Rev. chil. anat. v.19 n.3 Temuco dic.

2001
doi: 10.4067/S0716-98682001000300012

TRANSFORMACIN EPITELIO-MESENQUIMTICA DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO

EPITHELIAL-MESENCHYMAL DEVELOPMENT TRANSFORMATION DURING EMBRYONIC

Mara Anglica Montenegro & Mariana A. Rojas

Programa de Morfologa, Instituto de Ciencias Biomdicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile

RESUMEN: La transformacin entre un epitelio y un mesnquima es un proceso celular crtico que cumple una importante funcin en la morfognesis de diferentes rganos, como la desaparicin del epitelio palatino medio que permite la fusin del paladar; el epitelio del conducto de Mller que est destinado a desaparecer en el macho; la formacin del mesoderma durante la gastrulacin; el desarrollo de la cresta neural; la formacin de las vlvulas y tabiques que dividen el corazn embrionario, etc. Durante este proceso, las clulas epiteliales pierden sus uniones celulares, dejan de expresar citoqueratinas y empiezan a sintetizar vimentina. Adems, degradan la lmina basal y extienden filopodios a travs de ella hacia el mesnquima subyacente, adoptando una morfologa de fibroblasto. El control molecular de este proceso est asociado a factores de crecimiento, especialmente TGF-3 y a la protena zinc finger Slug. PALABRAS CLAVE: 1. Transformacin epitelio-mesenquimtica; 2. Fusin palatina; 3. Cresta neural; 4. Desarrollo del corazn; 5. Formacin del mesoderma. INTRODUCCIN La transformacin epitelio-mesenquimtica (TEM) es un proceso celular crtico que conduce la morfognesis en un nmero considerable de rganos y tejidos, como la formacin del mesoderma durante la gastrulacin; la separacin y migracin de la cresta neural; la involucin del conducto de Mller en el macho; la formacin de las vlvulas y septos cardacos; la fusin del paladar, entre otros (Trelstad et al., 1982; Shuler et al., 1991; Dubandet al., 1995; Hay, 1995; Markwald et al., 1995; Viebahn, 1995). Durante la morfognesis, se producen cambios dramticos de un estado de diferenciacin a otro; algunos epitelios se transforman en mesnquima junto con la habilidad de migrar para formar tejido conectivo, inducidos por la matriz extracelular o por factores de crecimiento. Esta conversin fenotpica involucra una reorganizacin del citoesqueleto y cambios, tanto en las interacciones clula-clula, como clula-matriz. Este proceso tambin ocurre en tejidos adultos en algunas condiciones patolgicas. Las clulas epiteliales son clulas polarizadas, que sintetizan y se apoyan en una lmina basal, estn relacionadas con sus vecinas por uniones especficas y contienen molculas de adhesin caractersticas, como caderina-E que se distribuye en las superficies laterales de los epitelios donde interactua con otras caderinas-E de clulas adyacentes (Cowin & Burke, 1996). El sindecn-1, proteoglicano de heparn-sulfato, es un receptor de la membrana celular que tiene una distribucin similar a la caderina-E (Bernfield et al., 1992). Una clula mesenquimtica tiene forma alargada con prolongaciones y sintetiza componentes de matriz extracelular (MEC). Estas clulas mesenquimticas interactuan con la MEC a travs de receptores distribuidos por toda la superficie celular y no forman uniones. Los epitelios son ricos en filamentos intermedios de citoqueratina (Rojas et al., 1998), en cambio, las clulas mesenquimticas tienen vimentina (Steiner & Roop, 1988). Durante la TEM, aparecen filopodios en la superficie basal de las clulas epiteliales, que se extienden hacia la MEC intersticial, luego la clula se elonga y se desprende del epitelio (Fig.

1). Las citoqueratinas desaparecen y se sintetiza vimentina. La caderina-E y las desmoplaquinas se pierden o se redistribuyen (Prieto & Crossin, 1995). Las uniones celulares se rompen, aparecen nuevos receptores de MEC y as la laminina y el colgeno IV de la lmina basal, son reemplazados por fibronectina y colgeno I. (Guarino, 1995). In vitro, varios epitelios se transforman en mesnquima cuando se suspenden en colgeno tipo I. Por otra parte, tambin in vitro, caderina-E induce a fibroblastos a formar desmo-sosmas y un epitelio estratificado (Vanderburg & Hay, 1995). En la TEM se producen los siguientes cambios fenotpicos: - En los filamentos intermedios: aparicin de vimentina y prdida de citoqueratinas - En la adhesin clula-clula: prdida de uniones celulares y cambios en las molculas de adhesin - En la matriz extracelular: prdida de la lmina basal y sntesis de matriz mesenquimtica - En la morfologa y funcin celulares: prdida de la cohesividad celular, cambios en la forma y polaridad celular y aumento de la motilidad

Fig. 1. Cambios morfolgicos que experimentan las clulas epiteliales en su transformacin hacia clulas mesenquimticas.

Transformacin epitelio-mesenquimtica en la fusin de los procesos palatinos. El proceso de palatognesis es una de las etapas del desarrollo embrionario en la que la TEM ha sido muy bien analizada (Fitchett & Hay, 1989; Shuler et al., 1991; 1992; Carette & Ferguson, 1992; Griffith & Hay, 1992;Shuler, 1995; Kaartinen et al., 1997; Sun et al., 1998a y 1998b). El desarrollo del paladar, evento complejo que frecuentemente se altera produciendo fisura palatina, constituye un buen modelo experimental para estudiar las interacciones tisulares que se producen durante la embriognesis. Esto se debe a que aparece relativamente tarde en el desarrollo y los procesos palatinos se pueden disecar fcilmente y cultivar in vitro bajo condiciones controladas, donde se fusionan normalmente, en ausencia de factores exgenos.

Este proceso consta de varias etapas, de acuerdo a la posicin de los procesos palatinos en la cavidad oral (Ferguson, 1988). Los procesos palatinos emergen desde las paredes mediales de los procesos maxilares y crecen verticales a ambos lados de la lengua. Posteriormente, rotan y se reorientan a una posicin horizontal sobre la lengua y se encuentran en la lnea media (Fig. 2). En esta etapa, el epitelio palatino medio consta de una capa basal de clulas cbicas y una capa superficial de clulas peridrmicas.

Fig. 2. Diagrama que muestra las sucesivas etapas de la fusin y confluencia de los procesos palatinos. A) Los procesos palatinos han rotado a una posicin horizontal y las clulas peridrmicas se estn decamando*. B) Formacin de la lmina epitelial media. C) Ruptura de la lmina epitelial y formacin de islotes (flechas). D) Confluencia del tejido mesenquimtico.
En las horas siguientes, los epitelios medios contactan, adhieren y forman una lmina epitelial media. Algunas clulas del periderma de la zona media degeneran, experimentando muerte celular programada y son eliminadas antes de la adhesin. A medida que la cabeza crece, principalmente en altura, la lmina epitelial media se adelgaza a una capa de clulas, se rompe en pequeos islotes y luego desaparece, permitiendo la continuidad del tejido mesenquimtico de ambos procesos. Experimentos de separacin y recombinacin de capas celulares in vitro, han demostrado que el epitelio palatino medio juega un rol pasivo en este proceso, recibiendo las instrucciones desde el mesnquima subyacente (Pourtois, 1972). La seal de esta interaccin es compleja e involucra tanto a molculas de la MEC como factores de crecimiento. La fusin completa del paladar secundario de los mamferos, requiere la desaparicin del epitelio palatino de la lnea media del paladar, con el objeto de permitir la confluencia mesenquimtica. Actualmente existen evidencias que la desaparicin del epitelio palatino embrionario se debe a tres mecanismos: 1. Muerte celular programada o apoptosis de algunas clulas superficiales. 2. Transformacin de clulas epiteliales, principalmente basales, en clulas mesenquimticas. 3. Migracin de algunas clulas epiteliales al epitelio oral o nasal superficial. Los mecanismos moleculares involucrados en estos procesos, son diferentes, y por lo tanto, pueden ser dife-rencialmente afectados por los teratgenos que producen fisura palatina. La muerte celular programada fue propuesta hace muchos aos debido a la presencia de lisosomas y a la sntesis de enzimas lticas en el epitelio palatino medio (Pratt & Martin, 1975). Este epitelio representa un grupo definido de clulas que desaparecen en una etapa precisa del desarrollo, lo que es una caracterstica de apoptosis. Sin embargo, con tcnicas especficas para detectar degradacin del ADN, otra caracterstica de apoptosis, esto slo se detecta en algunas clulas palatinas (Gavrieli et al., 1992; Mori et al., 1994; Taniguchi et al., 1995; Martinez-Alvarez et al., 2000). Utilizando mtodos diferentes, Fitchett & Hay y Shuler et al. (1991), postularon que no todas las clulas experimentan apoptosis, sino que se transforman en clulas mesen-quimticas. Esta TEM se observ con microscopa electrnica (Fitchett & Hay; Griffith & Hay) y fue confirmada por estudios de lineajes celulares tanto in vivo como in vitro (Shuler et al.; Hay; Shuler). En 1992, Carette & Ferguson presentaron evidencias que otras clulas del epitelio palatino tambin persisten viables pero con un

fenotipo epitelial y migran hacia el epitelio oral o nasal vecino, integrndose a ellos como clulas epiteliales. La TEM en el paladar embrionario se analiz con el colorante vital DIL, combinado con estudios inmuno-histoqumicos y ultraestructurales. La naturaleza lipoflica de este colorante, conduce su incorporacin en la membrana plasmtica de las clulas, pero slo de aquellas que estn en contacto con la solucin y no es transferida a otras clulas (Serbedzija et al., 1989). Tanto in vivo como in vitro, se identificaron clulas marcadas que quedan en la lmina epitelial media y luego adoptan un fenotipo mesenquimtico (Carette & Ferguson; Shuleret al.; Montenegro et al., 2000). La lmina epitelial teida con el colorante, presenta inmunotincin positiva con keratina y con laminina, pero no con vimentina (Fig. 3). La vimentina tie slo las clulas mesenquimticas. Caderina-E y sindecn-1 se expresan simultneamente, durante la formacin y ruptura de la lmina epitelial, pero en el rea donde el epitelio se ha transformado en clulas mesenquimticas, no se observa tincin para ninguno de los dos anticuerpos (Sun et al.,1998b; Montenegro et al., 2000).

Fig. 3. Deteccin inmunohistoqumica de citoqueratinas AE1 en el epitelio palatino medio durante la fusin de los procesos palatinos. a y b) Inmunotincin positiva en el epitelio medio y en el epitelio que se fusionar con el tabique nasal (flechas). A: 40 X, B. 100 X. c). Inmunotincin positiva slo en los islotes epiteliales. 100 X.
El examen ultraestructural permite observar pequeas discontinuidades en la lmina basal y las clulas epiteliales extienden filopodios a travs de ellas, pierden sus uniones celulares y adoptan la morfologa de fibroblasto. Al mismo tiempo, se acumula tenacina y colgeno tipo

III bajo la lmina basal, perpendicular a ella, y las clulas epiteliales parecen migrar hacia el mesnquima subyacente a lo largo de estas fibrillas. El control molecular de la TEM en la fusin palatina, est asociado a la expresin de factores de crecimiento, especialmente TGF-3, a colgeno y a tenacina, mientras que la muerte celular programada depende de prostaglandinas y AMPc (Ferguson, 1994; Montenegro & Palomino, 1989; 1990). El TGF-3 muestra un patrn de expresin muy especfico y restringido al epitelio palatino medio. Esta expresin se correlaciona temporalmente con la iniciacin de la fusin del paladar y con la desaparicin del epitelio palatino medio (Kaartinen et al.). La inhibicin de la actividad del TGF-3 con anticuerpos neutralizantes o con antisense oligonucletidos, previene la fusin palatina, mientras que la inhibicin de las otras isoformas del TGF- no tienen efecto en la fusin (Brunet et al., 1995; Proetzel et al., 1995). Adems, ratones transgnicos, en los cuales se previene la expresin del TGF-1, tienen desarrollo facial normal; en cambio, en los transgnicos en los cuales se bloquea la expresin del TGF-3, presentan fisura palatina (Taya et el., 1999). Por otra parte, in vitro el TGF-3 promueve transformacin del epitelio palatino medio a mesnquima. La alteracin de este proceso de fusin, contribuye a la fisura palatina, uno de los defectos congnitos ms comunes en la especie humana (Gorlin et al., 1990). Los gluco-corticoides inducen fisura palatina en ratones. Diferentes cepas de ratones tienen diferente susceptibilidad a la induccin de esta anomala, cuando se administra una dosis standard de glucocorticoides, lo mismo que por un estmulo de stress, durante el perodo crtico de la organognesis del paladar. (Fraser et al., 1957; Goldman, 1984; Montenegro et al., 1995). Los glucocorticoides inhiben la sntesis de algunas molculas de la MEC y reducen la expresin de TGF-3 en el paladar embrionario de una manera dosis-dependiente, en cambio, tienen poco efecto sobre los TGF-1 y TGF-2 (Potchinsky et al., 1996; Montenegro et al., 1998). Transformacin epitelio-mesenquimtica en el corazn embrionario. Los esbozos de las vlvulas del corazn y los septos cardacos se forman por TEM de las clulas endoteliales del endocardio en el canal aurculo-ventricular (Markwald et al.). Las almohadillas endocrdicas tempranas estn formadas por una MEC cubierta por endotelio. Estas almohadillas se fusionan en el centro del tubo cardaco y dividen el flujo sanguneo en los futuros orificios mitral y tricspide. Entre las dos capas epiteliales (endocardio y miocardio), se acumula la gelatina cardaca, una capa de MEC secretada por el endocardio (Fig. 4). Luego el endotelio de las almohadillas que reviste el lumen, es activado por un estmulo proveniente del miocardio adyacente y las clulas endote liales migran a la MEC subyacente. Las clulas del endocardio emiten filopodios y migran igual que en el paladar. En la formacin del tabique artico-pulmonar, durante la divisin del tronco arterioso con clulas derivadas de la cresta neural, tambin se produce un cambio de clulas epiteliales a mesenquimticas.

Fig. 4. Corte sagital de embrin de pollo teido con H-E-azul de Alcin. a) Se observa el corazn embrionario (C), los arcos farngeos (a), la copa ptica (O), la vescula auditiva (A), la placoda nasal (N). 40 X.

b) Imagen a mayor aumento que muestra el endocardio (E), la gelatina cardaca (G), el miocardio (M) y las clulas del endocardio que se estn transformando en clulas mesenquimticas a nivel de las almohadillas endocrdicas (flechas). 200 X

Las clulas endoteliales activadas experimentan cambios morfolgicos, para llegar a ser clulas mesenquimticas rodeadas de MEC. El signo inicial viene del miocardio y en ste est involucrado tambin el TGF-3 (Potts & Runyan, 1989). En las zonas donde va a ocurrir la TEM, el miocardio secreta un complejo llamado adheron que regula la produccin de TGF3 que es expresado en el endotelio y es necesario para la transformacin (Boyer et al.,1999). En las almohadillas endocrdicas, los niveles de TGF-3 mRNA se correlacionan con la induccin de TEM en ellas. Adems, los anticuerpos anti TGF-3 y los antisense oligonucleotidos contra TGF-3, inhiben la TEM, en el endotelio del canal aurculo-ventricular (Potts et al., 1991). Pero en el corazn, la TEM est mediada por otras molculas adems del TGF-3. Slug, una proteina zinc finger, es mediador de este proceso en el corazn embrionario de pollo, ya que causa disociacin de los desmosomas, que es el paso inicial de la TEM (Savagner et al., 1997; Romano & Runyan, 1999). Transformacin epitelio-mesenquimtica en la cresta neural. En la cresta neural y en la gastrulacin, la transformacin epitelio-mesenquimtica est ntimamente asociada con el inicio de la migracin celular. En aves y mamferos, la emergencia de la cresta neural craneal no ocurre en estricta sintona con el cierre progresivo del tubo neural, a lo largo del eje rostro-caudal, como sucede en urodelos. En aves, se produce antes de la separacin del ectoderma epidrmico del resto del tubo, cuando los pliegues se estn fusionando (Figs. 5 y6). En mamferos, la dispersin de la cresta neural ceflica se produce mucho antes que los pliegues neurales se pongan en

contacto (Bronner-Fraser & Baker, 1997). Las clulas de la cresta neural, se separan del epitelio neural como una oleada que empieza en la cabeza, a nivel del cerebro medio, y se extiende rostralmente al cerebro anterior y caudalmente al cerebro posterior y luego, progresivamente al tronco.

Fig. 5. Emergencia de las clulas de la cresta neural ceflica. embrin de pollo. B. En embrin de ratn.

A. En

Fig. 6. Corte transversal de embrin de pollo que muestra la emergencia de la cresta neural ceflica (flechas). Se observa el rombencfalo (R), la faringe (F). H.E.-azul de Alcin. 100 X.
En la cresta neural, los eventos son similares a los que ocurren en la TEM del paladar y del corazn (Duband et al.): cambios en la forma celular, cambios en las interacciones clulaclula (en las clulas de la cresta neural aparecen grandes espacios intercelulares junto con la prdida de la expresin de caderina-N) y cambios en la MEC (la lmina basal del epitelio neural se interrumpe y desaparece en la parte dorsal, al mismo tiempo que la cresta neural migra y se repone una lmina basal continua, una vez que ha migrado). El factor de transcripcin Slug, protena zinc finger que pertenece a la familia Snail, se expresa en la regin dorsal del tubo neural en el momento en que se inicia la migracin de la cresta neural. Snail es fuerte represor de la expresin de caderina-E. Dorsalina, gen que codifica para un miembro de la familia TGF-, se expresa especficamente en la regin dorsal del tubo neural, en el momento en que se inicia la migracin de la cresta neural. TGF- provoca migracin prematura de las crestas neurales, en aves.

Transformacin epitelio-mesenquimtica en la formacin del mesoderma. Las clulas del mesoderma se originan del epiblasto epitelial y, desde aqu, se distribuyen entre epiblasto e hipoblasto. Las clulas mesodrmicas experimentan cambios fundamentales en la forma y organizacin celulares, pasando desde una clula epitelial polarizada a una clula mesenquimtica no polarizada. Este proceso est restringido a una estrecha zona del epiblasto que corresponde a la lnea primitiva (Fig.7 y 8).

Fig. 7. Corte transversal de embrin de pollo que muestra la migracin de las clulas del epiblasto a travs de la lnea primitiva. Las flechas indican el surco primitivo. HE-azul de Alcin. 200 X.

Fig. 8. Inmunotincin de citoqueratinas 8-18 en las clulas del polo posterior del epiblasto de embrin de conejo de 18 das.

El epitelio epiblstico, antes de la formacin del mesoderma, vara en las distintas especies de mamferos desde cbico simple, en conejo, gato, perro y caballo, a cilndrico pseudoestratificado, en ratn, cerdo, mono y especie humana. Estas clulas epiblsticas estn apoyadas en una lmina basal y presentan uniones intercelulares del tipo gap, desmosomas, y uniones adherentes y ocluyentes (Burdsal et al., 1993). En la TEM que ocurre durante la gastrulacin, las clulas del epiblasto que ingresan por la lnea primitiva, pierden las caderinas E y N, emiten proyecciones filiformes, degradan la lmina basal y protruyen a travs de ella (Viebahn). Transformacin masculino. epitelio-mesenquimtica en el conducto de Mller del feto

Allard et al. (2000), demostraron que la apoptosis es un proceso decisivo pero no suficiente en la regresin del conducto de Mller en el embrin masculino y que la TEM es tambin un evento importante en este proceso. Las clulas epiteliales del conducto de Mller destinadas a desaparecer en el macho, no contienen ms lisosomas que sus contrapartes vivas en el embrin femenino. En vez de experimentar muerte celular programada, muchas de estas clulas se elongan y envan filopodios al tejido conectivo adyacente, de manera similar a lo que ocurre en el corazn embrionario y en los procesos palatinos (Trelstad et al. y Allard et al., 2000) (Figs. 9 y 10).

Fig. 9. Esquema que muestra la transformacin epitelio mesenquimtica (A) y la apoptosis (B) en las clulas del conducto de Mller en el macho.

Fig. 10. Corte transversal de Octodn degu que muestra el conducto de Wolff (puntas de flecha) y el conducto de Mller en regresin (flechas).

SUMMARY: The transformation between epithelia and mesenchyme is a critical cellular process that plays an important role in the morphogenesis of a number of different tissues: the disappearance of the midline palatal epithelial seam leading to confluence of the palate; the cells of the mllerian epithelium destined to disappear in the male; the formation of the

mesoderm during gastrulation; the development of the neural crest; the formation of the atrioventricular cushion and the aortic-pulmonary septum in the embryonic heart, etc. During this process the switch from cytokeratin expression (normally present in epithelia) to vimentin (normally present in mesenchyme) occur. The basal lamina disappears and elongating epithelial cells extend filopodia into the adyacent mesenchyme. The cells loss epithelial cell junctions, and adopt a fibroblastic morphology. In most of these tissues, the molecular control of the epithelial-mesenchymal transformation is associated to the expression of growth factors, mainly TGF-3 and to the zinc finger protein Slug. KEY WORDS: 1. Epithelial-mesenchymal transformation; 2. Palatal fusion; 3. Neural crest; 4. Embryonic hear; 5. Formation of the mesoderm.
Direccin Prof. Programa Instituto Facultad Universidad Independencia Casilla Santiago CHILE para Mara de de de correspondencia: Montenegro Morfologa, Biomdicas, Medicina, Chile 1027 70079, 7

Dra. de

Anglica Ciencias

Fax E mail: mmontene@machi.med.uchile.cl Recibido Aceptado: 20-09-2001 :

56-2-6786264

28-07-2001

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