O1

Reviso de Conjunto
Fig.1 Sangue
Barreira hematoenceflica:
O que preciso saber em investigao neurotoxicolgica
Blood-brain barrier: What we need to know in neurotoxicological research
Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa Setembro 2008
Filipa Isabel Santos Sanches Praceta Gervsio Lobato n 4 3 dto 2745-873 Massam 214373680 / 914215031 Professora Dra. Maria Alexandra Brito
Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008
ndice
Resumo Notas referenciais Um pouco de histria Neurotoxicologia Barreira Hematoenceflica

Estrutura e Funes Desenvolvimento: do embrio as ser adulto Propriedades: permeabilidade paracelular e polarizao celular
Papel dos Astrcitos, Percitos e outras clulas na diferenciao da Barreira Hematoenceflica Transporte ao longo da Barreira Hematoenceflica
Tipos de transporte natural Transporte de acares, aminocidos, protenas, lpidos e gua Estratgias para facilitar o transporte molecular
Doenas do Sistema Nervoso Central

Patologias Farmacologia Papel dos astrcitos quando a integridade da BHE posta em causa Imunovigilncia
Concluses Referncias bibliogrficas

Texto Imagens
Resumo
A Barreira Hematoenceflica, enquanto sistema biolgico complexo, tem vindo a ser desvendada medida que se vo conhecendo melhor as estruturas que a compem. Estruturalmente, esta barreira formada por clulas endoteliais rodeadas e suportadas por outras clulas, nomeadamente os astrcitos e os percitos, no esquecendo os prprios neurnios. Todas estas clulas e o meio que as envolve parecem ter um papel fundamental e especial, em diferentes alturas do desenvolvimento, na diferenciao e manuteno da Barreira Hematoenceflica. A presena da barreira a principal causa para a sobrevivncia do crebro, sendo esta a responsvel pela manuteno do ambiente restrito e controlado que este rgo necessita para sobreviver. Os sistemas de transporte presentes so vastos e de importncia extrema, tanto os que ocorrem naturalmente, como os que podem ser induzidos por factores externos, nomeadamente em algumas situaes patolgicas. fundamental que se continuem a desenvolver esforos para um conhecimento mais profundo da Barreira Hematoenceflica, nomeadamente ao nvel da sua ultraestrutura, a fim de se explicarem todas as suas capacidades e particularidades funcionais. S desta forma se conseguiro bons resultados na preveno e no tratamento das doenas que afectam o Sistema Nervoso Central e cujas solues teraputicas se mostram ainda bastante pobres.
Palavras-chave:
BHE Endotlio cerebral Junes Apertadas Glia Transportadores endoteliais Neurotoxicologia
Notas referenciais
The concept of an endothelial blood-brain barrier (BBB) was confirmed by the unequivocal demonstration that the passage of molecules from blood to brain and vice versa was prevented by endothelial tight junctions (TJs). There are three major functions implicated in the term "BBB": protection of the brain from the blood milieu, selective transport, and metabolism or modification of blood- or brain-borne substances. The development of the BBB is a complex process that leads to endothelial cells with unique permeability characteristics due to high electrical resistance and the expression of specific transporters and metabolic pathways.
(por Ribatti D. et al em ANATOMICAL REC B NEW ANATOMY, 2006)
The blood-brain barrier (BBB) segregates the circulating blood from interstitial fluid in the brain, and restricts drug permeability into the brain. Our latest studies have revealed that the BBB transporters play important physiological roles in maintaining the brain milieu.
(em Biol Pharma Bull, 2004)
The barrier layers of the nervous system can be modulated by a number of receptor-mediated processes, involving several signal transduction pathways, both calcium dependent and independent. The challenge for the next era of CNS barrier studies will be to apply new knowledge from proteomics and genomics to understanding the in vivo condition in physiology and pathology.
(em CELL MOL NEUROBIOL, 2005)
Um pouco de histria
O conceito de barreira hematoenceflica (BHE) surge no final do sculo XIX, por volta de 1855, com Paul Erlich. A sua definio encara-a como um dique protector das clulas cerebrais contra as flutuaes do meio interior ou contra a aco das substncias imprprias para o sangue [12] [5]. Pouco mais tarde, surgem as primeiras ideias de que a impermeabilidade capilar do sistema nervoso central (SNC) se deve principalmente s membranas celulares, mas estudos sobre os capilares centrais levados a cabo por Joo Mirabeau Cruz [12] no apontam diferenas face aos outros capilares do organismo. Segundo Bierley
[12]
, devem ser
aplicadas as mesmas leis aos capilares cerebrais que aos restantes; no entanto, este aceita que possa haver diferenas na matria amorfa (cimento) que envolve os capilares e que esta possa ser responsvel pela impermeabilidade. J em 1967, Reese e Karnowsky conseguiram provar que a barreira estava localizada no endotlio vascular cerebral, aps realizarem uma anlise microscpica com um marcador especfico, a peroxidase horseradish [12] [5]. Posteriormente, estudos realizados por Maynard, Shultz e Pease no mostram fenestraes ou poros nos endotlios capilares. Outros morfologistas referem as terminaes gliais, particularmente os astrcitos, como envolvendo os capilares e, portanto, estas deveriam corresponder dita BHE
[12]
. Estes prolongamentos tornavam as clulas
astrocitrias o principal mediador entre o endotlio e o tecido neural, pelo que parecia vivel atribuir-lhes funes importantes alm do transporte (suporte estrutural e manuteno da BHE). Mas esta no seria uma barreira perfeita, uma vez que tambm se detectaram espaos por onde se pensou que algumas substncias poderiam aceder ao SNC. Para Maynard, Shultz e Pease, o facto da nutrio do SNC poder ser feita por estes ps terminais dos astrcitos parecia explicar a selectividade aparente da barreira. Mas, mais uma vez, a anlise morfologia cada vez mais especfica levantava novos problemas: por microscopia electrnica, verificou-se que somente 85% da superfcie capilar cerebral estava coberta por uma camada contnua e simples destes ps, de espessura desigual [12]. Schmitt, mais tarde, foi levado a concluir que o fenmeno barreira no poderia defenir-se em termos de mecanismo simples ou de estrutura especfica responsveis pela entrada de um grupo de substncias para o crebro
[12]
; era importante encarar
cuidadosamente os elementos fundamentais neste fenmeno: as junes intercelulares nervosas, o micromeio envolvente e, enfim, as prprias membranas (endotelial e neural). Muitos factos continuavam por explicar. Outros ainda continuam.
Neurotoxicologia
Quando se fala no crebro e na sua capacidade de se auto-regular e de se manter num ambiente controlado, comum que se fale tambm da possibilidade de agentes exteriores ou situaes patolgicas terem a capacidade de interferir com as suas funes e estruturas, condicionando muito este orgo que necessita, para a sobrevivncia de todo o organismo, funcionar na melhor das condies. Assim surge o conceito de Neurotoxicologia, ou seja, a rea que estuda os agentes que, directa ou indirectamente, tm a capacidade de provocar uma desregulao no funcionamento normal do crebro [7] [17]. E porqu, neste mbito, fazer referncia Barreira Hematoenceflica? Porque, de facto, a capacidade que o crebro tem de se manter, em situaes normais, isolado dos factores que lhe podem causar toxicidade atribuda, em grande parte, existncia desta complexa barreira [38] que, no presente trabalho, ser largamente explorada.
Fig.2 Crebro
Barreira Hematoenceflica
Estrutura e Funes
A BHE, apesar da designao que mantm, bem mais que uma separao fsica entre o sangue e o tecido cerebral. Ela hoje definida como uma estrutura dinmica e complexa especfica do SNC, constituda por clulas endoteliais cerebrais que evoluiram e apresentam aqui caractersticas bem distintas do restante endotlio vascular presente no organismo, o que permite manter um ambiente cerebral extremamente controlado
[26]
e estvel, mesmo em situaes de No entanto, apesar da sua enorme
grande flutuao do meio exterior. impermeabilidade, medida que o dimetro dos vasos aumenta, as falhas na BHE vo sendo mais frequentes; de forma
Fig.3 Barreira Hematoenceflica
semelhante, medida que se observam zonas mais profundas, essas falhas praticamente no acontecem [26]. As caractersticas que conferem barreira propriedades to particulares so vrias, nomeadamente a ausncia de fenestraes, presena de junes apertadas (tight juntions) constitudas por protenas transmembranares que se associam, por sua vez, a outras transmembranares e citoplasmticas, baixo nmero de vesculas de pinocitose, grande nmero de mitocndrias, reduzida densidade proteca intersticial e uma variedade de sistemas de transporte representados por uma grande diversidade de complexos protecos (presentes tanto na membrana luminal como abluminar dos capilares) [2]
[27] [38] [1] [3] [9] [15] [19] [20] [21]
A presena de uma barreira parece ter dois grandes propsitos: manter dentro de limites muito apertados a composio do meio ambiente interno cerebral (fluidos intersticial e cerebroespinal) e a neuroproteco [38]. Contudo, a BHE no consegue, por si s, ser responsvel pelo cumprimento de todas as funes que lhe esto atribuidas. Assim, existem outras clulas que ao estarem intimamente ligadas a esta permitem o seu funcionamento na perfeio, em condies normais: so elas as clulas gliais, nomeadamente os astrcitos e os percitos. A proximidade destas clulas
[23]
, por um lado, com o endotlio e, por outro, com os neurnios, permite que se estabelea
uma relao extremamente controlada e fundamental entre o meio circulante e o tecido neuronal [16] [19] [26] [27].
A rede capilar cerebral extremamente densa e eficiente, apresentando uma rea de superfcie entre 100 e 200 cm2/g de tecido. Uma consequncia positiva desta situao consiste no facto de todas as clulas cerebrais no estarem nunca a mais de 20 m de distncia de um capilar [11]. As clulas endoteliais que do origem barreira hematoenceflica esto intimamente ligadas por junes
[3] [19] [39]
que, de certa forma, so a primeira linha de controlo de todas

[11] [1]
as substncias que entram no SNC. A presena dessas junes apertadas torna o endotlio cerebral, especialmente ao nvel dos capilares, impermevel difuso aquosa . Mesmo solutos importantes e necessrios sobrevivencia das clulas neuronais, como nutrientes essenciais ou aminocidos, esto impedidos de entrar no crebro por simples difuso. Da que, para ser vivel, fundamental a existncia de sistemas de transporte em larga escala, por forma a fornecer todas as substncias necessrias ao bom funcionamento do crebro [6]. As funo junes apresentam, assim, uma ao extremamente
[13]
importante
impedirem a movimentao paracelular livre dos solutos [15] transporte

[7]
, mas no s. Estas tambm que ocorre atravs da
tm um papel fundamental na selectividade de

[10]
barreira, j que ao impedirem a movimentao de protenas transmembranares e lpidos nas

Fig.4 Barreira Hematoenceflica
membranas celulares endoteliais, conseguem
controlar onde e em que sentido se d a passagem dos solutos, sejam eles hidroflicos ou lipoflicos. A expresso dos transportadores tambm extremamente controlada, conseguindo-se uma optimizao excepcional no aporte das substncias necessrias ao bom funcionamento cerebral, bem como na remoo de substncias desnecessrias ou txicas no sentido inverso. Ou seja, possvel que o transporte seja direccionado como mais conveniente, do sangue para o SNC ou vice-versa e em quantidades tambm ajustveis s necessidades
[11] [7]
.
[17] [21] [15]
Morfologicamente, todas as estruturas que compem a barreira e a suportam

[27]
esto organizadas da seguinte forma: o endotlio microvascular partilha com os
astrcitos e os percitos uma membrana basal. Os astrcitos, localizados no parnquima cerebral, conseguem com os seus ps astrocitrios (prolongamentos que se estendem desde o tecido neuronal at aos vasos, formando uma rede que termina junto membrana basal) envolver mais de 90% do endotlio capilar [20]. J os percitos, clulas mais pequenas,
localizam-se em torno da vasculatura cerebral, em contacto tanto com o endotlio como com os astrcitos. Clulas endoteliais (CEs) O endotlio capilar apresenta, no crebro, uma rea de superfcie de cerca de 100 cm2/g de tecido e o volume que ocupa de 1% do volume tecidular. Para um crebro normal de 1200 g, estimou-se que a barreira hematoenceflica apresente uma extenso de 12 m2 e ocupe um volume de 1,2 ml [11].
Fig.5 Estrutura celular da BHE
Penetrar nas clulas endoteliais um processo limitado e controlado, sendo, em primeira linha, dependente de factores como a solubilidade lipdica, o peso molecular e a forma dos solutos. Molculas lipoflicas atravessam, por difuso passiva, mais facilmente as membranas endoteliais, enquanto que molculas hidroflicas com pesos moleculares superiores a 5 kDa esto praticamente excludas da travessia, sejam elas ies, protenas, glcidos ou outras [11]. As clulas endoteliais apresentam duas faces, uma luminal (em contacto com o sangue) e outra abluminal (virada para o meio interno cerebral), que apresentam algumas diferenas entre si, nomeadamente ao nvel dos transportadores que ai existem
[11]
. Assim, ao nvel da
membrana luminal esto presentes em maior nmero sistemas de transporte facilitado, enquanto que na membrana abluminal surgem principalmente sistemas de transporte contra o gradiente de concentrao. Esta especificidade permite que o aporte e eliminao de substncias resulte num ambiente interno praticamente sem oscilaes de composio, o
Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008 10
que fundamental para o bom funcionamento daquele que , sem dvida o principal rgo do organismo, o crebro. Junes apertadas (JAs) As junes apertadas correspondem a uma estrutura que consiste num complexo proteico de fuso entre clulas endoteliais adjacentes localizado ao longo das paredes laterais das CEs [15] [21] [11] [26] [39] [10]. A complexidade proteica destas estruturas no foi ainda totalmente esclarecida, mas contam-se j algumas protenas de extrema importncia e de presena indispensvel, nomeadamente as seguintes: ocludina, claudina, molcula de adeso de juno (JAM) e zonula occludens (ZO). A ocludina
[11] [3] [14] [21]
foi a
primeira protena das JAs a ser identificada. Ela apresenta nveis maiores em tecidos cerebrais do que nos restantes tecidos, sugerindo desde logo um papel importante ao nvel da barreira, particulamente Esta no que possui diz uma respeito s junes. protena extremidade C-terminal
Fig.6 Protenas da JA ao nvel da membrana endotelial
citoplasmtica que se pode ligar a uma outra protena, a actina, na integridade da juno.
parte integral do citosqueleto da clula. Daqui se pode perceber a importncia da ocludina Estudos realizados em animais modificados geneticamente mostraram que na ausncia da ocludina continua a haver formao da barreira, contudo esta no parece estar nas melhores condies de funcionalidade da BHE. Em 1998 foram identificadas duas protenas da famlia das claudinas
[3] [11] [21] [28] [29] [28] [29] [13]
, o que sugere ainda um papel na regulao
,a
claudina-1 e a claudina-2, com pesos moleculares de 23 kDa. Posteriormente muitas outras foram sendo identificadas, sendo esta, hoje, uma famlia de 24 protenas conhecidas.
11
Estas protenas no apresentam nenhuma semelhana com as ocludinas ao nvel da sequncia gentica e, ao contrrio destas, so exclusivas do tecido cerebral e das JAs. Um aspecto importante sobre as claudinas consiste no facto de apenas na presena destas ser possvel a sntese de protenas viveis quando se procede transfeco (neste caso, co-transfeco) de ADNc de ocludinas. Caso contrrio, a juno torna-se desorganizada e desfuncional. Existem vrios isotipos de claudinas que podem polimerizar, formando homo ou heteropolmeros. Esta propriedade parece revelar uma diversidade estrutural e mesmo funcional das JAs. No mesmo ano da descoberta das claudinas, foi identificada outra protena deste complexo, a JAM
[11] [3]
. Esta apresenta um peso molecular de 40 kDa e, at hoje, j se
conhecem trs distintas. Pertencente superfamlia das imunoglobulinas, tem, em conjunto com uma outra molcula (PECAM-1, molcula de adeso das clulas endoteliais), a funo de regular a migrao dos leuccitos ao longo das CEs. Um outro conjunto de protenas, pertencentes famlia das guanilo-cinases associadas membrana (MAGUK), so designadas por zonula occludens
[3] [11]
(ZO-1, ZO-2 e ZO-3) e
sendo protenas citoplasmticas, tm como funo o suporte estrutural das junes. Estas protenas podem ligar-se actina, j que possuem multiplos locais de fosforilao, e apresentam, ao nvel da sua estrutura, trs domnios distintos: SH3, GUK e PDZ. O primeiro importante nas ligaes a outras molculas ou ao citosqueleto da clula. J o domnio que PDZ reconhece ser muitos motivos C-terminais tetrapeptdicos, podem encontrados, nomeadamente, nas claudinas e nas JAMs, sugerindo ser este um dos locais de ligao entre as protenas.
Fig.7 Zonula Occludens
A modulao da barreira , como se pode perceber pelo elaborado conjunto proteico envolvido, um processo complexo e que requer, alm das protenas descritas, outras, nomeadamente protenas citoplasmticas cinases C, protenas G e a cingulina. O antignio C est associado permeabilidade paracelular, enquanto que as protenas cinases C assumem um papel ao nvel da polarizao celular, dois assuntos a serem analisados em pormenor mais frente. Por sua vez, as protenas G tm a sua funo
[11] [3]
. Aqui se incluem o antignio 7H6, protenas
12
centrada na resistncia transmembranar. E, finalmente, a cingulina actua como um elo de ligao entre vrias protenas das JAs, nomeadamente a ZO-1, a ZO-2, a ZO-3, a JAM e a miosina. Zona de aderncia (ZA) As JAs esto localizadas na proximidade de uma outra zona fundamental, a zona de aderncia. A formao das junes est dependende da formao prvia desta zona [3] [11].
Fig.A Juno Apertada e Zona de Aderncia (protenas envolvidas)
Esta zona de aderncia constituda por protenas transmembranares e tambm citoplasmticas, respectivamente da famlia das caderinas e da famlia das cateninas, responsveis, em parte, pela estabilidade das JAs por permitirem a ancoragem da actina
[24] [36] [23]
, protena citoplasmtica do citosqueleto, ZA.

[3] [11]
As caderinas
so glicoprotenas que possuem um nico domnio e interagem
homotipicamente para permitir a adeso de clulas adjacentes. A relevncia destas na modulao da BHE foi determinada atravs de um estudo que sugeriu que, na ausncia das caderinas, a formao das JAs encontrava-se impedida. O estudo teve como fundamento a utilizao de anticorpos contra uma protena desta famlia, a caderina E. Uma outra caderina de relevncia conhecida a caderina VE
[11]
que assume um papel
importante na sequncia estrutural de molculas que permitem a integridade das junes, visto estabelecer uma ligao, no espao intracelular, com outra protena, a caterina, que, por sua vez, se liga actina. Alguns estudos revelaram que, na ausncia do C-terminal desta protena, continua a ocorrer a formao das JAs, no entanto h um aumento da
13
permeabilidade paracelular. Alm disto, a caderina VE tm um outro papel fundamental e que consiste no facto de s na sua presena haver capacidade de resposta da clula ao factor de crescimento (VEGF), evitando-se assim a morte celular por apoptose devido a uma diminuio dos complexos moleculares intracelulares entre o VEGF-R2, a caderina VE e a catenina , fundamentais para a sobrevivncia celular [11]. Alm das protenas referidas anteriormente, surge ainda outra que parece ser tambm importante ao nvel da modulao das junes, a caderina p120 [11] [28]. Membrana basal (MB) As clulas do endotlio capilar cerebral sintetizam um conjunto de substncias que originam a membrana basal
[11]
. Esta membrana, de estrutura trilamelar, assume uma
funo de barreira selectiva e suporte fsico, acrescentando-se agora um papel na regulao biolgica das clulas (multiplicao, diferenciao, migrao, reparao e desenvolvimento celular e tecidular)
[18]
. O facto de apresentar carga negativa confere-lhe ainda outra
propriedade, que resulta na capacidade de intervir na filtrao de protenas aninicas. Os principais componentes desta membrana so colagnio tipo IV, laminina e proteoglicanos
[11]
, no entanto, investigaes recentes mostraram que, na realidade, a MB
apresenta uma composio macromolecular bem mais complexa do que aparentava.

Fig.8 Membrana Basal
14
O colagnio, componente principal da MB, assume o papel de esqueleto da membrana e localiza-se numa zona designada por lmina dura (local de fuso da MB com a membrana das clulas endoteliais e gliais). A laminina e os proteoglicanos, por sua vez, esto presentes numa zona designada por lmina rara interna, ao nvel do endotlio, e externa, junto glia. A ligao entre a MB e as clulas que a rodeiam, sejam as clulas endoteliais ou outras, feita por uma protena transmembranar especfica, a integrina
[11]
, um heterodmero
(subunidade e subunidade ) que apresenta 22 isotipos devido s combinaes possveis entre as 16 subunidades e as 8 subunidades que se conhecem. Esta protena actua como um receptor mecnico que transmite uma fora de tenso entre a matriz extracelular e o citosqueleto. No entanto, no , por si s, responsvel por esta ligao estrutural, j que durante a ligao MB, a integrina sofre uma agregao com recrutamento de protenas citoplasmticas, as quais apresentam por sua vez locais de fixao para as molculas do citosqueleto e para a ancoragem dos complexos proteicos aos filamentos de actina
[36] [23] [24]
. Estudos realizados sugerem que, quando alterada a composio da membrana,
nomeadamente atravs da degradao do colagnio tipo IV pela mealoprotease MMP-2 ou por estimulao das colagenases, h um aumento da permeabilidade vascular ou mesmo abertura da barreira [11].
15
Desenvolvimento: do embrio ao ser adulto
Com o desenvolvimento cerebral, que ocorre bastante cedo durante a gestao, a BHE no surge completamente formada. No nascimento a barreira apresenta-se ainda dbil nas funes que lhe esto atribudas, pelo que necessrio que o endotlio continue a especializar-se at adquirir todas as propriedades estruturais e bioqumicas que tornem a barreira madura e perfeitamente funcional. A cronologia dos acontecimentos que levam ao aparecimento da barreira varivel interespcies e, por vezes, surgem divergncias at mesmo dentro da mesma espcie [37]. Actualmente, e a a noo
[3]
cronolgica
[11] [19] [23]
que
[37]
prevalece pe lado a lado a maturao da BHE neovascularizao instantneo, (angiognese) e refere ainda que este processo no mas sim gradual, prolongando-se para alm do nascimento. O processo de vascularizao cerebral comea num plexo perineural pr-existente, a partir do qual as clulas endoteliais invadem a ectoderme neural e, por fuso e ramificao, estabelecem o primeiro sistema vascular no neocrtex. Este sistema vascular ainda muito
Fig.9 Neovascularizao / Angiognese
primitivo e apresenta fenestraes ao nvel do
endotlio, no entanto, j se verificam algumas caractersticas que sugerem a evoluo que se seguir, nomeadamente a ligao, por junes, entre as clulas endoteliais [37]. A gliognese tem um incio mais tardio no desenvolvimento embrionrio e apenas numa fase ps-natal se verifica a predominncia das clulas gliais face populao celular cerebral [37].
16
Propriedades: permeabilidade paracelular e polarizao celular
A permeabilidade paracelular
[15]
[11]
da barreira regulada por modificaes da
arquitectura do citosqueleto, por modificaes ps-traducionais das protenas juncionais e por degradao proteoltica dos constituintes das junes. Os estmulos que modulam a organizao e a coeso das junes no esto ainda totalmente esclarecidos, mas podero ser, alm do contacto directo entre as clulas, agonistas que actuam nos receptores membranares (por exemplo, as citosinas) ou uma modificao no equilbrio do ambiente fisiolgico das clulas (alterao da carga energtica ou do sistema redox, por exemplo). O complexo de fuso paracelular que constitui as JAs regulado por um conjunto de segundos mensageiros, molculas com funes muito especficas, nomeadamente Ca2+, AMPc, fosfolipase C, cinase A, cinase C e protena G. Da presena de Ca2+
[21] [1] [11] [16]
depende a intereco homotpica das molculas de
caderina e dos elementos da zona de aderncia (clcio extracelular), bem como tambm est dependente dele o aumento da resistncia elctrica transcelular (neste caso, clcio intracelular). O aumento da concentrao intracelular de AMPc
[21] [11]
, por sua vez, promove a
activao da protena cinase A, tornando o endotlo mais impermevel. Este aumento de concentrao resultado da presena de anlogos do AMPc, de substncias estimulantes da sua sntese (como a fosfocolina) ou de inibidores do seu metabolismo (como os inibidores das fosfodiesterases). Quanto cinase A
[21] [11]
, ela pode fosforilar protenas directamente implicadas na

[11]
estabilizao das junes e no controlo da fora de adeso celular. Um bom exemplo deste ltimo ponto a GTPase Rho A , uma protena que actua como um interruptor celular, alternando entre a forma activa, trifosfatada, e a inactiva, difosfatada, e que tem implicaes ao nvel da fosforilao da cadeia leve de miosina, alterando a organizao dos filamentos de actina[23] [24] [36] do citosqueleto. Existem, ento, diversas molculas capazes de inibir as cinases A, aumentando a impermeabilidade da barreira (os inibidores da dissociao do complexo Rho-GDP so exemplo), ou capazes de activar cinases A, diminuindo, por seu lado, a impermeabilidade da barreira (como o caso da trombina e do cido lisofosfatdico). No caso da trombina, esta apresenta ainda a capacidade de activar as metaloprotenas da matriz celular, surgindo aqui implicaes na degradao da MB das CEs [11].
17
O papel da BHE vai alm do controlo da permeabilidade paracelular, extensamente supracitada, sendo tambm fundamental referenciar a sua regulao ao nvel da polarizao celular
[11] [18]
, que consiste na distribuio assimtrica dos constituintes da membrana entre
as suas duas faces. Ao nvel da face apical (ou luminal) predomina a fosfatidilcolina e na face basolateral (ou abluminal) maioritria a presena de esfingomielina e de glucosilceramida. Algumas protenas implicadas na angiognese (VEGF-R e metaloproteinase membranar tipo I) esto especialmente orientadas para a face basolateral. E a GLUT-1, um transportador membranar, encontra-se cerca de trs vezes mais presente na face apical que na face basolateral. A polarizao encontra-se favorecida nas clulas endoteliais cerebrais, o que limita a difuso de lpidos pelas membranas nas regies apical e basolateral. Por outro lado, permite assegurar o transporte de algumas substncias e a realizao orientada de algumas reaces bioqumicas que ocorrem ao nvel das membranas endoteliais. Por vezes, uma alterao de polarizao pode ser suficiente para levar desregulao do funcionamento da barreira, mesmo sem alterao da permeabilidade desta. A alterao da polarizao est associada a um risco aumentado de acidente vascular cerebral (AVC) ou predisposio de ruptura da barreira durante um episdio de AVC. Mendel et al., em 1993, demonstrou a independncia entre estes dois mecanismos [11]. A diminuio do clcio extracelular provoca a dissociao das junes e uma redistribuio dos lpidos na membrana basolateral, sem alterar a permeabilidade basolateral. J a diminuio do ATPc intracelular provoca um aumento da permeabilidade celular, sem recolocao dos lpidos, ou seja, sem alterar a polarizao. Mendel chegou tambm concluso de que a ocludina estava implicada apenas na limitao da difuso lateral [11].
18
Papel dos Astrcitos, Percitos e outras clulas na diferenciao da BHE
A BHE encontra-se em estreita associao com outras clulas, nomeadamente os astrcitos e os percitos, e parece ser desta associao que resulta, em parte, a diferenciao que as clulas endoteliais cerebrais sofrem e que no se verifica em mais nenhum outro local do organismo. Das experincias largas que tm sido realizadas com a finalidade de perceber como e porqu o endotlio assume estas caractersticas, chegou-se a um ponto que parece ser comum a todas e que mostra que as clulas gliais, os neurnios e, consequentemente, o meio ambiente que envolve as clulas endoteliais so os responsveis por essa diferenciao e especializao. E porqu referir-se o meio ambiente que envolve todas as clulas que fazem parte ou, de alguma forma, esto associadas BHE? Porque, segundo diversos autores
[1] [3] [16] [18] [19] [20] [23] [33] [30]
, as clulas comunicam entre si, no s
directamente por contacto fsico (possvel devido proximidade entre os diversos tipos celulares), mas possivelmente tambm atravs de mediadores sintetizados pelas vrias clulas e que se movimentam ao longo dos espaos intercelulares do parnquima neuronal. Todo o processo de diferenciao do endotlio est ainda sob uma srie de dvidas e envolvido num conjunto de meras hipteses, plausveis, mas que no parecem ainda explicar tudo como realmente acontece. No entanto, parece j obvio que molculas de superfcie membranares e factores solveis (funcionando como segundos mensageiros) esto por detrs dessa diferenciao. Astrcitos Os astrcitos, com os seus ps
terminais, prolongamentos que estas clulas em forma de estrela apresentam

[21] [2] [1] [3] [11] [19]
, envolvem mais de 90% da superfcie

[20]
dos capilares endoteliais
e conseguem,
ao mesmo tempo estar perto do neurnios situados no parnquima cerebral, da que sejam considerados como um candidato natural para a comunio que deve ocorrer entre neurnios e endotlio. Diversos estudos in vitro e in vivo
Fig.10 Astrcitos
[1] [18]
realizados sugerem o importante papel dos astrcitos na maturao da BHE
. Culturas
19
celulares onde se favorece o contacto entre endotlio e astrcitos mostram que h um aumento da formao de junes apertadas na membrana das clulas endoteliais. Tambm a utilizao de um meio de cultura condicionado por astrcitos, mas sem a presena fsica destas clulas, permitiu induzir resistncia elctrica transendotelial mais elevada (um aumento de AMPc numa cultura endotelial na presena de um meio condicionado aumenta em cerca de seis vezes a resistncia transendotelial das junes apertadas). E ainda, a utilizao de inibidores da sntese proteca ou a tripsilina previnem a actividade indutora dos astrcitos face barreira, sugerindo o envolvimento de protenas ou pptidos nesse processo. Com base nos resultados referidos e em muitos outros, pressupe-se que a induo pode ficar a deve-se ao contacto directo com astrcitos ou a algum agente solvel por eles sintetizado. realidade que existem alguns estudos, nomeadamente estudos in vivo, que parecem contrariar o papel activo dos astrcitos na aquisio e manuteno das funes da BHE, no entanto, no parecem abalar os resultados favorveis a esta hiptese, deixando apenas a referncia que h ainda muito por explicar [11]. No que respeita induo directa exercida pelos astrcitos, estudos revelam que clulas astrogliais e endoteliais em co-cultura produzem alteraes do foro lipdico no endotlio. Quanto induo indirecta, esto identificadas vrias substncias sintetizadas pelos astrcitos que actuam como agentes moduladores da BHE. O factor de crescimento dos fibroblastos (FGF) responsvel pela diminuio da permeabilidade da BHE; um dfice de FGF-2 e de FGF-5 em animais mutantes levou a uma reduo dos nveis de protenas das junes (ocludina e ZO-1) e, consequentemente, a uma perda de funcionalidade da barreira. J o factor de crescimento de transformao (TGF- ) actua como um mediador na regulao de protenas do endotlio. Finalmente, o substracto da cinase SseC (SSeCKS) favorece a expresso astrocitria de angiopoietina-1 e, logo, a estimulao da sua secreo, o que leva a um aumento da expresso de protenas das JAs e consequente reduo da permeabilidade da barreira. Os astrcito tm um papel importante na defesa contra agentes agressores. Estas clulas gliais induzem a expresso de protenas antioxidantes, como o caso da glicoprotena-P
[39] [18] [11]
que previne a entrada no crebro de xenobiticos O aumento dos marcadores de actividade

[4] [31] [8]
potencialmente neurotxicos. enzimtica associados BHE, a elevao dos nveis protecos dos transportadores de glucose
Fig.11 GLUT-4 (transporte de glucose)
20
(GLUT) e o aumento da resistncia elctrica transendotelial so algumas das funes atribudas aos astrcitos que esto j bastante bem documentadas. Percitos Outro tipo celular importante para a BHE e que pode ser encontrado intimamente ligado ao endotlio so os percitos
[3] [11] [16] [19] [20] [19] [23] [30] [2]
. O seu papel foi, durante anos,
subjogado para segundo plano por faltarem marcadores especficos de reconhecimento destas clulas. Tornava-se difcil o estudo pormenorizado e individualizado dos percitos sem uma base de identificao e seleco das clulas. Os percitos localizam-se na face abluminal do endotlio cerebral e apresentam-se em muito maior nmero no crebro do que na restante rede capilar do organismo [20]. Este
Fig.12 Percitos
tipo
de da
clulas intervm no desenvolvimento
rede capilar cerebral, bem como nos mecanismos de permeabilidade selectiva da barreira (por estabilizao das JAs), factos que foram surgindo medida que a sua ultraestrutura foi sendo desvendada. A angiognese
[3] [11]
, ou neovascularizao, complexa e fundamental desde os
primeiros passos do desenvolvimento cerebral embrionrio. Este processo necessita de uma diferenciao inicial de angioblastos num plexo vascular, seguida da germinao de novas clulas endoteliais, de forma contnua, a partir dos vasos de origem. A neovascularizao cerebral est dependente da sntese de um factor de crescimento endotelial (VEGF) e da presena de receptores do tipo 1 e 2 do VEGF (VEGF-R1 e VEGF-R2) nas clulas endoteliais. Durante o desenvolvimento embrionrio, os vasos neosintetizados so mais numerosos do que o necessrio, pelo que h uma reduo do nmero de vasos medida que a expresso do VEGF vai diminuindo
[20]
. Alm disso, ao longo da maturao, as clulas
endoteliais vo adquirindo, para sobreviverem, alguma independncia face ao factor de crescimento, situao essa que coincide com a interaco com os percitos que so capazes de inibir a proliferao do endotlio por inibio de contacto (atravs da produo do factor de crescimento tumoral tipo (TGF- ). A comunicao entre percitos e endotlio, facilitada por junes lacunares, parece ser conduzida por um segundo mensageiro secretado pelas clulas endoteliais, a endotelina-1.
21
Surge assim um outro aspecto importante, j que se pensa ser esta molcula a responsvel pelo recrutamento dos percitos para junto do endotlio durante a angiognese, bem como pela estimulao da produo de novos percitos. A importncia desta condio fundamental, j que sugere um papel de autoregulao, por feed-back negativo, do endotlio face ao seu prprio crescimento. A razo percitos/clulas endoteliais, bem como a rea de superfcie de contacto entre os dois tipos de clulas, aumenta com o grau de impermeabilidade dos tecidos: por ordem decrescente de impermeabilidade surge a retina > crebro > pulmo > msculo esqueltico. Estudos in vitro realizados recorrendo a uma cultura celular endotelial posta em contacto com um meio contendo percitos mostram que a difuso de substncias como o dextrano diminui. Esta capacidade de impermeabilizao dos percitos parece ser causada por substncias reguladoras de curta semi-vida, como NO ou prostaglandina, cuja origem no est ainda totalmente esclarecida e cujo mecanismo de aco parece estar ligado sntese de segundos mensageiros como o AMPc ou o GMPc. Os percitos contribuem para a formao da MB com colagnio, laminina e proteoglicano. E actuam, ainda, como primeira linha de defesa nas rupturas da BHE devido sua capacidade de fagocitar molculas de elevado peso molecular que podem atravessar a barreira nestas situaes. So clulas fagocitrias exclusivamente do tipo granular, no que diz respeito ao ser humano, apresentando inmeros lisossomas, cujo nmero pode aumentar com a abertura hiperosmtica da BHE. Neurnios O papel dos neurnios no que diz respeito BHE tem sido ignorado, ao contrrio do que sucede com as restantes acham clulas presentes no crebro. Alguns autores improvvel que os neurnios estejam implicados na induo da barreira ou mesmo na excluso de molculas durante as primeiras etapas da vascularizao cerebral. No entanto, a neurognese antecede a gliognese, com excepo das clulas astrocitrias radiais, o que sugere a possibilidade de um papel importante, pelo menos numa fase mais precoce, na morfologia, diferenciao e proliferao das clulas cerebrais, incluindo os prprios astrcitos [11].
Fig.13 Neurnio
22
Algumas experincas tm mostrado isso mesmo: a comparao de co-culturas de clulas endoteliais com neurnios ou astrcitos tm mostrado que, no primeiro caso, os nveis de GGT (enzima implicada no transporte de aminocidos atravs da membrana) so mais elevados; e a induo do mensageiro da ocludina (protena fundamental das JAs) pelo colagnio do endotlio no acontece sem a presena dos neurnios.
Fig.14 Neurnios
23
Transporte ao longo da Barreira Hematoenceflica

Tipos de transporte natural
A barreira surge como forma de manter o ambiente neuronal estvel e controlado. No entanto, fundamental que chegue aos tecidos cerebrais um vasto grupo de molculas que no podem ser produzidas ou pelo menos no nas quantidades que seriam necessrias. Assim, a BHE est apta a fazer o transporte de vrias substncias necessria. De forma natural e em condies de normal funcionamento da barreira, do-se vrios tipos de transporte, nomeadamente: migrao celular, difuso passiva, influxo e efluxo mediado por transportadores, transcitose mediada por receptor, transcitose mediada por absoro e transporte por modulao das JAs. O esquema que se segue exemplifica alguns dos tipos de transporte referidos.
[6] [22] [32] [35] [40]
segundo
diversos mecanismos, dependendo do tipo de molcula e da quantidade de aporte
Fig.B Mecanismos de transporte atravs da BHE
A migrao celular consiste na movimentao dos leuccitos atravs da barreira. A difuso passiva resulta na simples travessia de algumas molculas com lipossolubilidade elevada que, por esse motivo, conseguem movimentar-se atravs das membranas passivamente. Por sua vez, o influxo mediado por transportadores permite, atravs de complexos protecos, fazer chegar ao SNC molculas polares ou pouco lipoflicas que de outra forma no conseguiriam atravessar a barreira e que so fundamentais, como alguns
nutrientes e outros metabolitos. J o efluxo mediado por transportadores, como o prprio nome indica, um fenmeno semelhante ao anterior, mas em sentido inverso, e de extrema importncia, pois permite expelir do SNC um grande nmero e variedade de molculas que, devido s suas propriedades lipoflicas chegam facilmente ao crebro, mas que no so necessrias em quantidades to elevadas ou so mesmo txicas para os tecidos neuronais; este sistema permite manter abaixo do que seria de esperar a penetrao de muitas molculas indesejveis. Relativamente transcitose mediada por receptor, este mecanismo transporta macromolculas como protenas e pptidos necessrios ao bom funcionamento cerebral, mas que de outra forma, devido s suas dimenses elevadas, no conseguem atravessar a barreira. Semelhante a este, surge ainda outro mecanismo de transporte de molculas de elevado peso molecular, a transcitose mediada por absoro, cuja particularidade est no facto destas molculas apresentarem carga elctrica negativa (molculas catinicas induzem este tipo de transporte). Finalmente, o ltimo tipo de transporte resulta de uma modulao das JAs, visto permitir, em situaes muito particulares e para molculas especficas, o movimento de solutos polares atravs da via aquosa paracelular.
25
Transporte de acares, aminocidos, protenas, lpidos e gua
Acares A glucose
[27] [33] [4] [31] [8]
a principal fonte de energia cerebral. A rapidez com que
penetra os tecidos cerebrais depende da sua concentrao no sangue e o rpido metabolismo central que sofre permite manter um gradiente osmtico suficiente (mesmo em situaes de hipoglicmia) sem que seja necessrio um transportador activo. O transporte
[11]
feito por difuso facilitada atravs de uma protena, constituda por
doze regies transmembranares, que pertence a uma famlia com sete membros. Alm disso, trata-se de um transporte estereotpico, selectivo para a D-glucose (o ismero L no consegue atravessar a barreira). Os principais transportadores dos acares so o GLUT-1, principalmente localizado ao nvel do endotlio e dos astrcitos, e o GLUT-3, exclusivo dos neurnios. Nos astrcitos, o GLUT-1 encontra-se em maior nmero nos ps terminais em contacto com o endotlio e as sinapses, o que sugere que a astroglia tem um papel de intermedirio na distribuio da glucose at aos rgos efectores. Alm da D-glucose, tambm responsvel pelo transporte dos ismeros dextrgiros da manose, xilose e galactose. Este transportador foi includo no conjunto de protenas de stress reguladas pelos nveis de glucose, pois encontra-se aumentado em situaes de hipoglicemia [11]. Aminocidos At data, nove transportadores de aminocidos so conhecidos no que diz respeito ao endotlio cerebral [11]. Os sistemas de transporte independentes do Na+ (antiport), nomeadamente o sistema L e o sistema y+, permitem a passagem simultnea de aminocidos em ambos os sentidos e esto presentes nas duas faces da membrana endotelial, luminal e abluminal. O sistema L transporta aminocidos neutros (leucina, fenilalanina, triptofano, treonina, isoleucina, metionina e valina, por exemplo), enquanto o (como a lisina, arginina e ornitina).
Fig.15 Antiport
sistema y+ permite o transporte de aminocidos com um grupo catinico na cadeia lateral
26
Por sua vez, o sistema de transporte dependente de Na+ (simport) como o caso do sistema A, co-transportador que se encontra apenas na face abluminal do endotlio e que, graas ao transporte electrognico de Na+, permite extrair do espao cido extracelular cerebral pequenos cuja aminocidos neutros, como a glicina ou o -aminobutrico deve (GABA), ser
Fig.16 Simport
concentrao
extritamente
controlada devido sua funo de neurotransmissores inibitrios. Qualquer um dos sistemas pode transportar diferentes aminocidos, no entanto, numa situao de concentrao elevada de um deles, h competio para os receptores mais especficos para o que estiver em maior nmero e, assim, ser transportado primeiro. Isto torna o crebro muito vulnervel em situaes de desequilbrio de aminocidos [11]. Protenas As molculas protecas so transportadas, ou por endocitose ou por transcitose. Este ltimo mtodo no mais do que um fenmeno de endocitose no qual as protenas se ligam face luminal da membrana (atravs de um receptor especfico ou por interaco electrosttica), so internalisadas e transferidas graas a um trnsito vectorial de vesculas de pinocitose e so libertadas quando atingem a face abluminal da membrana.
Fig.17 Protenas
A verdade que a grande maioria das protenas e pptidos no
atravessam a barreira, impermeabilidade que se explica, como j foi referido anteriormente, pelo reduzido nmero de vesculas de pinocitose presentes no endotlio cerebral [11]. Lpidos Os cidos gordos, devido sua natureza lipoflica, tm a capacidade de atravessar a barreira sem ajuda e rapidamente difundir-se pelos tecidos cerebrais. Geralmente, quando em circulao, os cidos gordos esto associados albumina, ficando somente cerca de 5% destes livres para atravessar, duma vez, a membrana endotelial cerebral [11].
27
gua O controlo do movimento de gua e do volume celular de uma importncia vital, caso contrrio surge o edema que, por impedimento de expanso dos tecidos devido rigidez craneana, pode ser fatal. A gua atravessa a barreira de acordo com os princpios fsicos da osmolaridade. O transporte membranar assegurado por canais aquosos da famlia das aquaporinas (AQP). Estes canais so protenas monomricas transmembranares e pertencem a uma famlia de onze membros conhecidos, dos quais seis se encontram no crebro. No foi possvel demonstrar a presena de AQPs no endotlio central, no entanto, uma delas, a AQP-4, foi posta em evidncia nos astrcitos ao nvel dos seus ps terminais e das fendas sinpticas e a sua importncia na regulao dos volumes celulares e tecidulares foi demonstrada em estudos in vivo. A aparente ausncia destes canais nas clulas endoteliais no permite associar a evacuao de gua pela membrana da BHE, sugerindo que sejam as junes paracelulares as responsveis pela permeabilidade aquosa que, por vezes, se associa barreira [11].
28

Estratgias para facilitar o transporte molecular
O transporte de molculas atravz da BHE ocorre, como foi extensamente descrito, segundo uma srie de sistemas ou simplesmente por difuso devido s propriedades dos prprios solutos. No entanto, devido a inmeras situaes patolgicas que afectam o SNC ou a disfunes da prpria barreira, surge, por vezes, necessidade de fazer entrar no crebro substncias que normalmente no conseguiriam a penetrar. Desta forma, tm sido exploradas diversas formas que permitam facilitar a entrada de diversas substncias nos tecidos cerebrais, especialmente no que diz respeito transposio da barreira. Alguns mtodos com essa finalidade so descritos de seguida. Lipidizao e outras manipulaes fisico-qumicas [6] [32] [40] Este processo baseia-se no pressuposto de que a penetrao passiva da barreira por molculas aumenta linearmente com a lipofilia. Sempre que esta regra no se verifica, a razo atribuda a transportadores que aumentam o influxo de substncias que no deveriam passar a barreira ou aumentam o efluxo das que deveriam atravess-la. Esses transportadores so, por exemplo, a glicoprotena P (PgP), a protena relacionada com o cncro da mama (BCRP) ou as protenas de resistncia a mltiplos frmacos (MRPs). Assim, a manipulao qumica e fsica das molculas pode favorecer, sem alterar a sua funo, a entrada no SNC. Pr-frmacos e Sistemas de transporte qumicos [6] [40] Uma boa abordagem consiste em modificar as molculas para as tornar mais favorveis passagem pela BHE. Um exemplo disto so as molculas de morfina, codena e herona (a ltima apresenta a melhor taxa de penetrao no SNC, sendo que estruturalmente so todas muito semelhantes). A tcnica de ndice de uptake cerebral de Oldendorf mostra que a simples metilao ou acetilao estratgica numa destas molculas melhora muito a sua penetrao cerebral. Posteriormente passagem pela barreira, estas molculas actuam como pr-frmacos: o caso da herona, que metabolizada a morfina e esta, sim, actua sobre o receptor opiide. Alm disso a molcula de morfina fica presa no meio cerebral por, j metabolizada, no conseguir voltar a transpor a barreira no sentido inverso; este princpio de aprisionamento
Fig.18 Anlise
ps-metabolizao de pr-frmacos a principal caracterstica desta abordagem para fazer chegar diversas substncias ao SNC e mant-las l o tempo necessrio para exercerem a sua funo. Bodor e Buckwald estimaram que cerca de 5% dos frmacos comercializados podero actuar como pr-frmacos, mesmo que no tenham sido designados como tal. Desta forma, o metabolismo perifrico minimizado. Outra abordagem consiste na utilizao de um vector ao qual se liga o frmaco para facilitar a entrada no crebro. Aps a quebra da ligao (que deve ser do tipo ster, facilmente quebrada aps penetrao), o frmaco no consegue voltar a sair e est em condies para exercer a sua funo. Injeco/Infuso intracerebral [6] possvel evitar a BHE atravs de um injeco de frmaco directamente no crebro, intraventricular ou intratecal, no espao subaracnoideu. Pode administrar-se uma soluo ou um implante slido para uma libertao prolongada. No entanto, esta abordagem tem alguns inconvenientes. A administrao pode, dependendo da rapidez, danificar a zona onde feita e mesmo as zonas envolventes, devido presso exercda pelo volume que ocupa. Tambm acontece que devido ao fluxo de fluidos entre o espao extracelular, o sistema ventricular e o espao subaracnoideu, qualquer frmaco introduzido no crebro apresenta uma semi-vida muito curta. Contudo, neste ltimo caso, a situao pode ser usada como uma vantagem face ao local onde se pretende que o frmaco actue, se forem conhecidas as vias e direces que os fluidos extracelulares seguem. Rota olfativa [6] Os neurnios olfativos penetram na placa cribiforme e as suas terminaes sensitivas acabam na mucosa nasal. Eles so nicos, pois tm a capacidade de se regenerar, devendo esta propriedade estar relacionada com a grande exposio que estas clulas apresentam face ao meio exterior, to pouco comum no que diz respeito populao celular
Fig.19 Nervo olfativo
30
neuronal. Ao nvel da placa cribiforme, uma parte da membrana aracnide envolve estes neurnios e o lquido subaracnoideu drena para o exterior do crebro, para os vasos linfticos, a maior parte do fluido cerebrospinal (FCS) e, consequentemente, todas as substncias que a se encontram. Contudo, uma pequena poro do FCS parece retornar para o espao subaracnoideu e, com ele, algumas substncias provenientes da mucosa olfativa, como acontece com a cefalexina, as sulfonamidas, a zidovudina, a insulina e a hialuronidase. Diversos estudos mostram que esta via facilitada para solutos lipoflicos, o que sugere que em algum ponto da rota olfativa ocorra um transporte de fase lipdica. Foi tambm detectado que molculas de peso molecular entre 20 kDa e 40 kDa (estudo realizado com dextranos) esto excludas desta via. Uma outra tentativa de explicar o rpido acesso atravs da via olfativa sugere que o transporte ocorra atravs do epitlio olfativo, o que envolve uma internalizao pelos neurnios olfativos e um transporte axonal retrgrado. No entanto, esta abordagem no aprece ser vivel, pois a chegada das substncias bem mais rpida do que esta via permitiria. Um exemplo da chamada rota olfativa a cocana snifada. Modulao da BHE [6] A abertura osmtica da barreira com uma soluo hipertnica de manitol a 25% um procedimento bastante comum; administra-se a uma taxa de 4-8 ml/segundo durante 30 segundos,conseguindo-se que a BHE se mantenha aberta por um perodo de 30 minutos. O mecanismo desta abertura da barreira parece ser a perda de gua das clulas que encolhem, provocando uma desagregao das protenas das junes paracelulares. Assim, a abertura osmtica parece facilitar a passagem paracelular, tanto para molculas de pequenas dimenses como maiores (vrus, por exemplo). Quando a barreira aberta por esta via, a passagem de substncias no nada selectiva, levando a que cheguem ao meio neuronal molculas como albumina ou neurotransmissores excitatrios que circulam no sangue, o que pode se bastante desvantajoso. Na tentativa de melhorar a selectividade, usaram-se anlogos da bradicinina (liga-se ao receptor B2 da superfcie luminal endotelial) que parecem conseguir modular as JAs por aumento do Ca2+ intracelular; um exemplo de um anlogo o RMP-7. Contudo, os resultados observados com estes anlogos no mostraram um aumento to significativo como seria de esperar.
31
Ainda falta referir um ponto importante, as frequncias de rdio, cuja absoro pelos tecidos, nomeadamente pela BHE, promove uma elevao da temperatura local e, assim, um aumento da permeabilidade por alterao das funes da barreira. Os resultados das investigaes esto ainda pouco maduros, sendo este um assunto ainda controverso.
Fig.20 Microondas, Ondas de Rdio e Ultrasons
A traco por estes mtodos (ultrasons, ondas de rdio, microondas) deve-se possibilidade de provocar a abertura da barreira em locais especficos e no globalmente, o que pode ser bastante vantajoso. Transportadores endgenos [6] A BHE apresenta, como foi j largamente abordado, grande nmero de transportadores endgenos, a maioria para solutos polares. A sua expresso vectorial permite optimizar o transporte para o crebro; os frmacos podem ser considerados pseudosubstractos e passar, assim, a barreira. O uso de transportadores endgenos pode ser extensvel a pptidos e protenas que usem a via endoctica, atravs da sua ligao a um anticorpo monoclonal, formando um vector que ir, ento, ser transportado. Como feito o transporte e a libertao da molcula no SNC ainda pouco claro. Inibio dos mecanismos de efluxo (transportadores ABC) [6] [32] Existem, na BHE, mecanismos de efluxo activo dependentes de ATP (transportadores ABC), que removem substncias que acedem ao SNC e que, no sendo necessrias ou podendo mesmo ser txicas, o crebro tem o cuidado de expulsar. Geralmente, estas substncias apresentam ptima lipofilia, pequena rea de superfcie polar e anis aromticos, caractersticas essas que as tornam ptimos candidatos para o
Fig.21 Estrutura de um transportador ABC
efluxo. Exemplos deste tipo de transportadores so a PgP, BCRB, MRP-1 e MRP-2.
32
Surge, assim, na tentativa de aumentar o uptake de certas molculas para o crebro, a necessidade de utilizar inibidores dos transportadores de efluxo. Estes podem actuar segundo mecanismos competitivos ou no competitivos. Vectores peptdicos de penetrao celular [6] Os vectores so uma boa aposta para fazer chegar ao crebro substncias fracamente penetrantes. Estas estruturas so pptidos de origem natural ou sinttica que atravessam a membrana celular com facilidade, sem requerer endocitose. Apresentam uma estrutura de hlice- anfiptica e tm trs domnios hidrofbicos alternados carregados positivamente (resultado da expresso de sequncias repetidas de aminocidos), no apresentam ligaes dissulfito e ainda tm a capacidade de se ligar a ismeros dextrgiros de aminocidos que, ao serem incorporados, aumentam o tempo de circulao no sangue por diminuio da susceptibilidade s peptidases circulantes e tecidudares. Dois exemplos desses pptidos so o Syn B1 e a Penetratina. Lipossomas e Nanopartculas [6] [25] Os lipossomas e as nanopartculas so construes complexas onde se podem acomodar grandes quantidades de frmacos, pptidos ou enzimas. A sua superfcie pode ser desenhada com a finalidade do complexo ser direccionado especficos. Imunolipossomas peguilados tm sido utilizados com sucesso no direccionamento de luciferase e galactosidade para o crebro. E imunolipossomas semelhantes, usando um receptor de transferrina OX26, tm conseguido fornecer digoxina ao SNC. Nanopartculas de polibutilcianoacrilato (PBCA) tiveram resultados positivos ao fazer chegar aos tecidos cerebrais um grande nmero de substncias, como
Fig.22 Lipossoma
para
crebro
por
mecanismos
so
exemplo e
dalargina, Neste
loperamida, caso, a
tubocurarina
doxorrubicina.
incorporao pode ser feita na estrutura da nanopartcula ou por absoro sua superfcie. As vantagens destes mtodos consistem principalmente na possibilidade de se construir um complexo de forma a ser direccionado para um local especfico, a poder transportar
33
molculas de peso molecular elevado e de conseguir fornecer grandes quantidades de substncia.
Fig.23 Nanopartcula
34
Patologias
O sistema nervoso central afectado por um grande nmero de doenas que, por este se tratar do principal rgo do organismo, so muitas vezes incapacitantes ou mesmo fatais para o Homem. Neste mbito, importante ter-se presente a variedade de doenas que afectam o SNC
[3] [9] [11] [15] [19] [10]
, como se pode ver de seguida:

Ataque Vascular Cerebral (AVC) Ataxia Herdada Doena de Alzheimer Doenas de Armazenamento Lisossomal Doena de Canavan Doena de Creutzfeldt.Jacob Doena de Parkinson Erros metablicos pr-natais Esclerose em Placas Esclerose Lateral Amiotrfica Esclerose Mltipla Huntingdons Chorea SIDA neurolgica Sndrome do X Frgil Trauma Cerebral Tumor Cerebral
Muitas vezes, as patologias neurolgicas devem-se a uma grande falha teraputica associada dificuldade de fazer chegar aos tecidos cerebrais os frmacos que poderiam tratar ou pelo menos reduzir a progresso das doenas, sendo esta uma consequncia directa da presena da BHE. , por isso, fundamental continuar a progredir na investigao de novos recursos teraputicos e na malhor forma de os fazer chegar aos locais onde podem desempenhar a sua funo a tempo e horas de evitar danos maiores ou mesmo conseguindo a total recuperao.
Fig.24 Rede Vascular Cerebral
35
Farmacologia
Quando se fala em tratar as mais variadas patologias associadas ao SNC, surge, quase de imediato, a noo de que o primeiro ponto crtico , sem dvida, conseguir transpor a BHE [6]. E isso consegue-se, com sucesso, recorrendo a: Solues hipertnicas de manitol e arabinose (infuso intracarotdica) Pptidos quimricos No entanto, alm da penetrao dificultada, outros dois pontos crticos surgem pela frente. O primeiro faz, de certa forma, referncia a uma propriedade do crebro que tem sido substimada, a sua elevada capacidade metablica, e que leva a uma difcil acumulao de frmacos no parnquima cerebral
[6] [11]
(que j
conhecido como uma segunda barreira penetrao de solutos), atravs de mecanismos que, por um lado, degradam as molculas de frmaco atravs de
Fig.25 Pptido quimrico
complexos enzimticos de defesa; por outro, difundem passivamente os frmacos para o fluido cerebrospinal (cuja taxa de renovao elevada, rondando os 360 a 880 l/g de tecido) e, de seguida, para o sistema linftico, reduzindo bastante o tempo de semi-vida dos solutos; ou, ainda, rejeitam as substncias medicamentosas por via de transportadores membranares. Quanto ao segundo ponto crtico, fala-se de agentes que interferem com a protena PgP
[6] [11] [39]
(transportador ABC, que tem como funo o efluxo de substncias do meio
cerebral), permitindo assim prolongar o tempo de permanncia dos frmacos no crebro. As caractersticas bioqumicas que dificultam o acesso aos tecidos cerebrais podem resumir-se, de certa forma, elevada polarizao com superfcie polar superior a 8 nm2, elevada fora de ligao de Lewis, grande capacidade de ligao ao Hidrognio e presena de ligaes rotativas ou de estruturas muito ramificadas. ainda importante que sejam neutras a pH fisiolgico, pois apenas esta poro que pode atravessar a barreira. A maioria dos frmacos que presentemente so usadas para tratar doenas cerebrais apresentam um peso molecular entre 150 e 500 kDa e um coeficiente de partio (octanol/gua) entre -0.5 e 6.0 [7].
36
Papel dos astrcitos quando a integridade da BHE posta em causa
Diversas condies patolgicas podem estar na origem de leses na BHE, como as doenas degenerativas, glioblastoma, processos inflamatrios ou desordens de carcter psicolgico. Uma forma de detectar se a integridade da barreira foi posta em causa consiste na deteco sangunea de um conjunto de protenas especficas do fludo cerebrospinal. Alguns exemplos destes marcadores da intregridade da BHE so as protenas S100, NSE, GFAP e TTR [13] [27]. Quando os tecidos cerebrais esto em hipxia
[3] [19] [36]
, os astrcitos reagem mais
rapidamente do que as clulas endoteliais ou os neurnios e conseguem, durante algum tempo, regular a capacidade glicoltica, permitindo que a gliclise anaerbia providencie ATP suficiente para a sobrevivncia cerebral, ou que o uptake de glutamato se mantenha, na tentativa de evitar danos profundos
[20]
. Nestas situaes, os astrcitos tomam a
designao de reactivos, constituindo uma proteco para o crebro devido sua capacidade antioxidante endgena e atravs da expresso de protenas ausentes em condies normais, como o caso da nestina (protena intermediria de filamento). Diversos estudos in vitro demonstram que, quando em co-cultura com clulas gliais, as clulas endoteliais apresentam melhor taxa de sobrevivncia face a situaes de hipxia (estruturas membranares protectoras contra a hiperpermeabilidade so mais rapidamente recuperadas nestes casos) [20].
Fig.C P terminal envolve capilar cerebral junto a um transportador
37
Imunovigilncia
Aps a evidncia de que veias linfticas cervicais contactavam com o tecido cerebral pelas glndulas linfides e que um pequeno nmero de linfcitos atravessava a BHE
[11]
, perdeu-se a ideia de que o
crebro era um rgo privilegiado no que concerne fonte da sua imunidade.

Fig.26 Linfcitos
Admite-se agora que, se um anticorpo estimular o sistema imunitrio, as clulas linfocitrias patrulham o
[11]
crebro procura do antignio responsvel
. O papel da barreira na apresentao do
antignio um assunto totalmente hipottico, pelo menos por enquanto. Apesar dos conhecimentos que se tem sobre as clulas leucocitrias e linfocitrias, ainda muito pouco se sabe sobre os mecanismos de diapedese. Durante a imunovigilncia, a transmisso dos linfcitos ocorre sem ruptura da BHE
[11]
, o que um verdadeiro enigma,
a menos que os lnfcitos sejam capazes regenerar protenas das JAs, nomeadamente a ocludina e a caderina. Se isto acontece ou no, no se sabe; o mecanismo de acesso das clulas imunitrias ao crebro est ainda por explicar. Uma hiptese refere que os linfcitos podero formar uma ligao com os constituintes dos complexos fusionais endoteliais durante a penetrao da barreira referido, ainda nada foi comprovado.
[11]
, mas como foi
38
Concluses
Historicamente, tem-se provado que a Barreira Hematoenceflica constitui um enorme impedimento entrada de substncias no Sistema Nervoso Central. No entanto, esta no mais considerada como uma entidade rgida, condio essa que foi vivel durante muito tempo. A multiplicidade de estratgias do crebro para permitir ou impedir o movimento de substncias atravs da barreira e as combinaes dessas abordagens permite-lhe manter um ambiente muito controlado. J a sua abertura, em situaes normais, extremamente selectiva, mas pode acontecer. As caractersticas da BHE so, em grande parte, responsveis pelas dificuldades de agir farmacologicamente sobre muitas doenas que afectam este rgo. Mais de 98% de todas as molculas potencialmente activas so incapazes de atravessar a barreira. Assim, na maioria das situaes, torna-se indispensvel a utilizao de mtodos auxiliares que ajudem os frmacos a penetrar no SNC. O sucesso de um plano teraputico passa especialmente por um melhor conhecimento dos mecanismos de transporte e de eliminao que ocorrem nos tecidos cerebrais. Perceber o funcionamento e a biologia molecular associada BHE tem aberto portas para uma srie de estratgias de transporte sem que haja comprometimento das estruturas envolvidas. Sabe-se hoje que o endotlio extremamente influenciado pelo meio que o rodeia, pelas clulas gliais e neuronais e pelo parnquima cerebral, pelos factores solveis que circulam nos fluidos cerebrais, pelo prprio sangue e substncias que o compem. Mas no deve ser esquecido que, de acordo com vrias opinies e estudos realizados, as clulas endoteliais tambm assumem um importante papel na modulao do ambiente que o rodeia, faltando ainda muitos dados que permitiro conhecer na perfeio todos estes processos de organizao, funcionamento e mesmo de co-regulao das estruturas celulares que compem o SNC.
Fig.27 Crebro
Sumariando mais de 20 anos de pesquisas sobre as mais diversas reas que envolvem o funcionamento do crebro, nem o papel exacto dos astrcitos na formao e manuteno
39
da BHE, nem os mecanismos celulares e moleculares de interaco entre o endotlio e o ambiente neuronal envolvente foram ainda totalmente elucidados. Principalmente dois motivos fazem com que devam continuar os esforos de pesquisa nesta rea: a necessidade urgente de agir sobre as doenas neurodegenerativas e a necessidade de influenciar a abertura da barreira em situaes patolgicas de ruptura (isqumia, tumores, doenas auto-imunes ou traumatismos) de modo a prevenir e tratar situaes de toxicidade neurolgica.
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Referncias Bibliogrficas
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th
Imagens (adaptadas)
Figura A
http://www.nature.com/nrn/journal/v7/n1/fig_tab/nrn1824_F4.html
Figura B
http://www.nature.com/nrn/journal/v7/n1/fig_tab/nrn1824_F3.html
Figura 1 Figura 2
http://carzuri.blogspot.com/2008/01/o-nosso-crebro.html http://oglobo.globo.com/blogs/moreira/post.asp?cod_Post=66655&a=88
Figura 3
http://www.nature.com/nrd/journal/v1/n2/fig_tab/nrd725_F1.html
Figura 4
http://www.mcg.edu/news/mcgtoday/Sum05/allied.htm
Figura 5
http://www.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2005/Ivermectin/images/blood%20brain%20barrier.gif
Figura 6
http://www.neurosci.ru/images/img_tight_junction.jpg
43
Figura 7
http://histoblog.viabloga.com/images/Ultrastructure_JS.jpg
Figura 8
http://www.upei.ca/pathclub/fig13.jpg
Figura 9
http://www.sistemanervoso.com/pagina.php?secao=11&materia_id=207&materiaver=1
Figura 10
http://www.hipocampo.org/images_art/astrocito.jpg http://neurophilosophy.files.wordpress.com/2006/10/copy-of-astro-gfap1.jpg http://img.tfd.com/dorland/thumbs/astrocyte.jpg
Figura 11
http://www.betacell.org/images/CMS/insulin-receptor-GLUT4_w500.jpg
Figura 12
http://www.udel.edu/biology/Wags/wagpage2/respages/retepage/semperi1.gif http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/icv/icv17.gif
Figura 13
http://www.sogab.com.br/floresdias/neuron2.gif
Figura 14
http://www.communicationcurrents.com/NCANewsletter/files/ccLibraryFiles/Filename/000000000028/neuron.jpg http://www.3dscience.com/img/Products/3D_Models/Biology/Cells/Neuron/supporting_images/3d_model_neuron_web1.jpg
Figura 15 e 16
http://paginas.terra.com.br/educacao/prof.regis/flamed/citologia.htm
Figura 17
http://www.geneticarchaeology.com/Images/Protein_DX.jpg http://ocw.mit.edu/NR/rdonlyres/Biology/7-343Fall-2004/A16CB8C0-69F7-49D4-B1E4-F016CE7D9928/0/chp_subtilisinbp.jpg http://www.dsimb.inserm.fr/~debrevern/PBs/images/protein_rasmol_02b.jpg
Figura 19
http://www.afh.bio.br/sentidos/img/nariz.gif
Figura 21
http://www.lbl.gov/Science-Articles/Archive/images3/abc-transporter.jpg
Figura 22
http://blog.scheeko.org/imagens/kinesin1.jpg http://media-2.web.britannica.com/eb-media/37/96837-004-AAC9A5BB.jpg
Figura 23
http://www.magnecell.com/images/Nanoparticle.jpg http://www.unicamp.br/unicamp/unicamp_hoje/ju/julho2005/fotosju294online/ju294-pag06.jpg
Figura 25
http://www.nature.com/nrd/journal/v1/n2/fig_tab/nrd725_F2.html http://pdbwiki.org/images/8/8f/1ihq.2.jpg
Figura 26
http://www.brasilescola.com/upload/e/imunidade.jpg
Figura 27
http://www.trutinadulcem.com/Brain/Brain300.jpg
44
Barreira hematoenceflica:
O que preciso saber em investigao neurotoxicolgica
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Reviso de Conjunto

Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa Setembro 2008

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

Resumo Notas referenciais Um pouco de histria Neurotoxicologia Barreira Hematoenceflica

Doenas do Sistema Nervoso Central

Concluses Referncias bibliogrficas

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

BHE Endotlio cerebral Junes Apertadas Glia Transportadores endoteliais Neurotoxicologia

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

. Estes prolongamentos tornavam as clulas

; era importante encarar

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

e estvel, mesmo em situaes de No entanto, apesar da sua enorme

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

que, de certa forma, so a primeira linha de controlo de todas

impedirem a movimentao paracelular livre dos solutos [15] transporte

, mas no s. Estas tambm que ocorre atravs da

tm um papel fundamental na selectividade de

barreira, j que ao impedirem a movimentao de protenas transmembranares e lpidos nas

membranas celulares endoteliais, conseguem

Morfologicamente, todas as estruturas que compem a barreira e a suportam

esto organizadas da seguinte forma: o endotlio microvascular partilha com os

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

Fig.5 Estrutura celular da BHE

, o que sugere ainda um papel na regulao

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

. Esta apresenta um peso molecular de 40 kDa e, at hoje, j se

(ZO-1, ZO-2 e ZO-3) e

. Aqui se incluem o antignio 7H6, protenas

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Fig.A Juno Apertada e Zona de Aderncia (protenas envolvidas)

, protena citoplasmtica do citosqueleto, ZA.

so glicoprotenas que possuem um nico domnio e interagem

que assume um papel

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. Esta membrana, de estrutura trilamelar, assume uma

. O facto de apresentar carga negativa confere-lhe ainda outra

, no entanto, investigaes recentes mostraram que, na realidade, a MB

apresenta uma composio macromolecular bem mais complexa do que aparentava.

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

. Estudos realizados sugerem que, quando alterada a composio da membrana,

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

Desenvolvimento: do embrio ao ser adulto

primitivo e apresenta fenestraes ao nvel do

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Propriedades: permeabilidade paracelular e polarizao celular

da barreira regulada por modificaes da

depende a intereco homotpica das molculas de

, por sua vez, promove a

, ela pode fosforilar protenas directamente implicadas na

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

, que consiste na distribuio assimtrica dos constituintes da membrana entre

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

Papel dos Astrcitos, Percitos e outras clulas na diferenciao da BHE

, as clulas comunicam entre si, no s

terminais, prolongamentos que estas clulas em forma de estrela apresentam

, envolvem mais de 90% da superfcie

dos capilares endoteliais

realizados sugerem o importante papel dos astrcitos na maturao da BHE

Barreira hematoenceflica: O que precisamos saber em investigao neurotoxicolgica Setembro 2008

que previne a entrada no crebro de xenobiticos O aumento dos marcadores de actividade

Fig.11 GLUT-4 (transporte de glucose)