CARIOTIPO

Un cariotipo es la dotacin cromosmica completa de un individuo o una especie, que puede observarse durante la mitosis. El trmino tambin se refiere a la presentacin grfica de los cromosomas, ordenados en pares de homlogos y que se puede describir conforme a una nomenclatura convencional. La normalidad es tener 46 cromosomas, aun cuando puede haber de ms o bien de menos. En el varn normal, hay 44 A + XY y en la mujer 44 A+XX. Son 44 autosomas y los otros 2 son cromosomas sexuales. Estos ltimos hacen que se defina el gnero sexual, es decir, que seamos hombre o mujer. Tienen un punto central en donde se unen y dos pares de brazos con distinta longitud. Son 23 pares, es decir, dos unos, dos doses, etc., que son similares entre s a excepcin de los cromosomas sexuales X e Y que no se parecen entre ellos. Un cromosoma, de cada par, proviene de la madre y el otro del padre. Luego se agrupan por grupos por parecerse entre s varias parejas. Las alteraciones en su nmero total dan lugar a errores genticos con las malformaciones correspondientes. Tambin ocurre algo similar si falta un brazo o parte de l, en alguno de ellos. La gravedad y su significado clnico dependen del cariotipo y del lugar que ha sido afectado. La medicina moderna va por conocer exactamente como estn constituidos cada uno de los cromosomas y en donde se hayan alterados cuando aparece una malformacin o enfermedad. El futuro de la medicina parece que va por lograr detectar que gen del cromosoma es el causante de tal o cual enfermedad y modificarlo para que no aparezca en el futuro. Los cromosomas de cada especie poseen una serie de caractersticas, como la forma, el tamao, la posicin del centrmero y las bandas que presentan al teirse. Este conjunto de particularidades, que permite identificar los cromosomas de las distintas especies, recibe el nombre de cariotipo, y su representacin grfica, ordenada por parejas de cromosomas homlogos, se denomina cariograma.

El estudio de los cariotipos es posible debido a la tincin. Usualmente un colorante adecuado es aplicado despus que clulas han sido detenidos durante la divisin celular mediante una solucin de colchicina. Para humanos las clulas blancas o LEUCOCITOS de la sangre son las usadas ms frecuentemente porque ellas son fcilmente inducidas a crecer y dividirse en cultivo de tejidos.2 Algunas veces las observaciones pueden ser realizadas cuando las clulas no se estn dividiendo interfase. El sexo de un neonato feto puede ser determinado por observacin de clulas en la interfase. Para determinar el cariotipo de un individuo, es necesario llevar a cabo un cultivo de clulas y, cuando estas comienzan a dividirse, teirlas y hacer una preparacin microscpica para fotografiar los cromosomas. En un feto, las clulas se pueden obtener por amniocentesis, es decir, efectuando una puncin en el vientre de la madre para obtener lquido amnitico o bien por puncin directa del cordn umbilical para extraer sangre del feto. En un individuo adulto se utilizan los glbulos blancos de la sangre. El ltimo paso para determinar el cariotipo es ordenar y emparejar los cromosomas, y verificar si es correcto.

Forma en que se realiza un examen para crear un cariotipo

1. El examen se puede realizar en una muestra de sangre, de mdula sea, de lquido amnitico o de tejido placentario. 2. Los cromosomas contienen miles de genes que se almacenan en el ADN, el material gentico bsico. 3. La muestra se deja crecer en un cultivo de tejido en el laboratorio y luego las clulas se seleccionan, los cromosomas se tien y se observan bajo el microscopio. 4. Las clulas se fotografan para obtener un cariotipo que muestre la disposicin de los cromosomas. Ciertas anomalas se pueden detectar a travs de la cantidad o disposicin de los cromosomas.

Preparacin para el examen

Para el examen de sangre no se necesita una preparacin especial. Para examinar el lquido amnitico se realiza una amniocentesis. El examen del tejido placentario se hace despus de una muestra de vello corinico o despus de un aborto espontneo, y para examinar una muestra de mdula sea se requiere de una biopsia de mdula sea.

TECNICAS DE ESTUDIO DEL CARIOTIPO

Las tcnicas disponibles actualmente y que pueden realizar los laboratorios de gentica para caracterizar las alteraciones genticas son:

Cariotipo Clasico: En el cariotipo clsico se suele utilizar una solucin de

Giemsa como tincin, especfica para los grupos fosfato del ADN, para colorear las bandas de los cromosomas llamadas Bandas-G, menos frecuente es el uso del colorante Quinacridina que se une a las regiones ricas en Adenosina-Timina. Cada cromosoma tiene un patrn caracterstico de banda que ayuda a identificarla. Los cromosomas se organizan de forma que el brazo corto de este quede orientado hacia la parte superior y el brazo largo hacia la parte inferior. Algunos cariotipos nombran a los brazos cortos p y a los largos q. Adems, las diferentes regiones y subregiones teidas reciben designaciones numricas segn la posicin a la que se encuentren respecto a estos brazos cromosmicos.

Cariotipo Digital: El cariotipo digital es una tcnica utilizada para cuantificar el

nmero de copias de ADN en una escala genmica. Se trata de secuencias de locus de ADN especficos de todo el genoma que son aisladas y enumeradas. 5 Este mtodo es tambin conocido como cariotipado virtual.

Caritipo Espectral: La tcnica de cariotipo espectral en colores (SKY) permite

la deteccin e identificacin simultnea de todos los cromosomashumanos mediante la combinacin de cinco fluorocromos. La sonda que se utiliza para hibridar las clulas tumorales en metafase es una mezcla de sondas de pintado cromosmico de los 24 cromosomas, cada uno marcado con una combinacin de fluorocromos diferente. Se necesita un equipo y un softwareespecial para detectar y discriminar las diferentes sondas de ADNque se hibridan simultneamente. Por lo tanto, esta tcnica combina la sensibilidad del FISH con la gran ventaja del anlisis citogentico convencional: obtener una visin global de las todas las alteraciones cromosmicas en un nico experimento. Este mtodoha permitido detectar translocaciones crpticas, en algunos casos recurrentes y, sobre todo, analizar cariotipos complejos e investigar los orgenes genticos del material implicado en cromosomas marcadores. As, se ha podido detectar el origen de las adiciones en el brazo largo del cromosoma 14, tan frecuentes en neoplasias linfoides. El principal inconveniente del SKY es que no permite detectar inversiones ni pequeas delecciones. Los resultados de esta tcnica pueden abrir campos a nuevas investigaciones, pero adems puede tener un significado pronstico, ayudando a identificar

alteraciones genticas recurrentes que identifiquen subtipos especficos de una enfermedad. En las leucemias agudas el SKY ha permitido la deteccin de translocaciones crpticas en cromosomas que el anlisis mediante bandas G detectaba como de-leccionados, proporcionando una herramienta para que en el futuro se puedan definir mejor los grupos de mal pronstico. Cuando se desarroll la tcnica, se pens que el SKY podra detectar alteraciones en los pacientes con neoplasias hematolgicas pero que presentaban cariotipo normal. Algunos trabajos recientes muestran que el SKY detecta alteraciones crpticas en un porcentaje muy bajo de estas muestras. Estos resultados, junto con el hecho de que es una tcnica laboriosa y cara, sugieren que probablemente el SKY no es la tcnica de eleccin para el estudio de casos con un resultado citogentico normal. Las distintas tcnicasgenticas no se excluyen, son complementarias unas de otras. Lo importante es valorar qu tipo de estudio se debe utilizar en cada caso. Esto se aplica tambin al SKY, que siempre se debe utilizar como un mtodo complementario del anlisisde bandas G. El cariotipo convencional permite analizar un mayor nmero de metafases y proporciona una descripcin ms exacta de las bandas implicadas en los reordenamientos. En conclusin, el SKY puede representar un importante instrumento en el anlisis citogentico, especialmente en casos con cariotipos complejos. La capacidad de discernir diferencias genticas entre poblaciones de clulasleucmicas similares morfolgica e inmunolgicamente est ayudando a establecer las bases para una revisin de la clasificacin de neoplasias hematolgicas. La utilizacin conjunta de estas tcnicas est aportando datos a una investigacin dirigida a identificar factores pronsticos en estos pacientes.

Estudios Cromosmicos De Bandeo Extendido: Los estudios de

bandeo extendido o de "alta resolucin" implican el estudio de los cromosomascon una resolucin ms alta que la del anlisis cromosmico estndar mencionado anteriormente. Los cromosomas estn dispuestos de manera tal que se alargan un poco, por lo que se pueden ver ms bandas. Esto permite observar partes ms reducidas del cromosoma e identificar, de este modo, anomalas cromosmicas estructurales ms pequeas que no pueden ser vistas en un anlisis de rutina.

Hibridacin Fluorescente In Situ (FISH): La hibridacin fluorescente in

situ es una tcnica de laboratorio que determina cuntas copias de un segmento especfico de ADN existen en una clula. Tambin se utiliza para identificar cromosomas con estructuras anmalas. En el laboratorio, se modifica qumicamente un segmento de ADN y se lo marca de manera que pueda ser visto fluorescente (muy brillante) utilizando un microscopio especial. Este ADN se conoce como "sonda". Cuando se las coloca en las clulas bajo ciertas condiciones, las sondas pueden detectar segmentos homlogos de ADN. La hibridacin fluorescente in situ se puede utilizar para detectar anomalas cromosmicas estructurales (como las delecciones submicroscpicas) que se encuentran ms all de la resolucin de los estudios cromosmicos de bandeo extendido. "Telmero" es un trmino que se utiliza para describir los extremos de los cromosomas. Cuando se utiliza la hibridacin fluorescente in situ (su sigla en ingls es FISH) especficamente para buscar anomalas cromosmicas en esta zona, se la denomina " examen subtelomrico FISH" . Las sondas usadas en la FISH se pueden clasificar en: Sondas que identifican una estructura especfica y repetitiva del cromosoma: Estas sondas hibridan con las secuencias y satlite adyacentes al centrmero, que son especficas de cada centrmero, pero que varan de un cromosoma a otro. Las sondas centromricas permiten identificar alteraciones de tipo numrico, especialmente monosomas y trisomas y otras

aneuploidas tanto en las cromosomopatas (Sndrome de Turner, sndrome de Down, sndrome de Klinefelter) como en los tumores (trisoma 8 o monosoma 7 en leucemias agudas).

Sondas que hibridan simultneamente con mltiples secuencias del cromosoma:Se denominan sondas de pintado cromosmico a aquellos fragmentos de ADN que se obtienen mediante separacin cromosmica por citometra de flujo y se marcan directamente mediante DOP-PCR. Slo pueden utilizarse en metafase y sirven para detectar alteraciones estructurales (translocaciones, cromosomas marcadores, derivativos, etc.) difciles de identificar con la citogentica convencional, como la t(12;21)(p12;q22) en la leucemia aguda linfoblstica B del nio. Sondas que hibridan con una nica secuencia de ADN: Estas sondas permiten sobre todo detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosmicas concretas. Para poderutilizarlas es necesario conocer a priori la regin candidata a estudio en cada patologa. Sus aplicaciones son: a) la deteccin de translocaciones cromosmicas tales como la t(9;22)(q34;q11), con fusinde los genes BCR y ABL, en la leucemia mieloide crnica o la t(11;14)(q13;q32), donde BCL-1 se transloca a la regin de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, en el linfoma del manto (fig. 3); b) el estudio de prdidas de genes concretos, como el gen del sndrome de Prader-Willi, o la prdida de P53 en tumores, y c) el estudio de genes que se amplifican, es decir, se multiplican de manera considerable en el ncleo de la clula tumoral, como N-MYC en el neuroblastoma.

Anlisis de Microarreglo Cromosmico: Un anlisis de microarreglo

cromosmico (CMA, por sus siglas en ingls) es un nuevo anlisis que se utiliza para detectar desequilibrios cromosmicos a una resolucin mayor que las tcnicas cromosmicas estndar actuales o las tcnicas FISH. Una muestra del ADN del individuo a examinar y una muestra de ADN para control se disponen en un orden (arreglo) particular sobre un portaobjetos de vidrio. A las muestras de ADN se aade colorante fluorescente. Luego se colocan los portaobjetos en un lector especial que mide el brillo de cada rea fluorescente. Este proceso busca identificar un cambio en el nmero de copias de ADN. Estos cambios en los nmeros de copias de ADN pueden representar cambios observados en la poblacin general, los cuales no causan enfermedades genticas. Sin embargo, algunos cambios en los nmeros de copias pueden indicar una anomala cromosmica, como un desequilibrio cromosmico, prdida o ganancia. Los tipos de anomalas cromosmicas pueden incluir pequeas reordenaciones cromosmicas, pequeas duplicaciones de material cromosmico (trisomia), o pequeas supresiones de material cromosmico (monosomia). Entre los tipos de microarreglos tenemos:

Microarreglos que detectan ganancias y prdidas de genes (prdida de heterogenicidad): Ciertas prdidas o ganancias cromosmicas estn relacionadas con la progresin del cncer y los patrones de estos cambios son importantes para establecer un pronstico clnico. Con el uso de microarreglos y el anlisis de sus resultados se podra predecir cules regiones cromosmicas contienen genes que inician y mantienen procesos tumorales. Los resultados pueden ser visualizados en diagramas jerrquicos referidos como " modelos en rbol de progresin del tumor" . La tcnica de Microarreglos de Hibridizacin Genmica Comparativa permite visualizar ganancias y prdidas o cambios en el nmero de copias de un gen particular involucrado en determinada patologa. En este tipo de microarreglos se usan grandes porciones de ADN genmico que sirven como ADN inmovililizado en el plato y cada punto o spot de ese ADN representa una regin cromosmica conocida. La mezcla a hibridizar contendr ADN genmico marcado, proveniente de tejido enfermo y tejido sano. Si el nmero de copias del gen de inters estn aumentadas, una gran cantidad de ADN de la muestra se hibridizar en los puntos o spots del microarreglo que representan el gen involucrado, mientras que al utilizar muestra proveniente de tejido sano slo un pequeo nmero se hibridizar en el mismo punto. Dicha diferencia en la cantidad de material hibridizado podr reflejarse en fluorescencias dismiles y as ser detectado por el escner y por los programas de lectura.

Microarreglos que detectan mutaciones en el ADN: Cuando se utilizan los microarreglos para detectar mutaciones o polimorfismos en una secuencia gnica, el ADN inmovilizado suele ser un nico gen; el material colocado en otros pozos puede diferir solamente en uno o en unos cuantos nucletidos. Un tipo de secuencia que suele utilizarse para este tipo de anlisis son los Single Nucleotide Polymorphism (SNP) o Polimorfismo de nucletido nico, pequea variacin genticaque puede ocurrir dentro del ADN de un individuo. En este tipo de experimento se necesita ADN genmico derivado de una muestra normal para ser usado en la mezcla de hibridizacin. Una vez que los investigadores han establecido que un SNP se relaciona con una enfermedad de inters, pueden usar la tecnologa para detectar quines tienen o son susceptibles de tener la enfermedad. Cuando el ADN genmico de un individuo se hibridiza con un arreglo cargado de varios SNPs, el ADN muestra (target) se hibridizar con mayor frecuencia con los SNPs asociados al individuo a estudio. Estos puntos del microarreglo tendrn mayor fluorescencia y se demostrar que dicha persona es susceptible o tiene determinada enfermedad.

Hibridacin genmica comparada: En la HGC se produce la hibridacin

de ADN tumoral y ADN normal frente a cromosomas normales. Esta tcnica presenta la ventaja de no necesitar material en fresco, ya que el ADN se puede obtener de tejido en parafina. Con ella se pueden conocer alteraciones numricas (prdidas o ganancias de material genmico), pero no la presencia de translocaciones recprocas. Su aplicacin al estudio de los tumores ha puesto de manifiesto que en la mayora de las neoplasias hay alteraciones genticas. Fundamento de la hibridacin genmica comparada: La HGC consiste en la hibridacin competitiva entre ADN tumoral (test) y ADN normal (referencia) sobre metafases normales en presencia de un exceso de ADN Cot-1 humano. Previamente, el ADN tumoral y el ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes (por ejemplo, el ADN tumoral con un fluorocromo verde y el ADN normal con uno rojo) lo que permitir su posterior identificacin mediante un microscopio de fluorescencia. El anlisis digital de las metafases capturadas cuantifica la proporcin de verde y de rojo en todos los cromosomas de manera que si existe una ganancia de material gentico en una determinada regin cromosmica se producir un aumento de la fluorescencia verde a ese nivel, mientras que si hay una prdida de material gentico se producir una disminucin de la fluorescencia verde y por tanto un aumento relativo de la fluorescencia roja. El cariotipaje posterior se realiza sobre la base de la tincin con DAPI de los cromosomas. La HGC ha sido la primera tcnica combinada de citogentica e hibridacin in situ fluorescente que ha permitido realizar un anlisis global del genoma. Puesto que

las alteraciones en el nmero de copias de ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la patogenia del cncer, la HGC ha despertado gran inters en el estudio de las neoplasias. La HGC ha sido utilizada de forma ms amplia en el estudio de los tumores slidos que de las neoplasias hematolgicas, entre otras razones por la dificultad que entraa obtener mitosis en los tumores slidos, y porque los reordenamientos no recprocos y las amplificaciones gnicas se producen con ms frecuencia en ellos que en las neoplasias hematolgicas. No obstante, puesto que la HGC no requiere metafases de las clulas tumorales y no est afectada por la seleccinclonal inherente a los cultivos celulares, se ha utilizado en hemopatas malignas. Las neoplasias linfoides B representan el grupo ms estudiado y ms concretamente los linfomas no Hodgkin (LNH) en los que se ha demostrado que las amplificaciones constituyen una alteracin ms frecuente de lo que se supona, y que se asocian generalmente a linfomas agresivos. Otra aportacin importante de la HGC al conocimiento de la patogenia de los linfomas ha sido la demostracin de que la amplificacin es otro mecanismo que causa sobreexpresin de la protena bcl-2, aadido al ya conocido mecanismo de translocacin.