las materias primas utilizadas en la manufactura alimentos de y medicinas para poder clasificarlos como "sanitariamente seguros" (status GRAS: "generally recognized as safe" de la USDA) han limitado de modo considerable las fuentes potenciales de produccin de estas enzimas para su utilizacin industrial (Bailey manera, y Pessa, 1990; Kilara y Benchura, 1990). De esta prcticamente todas las pectinasas comerciales que existen en el mercado provienen de especies de hongos del gnero Aspergillus, sobre todo de Aspergillus niger. Aunque existen, como se mencion anteriormente, bacterias productoras de pectinasas, como lo es, por ejemplo, Bacillus subtilis, las enzimas de origen bacteriano son vistas con cierta desconfianza y no son producidas comercialmente, aunquerepresentanan,unafuentepotencialinteresante si se considera que en algunos casos son producidas en forma constitutiva (Tsuyumu, 1977; Tsuyumu, 1979). Las pectinasas fngicas que se producen comercialmente consisten en mezclas de pectinesterasas, pectinliasas y poligalacturonasas -y enocacionesalgunasotrasactividadesenzimticasendiversas proporciones (Kotzekidou, 1991; Genecor Inc. Catlogo de informacin NOP2CL84. SanFrancisco,U.S.A.).Estas de Productos enzimticos los preparaciones comerciales se desempean bien, en general, en principales campos de aplicacin de las pectinasas. La produccin Industrial de tales complejos enzimiiticos se lleva a cabo por medio sumergido, y el de cualquiera de dos procedimientos: el liquido 2). Como semencionantes,elprimeroesmuy Slido (Tabla ampliamnete usado por su ms fcil control, sin embargo, el segundo mtodo rinde mayor cantidad de enzima por gramo de substrato y (Trejo col., 1991), a una concentracin mayory es relativamente econmico, y utilizado (Ghilkdyal por lo cual empiezaa ser cada vez mejor visto y col., 1981; Pandey, 1992).
REGULACION DE LA SINTESIS DE PECTINASAS

Pese a que,comosedijo, los hongos son los principales microorganismos productores de pectinasas a nivel industrial, la regulacin de la sintesis de estas enzimas ha sido mejor estudiada en a las bacterias fitopatgenas (Aguilar y Huitrn,1987), quizds debido cuestiones de simplicidad gentica. Se ha reportado que dentro de de diferentes tipos de enzimas stas existen especies productoras pcticas a un nivel constitutivo sensible a represn catablica (Leone y Van den Heuvel,1987). En algunos otros casos, la enzima es inducible (Foda y col., 1984), pudiendo ser excretada al medio permanecer ligada a la superficie celular (Ramboutsy Pilnik, 1980).
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Se ha demostrado la ingerencia AM de P ciclico (AMPc) como un mediador de la regulacin de la sintesis de pectinasas en algunos casos (Tsuyumu, 1979). En los hongos filamentosos, el conocimiento sobre la regulacin de la sintesisde pectinasas es ms limitado, aunque es de esperarse una variabilidad, al menos similar a la de las bacterias (Leone y Van den a la fecha indican que en este Heuvel, 1987). Los estudios realizados aspecto existen diferencias notables entre cepas. Foda y col. (1973), estudiando las condiciones ptimas en el medio de cultivo para la Penicillium mejor produccin de pectinasas con hongos de los gneros y Aspergillus, hallaron que era dificil hacer generalizaciones; encontraron que factores como la temperatura, la aireacin, el pH y la composicin del medio eran factores importantes, pero que la cantidad de enzima producida a un nivel dado de cada uno de dichos factores variaba entre cepas -incluso de la misma especiede acuerdo a la sensibilidadde cada cepa. En general, se sabe desde ya hace tiempo, que las actividades pectinoliticas pueden ser inducidas en algunos hongos por la presencia de pectina de compuestos relacionados con ella, como el mucato, el poligalacturonato el palpitato, en el medio de cultivo (Foda y col, 1984). Vasu en 1967, demostr que las enzimas pcticas Aspergillus niger ocurren en distintos tipos producidas por moleculares, existiendo algunas inducibles y otras constitutivas. Dado que se cree que la induccin de pectinasas es importante como los requrrimientoinicialparalapenetracin y clonizacin de tejidos vegetales por organismos que atacan las plantas (Collmer y Keen, 1986; Runlin y col., 1990), este fenmeno ha sido estudiado y Keen, 1986; extensamente en diversos gneros de hongos (Collmer Dean y Timberlake, 1989; Leone y Van den Heuvel, 1987). Diversos estudios, realizados sobre la produccin pectinsica de hongos fitopatgenos cultivados en medio con paredes celulares como fuente carbonada, reportan que existe una correspondencia temporal entre la secuencia de aparicin en el medio de los diferentes tipos de enzimas pectinoliticas ( y en ocasiones de algunas otras y la actividades enzimticas tambin implicadas en la pared celular) secuencia de capas diferentes de tejido vegetal que el patgeno va encontrando al establecer su ataque (Cooper y Wood, 1975; Leone y Van den Heuvel, 1987). Ello di origen a la pregunta de cmo estos organismos son capaces de detectar el substrato en el medio, an cuando molculas tan grandes como la pectina no pueden entrar a la clula (Leone y Van den Heuven, 1987). Algunos investigadores han apoyado la idea de que existe un nivel bajo constitutivo de secrecin de enzimas degradadoras de la pared celulary que los productos de degradacin pueden entonces atravesar la membrana celular hacia el interior e inducir la mayor produccin de tales enzimas (Tsuyumu, 1977; Leone y Van den Heuvel, 1987). Variosestudioshancomprobadoquebajasconcentracionesde 6 la molculas de carbohidratos simples, como el cido galacturnico sacarosa, son capaces de aumentar la presencia de enzimas pectinoliticas en el medio (Keen y Horton, 1966; Foda y col, 1984; Aguilar y Huitrn, 1987). Sin embargo, no est claro an cul es el compuesto que acta como inductor directo dentro de la clula, pues de acuerdo con la cepa y al parecer, la naturaleza del inductor varla el tipo de enzima implicados (Tsuyumu, 1977;Aguilar y Huitrn, 1987).

Adicionalmente,elpapelquedesempeanlasmolculas de un compuesto dado como reguladores de la sintesis de enzimas varia en funcin de su concentracin en el medio. Keen y Horton (1966), en contraron en Pyrenochaeta terrestris, que la produccin de endopoligalacturonasa (endo-PG) era estimulada por la presencia en el medio de glucosa u otras hexosas en concentraciones O. de005 M, pero que la misma enzima era reprimida si la concentracin de dichas hexosas era aumentada en un orden de magnitud, a O. 05 M. El mismo fenmeno ha sido reportado en varias ocaciones para otros compuestos y microorganismos,incluyendoelgneroAspergillus(Aguilar y Huitrn, 1987). Algunos autores reportan que los mejores medios para inducir la sntesis de pectinasas son aquellos formados por una fuente mixta de y algn carbohidrato carbono con molculas de substrato (pectina) simple(glucosa) a bajaconcentracin(Rambouts y Pilnik, 1980; Chopra y Mehta, 1985). De este modo, la produccin de pectinasas depende de un sutil equilibrio entre los efectos de induccin y represin catablica de medio de los distintos compuestos presentes en el substrato cultivo. La represin catablica, que consiste en la inhibicin de la sntesis de enzimas catablicas inducibles provocada por la presencia de glucosa en el medio (Herzkowitz,1977) es un fenmeno general en los microorganismos. En el caso de Aspergillus niger, se sabe que la produccin poligalacturonasa de reprimida es por ciertos carbohidratos que son aprovechados con preferencia sobre el cido galacturnico, como son la glucosa, la fructosa y los intermediarios de la gluclisis (Keen y Horton, 1966; Maldonado y col., 1989). Queda a C l n por aclarar el nivel exacto al cual la expresin pectinolrtica es estudiar la represin controlada. Shinmyo y col. (1978), al catablica de la poligalacturonasa, analizaron la estabilidadde los correspondientes -As y supusieron a partir del tiempo de vida media de stos, que el control se efectuaba a nivel de la traduccin.Ms tarde, sin embargo, Maldonado y colaboradores (1989) trabajando con Aspergillus niger encontraron evidencias de que el punto de regulacin de la pectinesterasa y la poligalacturonasa se encontraba a nivel de la transcripcin, en tanto que Deany Timberlake (1989), al estudiar el gen de la pectato liasa de Aspergillus nidulans, reportaron un nivel de mRNA que no corresponda exactamente al nvel de enzima liberada al medio, por lo cual concluyeron que existe, un control postranscripcional que regula la expresin de esta actividad Es probable, pues, que existan en enzimtica en el medio de cultivo. los hongos filamentosos varios puntos de control de la expresin de las pectinasas. Leone y Van den Heuvel (1986), quienes han trabajado con Botritis cinerea, piensan que la actividad pectinolitica constituye, de hecho, una ruta catablica en la cual existe, no solo represin de enzimas por catabolito final, sino un control de retroalimentacin a lo largo de todaunacadena de enzimascoordinadas.Por lo tanto, el desarrollo de nuevas cepas de Aspergillus niger para la produccin industrial de pectinasas requiere de un conocimiento cada vez ms avanzado sobre los mecanismos de induccin y represin de stas. Los avances en este campo facilitarn, entre otras cosas, el desarrollo de estrategias novedosas para el aislamiento de nuevas cepas de organismos productores de dichas enzimas.
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FERMENTACION EN MEDIO SOLIDO ( F s S )

DEFINICION: llFermentacinllentrminosBioquimicos,esaquelconjuntode reacciones catablicas productoras de ATP en las cuales las molculas orgnicas actan tanto como donadores primarios de electrones como de 1979). Durante dichas aceptores finales de stos (Lehninger, reacciones, se producen compuestos de utilidad prctica para el hombre y , es una costumbre hablar de llfermentacionesll para referirse, en el ambit0 industrial,a los procesos microbianos de produccin de y col., 1987; Scriban, 1985). tales compuestos (Brock La gran mayoria de las fermentaciones industriales en la sociedad occidental han utilizado y desarrollado la denominada onfermentacin liquidaou %Urnergidan (FmS) (Hesseltine, 1972), enlacualel sistema est formado por microorganismos inoculados en un medio que consiste de una solucin suspensin acuosa de nutrientes que se agita a fin de obtener un adecuado contacto entre stos y la fase bitica (Scriban, 1985). Sin embargo,existe otra tcnica general de fermentacin , i.e. la "fermentacion en medio slidom@ (FsS), que se ha usado tradicionalmente para la manufactura de productos y que ha comenzado l o s procesosproductivosdebido a las a cobrarimportanciaen ventajas que presenta en muchos casos sobre(FmS) la (Pandey, 1990). La fermentacin en medio slido, es Voda aquella fermentacin en 1972). Ms la cual el substrato no es liquido1' (Hesseltine, exactamente, la F s S puede ser definida como una tcnica de cultivo de microorganismos sobre superficie la particulas de slidas humedecidas a un grado tal que permite el crecimiento de dichos microorganismos pero no excede el nivel de retencin mxima de agua & Blachere, 1988). de la matriz slida (Durand
FACTORES FISICOQUIMICOS: IMPORTANCIA DE LA

EN LA FSS.

A diferencia de la FmS, en la cual, por definicin, el agua no es un factor limitante, en laF s S , la cantidad mxima de agua presente en el medio, est en funcin de la capacidad de retencin del substrato (Oriol, 1987) , de modo que ste debe ser capaz de absorber agua en una cantidad equivalente a una varias veces su propio peso de agua ( a , ) relativamente alta en su seco, manteniendo una actividad superficie (Viniegra, 1988). Para poder se til en el crecimiento de microorganismos, el liquido en el seno de la matriz no debe ser excesivamente abundante, para no disminuir la porosidad y , por consecuencia, el intercambio gaseoso, ms debe estar presente en cantidad suficiente para no limitar dicho crecimiento (Oriol, 1987). De hecho, una revisin de los trabajos sobre el tema, muestra que no solamente la cantidad de agua es importante, sino tambin la disponibilidad de sta, concepto representado fisicamente por la "actividad del agua" ( a , ) (Grajek y Gervais, 1987; Guilbert, 1988; Solis y col., 1 9 9 1 ) .
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La matriz slida que conforma el substrato en la FsS debe, asimismo, presentar una porosidad elevada, una re acin de volumen a superficie, muy alta (del orden de a lo6 m /1), debe absorber contener nutrientes microbianosy debe, finalmente, estar libre de compuestos inhibidores hacia los microorganismos de inters 1988) (Viniegra,

':c

Substancias tanto naturales como sintticas pueden ser usadas como substratos en los procesos de FsS. En la prctica, los principales materiales disponibles son pollmeros naturales insolubles en agua que los microorganismos pueden ser usados como fuente de carbono por 1992). (celulosas, ligninas, pectinas, etc.) (Pandey,
COMPARACION ENTRE FsS y FmS.

Con respecto a la fermentacin sumergida, la FsS presenta varias ventajas: Necesita grandes cantidades de esporas como inculo, es ms difcil de controlar en cuanto a ciertos parmetros fisicoqumicos debido a la heterogeneidad de los substratos involucrados normalmente, dificultando el mantenimiento de las condiciones ptimas de fermentacin; y, en el mundo occidental, los conocimientos tecnolgicos, fisiolgicos y fundamentales respecto a esta tcnica 1981). son menoresy relativamente recientes (Raimbault, Noobstante,la FsS presentatambinunaserie de grandes ventajas, con importante impacto econmico, entre las que se 1972; Viniegra, 1988; encuentran las siguientes (Hesseltine, Shankaranand y col., 1992):

Debido al bajo volumen de agua utilizado, el producto obtenido se encuentra mucho ms concentrado al final del proceso que en el de la fermentacin sumergida, en la cual pequeas cantidades de producto deben ser separadas de grandes cantidades de agua. En algunos casos, lasubstancia de inters es producida por el microorganismo de manera intracelular al cultivarlo en FmS, pero es excretada al medio cuando se cultiva por FsS.

- El relativamente bajo valor de la actividad del agua requerido para obtener mximo rendimiento del producto con hongos, favorece el crecimiento de stos sobre el de bacterias contaminantes, por lo cual las necesidades de operacin estriles se ven reducidas.
Al utilizar menos agua en el proceso, la FsS genera menos agua residual, de la cual una buena parte puede ser evaporada en tambores rotatorios,reducindoseasisignificativamenteelcostodelos de aguas residuales. procesos de tratamiento

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- La aireacin es ms fdcil de obtener debido a la existencia de espacios entre las partculas slidas del substrato, provocando que la disponibilidad de oxfgenonosea un factorlimitantedel crecimiento microbiano.
- Ya que las esporas son usadas directamente como inculo, no es necesario contar con inculos preformados ni Iltanques semillatt.
Adems de todo lo anterior, la complejidad del equipo de no es mayor que la del laboratorio la planta piloto requerido necesario para fermentaciones sumergidas tradicionales (Hesseltine, 1 9 7 2 ) , y en muchas fermentaciones, los rendimientos en FsF son mucho mayores que en fermentacin sumergida (Sreekantiah y col, 1 9 7 3 ) .

MICROORGANISMOS UTILIZADOS Y

USOS

TRADICIONALES DE LA FSS

La seleccin del microorganismo apropiado es uno l o de s criterios ms importantes para el funcionamiento ptimo del proceso en la FsS. Aunque los microorganismos utilizados para la FsS son variados (Pandey, 1 9 9 2 ; Shankaranand, 1 9 9 2 ) , la mayora de los casos 1 9 8 7 ; Pandey, 1 9 9 2 ) . conciernen a los hongos filamentosos (Oriol, El tipo de desarrollo de los hongos en FsS vara de aquel observado en FmS; en tanto que en este ltimo sistema, el micelio forma ltpelletsll, en FsS, la casi nunca ausencia de liquido intersticial hace que sea la geometra del substrato la que oriente el desarrollo apical y las ramificaciones. En este sentido, los substratos slidos se asemejanm6s al medio ambiente natural de los homngos filamentosos (Orio1,1987). La FsS con hongos filamentosos ha sido empleada desde hace varios siglosenlamanufacturadealimentostradicionales(Raimbault, 1 9 8 1 ) . En oriente, el uso de la salsa de soya tipo koji, producida porlafermentacinslidadeestosgranos,seremontahasta probablemente ms de 2 , 0 0 0 aos antes de nuestra era (Aidoo y col., 1982). En general, el objetivo buscado, en las fermentaciones tradicionales era, ms que aumentar el valor nutritivo del alimento, mejorar sus caractersticas sensoriales, aadiendo algn sabor, color u olor agradable eliminando alguno desagradable, bien, aumentar 1 9 8 1 ) . En algunos casos sus posibilidades de conservacin (Raimbault, lo quese consigue es aumentar la digestibilidad de ciertos productos 1 9 8 7 ) . Existen muchos ejemplos de vegetales como la soya (Oriol, productos tradicionales fabricados por FsSy reportados en variadas revisiones (Aidoo, 1 9 8 2 ; Viniegra, 1 9 8 8 ; Pandey, 1 9 9 2 ) , entre los que se encuentran: Los quesos llmaduradosl' -vgr. Roquefort y Camembert, fermentados con esporas de Penicillium roqueforti y Penicillium camemberti, respectivamente- que implican procesos que datan tal vez de 1 , 0 0 0 aos A . C . (Pandey, 1 9 9 2 ) .

13

El tempeh, producido por la FsS de frijoles de pulpa Rhizopus oligosporus en Indonesia, Nueva Guinea y Surinam.

de coco con

El miso, producto de la fermentacin slida de arroz y soya con Aspergillus oryzae y Saccaromyces rouxii, elaborado en Japn China,

Taiwan y Filipinas.
ragi por la fermentacin fngica de En la India se produce el pozol, por la semillas leguminosas y en algunas reas de Mxico, el fermentacin de maz.

EL KOJI. APLICACIONES INDUSTRIALES.

El Koji es una etapa comn en la mayora de las fermentaciones Asidticas. Tiene la funcin de proveer inicialmente una fuente de enzimas que transforman los constituyentes vegetales en compuestos ms simplese implica, a su vez, varias etapas:

Aspergillus Oryzae A . soyae, aunque pueden usarse cepas de otros hongos delos gneros Aspergillus Rhizopus.

La propagacin

esporulacin del hongo, generalmente

- La produccin de un k o j i lliniciadorll por inoculacin de esporas y posterior dessarrollo del hongo sobre arroz cocido al vapor. - Fermentacin del substrato adecuado (arroz, maz, soya, etc., solos mexclados) inoculando con el k o j i lliniciadorll e incubando a 25-35OC durante aproximadamente3 das, a lo largo de los cuales debe controlarse estrictamente la humedad y la temperatura.
Lo anterior constituye normalmente una primera etapa que implica una segunda fermentacin (Raimbault, 1981), cuyo desarrollo depende de la aplicacin particular de que se trate.

Algunos de estos procesos tradicionales han dado lugar a aplicaciones industriales, principalmente en Japn, siendo el proceso k o j i , sin duda, aquel que mayor nmerode aplicaciones industriales ha encontrado. Este tipo de proceso ha sido desarrollado en ese pas de produccin a gran escala completamente automatizado hasta un nivel (Hesseltine, 1972).

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Entre las principales aplicaciones industriales encuentran:

de la FsS se

a).- Produccin de enzimas: Numerosas enzimas que encuentran amplia aplicacin en los campos de la tecnologia de alimentos, el diagnstico clinico, el anlisis clinico y otros, son producidas por FsS. Asi, durante aos se ha producido el complejo amilolitico llamado lltakadiastasagg por un proceso ideado por Takamine en 1916 koji (Oriol, 1987). La tabla siguiente expone algunas de basado en el FsS a nivel industrial junto con los las enzimas producidas por principales substratos y microorganismos involucrados en su elaboracin (Raimbault, 1981;0riol, 1987; Wasserman, 1990; Pandey, 1992).

SUBSTRATO MICROORGANISMO ENZIMA USADO Amilasas


Aspergillus oryzae A. niger, A. flavus A. oryzae, A. flavus, Bacillus subtilis Aspergill us sp. Penicillium sp. Trichoderma karungi Poliporus spp. Cndida lipoltica Geotrichum candidum Acetobacter peroxydans Aspergillus niveus

Fibra de trigo Bagazo de caa Fibradetrigo

Proteasas

Pectinasas

Cscara de citricos Cscara de manzana Bagazo caa, de papel. arroz, de Fibra de trigo de

Celulasas

Lipasas

Catalasas

Fibradetrigo

b) Produccin de metabolitos:Es ya generalizado el uso de la FsS para la produccin de cidos orgnicos de gran demanda industrial como son el cido citrico, de amplia aplicacin y que es en este 1987); el dcido glico, rubro, el principal producto fngico (Oriol, utilizado para la fabricacin de colorantes y los cidos glucnico y kjico, (Pandey, 1992; Shankaranand y col., 1992) por dar algunos ejemplos.
15

.-

Tambin se producen por FsS metabolitos secundarios, como antibiticos (Barrios y col., 1 9 9 2 ) y se han producido micotoxinas a los Estados Unidos desde hace algunos aos a nivel de laboratorio en fin de realizar estudios toxicolgicos de stas, principalmente aflatoxinas y de ocratoxinas (Hesseltine, 1 9 7 2 ; Oriol, 1 9 8 7 ) . c).- Enriauecimiento proteico de desechos aaroindustriales: Siendo evidentes los problemas de contaminacin, por un lado,y de escasez de alimentos por el otro, en muchos paises la bsqueda de fuentes alternasdeproteinahallevado a realizarestudiossobrela FsS sobredesechos optimizacindelcrecimientodehongospor agroindustriales,paralavalorizacindetalessubstratospor procedimientos que sean poco costosos, simples y rsticos (Roussos, 1 9 8 9 ; Pandey, 1 9 9 0 ; Jacob, 1 9 9 1 ) . Como se mencion anteriormente, en los paises del mundo los orientales, los occidental, a diferencia de lo que sucede en procesos fermentativos industriales se desarrollado han lo que sistemtiticamentedellado de lafermentacinsumergida, posiblemente haya representado un retraso en la obtencin eficiente 1 9 7 2 ) . No obstante, de ciertos productos de fermentacin (Hesseltine, FsS han provocado ya la canalizacin de las ventajas que presenta la esfuerzos hacia el desarrollo de procesos que permitan aprovechar tales ventajas en la generacin de productos cuya obtencin en fermentacin sumergida es menos eficiente, muy complicada imposible. As,se encuentra ya amplia literatura de estudios sobre la obtencin de productos tiles tales como esporas de hongos (Larroche y col., 1 9 8 8 ) enzimas (Raimbault, 1 9 8 8 ) , antibiticos (Barrios y col., 1 9 8 8 ) , saborizantes (Revah & Lebeault, 1 9 8 8 ) , etc. Desde hace vartios aos se desarrollan investigaciones para el aprovechamiento y valoracin de numerosos subproductos de la industria agro-alimentaria FsS (Raimbault y col, 1 9 8 5 ; Pealoza y col., utilizando la tcnica de 1 9 8 5 ; Grajek y Gervais, 1 9 8 7 ; Sols y col., 1 9 9 0 ; Pulgarin y col., 1 9 9 1 ) . Es posible vislumbrar la utilizacin de esta tcnica a nivel de gran escala en los campos de la alimentacin, la farmacia, la y otros (Viniegra, industria qumica, el control ecolgico de plagas
1988).

Seguramente, la tendencia a utilizar la fermentacin en medio slido como tcnica de produccin a nivel industrial aumentar& en un futuro prximo, pues las ventajas que presenta cobran cada vez mayor importancia en un mundo en el cual el aprovechamiento de los desechos los recursos ecolgicos agricolas e industriales y el uso racional de han alcanzado una relevancia fundamental, a un grado tal que ciertos aspectos -como puede ser, por ejemplo, el costo de tratamiento de aguas residuales- podrian en un momento dado llegar a ser claves en la sobrevivencia de una determinada industria.

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OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICO8 OBJETIVO GENERAL:

Produccin y purificacin de enzimas por medio de la tcnica de Fermentacin slida(FsS)

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

i)

Determinar

el

tiempo

ptimo

de

produccin

de

pectinasas

por

FsS.

ii) Identificacin de la( S ) fraccin(es) del extracto que presentan actividad pectinolitca iii) Purificacion de la(s) protena(s) con actividad pectinolltica a partir de las fracciones identificadas.
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Se encontr que el tiempo ptimo de fermentacin en el que se detecta un mximo de actividad en el sistema de FsS es de72 horas. Se logr la purificacin parcial del extracto crudo obtenido se lleg hasta la identificacion mediante fermentacin slida, ya que de dos fracciones con actividad pectinoltica. La purificacin de las fracciones se llev a cabo de manera parcial mediante la electroforesis en gel de acrilamida, la cual mostr que se requieren todavia mas pasos de purificacin, pues se encontr que cada fraccin contenia varias protenas. Se considera que, a gross0 modo, se cumpli con la parte del objetivo general correspondiente a la produccinde enzimas por medio de la tcnica de fermentacin slida, y en lo que respecta al objetivo especfico de purificacin y caracterizacin de una enzima pectinasa, fui? logrado en forma parcial obtenindose no solo una, sino dos complejos enzimticos parcialmente purificados.
METODOLOGIA UTILIZADA Cepa. La cepa C28B25, de Aspergillus n i g e r , utilizada en este trabajo, proviene de la coleccin de mohos UAM-ORSTOM, eleccionada (135 U g ' D P muy por por su mayor actividad pectinolitica en Ssf 35 U g ' l D P ) (Antier et a1.1993). encima del nivel de referencia de

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Obtencin del Inculo.

La esporulacin del microorganismo se llev a cabo en matraces Erlenmeyer de 2 5 0 m1 que contenian 5 0 m1 de medio PDA a 37OC. La recoleccin de las esporas se realiz a las 72 hrs. utilizando 5 0 m1 1 %, utilizando un agitador de una solucin estril de Tween-80 0 .al magntico para lograr su desprendimiento. El conteo de esporas se realiz con una cmara de Neubauer.
Medio
(%)

de

Cultivo.

Para SsFy con un inculo de 2 x lo7 esporas/g de bagazo Pectina

..................... Sacarosa....................
...................... Urea ........................ ......................
pH
= 4.5

1.5

3.14

(NH4)SO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.26 KH2P04


0.65
0.3

MgSO 4....................... 0.02 FeS04....................... 0.029

Agua..

70 ml.

Bagazo de caa de azcar....23.1

(%)

para SmF y con un inculo de 2 x lo5 esporas/ml.

........................ (NH4)2S04 ...................... KH2P04 .........................


Pectina Urea
MgS04

1.5

0.29
0.3

...........................

0.1

..........................
..........................

0.0066
0.0096 1.0
100

FeS04 Bagazo Agua

......................... ...........................
pH
=

m1 (aforo).

4.5
18

APARATOS UTILIZADOS Viscosmetro


de

Ostwald.

Para efectuar

los

experimentos de

viscosimetra.
FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography) Bio-Rad. Para efectuar

los experimentos de purificacin por intercambio aninico. Con sus Q, correspondientes precolumna de intercambio aninico Econo-pac Columna de intercambioaninicoBioq2(Bio-Scal Q ) y columna de 12 HR 10/30. Todo esto con su exclusin molecular Superose correspondiente colector de fracciones.
SPECTRA/POR MWCO:12-14,000. (molecularporous membrane). Para realizar CONCENTRATORS.

las dilisis.
MACROSEPT~
CENTRIFUGAL

Para efectuar las

concentraciones.
pH meter 320 CORNING.

W-VISIBLE RECORDING. Para SPECTROPHOTOMETER SHIMADZU. W - 1 6 0 . cuantificar las actividades enzimticas obtenidas con la tcnica de
DNS

Mighty Small I1 SE250/SE260. HOEFER. Dispositivo para realizar las

electroforesis. Vidrieraengeneral.(matraces,vasos ensaye, pipetas, etc.). de precipitados,tubosde

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO DE DNS para las pruebas exo)

de actividad enzimtica (endo

Pectina de

frutas ctricas.(SIGMA). para pruebas de viscosidad. de viscosidad.

Acido poligalacturnico.Para pruebas Acido galacturnico. Para

las curvas patrn DNS. de el buffer de acetatos


6.8,

Acido Actico y Sal de Acetato de Sodio para STAKING GEL.(acrylamide

3 0 % , bisacrylamide 0 . 8 % , Tris.Cl/SDS pH Persulfato de amonio, etc.).Para las electroforesis

Reactivo de Bradford. Para cuantificacin 0.15 M, Solucin azulde Coomassie)

de protenas.(BSA, NaCl

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RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Se realizaron fermentaciones slidas (SsF) y liquidas (SmF) al principio del trabajo con objeto de determinar cul resultaba ser la idnea para obtener una mayor produccin de pectinasas. Se decidi trabajar con la SsFya que las actividades obtenidas en esta tltima resultaron ser considerablemente ms altas que las de SmF, como se 1 , 2 y 3. puede apreciar al comparar las tablas La figura 1 muestra los resultados obtenidos por viscosimetria, mismos que fueron la base quese tom para decidir sobre el tiempo ptimo necesario para futuras fermentaciones. En esta figura se puede apreciar que los extractos que deben ser utilizados son los correspondientes a las 72 hrs. El monitoreo de la secuencia de la purificacin se realiza tomando como parmetro la actividad especifica del complejo enzimtico, que es el resultado de dividir la actividad enzimtica se procedi a entre la cantidad de protenas, y para tal efecto purificar el extracto enzimtico, realizndose los siguientes pasos: del Concentracin Filtron 10K. 3) Paso a travs 4) Paso a travs
2)

1) DiAlisis

extracto crudo. del dializado mediante un Concentrador Centrifugo de una columna Econopak de intercambio aninico. de una columna BioQ2 de intercambio aninico.

Se tenlan28 mL del extracto crudo dializado, de los cuales8.5 mL se concentraron despus de la segunda etapa; de ese concentrado, despus de pasar por la columna Econopak, se seleccionaron las fracciones32 a la 36 (Figura 2); estas fracciones se pasaron por la columna BioQ2, seleccionandose 2 conjuntos de fracciones: la 37-38 y la 40-42 (Figura 3), que presentaban actividad. Esquemticamente se muestran 6, dondesepuedecorroborarque, losresultadosenlaTabla efectivamente, se tuvo un incremento en la capacidad pectinoltica, traducido esto como una medida del grado de purificacin del extracto crudo, especialmente despus del paso por la ltima columna, de donde se obtuvieron dos picos de actividad, siendo el segundo de ellos (30.65 U/mg de (fraccin 40-42) el de mayor actividad especifica protena)

20

ACTIVIDADES REALIZADAS

Pruebas de viscosimetria para determinar el tiempo ptimo de producci6n de enzimas. Pruebas de DNS para corroborar anteriormente sealados
los resultados de viscosimetria

Pruebas de viscosimetra para dejar definido el concepto que se habria de utilizar como unidad y asi poder cuantificar las actividades enzimticas. Pruebas de DNS para corroborar la cuantificacin de actividades enzimticas de las mismas muestras en las que se hicieron pruebas por. viscosimetra
los reactivos necesarios(Bufers Preparacin de DN8, Soluciones necesarias para efectuar las Solucin de electroforesis(ge1, staining, etc.).

de acetatos,

Preparado y realizacin

de

las por

electroforesis. el Mtodo de Bradford.

Cuantificacin de protenas

RECOMENDACIONES

Las didlisis y concentraciones pueden suplirse on el uso del R O T O F O R ' CELL BIO-RAD. aparato de separacin de protenas denominado que aprovecha la diferencia en puntos isoelctricos que presentan las proteinas (incluidas las enzimas) y ahorrar tiempo. Otra de las recomendaciones que considero pertinentes, en caso de efectuar las dilisis, es la de tener mucho cuidado con el ya tiempo que si en el extracto existen celulasas, stas destruyen la membrana con la que se efecta y adems efectuarlas en frio y con agitacin lenta. No usar Tris-HC1 como buffer ya que elimina la actividad enzimtica.

21

DENSIDAD OPTICA (280 nm)


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TABLA 4: ACTIVIDAD,CONCENTRACION PROTEMICA Y ACTIVIDAD ESPECIFICA DE LA PECTINASA ANTES Y DESPUES DE PASAR LAS MUESTRAS POR LA PRECOLUMNA ECONOPACK DE INTERCAMBIO ANIONIC0

METODO DE SEPARACIONEN COLUMNA

CONDICION

ACTIVIDAD CONCENTRACION ACTIVIDAD ENZIMATICA PROTEINTCA ESPECIFICA or/ml> (mg/ml> P / m g de protena)


.... ... .. . ................................ ... .. ........................................................................................

.... ...... ............................................................................................

99

Extracto crudo dializado y concentrado antes de pasar a travds de laprecolumna Econopak de intercambio aninico (8.5 ml)

6.1

18.28

Fracciones (32-36) (5 ml) despuds de pasar por la precolumna econopak y antes de haber sido dializadas y concentradas y a s i poder pasarlas por la columna BioQ2.

6.97

0.775

8.99

TABLA 5: ACTIVIDAD ENZIMATICA,CONCENTRAClON PROTEINICA Y ACTIVIDAD ESPECIFICA ANTES Y DESPUES DE PASAR LA MUESTRA POR LA COLUMNA DE INTERCAMBIO ANIONIC0 BioQ2

METODO DE SEPARACION EN COLUMNA


CONDICION ACTIVIDAD CONCENTRACION ACTIVIDAD ESPECIFICA ENZIMATICA PROTEINICA. ( U w

(mglml)

(U/mgde protena)

Dihlisis Y Concentracin de las fracciones recolectadas despus de ser pasadas travs de a la precolumna econopak intercambio de aninico, despus de haber sido dializadas y concentradas para poder pasarlas a travs de la columna BioQ2.(5
ml).

6.97

0.775

8.99

precolumna

(Fracciones 32-36) de la Econopak. Recoleccin de las (37-38) fracciones obtenidas de la columna BioQ2 de intercambio aninico(2 ml) y que corresponden con el con pico primer actividad .enzimtica. J3G(3) Recoleccin de las fracciones (40-42) que se obtuvieron despus que la muestra se pas a travs de la columna BioQ2 de intercambio aninico volumen de (3 ml) y que corresponden con el segundo pico con actividad enzimtica. FIG (3)

3.83

0.125

30.65

5.81

0.275

2.13

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