EL ABC DE LA BIOTECNOLOGA

Fuente: 1997 Biotech Report, Context Consulting, Timber Mill Research, Inc. Traduccin y Adaptacin: Depto. de Investigacin, Criadero Morgan de Mycoyen S.A., Guillermo Pozzi.

Conocimientos Bsicos: La Clula

1. Todo ser viviente est conformado de clulas.

2. Las plantas mayores y animales tienen ncleo dentro de sus clulas; los organismos menores, como las bacterias, no lo tienen. 3. Cada clula contiene la informacin
Clula Eucaritica

gentica para todo el organismo. 4. Toda vez que una clula se divide, crea una nueva copia de su informacin gentica.

Clula Procaritica

1. Cada clula de una planta tiene cromosomas apareados, dentro de su ncleo. 2. La informacin de todos los caracteres de una planta est contenida en sus cromosomas. 3. Durante la fertilizacin, cada parental contribuye con un set de cromosomas. 4. Cada clula tiene el set completo de la informacin gentica de la planta: su genoma.

Conocimientos Bsicos: La herencia de los caracteres

Conocimientos Bsicos: Los genes

1. La informacin gentica en los cromosomas consiste en cadenas extremadamente largas de ADN. 2. Los genes son segmentos discretos de ADN, codificando para informacin especfica.

3. La expresin de un gen es controlada por secciones vecinas del ADN.

4. En las clulas de cada tejido (raz, hoja, semillas),solo ciertos genes estan prendidos, o sea que su funcin se expresa.

Conocimientos Bsicos: El ADN

1. El ADN existe como doble cadena helicoidal. 2. El ADN esta escrito con slo cuatro bases. 3. Cada base siempre se complementa con su contraparte, en la otra cadena. A: Adenina T: Timina G: Guanina C: Citosina 4. Cuando el ADN se copia, cada cadena es el molde para la creacin de su cadena complementaria.
Nuevas Cadenas

Cadena Original

Cadena Original

Conocimientos Bsicos: La Protena

Los aminocidos: Glicina Alanina Valina Isoleucina Leucina Serina Treonina Prolina Acido Asprtico Acido Glutmico Lisina Arginina Asparginina Glutamina Cisteina Metionina Triptofano Fenil Alanina Tirosina Histidina

1. Hay 20 diferentes aminocidos que conforman la mayora de las protenas. 2. Las protenas son cadenas de cientos de aminocidos unidos por pptidos, en diferentes secuencias. Gly Ile Val Glu

Ins. Bovina (parcial)

3. Las protenas se organizan en complejas formas tridimensionales, que determinan sus propiedades y funciones. 4. Diferentes protenas tienen diversas funciones: enzimas, elementos estructurales, toxinas, almacenaje...

El ADN sirve como molde para la sntesis del ARN

1. Una de las bases del ARN es diferente.
A (ADN) se complementa con U (ARN) T (ADN) se complementa con A (ARN) G (ADN) se complementa con C (ARN) C (ADN) se complementa con G (ARN)

2. Una secuencia del ADN, llamada promotor, le ordena a la clula comenzar a construr ARN mensajero, a partir del gen que le sigue.

ARNm

ADN

Promotor

Gen

3. Luego, cabeza y cola, se agregan al ARNm antes de dejar el ncleo.

Cabeza (Cap.)

ARNm

Cola (Poly-A)

4. El ARNm terminado puede ahora servir de molde para la correspondiente protena.

El cdigo gentico: Traduccin de ARN en protena

1. Cada tres bases en el ARN, forman un codn correspondiente a ciertos aminocidos.

C A U
Isoleucina

U G G
Triptofano

C A U
Histidina

C G G
Glisina

2. La mayora de los aminocidos pueden ser codificados por ms de un codn.

Aac. Codones Cisteina UGU, UGC Prolina CCU, CCC, CCA, CCG Histidina CAU, CAC Stop= UAA, UAG, UGA

3. Tambin hay codones, que ordenan a la maquinaria de la clula, detener la sntesis de la cadena proteica. 4. Todo este proceso es llevado a cabo por estructuras complejas, llamados ribosomas, junto con enzimas y molculas especiales de ARN.

1. Los ribosomas se mueven a lo largo del ARNm y van adosando los aminocidos correspondientes a cada codn.

Construccin de una Protena: Traduccin del ARNm

2. Los aminocidos se unen entre s por ligaduras de pptidos. 3. La cadena proteica toma una forma tridimensional, basada en la secuencia particular de aminocidos. 4. Esta forma particular, es la que le confiere propiedades y funciones nicas.

Resumen: Pasos desde ADN a Protena

1. Un gen es parte del ADN, en un cromosoma. 2. El cdigo gentico es transcripto en el ARN mensajero.

3. El ARNm forma una cabeza y una cola para dejar el ncleo.

4. El cdigo en el ARNm es traducido, construyendo las largas cadenas de aminocidos que forman una protena.

5. La protena se organiza en su forma funcional.

Los pasos de la Ingeniera Gentica

1. Identificar un caracter deseable, pero que no pueda ser manejado por los mtodos clsicos de mejoramiento. 2. Encontrar algn organismo que lo exprese. 3. Encontrar el gen responsable del carcter deseado, en dicho organismo. 4. Combinar dicho gen con otros elementos necesarios para que este sea funcional en la planta. 5. Mover los genes a las clulas de la planta. 6. Encontrar las clulas modificadas exitosamente, y regenerarlas en plantas completamente funcionales.

Posibilidades de la Biotecnologa (ejemplos)

Caracteres de Proteccin: . Resistencia a Insectos . Tolerancia a Herbicidas . Resistencia a Hongos . Resistencia a Virus . Resistencia a Bacterias . Resistencia a Nematodes Caracteres de Calidad: . Demora de la maduracin . Aceites modificados . Protenas modificadas . Alto contenido de slidos . Produccin vegetal de anticuerpos, enzimas, etc.

Bsqueda de fuentes para genes deseados (ejemplos)

1. La bacteria de suelo, Bacillus thuringiensis (Bt), tiene genes para diversas protenas, selectivamente txicas para ciertos insectos. 2. El actinomycete de suelo, Streptomyces tiene un gen para una enzima que desdobla la molcula del Glufosinato de Amonio (herbicida). 3. Una lnea mutante de Arabidopsis thaliana, tiene un gen para una versin de la enzima EPSPS, menos sensible al Glifosato.

Bacillus thuringiensis (Bt)

Streptomyces

1. Las enzimas de restriccin cortan ADN, slo en ciertas secuencias especficas.

Herramientas Bsicas: Enzimas para cortar y pegar

Sitio de corte para EcoR1

2. Muchas dejan extremos pegajosos, de manera que otras piezas cortadas con la misma enzima, se ligan automticamente. 3. El extremo pegajoso de una pieza puede hibridar con el de otra pieza, cortada por la misma enzima.

4. Otras enzimas llamadas ligasas, terminan las uniones.

Herramientas Bsicas: Clonado

1. Adems de su principal cromosoma, muchas bacterias tienen tambin
ADN extrao

pequeas piezas circulares de ADN, llamadas plsmidos. Estos tienen a menudo, genes de resistencia a antibiticos. 2. Los plsmidos son fciles de manejar en tubos de ensayo, para cortar y pegar nuevas piezas de ADN.

Cromosomas Plsmido

3. Los plsmidos modificados, pueden ser colocados de nuevo en la bacteria, y sern copiados en cada duplicacin celular.
Bacteria

4. De sta forma es posible obtener un gran nmero de copias del gen, tan slo incrementando la bacteria.

1. Se extrae ADN de muchas clulas, y se corta en pequeas piezas.

Capturando el Gen Tomar la pieza de ADN buscada, desde el organismo donante

2. Las piezas se mezclan con plsmidos cortados con la misma enzima, las cuales al conjugarse conforman distintos plsmidos.

3. Los plsmidos, colocados de nuevo en bacterias, son ahora distintos, y entonces pueden ser separados. 4. Ahora, cada pieza de ADN puede copiarse tanto como sea necesario.

Encontrando el Gen correcto

1. Los plsmidos usados en la bacteria (vectores clonados), tambin contienen un gen de resistencia a antibiticos, de manera que slo aquellas que tengan el
Aislamiento con el nuevo plsmido

nuevo plsmido recombinante, crecern en el medio de cultivo. Este gen se llama marcador selectivo.

Aislamiento sin plsmido Uso de anticuerpos, ensayos de actividad enzimtica o exposicin ante toxinas o herbicidas.

2. Cada clon (progenie de bacterias con la nueva secuencia de ADN), puede ser probada para saber si contiene el gen deseado. Hay diversas maneras, dependiendo del caracter en cuestin.

Lo que acompaa al Gen: La construccin

1. Los genes deben estar prendidos para expresarse; para eso se usa el promotor. 2. El ARNm debe ser modificado para salir del ncleo, con los terminadores.

Promotor

Gen principal

Term.

Promotor

Marcador sel.

Term.

3. Es necesario saber cules (poco frecuentes) clulas han sido modificadas; para eso se agrega un gen marcador selectivo. 4. La combinacin terminada del gen + promotor + marcador selectivo + terminadores, se llama construccin o inserto.

Promotores: dnde se prender el gen?

1. Para que el ADN transcriba el gen en ARNm, debe haber un promotor delante de la secuencia. 2. Algunos promotores activan el gen en casi todas las clulas de la planta (Pr. Constitutivos). 3. Algunos solo lo hacen en las partes verdes.
35S

PEP-Carb.

4. Otros promotores solo trabajan en tejidos especficos, como polen, raz o tejidos daados.

Pr. Especfico de Raz

Marcadores Selectivos

1. El tipo ms comn es el de un gen que codifica para una enzima, que desdobla algn antibitico o componente de herbicida. 2. El gen marcador tambin necesita un promotor y terminador.
nptII bar kanamicna glufosinato de amonio

Medio de crecimiento para clulas con el antibitico o herbicida includo.

3. Normalmente la planta morira ante el qumico. Solamente sobrevivir si ha sido exitosamente modificada para poseer esta enzima.
Grupos de Clulas sobrevivientes (callos), resistentes al agente selectivo.

Promotor para el gen principal

Gen principal

Inserto listo para ser transferido a una planta

Terminador para el gen principal Promotor para el marcador selectivo Marcador selectivo

Plsmido Vector con puntos de insercin, marcador de resistencia a antibiticos...

Terminador para el marcador selectivo

Transfiriendo los genes a las plantas. Opciones de Transformacin

1. Agrobacterium. Uso de una bacteria como Ingeniero Gentico Natural. La bacteria conteniendo el inserto, infecta las clulas de la planta produciendo la recombinacin gentica. 2. Acelerador de Partculas (Gene Gun). Un caon artificial bombardea micropartculas con el inserto, sobre la clula. 3. Electroporacin. Uso de carga elctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. La corriente, fuerza el paso de los insertos al interior del ncleo. 4. Polietilenglicol. La exposicin de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las molculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyeccin mediante fibras microscpicas.Las fibras atraviesan las membranas, llevando los insertos.

1. El patgeno de suelo Agrobacterium tumefaciens, naturalmente inserta su ADN (plsmido Ti), en las clulas expuestas de sus huspedes, en tejidos radiculares daados.

Transformacin por Agrobacterium: Fundamentos

2. Este ADN extrao se incorpora y recombina con el ADN propio de la planta husped, dividindose y creciendo al azar, como un tumor. 3. El ADN de Agrobacterium toma el control de las clulas del tumor, causando la sntesis de aminocidos inusuales que sirven de soporte nutricional a la bacteria.

Preparando un gen para una transformacin mediante Agrobacterium

1. Las secuencias del plsmido Ti, responsable de la virulencia de la bacteria, se remueven (vrgenes).

Gen de inters

2. En otra bacteria, se ubica el gen

Promotor Terminador

deseable, entre las dos secuencias de borde del plsmido Ti. 3. Se integra el inserto que contiene el gen deseable, dentro del plsmido Ti, al ser incorporado nuevamente dentro de
Plsmido integrado

Borde Izquierdo

Borde derecho

Agrobacterium. 4. Bacteria clonada, lista para transformar.

1. Armar dos construcciones; una con los genes a incorporar (gen principal y marcador), y otra con las secuencias necesarias del plsmido Ti. 2. Integrar todo esto en un solo plsmido, en Agrobacterium, y usar este clon para infectar tejido vegetal. 3. Exponer el tejido tratado al agente qumico selectivo (antibitico o herbicida). Slo las clulas exitosamente transformadas, sobrevivirn. 4. Usar mtodos de cultivo de tejidos para regenerar plantas viables de las pocas clulas sobrevivientes.

Resumen: Transformacin mediante Agrobacterium

Transformacin por Acelerador de Partculas (Gene Gun)

1. Incorporar el inserto en un plsmido y hacer un gran nmero de copias en una bacteria.

Plsmido

Vector clonado

Cultivo

2. Extraer los plsmidos y cubrir con ellos pequeas partculas de tungsteno (1 micrn).
Plsmido Micropartculas

3. Disparar las partculas mediante una explosin, sobre los tejidos.

Callo, clulas o embriones

4. Exponer las clulas al agente selectivo para regenerar aquellas exitosamente transformadas.

1. En todo el proceso hay muchos pasos poco probables involucrados, debido a los siguientes obstculos: - Tener que introducir ADN en clulas vivas. - Lograr que el ADN sea insertado en forma estable, en los propios cromosomas de las clulas, haciendo viable su replicacin. - Lograr que esta insercin sea funcional. 2. No hay forma de controlar adonde se ubicar el ADN extrao: - Podra no ser funcional, dependiendo del sitio de insercin. - Podra afectar o anular la accin de algn gen importante de la planta.

Porqu un evento de transformacin es raro y costoso?

Los primeros desafos: Tolerancia a Glifosato

Objetivo: Transformar plantas sensibles en altamente tolerantes, para su aplicacin directa. Orgen: El Glifosato inhibe una enzima vegetal (EPSPS), necesaria para el crecimiento celular. Intento 1: Adicionar una nueva copia del gen para EPSPS, de petunia, con un promotor fuerte, para aumentar la concentracin de EPSPS en planta, y lograr tolerar mayores dosis de Glifosato. Resultado 1: An con ms EPSPS, las plantas fueron todava muy sensibles, como para ser de inters comercial.

Enzima desactivada por Glifosato

Extra EPSPS del gen de Petunia

Tolerancia a Glifosato: 2do Intento

Objetivo: Generar mutantes de algn organismo fcil de cultivar, hasta hallar algn individuo tolerante a Glifosato. Intento 2: Un aislamiento de Agrobacterium resulta menos sensible, pero su EPSPS es an funcional; se la transfiere a plantas TG. Resultado 2: En soja, ambos mecanismos sumados funcionan adecuadamente, no as en maz, que requiere trabajo adicional.
Medio de crecimiento para clulas con el herbicida includo

Enzima desactivada por Glifosato Organismo sobreviviente tolerante a Glifosato Molcula de Glifosato

EPSPS mutante

Objetivo: Encontrar un microorganismo que produzca una enzima capaz de detoxificar la molcula de Glifosato (GOX de Achromobacter sp.). Intento 3: Juntar los efectos del gen para esta enzima con el gen mutante de EPSPS, en plantas de maz. Resultado 3: Este intento, involucrando ambos genes result efectivo, logrando que las plantas estn protegidas por producir EPSPS insensible al herbicida, ms la capacidad de detoxificar parte del mismo.

Tolerancia a Glifosato: 3er Intento

Los primeros desafos: Tecnologa Bt

Objetivo: Lograr que la planta produzca su propio insecticida. Orgen: Algunos insectos pueden ser controlados mediante la aplicacin de Deltaendotoxinas de Bacillus thuringiensis. Estas toxinas son altamente selectivas e inocuas para el hombre y el ambiente, pero se desAl ingerir la toxina muere por parlisis digestiva

doblan rpidamente cuando estn expuestas a la luz ultravioleta. Intento 1: Poner el gen completo para la toxina-protena en la planta, con un fuerte promotor que funcione en todos los tejidos. Resultado 1: An con una transformacin exitosa, la planta no produca suficiente protena para protegerse a s misma.

Tecnologa Bt: 2do Intento

Orgen: Cuando la toxina natural (protoxina) entra en el intestino del insecto, se desdobla en la toxina activa, de cadena ms corta, por accin de las enzimas del insecto
Gen nativo completo Protoxina completa

Cdigo para Protoxina

Cdigo para Toxina activa

Toxina activa

Intento 2: Insertar un gen truncado que slo codifique para la porcin de la protena correspondiente a la toxina activa. Resultado 2: La planta produce mucho ms toxina ahora, pero sera conveniente an ms.

Tecnologa Bt: 3er Intento

Orgen: La planta prefiere usar ciertos codones para algunos aminocidos. Cuando no tiene estos codones preferidos produce mucha menos protena. Muchos de los codones en un gen bacterial, no son los preferidos, por lo tanto el gen no se expresa bien en la planta. Intento 3: Realizar cambios en el ADN del gen, base por base, de manera que codifique para los mismos aminocidos, pero usando los codones preferidos. Original TTAGCACCCTAGGCTAGCGTA Modificada TTACCACCCTACGGTAGCCTA Resultado 3: Cuando el gen es trucado y adems tiene los codones preferidos, expresa suficiente toxina para su autoproteccin.