CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Helen Arrieta, Fabin Rivas Unidad Curricular: Microbiologa General, Universidad Nacional Experimental Sur Del Lago Jess Mara Semprum UNESUR

RESUMEN
El cultivo y aislamiento de hongos en un laboratorio de microbiologa, proporciona una serie de conocimientos interesantes. Para trabajar con microorganismos existen diferentes tcnicas que son sumamente efectivas para cultivar y aislar estos seres microscpicos. Utilizando los medios de cultivo adecuados se puede lograr una investigacin exitosa y entender la manera de reproduccin de las bacterias y hongos, as como tambin saber el tiempo que necesitan para proliferarse. Esta prctica realizada fue fundamental y eficiente, pues trabajamos con las distintas tcnicas necesarias para cultivar y aislar microorganismos. Se pudo observar las variaciones en los pasos de cada tcnica, obteniendo resultados diferentes en cada mtodo. La bacteria utilizada en esta prctica para saber su reproduccin fue la escherichia coli, obteniendo colonias aisladas en cada uno de los procedimientos. Es significativa la forma de reproduccin de esta bacteria, tan solo en 30 horas se haban originado cientos de colonias aisladas, las cuales son clulas individuales que dividen y multiplican. Con respecto al cultivo y aislamiento de hongos se observo y entendi que necesitan un periodo ms largo de tiempo como por ejemplo 48 horas para reproducirse notablemente.

INTRODUCCION
En un laboratorio, al momento de trabajar con microorganismos lo primero que se debe hacer es cultivarlo. Luego aislarlo y mantenerlo aplicndole nutrientes y condiciones fsicas y qumicas que le ayuden a tales microorganismos poder reproducirse en forma controlada. Es importante recordar que los medios de cultivo son sustratos que cumplen con todas las condiciones adecuadas para poder cultivar y mantener un microorganismo, permitindole a estos seres microscpicos desenvolverse a su comodidad. Por consiguiente, esta prctica de laboratorio se baso en ciertos puntos como por ejemplo

Tomar y procesar muestras microbiolgicas a partir de distintos materiales. Al cultivar y aislar microorganismos empleando distintas tcnicas, surgieron las llamadas colonias aisladas, las cuales son clulas individuales que luego de la siembra y procesamiento se dividen o multiplican. Tambin en la prctica realizada en el laboratorio, se conocieron las tcnicas y formas de cultivo y aislamiento e hicimos trabajos manipulando hongos, as como resalto otro objetivo importante el cual fue obtener cultivos puros de hongos y levaduras. Todos los objetivos y trabajos que se hicieron en el laboratorio, fueron con la intencin de demostrar a los estudiantes en forma experimental las bases tericas antes planteadas. Esto fue logrado, pues al hacer los diferentes procedimientos y aplicando diversas tcnicas en el laboratorio tales como: Siembra por agotamiento, siembra a profundidad, siembra por dilucin, Siembra en tubos, obtencin de cultivos bacterianos puros ; se observ los resultados de cada una las tcnicas y los trabajos realizados. A continuacin se presentan los materiales, mtodos y procedimientos realizados en esta prctica de forma explcita.

MATERIALES Y METODOS

Materiales: o o o o o o o o o o o o o o o o o o Cultivos bacterianos Muestras problemas Placas de petri con PDA y AM Placas de petri con AA y AN Tacos y Cua Asa de platino Aguja de diseccin Bistur Tubos con agua peptonada Hipoclorito de sodio 10 Agua destilada estril Muestras de alimentos Hojas de planta enferma Algodn y alcohol Pinzas Rastrillo de vidrio Pipetas de vidrio de 0,1 ; 5 y 10ml Marcador indeleble

o o o

Mechero Cajas de petri Papel absorbente estril

Procedimientos:

1. Siembra por agotamiento: Se inici rotulando la caja de petri con datos importantes como: (fecha, medio de cultivo, especie, cepa, seccin y grupo). Luego se dividi en 4 cuadrantes la placa de petri por su exterior. Se tomo un asa metlica la cual esterilizamos en el mechero y se dejo reposar para que se enfriara y no daar a las bacterias. Utilizamos el asa para tomar las bacterias contenidas en una placa de petri separada de la cual bamos a utilizar, despus de haber tomado las bacterias se hizo el estriado en el primer cuadrante y luego sucesivamente en los 3 cuadrantes restantes. Al final se sello la caja de petri y se incubo durante 30 horas. 2. Siembra a profundidad: Se rotulo la caja de petri en la base con las mismas caractersticas del procedimiento anterior. Se fundi a bao de mara el medio de cultivo y se mantuvo a una temperatura entre 40 y 50C. Tomamos 1ml de del cultivo bacteriano lquido y lo colocamos en el centro de la caja de petri estril. Luego se agrego 10 ml de medio de cultivo con una temperatura adecuada para no matar a las bacterias. Este procedimiento finaliz cerrando la placa de petri (cerca del mechero) y se dejo solidificar. La placa de petri fue envuelta en papel parafilm durante 30 horas. 3. Siembra por extensin de superficie: Nuevamente rotulamos la base de la placa de petri. Luego iniciamos tomando 0.1 ml del medio de cultivo bacteriano liquido y se coloco en el medio de la placa; despus utilizamos un rastrillo de vidrio e hicimos varios movimientos hasta sentir friccin. Por ltimo sellamos la caja de petri con el papel parafilm y se incub por 30 horas a una temperatura entre 30 y 37. 4. Diluciones seriadas: Este procedimiento lo iniciamos partiendo de una solucin madre de la cual se tomo 1 ml y lo agregamos un envase con agua peptonada. Despues tomamos 1 ml del envase de agua peptonada y lo agregamos a un tubo de ensayo. Luego de los pasos mencionados hicimos procedimientos repetitivos, es decir, tomar 1 ml del tubo de ensayo y pasarlo a otro tubo de ensayo. Esto fue con la finalidad de aumentar el factor de dilucin de la muestra madre. 5. Siembra en tubos: Consisti en tomar un asa esterilizada y con el inoculo sembrar en un tubo de agar nutritivo (cuas) haciendo una puncin, y en el otro tubo de

ensayo nuevamente una puncin pero acompaada de una estra simple. Estos tubos fuerona incubacin y os tubos con caldos nutritivo se djejaron en agitacin. 6. Aislamiento y Cultivo de hongos Hongos de Pan: Con la ayuda de un bistur se tomo una pequea porcin de un pan facilitado por el profesor y lo colocamos en el centro de la placa de petri con medio de cultivo PDA haciendo una breve presin para evitar que al cerrar y voltear la caja de petri dicha muestra se moviera. Para finalizar sellamos la caja de petri con el papel parafilm y dejamos incubar por 30 horas.

Hongos de tejidos vegetales: Nuevamente utilizando el bistur se corto un pequeo trozo del tejido elegido en este caso, lo transferimos a la placa de petri y lo colocamos en centro con medio de cultivo AA. Se sello la placa de petri y se tranfirio a la incubadora.

Hongo Contaminado de cultivo invito vegetal: Se tomo una porcin del hongo contaminando luego lo colocamos en una placa de petri con medio de cultivo AM. Estos pasos fueron realizados cerca del mechero. Por ltimo se sello la placa de petri y se incubo durante 30 horas para despus ver los resultados.

RESULTADOS

Frmula

1er. Caso

2do. caso

3er. caso

Duplicado

DISCUSIN DE RESULTADOS

Los medios de cultivos se pueden clasificar segn su aspecto fsico, su composicin y su funcin. En cuanto al aspecto fsico los medios de cultivos puedes ser lquidos (caldos), semislidos y slidos. En la prctica realizada utilizamos medios de cultivos fsicos, constituidos por Agar, el cual es un agente idneo en estos estudios pues no puede ser consumido por las bacterias. Las bacterias tienen la facilidad de reproducirse a gran escala, de una pequea muestra de bacterias como la escherichia coli se obtienen miles de bacterias provenientes de la primera tras un periodo de incubacin. Para poder saber la cantidad de microorganismos reproducidos de la muestra principal fue necesario hacer una serie de pasos y mtodos, los cuales fueron de gran ayuda a la hora estudiar los nuevos microorganismos originados de bacterias y hongos.

Luego de haber concluido todos los mtodos y procedimientos, tras la incubacin la cual duro 30 horas, se procedi a observar lo que haba ocurrido en ese tiempo y a contar cada una de las colonias aisladas. En cuanto a las tcnicas de siembra utilizando la bacteria escherichia coli, se pudo observar grandes cambios. A simple vista se presentaban una variedad de puntos de color blanquecino que representaban las colonias aisladas. La placa de petri trabajada con la siembra por agotamiento (estriado), observamos que el primer cuadrante presentaba el estriado en buen estado en color blanquecino, pero el segundo cuadrante no poda verse muy bien, esto pudo haber ocurrido por algn error a la hora de realizar el estriado, sin embargo el tercer cuadrante tena buenas caractersticas donde se vean las colonias aisladas y el cuarto y ltimo cuadrante tena unas pocas colonias. En las placas de petri donde se realizo las siembras por dilucin observamos en la placa con dilucin 10-5 haba una mayor cantidad de colonias producidas que en la placa de petri 10-6 indicando as que las placas con dilucin 10-7 se haban producido aun menos colonias que las anteriores. En las placas de petri donde implementamos la tcnica de siembra por extensin de superficie en la cual agregamos 0.1ml de uno de los tubos de ensayo con dilucin 10-7. Se obtuvo 75 colonias aisladas. Al observar los tubos donde habamos hecho diferentes procedimientos, es decir, taco y cua, nos dimos cuenta que en el primer tubo (taco) donde introducimos el inoculo por todo el centro haba un crecimiento moderado de bacterias pero no era observable de manera adecuada. Luego en el tubo Cua nos dimos cuenta que el estriado lo habamos hecho de una forma que no fue tan favorable, pues el estriado casi no resaltaba y su color prcticamente era transparente. Por ltimo al observar a los hongos, nos dimos cuenta que estos estaban relativamente iguales al da anterior cuando los sembramos. Solo se pudo observar algunos pelos los cuales son micelios. Esto produjo en los estudiantes una interrogante, cual era la causa de que no hubieran cambios ms notables? La docente auxiliar Claudia Paredes aclaro la

duda, pues nos dijo que los hongos, a diferencia de las bacterias necesitan un periodo de tiempo ms largo para poder reproducirse a mayor escala.

CONCLUSIN Para el estudio de microorganismos es esencial cumplir con una serie de normas e higiene para lograr un trabajo exitoso. Tales normas y tcnicas de esterilizacin son de ayuda para evitar la contaminacin de los procesos en los cuales se utilicen bacterias y hongos. En un laboratorio todo debe permanecer en orden y esterilizado pues de lo contrario en las investigaciones y anlisis surgiran errores, ya sea por contaminacin o proliferacin de microorganismos sin control. En la prctica realizada, quedo clara y entendida la importancia de los medios de cultivos con agentes como los Agar (PDA, AM, AA, AN) los cuales son totalmente adecuados al momento de realizar trabajos con microorganismos. Cada practica hasta el momento vista, nos ha proporcionado una serie de conocimientos sumamente interesantes. Los microorganismos son seres muy abundantes a nuestro alrededor, esto se debe a la alta capacidad que tienen de reproduccin, pues en tan solo horas se originan grandes cantidades de seres microscpicos individuales de una pequea muestra. Se pudo observar que las bacterias se reproducen en colonias aisladas mucho mas rpido que los hongos. Las bacterias en tan solo 30 horas se dividen y multiplican a grandes cantidades, mientras que los hongos necesitan al menos 48 horas para reproducirse ms cmodamente.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Msc. Yani Aranguren Daz, Msc. Elwi Machado Sierra, Lic. Yosibel Mora Mndez, Dr. Fernando Isea Leon. Manual de prctica de Microbiologa para Ingeniera de Alimentos