Fluorforo

Um fluorforo ou fluorocromo, por analogia com os cromforos, um componente de uma molcula que faz com que esta seja fluorescente. um grupo funcional da molcula que absorver energia de um comprimento de onda especfica e posteriormente a emitir em outro determinado comprimento de onda maior (ou seja, com menor energia). A quantidade de energia emitida e seu comprimento de onda dependem tanto do prprio fluorocromo como do ambiente qumico no qual est (como o pH, por exemplo).

http://epidemiologiamolecular.com/01/02/2011/inmunofluorescencia/#_Toc255664696 5. FLUORESCNCIA
o resultado de um processo de trs passos que ocorre em algumas molculas (fluorforos)

1 : Excitao : entregou um fton de energia por uma fonte externa a um fluorforo que absorve , a passagem para um estado eletrnicoexcitado S1 ' 2 : Durao do estado animado : h um perodo de tempo finito (tipicamente 1-10 x 10-9 segundos), sofre alteraes conformacionais e pode interagir com seu ambiente molecular. Consequncias: A energia de S1 ' parcialmente dissipada produzindo um estado animado relaxado a partir do qual a fluorescncia emitida , no todas as molculas inicialmente estado excitado 1 de volta para o estado S0 fluorescncia , h outros processos. 3 : emisso de fluorescncia : um foto emitido , o que permite o retorno para o nvel fluorforo S0 . Devido a dissipao de energia durante o estado animado, a energia do foto menos . A diferena de energia a chamada "deslocamento de Stokes" (h EX -? h MS) que crtico para a sensibilidade de tcnicas de fluorescncia, uma vez que a emisso do fluorforo pode ser distinguido do fundo .

5,1. Espectro de fluorescncia

- O fluorforo mesmo pode ser repetidamente excitado e detectado. Para molculas poliatmicas em soluo transies electrnicas so substitudos por um espectro de energia chamado espectro de excitao de fluorescncia e de emisso. A largura de banda do espectro um parmetro importante quando dois fluorforos so detectados simultaneamente.

- O espectro de emisso de fluorescncia independente do comprimento de onda da qual excitado. Intensidade de emisso proporcional amplitude do espectro de excitao do comprimento de onda de excitao. - Para uma intensidade de fluorescncia necessrio satisfatrio para ser utilizado como radiao de excitao de comprimento de onda correspondente mximos de absoro do fluorforo. - O espectro de absoro e de fluorescncia de um fluorforo, em geral, est perto (l mais curto, respectivamente). Isto importante na escolha de filtros. - A intensidade do sinal depende dos mesmos parmetros como a absorvncia, mas tambm a partir da fonte de excitao (tipicamente um laser de ies de rgon, comprimento 488 nm) eo rendimento de recolha do detector.

- As amostras marcadas por fluorescncia biolgicos tipicamente contm mais do que uma espcie fluorescente, fazendo com que o isolamento do sinal complexo. Outros sinais pticos (tais como S2) pode corresponder ao fundo ou uma segunda sonda fluorescente. - Deteco de autofluorescncia pode ser minimizada pela seleco de filtros adequados para reduzir a transmisso de E2 em relao a E1.

- Extino de fluorescncia: o fluorforo em amostras biolgicas, em soluo e podem interagir com outras molculas. Como resultado desta interaco pode produzir uma perda de emisso de fluorescncia. um no-radiativa processo desexcitatcin causada por uma molcula estranha para o fluorforo (no fluorescente composto), que chamado quencher. O processo chamado de "extino" da fluorescncia

5,2. Eleio do fluorocromo

- A escolha de um fluorocromo depender de um certo nmero de factores. Se voc precisar de uma nica cor de escolha a FITC fluorocromo. O FITC barato, tem um elevado rendimento quntico e relativamente hidrfilo. A perda rpida de fluorescncia sob uma luz ultravioleta intensa pode ser resolvido atravs da adio para a preparao de fenileno diamina ou n-propil-galato, no entanto estes reagentes so txicos para as clulas

vivas.Derivado Triazinic de fluorescena, a fluorescena diclorometano triazinilamino (DTAF) tem propriedades pticas muito semelhantes a FITC, mas muito mais estvel. - O mais popular o isotiocianato de rodamina segundo fluorocromo tetrametil (TRITC), que isotiocianato de rodamina muito mais fluorescente. A fluorescncia vermelha intensa de TRITC facilmente distinguvel do FITC verde. Devido a isso charters multi-ano os dois fluorocromos de escolha para combinadas experimentos de fluorescncia. A perda de fluorescncia de TRITC muito menor do que o FITC.

5,3. MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA

- Luz de uma fonte de movimentos de comprimento de onda mltiplos atravs de um filtro de excitao que permite apenas a radiao animado passar o comprimento de onda desejado. Esta radiao reflectida pelo filtro dicrico e focada pela lente objectiva sobre a amostra, as molculas fluorescentes na amostra so excitados e emitem luz (fluorescncia) de um comprimento de onda especfico e maior. Esta luz focada pela lente eo grosso passa atravs do filtro dicrico e no reflectida. Um filtro de barreira final bloqueia qualquer luz residual com a frequncia da radiao de excitao.

- Fonte de luz: coincidente com o espectro de absoro do fluorocromo. Que atinge o olho (a retina danos UV) ou luz monocromtica. - Filtros: Exciter: Limpar a l bloco curto mais. Barreira: Transparente e longo bloqueio l curto. colocado entre o objeto eo observador.

5.3.1. BASE.
Corantes fluorescentes combinar com anticorpos, em seguida, expondo deste conjugado a anticorpos ou antignios em seces de tecido de esfregao correspondente de microorganismos, clulas ou cultura de tecidos em camada nica. Quando a reaco positiva e exposta luz ultravioleta ir produzir fluorescncia observvel sob o microscpio de imunofluorescncia. Realizando um acoplamento a um anticorpo de um fluorforo ou um enzima que catalisa uma reaco que fluoresce

5.3.2. MARCAO PRINCPIOS GERAIS DE ANTICORPOS substncia fluorescente

A) Os conjugados Compostos fluorescentes Antibodies + = conjugados Um conjugado de bom deve ter: - Forte fluorescncia - Reao com antgenos especficos Depende: - Qualidade e concentrao no soro Abs - Propriedades da substncia fluorescente - As modificaes que ambas podem sofrer no acoplamento Tambm influenciado por: - Dial Intensidade - Homogeneidade da marcao - Presena de outras molculas rotulado conjugar B) Anticorpos - Para obter mais especificidade utilizando antgenos puros para imunizar - Absorver o anti-soro para eliminar Abs indesejveis ou natural - Purifica-se a fraco de Ig para marcar - Verificar os ttulos de anticorpos - H um estreito paralelo entre ttulo e precipitante fluorescente - Qualificao dos reagentes: 1 e Ac conjugados deve ser titulada. C) fluorocromos A no acoplado com fluorocromo dialisada ou separados por filtrao em gel. Filtros disponibilidade

D) Dial Intensidade - Fluorocromo pode ser conjugado com um nmero varivel para cada molcula de protena, resultando em diferentes graus de marcao. - Aumento da intensidade de rotulagem, o mais forte - Acelerar tambm: - Diminuio do PI das protenas - As alteraes nas propriedades imunolgicas de anticorpos (6 ou 7 molculas de fluorescena / molcula de Ac o mximo) - Tmpera de fluorescncia (emisso de degradao de desempenho) E) de discagem Homogeneidade - Altamente marcado: no-especfica de fluorescncia - Moderadamente marcado: resultados mais satisfatrios - Insuficientemente marcada: fluorescncia muito intenso

5.3.3. TIPO INMUNOFULERESCENCIA

5.3.4. Influncia do tipo de anticorpo.

Ab policlonal Fora do sinal Especificidade Excelente Bom, mas por vezes o fundo elevada Sinal forte No renovvel Ab monoclonal Regular a bom Excelente, mas com possvel reao cruzada Especfico De sinal baixo Piscina Ab monoclonal Excelente Excelente

Vantagem Desvantagens

Sinal forte Especfico

Fundo Titular necessria

Disponibilidade

5,4. CELULAR EM REAES fase solvel.

Qualitativa uma tcnica utilizada para detectar a presena de Ab especfico no soro. Nesta tcnica, o visor do IC no directa, mas realizada por interveno de substncias fluorescentes ligadas a um anti-Ab ou AB, que recebe o nome genrico de conjugado fluorescente. Os relatrios so utilizados ou partculas de Ag (cortes de tecidos, bactrias, parasitas ou parasitas cortes, etc.)

5.4.1. Imunofluorescncia direta (IFD).

Adicionar a soluo de Ac fluorescente em Ag, previamente fixado sobre uma lmina ou placa, incubadas, lavou-se e ler os resultados.

5.4.2. Imunofluorescncia indireta (IFI).

O teste de soros (com o Ac pesquisados) aplicado sobre a Ag fixo, lavou-se e em seguida adicionou fluorescena anti-Ab contra a regio Fc da primeira, lavadas e ler os resultados.

Rotineiramente usado para detectar auto-Ab no sangue de pacientes com doenas autoimunes.

5.4.3. COLORAO INDIRETOS AMPLIFICADO pelo complemento.

Ac utilizado para detectar fixador do complemento. No segundo passo, aps a adio da AC, complemento fresco adicionado, o qual est situado em torno onde eles tm definir o Ac. Por causa dos passos de amplificao da via clssica do complemento, uma molcula de Ac pode definir muitas molculas de C3b a Ag, que so revelados com fluorescena C3b anti Ac. Esta tcnica muito mais sensvel.

Em todos os trs casos, o IC formado se manifestam pela observao do transportador em um microscpio com luz ultravioleta (Ac so fluorescncia verde). O padro de fluorescncia caracterstico de cada Ag

http://www.ifsc.usp.br/~donoso/espectroscopia/Luminescencia.pdf

Antigamente se distinguiam os fenmenos de fluorescncia e de fosforescncia pela vida media da emisso: at 10 ns era fluorescncia. Hoje elas se distinguem pelos estados de spin dos nveis envolvidos. Se durante o processo de emisso no ocorre mudana de multiplicide de spin, a emisso fluorescente. Se h inverso de spin (ex: triplete singlete) a emisso fosforescente. Na fluorescncia, a radiao emitida cessa imediatamente depois da excitao desaparecer. Na fosforescncia, a emisso espontnea persiste durante intervalos de tempo longos (de seg. at horas). Isto sugere que a fluorescncia uma converso da radiao absorvida em energia reemitida e que a fosforescncia envolve o armazenamento de energia Atkins & de Paula: Fsico Qumica e uma emisso lenta Fosforescncia A molcula pode efetuar um cruzamento intersistema, uma transio no radioativa entre estados de diferentes multiplicidade. As transies entre estados singleto e tripleto podem ocorrer na presena de acoplamento spin orbita. O mecanismo de cruzamento intersistema ser importante quando a molcula tiver tomos pesados, pois o acoplamento spin orbita ser grande. Este acoplamento quebra a regra de seleo e

a molcula pode, ento, emitir fracamente. Este processo explica a observao de a energia de excitao parece estar confinada em um reservatrio que vaza lentamente.