PRCTICAS DE GENTICA Y MEJORA VEGETAL

2 I.T.A. (H.F.) 05/06

Gumer Prez Garrido Departamento Produccin Agraria Universidad Pblica de Navarra

Indice:

1. Mitosis 2. Control cromosmico 3. Cariotipo 4. Meiosis 5. Ciclo de Drosophila melanogaster 6. Herencia de un gen autosmico 7. Herencia ligada al sexo 8. Casos prcticos leyes de Mendel. Mendelismo simple y complejo.. 9. Extraccin de ADN. 10. Cuantificacin de ADN y electroforesis. 11. Reaccin en cadena de la Polimerasa. 12. Prueba de bondad de ajuste

Mitosis

Mitosis
La divisin celular es el fenmeno por el cual una clula origina 2 clulas hijas, cada una de las cuales recibe, en condiciones normales, idntica informacin gentica. La mitosis, comprende 2 mecanismos: La cariocinesis, es decir, la divisin del ncleo, que asegura el reparto equitativo del material hereditario y la citocinesis, que reparte los orgnulos y componentes citoplasmticos a las clulas hijas, separndolas e independizndolas. Normalmente, la cariocinesis y la citocinesis son mecanismos sincronizados en ese orden, constituyendo juntos el proceso de divisin celular, aunque no siempre se produce esa sincronizacin. La divisin celular origina 2 clulas genticamente idnticas entre s e idnticas a la clula que les dio origen, manteniendo el nmero cromosmico de la clula parental preexistente. Para dividirse la clula, primeramente es necesario que se duplique su material gentico contenido en el ncleo, para luego repartirlo en partes iguales a las clulas hijas. Tambin tiene que aumentar su contenido citoplasmtico para poderlo repartir entre las dos nuevas clulas. Sin embargo, la divisin del citoplasma no es tan exacta o equitativa como la del ncleo. 1.Mitosis o cariocinesis La mitosis consta de las siguientes fases: profase, metafase, anafase y telofase. La mitosis es un proceso continuo, la separacin en distintas fases se ha realizado para la comodidad de estudio. Interfase No es una fase de la mitosis, es el perodo entre 2 mitosis sucesivas. En la interfase se distingue el ncleo con la cromatina y los nucleolos. La cromatina se defini, en principio, como la sustancia que constituye el ncleo interfsico y muestra ciertas propiedades de tincin por colorantes bsicos. La mayora de los autores la definen como la asociacin de ADN e histonas. La interfase se divide en tres subfases: G1, perodo anterior a la duplicacin de la cromatina. S, perodo de sntesis de la cromatina o de replicacin del ADN y sntesis de histonas. G2, fase posterior a la duplicacin de la cromatina y anterior al inicio de la siguiente mitosis. La duracin relativa de G1, S y G2 vara de una especie a otra y depende as mismo de la clula de la que se trate. Durante estos 3 perodos se produce la sntesis de protenas. La sntesis de ARN se produce sobre todo en los periodos G1 y G2. Cuando una clula no va a dividirse de nuevo y el ncleo interfsico no entra en el perodo S se dice que la clula se halla en perodo G0.

Mitosis 1.1.Profase La cromatina comienza a condensarse y espiralizarse formando los cromosomas. Durante toda la profase los cromosomas van acortndose debido a este proceso progresivo de espiralizacin. Los cromosomas desde el principio aparecen formados por dos cromtidas hermanas que son, gentica y morfolgicamente idnticas. Ambas cromtidas se mantienen unidas por el centrmero. Mientras la membrana nuclear est intacta y el o los nucleolos sean visibles, se dice que la clula est en profase. Al final del periodo profsico el nucleolo o nucleolos se desorganizan y la membrana nuclear se desintegra. Los cromosomas quedan libres en el espacio celular. Mientras tanto, en el citoplasma, los centriolos se han duplicado y cada diplosoma (par de centriolos), ha emigrado a un polo de la clula. Entre ambos se forma y se extiende el huso acromtico o mittico, constituido por filamentos (fibras del ster), en los que se insertan los cromosomas por el centrmero y comienzan a emigrar hacia la placa encuatorial. Este perodo desde que desaparece la membrana nuclear hasta que los cromosomas se localizan en el plano ecuatorial se denomina prometafase. 1.2.Metafase Los cromosomas han alcanzado su mximo grado de espiralizacin. Se disponen en crculo en la placa ecuatorial con los centrmeros perfectamente orientados, con cada cromtida hacia un polo celular. Esta orientacin asegura la correcta separacin en la fase siguiente. La accin de determinados tratamientos como la colchicina, la colcemida, la mescalina, la hidroxiquinolena, el bromonaftaleno, el paradiclorobenceno etc..o agua con hielo, inhiben la formacin de los microtbulos y por tanto la migracin hacia los polos en anafase. Estos tratamientos se utilizan en citogentica experimental para acumular clulas en metafase, que resultan apropiadas para el anlisis cariotpico. 1.3.Anafase En esta fase las cromtidas de cada cromosoma se separan y emigran hacia los polos, de manera que a cada uno van 2n cromtidas. Este movimiento se realiza gracias al huso acromtico. Como ambas cromtidas son idnticas, porque se formaron por duplicacin de la fase S de la interfase, los polos celulares reciben, exactamente el mismo material gentico. La anafase concluye cuando todos los cromosomas han alcanzado los polos. 1.4.Telofase Las cromtidas han terminado su migracin hacia los polos. La membrana nuclear se reconstruye alrededor de las cromtidas, los nucleolos vuelven a formarse y las cromtidas se desespiralizan volviendo a formar la cromatina. Se han formado 2 ncleos hijos.

Mitosis 2.Citocinesis La citocinesis es el proceso por el cual el citoplasma de la clula madre queda distribuido entre las 2 clulas hijas y estas se independizan por la formacin de la membrana celular. La separacin de las 2 clulas hijas es diferente en clulas animales y vegetales. En las clulas animales se produce la plasmocinesis, en la que a partir de la periferia de la clula el citoplasma se va estrangulando hasta que las clulas hijas se ponen en contacto. En las clulas vegetales se forman vesculas membranosas en la zona comprendida entre los ncleos hijos. Estas vesculas se fusionan unas con otras dando origen a la membrana plasmtica, quedando entre las membranas el contenido de las vesculas que constituir la pared celular.

Mitosis en clulas de la punta de la raiz de Lilium regale. a)Interfase, b) Profase temprana, c) Prafase tarda, d) Metafase, e)Anafase, f) Telofase. (De J. McLeish y B. Noad, Looking at chromosomes. Copyright. 1958. Macmillan.)

Mitosis 3.Variaciones en el proceso de divisin celular 3.1.Variaciones en la replicacin y reparto del material hereditario. 3.1.1. Endorreduplicacin. Es el fenmeno en el cual despus de un periodo de sntesis (S) el ncleo no entra en mitosis, sino que vuelve a experimentar otro periodo S. Los cromosomas vuelven a reproducir sus cromtidas formndose cromosomas con 4 cromtidas (duplocromosoma), con ocho (cuadruplocromosomas), si vuelve a producirse el proceso, etc. El caso extremo de la endorreduplicacin es la politenia, que da lugar a los cromosomas gigantes o cromosomas politnicos encontrados en glndulas salivales y otros tejidos de gran actividad metablica en dpteros e incluso en vegetales. Los cromosomas politnicos resultan de procesos de sntesis ininterrumpidos. 3.1.2.Haplocromosomas Es el fenmeno contrario a la endorreduplicacin. Los ncleos telofsicos con cromosomas de una sola cromtida entran en divisin sin haber pasado por el periodo de sntesis. En este caso los cromosomas metafsicos tendrn una sola cromtida y el proceso mittico se detiene en metafase. 3.2.Variaciones en los estados mitticos. 3.2.1.Endomitosis. Es el proceso en el cual al final de la profase no desaparece la membrana nuclear, continuando el proceso mittico en el interior de la misma. Las cromtidas en la endoanafase se separan pero no emigran a los polos, ni hay citocinesis (separacin de citoplasmas). Al entrar en interfase en el perodo S siguiente darn lugar a 4n cromosomas. Este fenmeno se conoce como endopoliploida. 3.2.2.Variaciones en la anafase. C-Mitosis. Algunos tratamientos como la colchicina, desorganizan los microtbulos, impidiendo la emigracin de las cromtidas hacia los polos y la citocinesis. En la anafase las cromtidas se separan pero no emigran a los polos. Por tanto, en la siguiente divisin celular las 4n cromtidas aparecern como 4n cromosomas. Las clulas sern autotetraploides.

Mitosis 3.3.Variaciones que afectan a la citocinesis en relacin con la cariocinesis. 3.3.1.Cariocinesis sin citocinesis. Se producen clulas binucleadas, por aplicacin de tratamientos fsicos o qumicos como la cafena aplicada en telofase. 3.3.2.Citocinesis sin cariocinesis. Se producen clulas anucleadas, por la aplicacin de bromuro de etidio.

Mitosis TRABAJO PRACTICO Observacin de distintas fases de la mitosis en pices radiculares de cebolla. 1.Obtencin del material. Se cortan races jvenes de cebolla, aproximadamente unos 20 mm, comprobando que conservan el pice radicular, que se distinguir por el cambio de color. 2.Fijacin. Se prepara la mezcla fijadora. Existen diversos fijadores: -3 Etanol:1 Actico (Carnoy). -3 Metanol:1Actico -7 Metanol:3 Actico -3 Metanol:1 Propinico -4 Etanol:1 Actico:1 Cloroformo Segn el fijador utilizado el tiempo y temperatura de la fijacin vara. Las raicillas de cebolla se han fijado en 3 Metanol:1 Actico a 4C. 3.Conservacin Se lava el material varias veces con la mezcla fijadora y se conserva a 4C. 4.Preparacin Las raicillas de cebolla que se hallan en mezcla fijadora se hidrolizan en HCl 1N durante 10 minutos a 60C. Transcurridos los 10 minutos de la hidrlisis, se lavan las raicillas en agua destilada y se colocan las raicillas sobre una gota de orcena actica o de orcena lactopropinica para su tincin, durante 10 a 15 minutos. A continuacin se realiza la preparacin. Primeramente, se toma una raicilla y se coloca sobre un vidrio portaobjetos y se corta el pice radicular con un bistur. Para realizar esta operacin se utiliza la lupa. Este pice radicular se corta a su vez en 4 fragmentos, se hace un corte longitudinal y otro transversal. Se separan los cuatro trozos y a continuacin se aade una gota del colorante. Seguidamente se coloca un cubreobjetos sobre el material que deseamos observar. Con la ayuda de un bastoncillo de madera se golpea y extiende el material. A continuacin se presiona con el dedo pulgar y se retira el exceso de colorante con un papel de filtro. 5.Observacin. Se observa al microscopio empezando con el objetivo de menor aumento. No es necesario utilizar el objetivo de inmersin. Se deben distinguir y dibujar, tal y como se ven, todas las fases de la mitosis.

Mitosis Cuestionario de practicas 1.Dibuje cada una de las distintas fases de la mitosis, adems de la interfase. 2.Por qu se encuentra mayor nmero de clulas en interfase que en divisin en las preparaciones de raz de cebolla? 3.La cebolla Allium cepa es una especie vegetal con 2n=16 cromosomas Cuntas cromtidas recibe cada polo en anafase? 4.Cuntas cromtidas tiene uno de los cromosomas de cebolla en telofase? 5.Un individuo diploide y homocigtico AA, Cuntas copias del alelo A tiene en el periodo G1 de la interfase y cuntas en metafase? 6.Un individuo diploide y heterocigtico Aa, Cuntas copias del alelo A tiene en el periodo G1 de la interfase y cuntas en metafase? 6.Existe alguna diferencia entre endomitosis y endorreduplicacin? 7.Por qu se bloquea la continuacin de la mitosis en metafase en especies que presentan haplocromosomas?.

Control cromosmico

Control cromosmico
Segn hemos visto, el ciclo celular comprende dos periodos fundamentales, interfase y divisin celular. La mayor parte de la vida de una clula transcurre en interfase. La divisin celular es el fenmeno citolgico por el que una clula eucaritica origina dos clulas hijas con idntica informacin gentica nuclear. La funcin esencial de los cromosomas es conservar, transmitir y expresar la informacin gentica que contienen. Los cromosomas no se observan como tales al examinar al microscopio los ncleos en reposo. Durante la profase mittica, los cromosomas se van constituyendo en cuerpos. En metafase, los cromosomas se encuentran perfectamente individualizados, adquieren su mayor grado de compactacin lo cual los hace ms fcilmente observables a microscopio de luz; adems se encuentran situados en el ecuador de la clula, unidos al huso acromtico por el centrmero. Cada cromosoma interfsico debe experimentar una serie de fenmenos que le convierten en un cromosoma metafsico, con una morfologa caracterstica. Por todo ello, para visualizar y contar el nmero de cromosomas de una especie, es imprescindible disponer de un material celular en divisin. Al realizar un control cromosmico interesa, por una parte, detener la divisin celular en metafase, de manera que el nmero de clulas en las que se observan cromosomas sea mayor, y por otra parte, inducir a la compactacin mxima de los cromosomas. Los tratamientos que se aplican para detener la mitosis en metafase se denominan C-mitticos, actan de dos maneras, destruyendo el huso acromtico o disminuyendo la energa. Desorganizando el huso acromtico se impide que los cromosomas se separen por el centrmero y las cromtidas emigren a los polos, es decir que no se produce la anafase. Por otra parte, al destruir el huso acromtico, los cromosomas quedan sueltos y es ms fcil visualizarlos.

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Control cromosmico TRABAJO PRACTICO Control del nmero de cromosomas de distintas especies vegetales. 1-Obtencin del material Se cortan races jvenes de distintas especies, de manera similar que en la prctica de mitosis. 2-Tratamiento c-mittico Las raicillas se colocan en agua destilada con hielo dentro de una cmara frigorfica (0-4C) durante 24 horas. 3.Fijacin Antes de aplicar el fijador se debe colocar el material en agua. La fijacin debe ser inmediata, durante 2 horas mnimo. Se utilizar el mismo fijador que en prcticas anteriores. 4.Conservacin 5.Hidrlisis 6.Tincin 7.Preparacin De manera similar que en la prctica de mitosis.

CUESTIONARIO 1-Dibuje una clula metafsica de cebolla y otra de lenteja. 2-Qu diferencia existe entre las clulas metafsicas observadas en la prctica de mitosis y en esta prctica de control cromosmico? 3-Qu nmero de cromosomas tiene cada una de las especies utilizadas en esta prctica?

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Meiosis

Meiosis
La meiosis es un proceso celular, ligado a la reproduccin sexual, por el cual, la clula madre de naturaleza diploide, da origen a los gametos de naturaleza haploide, de tal manera que en la fecundacin se reestablece el nmero diploide de cromosomas. As, mientras la mitosis es un proceso de divisin celular con formacin de dos ncleos hijos con el mismo nmero de cromosomas que la clula original, en la meiosis en cambio hay dos divisiones celulares con reduccin del nmero de cromosomas a la mitad. Fases de la meiosis La meiosis es un proceso citolgico que comprende dos divisiones celulares. En la primera divisin meitica ocurre una serie de intercambios de material gentico entre los cromosomas homlogos. Este fenmeno es un proceso complejo que comprende una larga profase en la que, para su mejor estudio y comprensin, se distinguen los estados: Leptoteno, Cigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinesis. Profase I Leptoteno. El comienzo de la profase I de la clula se caracteriza porque los cromosomas que se encuentran completamente desenrollados en el ncleo, debido a los procesos de sntesis de los momentos premeiticos, comienzan a estructurarse segn un doble modelo de espiralizacin, que conduce en definitiva a un aumento del volumen nuclear. Cigoteno. La clula diploide presenta en estos momentos 2n cromosomas homlogos completamente espiralizados (contrados), los cuales se aparean cada uno con su homlogo. Es una sinapsis perfecta, crommero a crommero, formando por tanto n bivalentes. Paquiteno. En este estado se terminaliza el apareamiento de los cromosomas homlogos n-bivalentes se visualizan engrosados, y cada uno de los cromosomas compuestos de dos cromtidas, hace que el bivalente se presente como una ttrada. Diploteno. Las dobles parejas de cromtidas homlogas comienzan a separarse, permaneciendo unidas por ciertos puntos que son los quiasmas, los cuales constituyen la visualizacin citolgica del mecanismo de intercambio de material gentico denominado sobrecruzamiento (crossing-over). Diacinesis. En este estado las ttradas aparecen muy condensadas con bucles unidos por los quiasmas; al mismo tiempo que se terminalizan hacia los extremos de la ttrada.

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Meiosis Metafase I A lo largo de la profase I, los centriolos duplicados se orientan dos a dos, hacia cada uno de los polos de la clula, visualizndose ya en la metafase I el aparato mittico, al mismo tiempo que las ttradas se disponen en la placa ecuatorial del aparato mittico. Anafase I En este estado ocurre la rotura y desaparicin de la membrana nuclear y la migracin de n cromosomas a cada polo. Es importante sealar en primer lugar que la reparticin de n cromosomas homlogos a cada polo ocurre al azar, y en segundo lugar que a diferencia con la mitosis, en esta primera divisin meitica no hay divisin longitudinal del centrmero, y por lo tanto separacin de las cromtidas, sino que stas permanecen unidas por sus respectivos centrmeros. Por lo tanto, esta divisin meitica I es una divisin reduccional. Telofase I Ocurre la individualizacin de las dos clulas de la divisin meitica I, con la aparicin de la membrana plasmtica que las separa, y la reaparicin de la membrana nuclear. Divisin meitica II Entre la telofase I y el comienzo de la segunda divisin meitica, a diferencia con la mitosis, no hay un perodo de sntesis y duplicacin del ADN, por lo dems la divisin meitica II, tiene lugar como la mitosis normal en cada una de las clulas haploides (meiocitos de segundo orden), resultantes de la divisin meitica I. Profase II En este estado los centriolos aparecen duplicados y migran dos a dos hacia los polos, constituyendo el huso mittico. Metafase II Los n cromosomas de cada una de las clulas hijas, se disponen en la placa ecuatorial del huso, al mismo tiempo que desaparece la membrana nuclear. Anafase II Ocurre la divisin longitudinal del centrmero y reparticin al azar de n cromtidas a cada uno de los polos, de modo que las cromtidas hermanas (que no sern idnticas por el sobrecruzamiento) van siempre a lados opuestos.

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Meiosis Telofase II En esta fase tiene lugar la individualizacin de las cuatro clulas hijas, con aparicin de las membranas plasmticas y nuclear. Ahora bien, a diferencia con la mitosis, las dos clulas resultantes de cada meiocito de segundo orden son diferentes, porque sus cromtidas han intercambiado material gentico previamente en la profase I. A continuacin, ocurre la desespiralizacin de las cromtidas y el periodo de sntesis y duplicacin del ADN. No obstante, se presentan numerosas excepciones a este esquema general de la meiosis, segn sean los ciclos haplontes, diplontes o diplohaplontes de las especies, o en una misma especie en la espermatognesis y ovognesis. Diferencias entre mitosis y meiosis La mitosis es un proceso de divisin celular con formacin de dos ncleos hijos con el mismo nmero de cromosomas, y por tanto la misma constitucin gentica. Constituye as el fundamento de la multiplicacin de los organismos unicelulares y del crecimiento en los pluricelulares. En cambio, la meiosis da origen a cuatro clulas hijas con la mitad del nmero de cromosomas todos ellos distintos entre s, debido al intercambio de material hereditario y a la distribucin al azar de las parejas de cromosomas, lo cual explica la variabilidad gentica de la especie; es adems el fundamento de la reproduccin sexual ente los individuos de una especie. Mitosis 1-Ocurre tanto en la lnea somtica como en la lnea germinal. 2-Ocurre en clulas diploides o haploides 3-No hay apareamiento de cromosomas en la profase. 4-Hay divisin longitudinal del centrmero en la anafase, de manera que se separan las cromtidas hermanas (del mismo cromosoma). 5-Como resultado se forman 2 clulas hijas haploides o diploides, segn sea la constitucin gentica de la madre. 6-Los productos mitticos normalmente son capaces de efectuar otras divisiones mitticas. 7-Por lo general, se lleva a cabo en todas las clulas somticas. 8-Las primeras mitosis se producen en el zigoto y durante toda la vida del organismo, las clulas sufrirn mitosis. Meiosis 1-Slo ocurre en la lnea germinal. 2-Ocurre slo en clulas diploides 3-Hay apareamiento con intercambio de material gentico en la profase I. 4-No hay divisin longitudinal del centrmero en la anafase I, se separan cromosomas homlogos; las cromtidas hermanas se separan en una divisin ecuacional de la anafase II. 5-Como resultado se pueden formar hasta cuatro clulas siempre haploides a partir de una clula madre. 6-Los productos meiticos no pueden experimentar otra divisin meitica, aun cuando puedan realizar divisiones mitticas. 7-Slo se da en clulas especializadas de la lnea germinal. 8-En los organismos superiores, se efecta despus que el individuo ha comenzado a madurar.

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Meiosis

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Meiosis

CUESTIONARIO 1-Dibuje cada una de la fases de la meiosis 2-Qu es un bivalente? En qu fase o fases se observa?. 3-Qu diferencia existe entre una anafase I y una anafase II? 4-La cebada tiene 2n = 14 cromosomas, cuntos cromosomas tiene una clula de cebada en una metafase de una mitosis, en una metafase I y II de una meiosis? 5-Si tiene una preparacin en la que observa clulas anafsicas en las que se separan cromtidas cmo sabr si se trata de una anafase de una mitosis o de una anafase II de una meiosis?

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Meiosis

Gua sobre Meiosis

Problema 1: Nmero de cromosomas Una clula humana tiene 46 en total o 23 pares de cromosomas. A continuacin de la mitosis, las clulas hijas tendrn cada una un total de ______ cromosomas. Despus de la meiosis I, las dos clulas hijas tendrn _____cromosomas, y despus de la meiosis II ______ cromosomas. A. 46, 46, 46 B. 46, 23, 23 C. 23, 23, 23 D. 46, 12, 12 Problema 2: Cuatro clulas diferentes El proceso de meiosis produce cuatro clulas con cromosomas no idnticos. Esta diversificacin ocurre durante: A. telofase 1 B. profase 1 C. metafase 2 D. profase 2 Problema 3: Mitosis vs. Meiosis Cul de lo siguiente es nico a la mitosis y no una parte de la meiosis? A. Cromosomas homlogos se aparean formando bivalentes B. Cromosomas homlogos intercambian segmentos C. Las cromatidas se separan durante anafase D. Cromosomas homlogos se comportan independientemente Problema 4: Uvas Thompson sin semillas Las uvas Thompson sin semillas son triploides, con tres copias de cada cromosoma. Qu fase del ciclo celular, las clulas triploides sern incapaces de completar? A. meiosis 1 B. S C. meiosis 2 D. G2 Problema 5: Reproduccin asexual vs. sexual Algunos organismos son capaces de reproducirse asexual o sexualmente. Bajo condiciones favorables, la reproduccin procede asexualmente. Cundo las condiciones se vuelven ms estresantes la reproduccin cambia al modo sexual. Por qu? A La reproduccin sexual es simple y ms rpida permitiendo producir un nmero mayor de . descendientes. B La reproduccin sexual requiere dos individuos separados, quienes pueden mutuamente . proveer apoyo nutritivo durante el estrs. C La reproduccin asexual requiere ms energa. . D La reproduccin sexual produce individuos con nuevas combinaciones de cromosomas . recombinados incrementando la diversidad.

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Meiosis Problema 6: Clulas haploides El estado de meiosis dnde las clulas se vuelven haploide. A. profase I B. profase II C. anafase I D. anafase II Problema 7: Eventos de la Meiosis Uno de los ms tempranos eventos que distingue la meiosis ocurre en profase I e involucra: A. Condensacin de los cromosomas B. Perdida de la membrana nuclear C. Movimiento de los cromosomas hacia el plato de metafase D. Apareamiento de cromosomas homlogos Problema 8: Coral marino El coral en el ocano crece por gemacin, donde el nuevo organismo crece del viejo por mitosis. Esta forma de replicacin es un ejemplo de: A. meiosis para producir un zygote B. reproduccin asexual C. reproduccin sexual D. formacin de gametos Problema 9: Fases de la Meiosis _________________ ms se parece a los eventos de la mitosis excepto que las clulas son___________. A. interfase, diploide B. meiosis II, diploide C. interfase, haploide D. meiosis II, haploide

Analogas y diferencias entre mitosis y meiosis:

Ejercicio 1: En la tabla que se muestra a continuacin, haga una X en los lugares correspondiente para indicar la presencia de cromosomas con una sola cromtida y la presencia de pares de cromosomas homlogos en las diversas fases de una clula normal en divisin Cromosomas con 1 cromtida Interfase anterior a Mitosis Telofase Mitosis Interfase anterior a Meiosis Profase II Meiosis Telofase II Meiosis Pares de cromosomas homlogos

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Meiosis Ejercicio 2: En la siguiente tabla, haga una X en la casilla apropiada para indicar la presencia de cromosomas apareados y si los cromosomas estn a nivel de dos cromtidas, en las siguientes fases de una clula normal en divisin.

Cromosomas apareados Interfase anterior a Mitosis Mitosis Profase Mitosis Anafase Meiosis Metafase I Meiosis Metafase II

Cromosomas con dos cromtidas

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Cariotipo

Cariotipo
Cromosomas Durante la vida, toda clula pasa por dos periodos que constituyen un ciclo: a)Perodo de interfase b)Perodo de divisin, que conduce a la formacin de 2 clulas hijas. Este ciclo se repite de generacin en generacin celular siendo el mismo para un tipo de clula, pero pudiendo variar en funcin del tejido que se trate. Durante el ciclo celular el ncleo de la clula sufre una serie de cambios complejos: desaparicin de membrana nuclear y de los nuclelos y condensacin de la cromatina en los cuerpos llamados cromosomas. En los cromosomas, estructuras responsables de la transmisin de los caracteres hereditarios, se localizan los genes. Las clulas del cuerpo, o clulas somticas, de cualquier organismo superior tienen un nmero cromosmico definido y caracterstico de la especie, representado por el nmero cromosmico 2n o nmero diploide. Este nmero significa que los cromosomas en las clulas somticas existen formando pares, recibiendo cada miembro del par el nombre de homlogo. Los gametos o clulas reproductoras, se forman por meiosis y tienen un nmero cromosmico n o haploide (del griego: haplos que significa mitad). En las especies en las que el sexo est determinado por cromosomas se pueden distinguir: a)un par de cromosomas sexuales b)autosomas o cromosomas no sexuales Cariotipo Las caractersticas ms importantes que identifican los cromosomas durante la mitosis son su nmero, tamao relativo, estructura, comportamiento y organizacin interna. Cariotipo es el complemento o conjunto cromosmico tpico del individuo o de la especie en el que se describe el nmero, forma y tamao de los mismos. El cariotipo se perpeta normalmente en la progenie (Battaglia, 1953). Es decir, en trminos generales, se admite la constancia en forma, tamao y nmero de los cromosomas, en todas las clulas que componen el ncleo de un individuo y en los individuos de cada especie. En el cariotipo se ordenan los pares de homlogos en series, de acuerdo a su longitud, en forma creciente. La representacin esquemtica del cariotipo se conoce con el nombre de Idiograma.

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Cariotipo El anlisis de la morfologa cromosmica se lleva a cabo en el estado de metafase que es el momento en el que los cromosomas presentan el mayor grado de espiralizacin, y compactacin. Es en este estado tambin cuando muestra las mejores condiciones de tincin con tintes que presentan afinidad por los cidos nucleicos; razn que favorece an ms el estudio citogentico de una determinada especie en esta fase del ciclo de divisin celular. Para confeccionar un cariotipo se deben tener en cuenta: 1.-Nmero bsico de cromosomas. 2.-Morfologa cromosmica 1.-Nmero bsico de cromosomas En principio, todos los individuos de una especie tienen el mismo nmero de cromosomas. Dos especies distintas pueden tener el mismo nmero de cromosomas. 2.-Morfologa de los cromosomas En la morfologa de los cromosomas distinguimos: 2.1.-Posicin del centrmero 2.2.-Localizacin de satlites y constricciones secundarias 2.3.-Distribucin de regiones hetero y eucromticas 2.1.-Posicin del centrmero La morfologa depende de la posicin del centrmero. Segn sea la posicin del centrmero: Posicin media, submedia, subterminal o terminal los cromosomas se clasificarn en: a)metacntricos o isobraquiales (centrmero equidistante de los extremos, brazos de igual longitud). b)submetacntricos o heterobraquiales (centrmero muy prximo al centro) c)acrocntricos o cefalobraquiales (centrmero muy prximo a un extremo) d)telocntricos (centrmero terminal, no se puede hablar propiamente de constriccin, ni de brazos, slo existe un brazo) La posicin del centrmero o constriccin primaria se calcula teniendo en cuenta los siguientes parmetros: c= largo total del cromosoma l= largo del brazo mayor s= largo del brazo menor y la posicin ser igual a: c = l + s El ndice centromrico es: i = (s x 100)/ c d=cs

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Cariotipo 2.2.Localizacin de satlites y constricciones secundarias. Se llama satlite al cuerpo esfrico de igual o menor dimetro que el del cromosoma y al que est unido por un filamento que representa la constriccin nucleolar o secundaria. Segn la posicin que ocupen, los satlites se clasifican en: a)Terminales: cuando el satlite se une al extremo de un brazo cromosmico a travs de la constriccin secundaria. b)Intercalares: cuando el satlite se encuentra entre dos constricciones secundarias. 2.3.Distribucin de regiones hetero y eucromticas. El grado de espiralizacin de los cromosomas vara en funcin del ciclo celular. As se puede observar que no todo el cromosoma se espiraliza al mismo tiempo. Existen zonas que permanecen condensadas durante la interfase celular o que se condensan precozmente. Dichas zonas se conocen como regiones heterocromticas constitutivas. Se localizan, por lo general, en las regiones pericentromricas y telomricas de los cromosomas y son ricas en ADN con pares G-C. Las regiones de los cromosomas que en interfase se espiralizan ms tardamente reciben el nombre de regiones heterocromticas facultativas. La localizacin de estas regiones es variable en funcin del tejido que se trate y el estado de desarrollo que se analiza. La localizacin de la heterocromatina (tanto constitutiva como facultativa) puede llevarse a cabo analizando cromosomas en placas metafsicas procedentes de cualquier organismo previo tratamiento y tincin especfica de las mismas. Las bandas de heterocromatina constitutiva, o bandas G, son observables con la tincin de Giemsa y su posicin es constante en los cromosomas a lo largo de todo el ciclo celular, razn por la cual se utilizan para la comparacin de genomas de especies emparentadas. NUMERO CROMOSMICO DE ALGUNAS ESPECIES Nombre cientfico Drosophila melanogaster Zea Mays Triticum dicoccum Triticum aestivum Triticum monococcum Soghum sp. Spinacea oleracea Allium cepa Raphanus sativus Columbia livia Canis familiaria Gallus domesticus Equus caballus Homo sapiens Ascaris megalocefala Lysandra nivescens Descripcin Mosca del vinagre Maz Trigo para pasta Trigo para pan Trigo escaa menor Sorgo Espinaca Cebolla Rbano Paloma Perro Gallo Caballo Hombre Un nemtodo Un lepidptero 2n 8 20 28 42 14 10,20,40 12 16 18 80 78 78 64 46 2 380

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Cariotipo TRABAJO PRCTICO Se utilizarn una fotografa de una placa metafsica de centeno (Secale cereale) 2n = 2x = 14 que ha sido tratada previamente con un cido una base e incubada con solucin tamponada antes de teirse con un colorante especial para cidos nucleicos. El tratamiento permite la visualizacin de bloques heterocromticos de posicin terminal, intersticial y pericentromrica a lo largo del cromosoma. La posicin de los bloques heterocromticos (bandas C) es constante aunque el tamao de los mismos puede variar bastante. En el trabajo prctico Vd. Deber identificar: 1.-Los diferentes tipos de cromosomas que presenta el centeno, en funcin de su morfologa. 2.-La/s constriccin secundaria y lo/s satlites. 3.-Los bloques heterocromticos y tambin deber: 4.-Confeccionar el cariotipo del centeno atendiendo a los requisitos enunciados anteriormente. Para ello: a)Recorte cada uno de los cromosomas de la fotografa dejando un reborde de 2mm. b)Identifique como par 1 al de mayor longitud. Coloque los siguientes pares de acuerdo a este criterio. CUESTIONARIO 1.Realice el cariotipo de centeno con la fotografa de una placa metafsica, que se adjunta en el guin. 2.Calcule el ndice centromrico de cada par de cromosomas homlogos. 3.En qu fase del ciclo celular se observan los cromosomas para el anlisis cariotpico? Por qu? 4.Las cromtidas de un cromosoma son idnticas a las cromtidas de su homlogo? Por qu? 5.Dos cromosomas homlogos, pueden tener bloques heterocromticos de distinto tamao? Por qu? 6.Qu tienen en comn dos cromosomas homlogos? 7.El centeno es una especie algama (fecundacin cruzada) con 2n = 14 cromosomas, mientras que la cebada es una especie autgama (autofecundacin) tambin con 2n = 14 cromosomas. Qu diferencias existirn entre un cariotipo de cebada y uno de centeno?

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Cariotipo

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Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster: Ciclo vital. Morfologa. Identificacin de mutantes

La Drosophila melanogaster es una mosca de tamao pequeo (3mm en estado adulto) ampliamente extendida por todo el mundo y abundante en frutas, especialmente si estn en fermentacin, por lo que se conoce como la mosca de la fruta o del vinagre. Se ha utilizado como organismo experimental en estudios genticos desde principios de siglo. Ha sido el organismo ms utilizado por los genticos, debido a que presenta grandes ventajas: -facilidad de cultivo -tiempo generacional corto (9 a 11 das a 25C) -progenie prolfica -pequeo tamao -nmero reducido de cromosomas 2n=8 -cromosomas politnicos en glndulas salivales -numerosos mutantes Medio de cultivo Existen varios medios de cultivo para D.melanogaster, a continuacin describimos el que hemos utilizado. Los ingredientes son: -Agua:2000ml -Harina de maz:137 g -Levadura en polvo:49 g -Agar:25 g -Sacarosa:50 g -Glucosa:97 g -Medio cido:25 ml (cido propinico + cido fosfrico) -Nipagina Se mezclan perfectamente todos los ingredientes, excepto el medio cido y la nipagina. Se calienta a bao Mara durante 45 minutos, removiendo para evitar grumos. Se retira la mezcla del fuego y se agrega el medio cido y la nipagina. Los componentes del medio cido se preparan y conservan por separado y se mezclan en partes iguales en el momento de aadirlo. El medio cido y la nipagina sirven para evitar la contaminacin por hongos y bacterias. Ciclo vital La D.melanogaster tiene un ciclo biolgico que incluye varios estados: huevo, larva, pupa, imago y adulto (ver figura). La duracin del ciclo de vida vara con la temperatura ambiental. A 25C, el ciclo de vida completo dura de 9 a 10 das, mientras que a 20C la duracin es de 15 das. La exposicin contnua a temperaturas superiores a 30C puede conducir a la esterilizacin y muerte de las moscas. As mismo, las bajas temperaturas, inferiores a 20C hacen decrecer la viabilidad de las moscas y prolongan su ciclo vital. La temperatura ptima para el cultivo es de 25C.

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Drosophila melanogaster

1-Huevo La fecundacin tiene lugar dentro del tero. A partir de la formacin del cigoto, comienza el desarrollo embrionario. El embrin se desarrolla dentro de las membranas del huevo, permaneciendo durante los estados iniciales del desarrollo en el cuerpo de la madre y siendo depositado despus. Una hembra puede empezar a depositar huevos despus del segundo da de emerger y la puesta puede continuar hasta unos 10 das despus. El huevo es de forma ovoide, cubierto por una fuerte membrana quitinosa, el corion, con la cara dorsal ms aplastada que la ventral que es redondeada. La superficie del corion presenta unas marcas o relieves hexagonales. El huevo viene a tener un tamao de 0,5mm. De su parte anterior se proyectan dos apndices en cuyo extremo se encuentran una especie de palas, a modo de remos, cuya funcin es la de hacer de flotadores para prevenir el hundimiento del huevo en la superficie semilquida en que son depositados. En la parte anterior, entre los dos apndices, hay un poro diminuto, el micropilo, que es precisamente por donde penetra el espermatozoide para fecundar a la clula huevo.

2-Larva Terminado el desarrollo embrionario emerge del huevo la larva, que es un pequeo gusanillo de gran movilidad, blanco, segmentado, con unas piezas negras en su regin anterior, mandbulas. En las regiones anterior y posterior tiene un par de espirculos de funcin traqueal. La larva sufre dos mudas hasta alcanzar el tamao adulto, a cada periodo entre muda y muda se le denomina estado larvario. El cambio se produce cuando se rasga la piel del estado anterior y sale de ella una larva un poco mayor. El primer estado larvario es el periodo comprendido entre el nacimiento y la primera muda, el segundo estado larvario comprende el periodo entre las mudas primera y segunda y el tercer estado larvario va desde la segunda muda hasta la inmovilizacin de la larva para dar lugar a la pupa. En el tercer estado larvario la larva llega a alcanzar un longitud de 4,5mm. Las larvas constituyen el material idneo para el estudio de los cromosomas politnicos presentes en las clulas de las glndulas salivales, de ah la necesidad de conocer sus caractersticas y desarrollo. Todo el periodo larvario es de gran movilidad, la larva no cesa de moverse y alimentarse formando unos canalillos caractersticos por todo el medio de cultivo. La distincin entre los estados larvarios se puede hacer fijndose tanto en el tamao de la larva como en el nmero de piezas mandibulares. El estado larval se extiende aproximadamente 4 das a 25C.

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Drosophila melanogaster

3-Pupa La larva en el tercer estado cambia sus espirculos por las antenas pupales y un poco despus se va inmovilizando y acortando su longitud, la cutcula se oscurece y fortalece formando el puparium. A esta prepupa se le puede considerar tambin como el cuarto estado larvario que termina con una muda. A partir de entonces comienza el periodo de pupa o crislida en el que se producen grandes cambios histolticos e histolgicos para dar lugar a los tejidos adultos. Las estructuras del adulto que se van adquiriendo van tomando ms forma y color conforme avanza el estado de pupa. Los tejidos localizados en el preadulto se llaman discos imaginales y, debido a la facilidad de su aislamiento se han utilizado mucho en Gentica del Desarrollo o Epigentica. El metabolismo pupal se centra en la sustitucin de los tejidos larvarios por los del adulto. 4-Imago. Las transformaciones histolgicas dan lugar a un individuo adulto, pero sexualmente inmaduro, llamado imago. Si el medio en el que se desarrolla el animal est a 25C, entre el cuarto y quinto da de la vida pupal se rasga el puparium y surge el imago. La Drosophila recin emergida es muy clara y tiene las alas sin desplegar. Una hora ms tarde despliega las alas y a las 12 horas ya tiene su pigmentacin normal de adulto. 5-Adulto El adulto es el estado reproductivo del ciclo. Los adultos sern sexualmente maduros despus de seis horas de emerger del pupario. En los machos, la formacin tiene lugar en los testculos. Las cuatro clulas derivadas de la meiosis de una clula madre son gametos viables y se acumulan en el saco eyaculador. En las hembras la clula madre de los gametos femeninos se divide en 16 clulas, de las cuales slo una experimenta meiosis, las otras se convierten en clulas nutritivas. La meiosis se detiene en metafase I. El esperma es almacena en las espermatecas y el receptculo seminal de la hembra ser descargado gradualmente en el oviducto, a medida que los huevos pasan a travs del mismo a la vagina. Cuando el espermatozoide penetra en el vulo inmaduro (fecundacin) contina la meiosis con la formacin de los corpsculos polares y la cariogamia. A continuacin el ncleo del huevo comienza a dividirse activamente. La hembra comienza a depositar huevos maduras al 2 da de haber emergido de la pupa; aproximadamente entre 50 y 70 huevos por da, durante los primeros das. La produccin de huevos decrece con el tiempo. El promedio de vida de la mosca adulta es de 37 das a 25C.

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Drosophila melanogaster

Cronologa del desarrollo de Drosophila melanogaster a 25C Por da Por hora Fase (aprox.) (aprox.) 0 0 Huevo depositado 0-1 0-22 Embrin 1 22 Eclosin del huevo (primer estadio) 2 47 Primera muda (segundo estadio) 3 70 Segunda muda (tercer estadio) 5 118 Formacin del pupario 5 122 Muda prepupal (cuarto estadio) 5.5 130 Pupa:eversin de cabeza, alas y patas 57 167 Pigmentacin de ojos pupales 9 214 Adulto emerge del pupario con alas dobladas 9 215 Las alas se expanden al tamao adulto

Morfologa externa El cuerpo de la mosca adulta se divide en: cabeza, trax y abdomen. La cabeza est compuesta por 6 segmentos fusionados. En ella se distinguen: -Antenas, un par, cada una formada por 3 segmentos -Probscide, lengua -Ojos compuestos, constitudos por numerosas facetas u omatidios (780 en las hembras, 740 en los machos) -Ocelo, tres, localizados entre los ojos compuestos, sobre la superficie dorsal de la cabeza. -Quetas o cerdas, rganos de los sentidos, de distinto tamao.

El trax est compuesto por tres segmentos fusionados. En l se distinguen: -Protrax, que lleva el primer par de patas. Cada pata consta de: Coxa, trocanter, fmur, tibia y 5 segmentos tarsales. -Mesotrax, que porta las alas y el 2 par de patas. Las alas tienen una estructura membranosa con 5 venas longitudinales y dos transversales cada una. -Metatrax, que lleva los halterios o balancines y el 3er par de patas.

El abdomen consta de 7 segmentos visibles en la hembra y 5 en el macho.

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Drosophila melanogaster Identificacin del sexo en la mosca adulta Las diferencias en los adultos son las siguientes: -Tamao. La hembra es ligeramente mayor que el macho. -Abdomen. La hembra tiene 7 segmentos visibles y el extremo posterior alargado, cada segmento abdominal tiene en la superficie dorsal una banda de color ms oscuro. El macho tiene 5 segmentos visibles y el extremo posterior redondeado; los dos ltimos segmentos estn fusionados. -Regin genital. La hembra tiene en la cara ventral del abdomen una placa anal y la placa vaginal. El macho tiene una placa anal y un arco genital de color pardo. Peine del sexo. Se encuentra slo en los machos. Es un conjunto de cerdas sobre cada segmento tarsal proximal del 1er par de patas. Tcnica de manipulacin Eterizacin de las moscas Es necesario inmovilizar las moscas para poder observarlas y transferirlas a los tubos con el medio de cultivo. Se utiliza el ter etlico como anestsico, durante 30 a 60 segundos. Las moscas sobreeterizadas mueren, se distinguen porque presentan el cuerpo encorvado y las alas extendidas, formando ngulo recto con el cuerpo y las patas tambin extendidas. Recoleccin de hembras vrgenes Las hembras de D. Melanogaster pueden acumular y utilizar el esperma de una inseminacin para una gran parte de su vida reproductiva. Por consiguiente, solamente hembras vrgenes deben ser usadas en cruzamientos predeterminados. Para obtenerlas, se vaca un tubo de cultivo de modo que no quede ningn adulto. Transcurridas menos de 8 horas se eterizan las moscas emergidas en ese periodo de tiempo, separando los machos de las hembras, que sern vrgenes. Identificacin de mutantes Se han descrito ms de 1000 mutantes diferentes de D. Melanogaster. Nosotros contamos con dos de ellos: ebony y white. La mutacin ebony produce un color muy oscuro, negro brillante en el cuerpo de la mosca. Se trata de una mutacin somtica que mapea en el cromosoma nmero 3. La mutacin white se caracteriza por producir individuos de ojos blancos, en vez de rojos del genotipo silvestre. Esta mutacin se encuentra en el cromosoma sexual X.

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Drosophila melanogaster

Descripcin de alelos mutantes La siguiente lista de mutantes de D.melanogaster es una versin abreviada de los cuatro grupos de ligamiento, correspondientes a los cuatro pares de cromosomas que posee esta especie. Cromosoma 1 Locus Smbolo Nombre 0.0 y yellow 0.0 sc scute 0.8 1.5 1.5 13.7 21.0 23.1 27.5 33.0 36.1 56.7 57.0 pn w wa cv sn oc t v m f B

66.0

bb

Descripcin cuerpo amarillo ausencia o marcada reduccin de ciertas quetas, especialmente las escutelares prune color de ojos ciruela white color de ojos blanco, ocelos, tubos de Malpighi y testculos incoloros White-apricot color de ojos naranja amarillento, alelo del white Cross-veinless venas transversales ausentes o presentes slo como trazos singed quetas enrrolladas y acortadas, hembras estriles ocelliless ocelos ausentes, tamao del cuerpo reducido, hembras estriles tan color de cuerpo canela o tostado vermilion color de ojos rojo bermelln brillante, ocelos incoloros miniature alas reducidas a 2/3 de su longitud normal forked cerdas cortas y retorcidas y el extremo hendido Bar (duplicacin) reduccin en el tamao del ojo que adopta la forma de una barra en los machos y en las hembras homocigotas; las hembras heterocigotas tienen ojos arrionados bobbed quetas escutelares posteriores ms cortas y delgadas que las normales.

Cromosoma 2 Locus Smbolo Nombre 13.0 dp dumpy 72.0 L Lobe 48.5 57.5 67.0 104.5 b cn vg bw black cinnabar vestigial brown

Descripcin alas reducidas a 2/3 del tamao normal, truncadas ojo lobulado, con 75% de penetrancia y expresividad variable cuerpo negro ojos de color rojo brillante que se oscurecen con la edad alas y halterios muy reducidos color de ojos marrn claro al emerger, oscurecindose con el tiempo, produce ojos blancos en combinacin con v, cn st

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Drosophila melanogaster

Cromosoma 3 Locus Smbolo Nombre 26.0 se sepia 40.4 D Dichaete

63.1

gl

glass

70.7

ebony

Descripcin color de ojos sepia que se oscurece en el adulto (inversip) alas separadas en ngulo de 45 del eje del cuerpo y 30 hacia arriba, letal en homocigosis aspecto vidrioso del ojo, debido a la fusin de facetas, los machos tienen ojos rojizos y las hembras ojos anaranjado amarillento, en el centro rodeado de un anillo incoloro; ocelos incoloros. cuerpo muy oscuro, negro brillante

Cromosoma 4 Locus Smbolo Nombre 0.0 ci cubitusinteruptus 2.0 ey eyeless 3.0 svn shaven 4.0 spa sparkling

Descripcin vena longitudinal IV del ala con varias muescas, cerca de la transversal posterior ojos reducidos a los 3/4 del ojo normal quetas del abdomen muy reducidas ojos muy brillantes en hembras

TRABAJO PRACTICO 1-Observacin de la distintas partes del cuerpo de D.melanogaster 2-Observacin de larvas, pupas y adultos 3-Distincin entre machos y hembras 4-Distincin entre individuos: -silvestres -ebony -white

Cuestionario 1-De qu color son los ojos del mutante ebony? 2-De qu color es el cuerpo de los mutantes white? 3-Cite tres diferencias entre machos y hembras de D. Melanogaster 4-En qu cromosoma se encuentra la mutacin white y en qu cromosoma la mutacin ebony? 5-Qu le sucede a los individuos de D. Melanogaster a ms de 30C?

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Drosophila melanogaster

Ciclo de vida con tiempos en das de Drosophila melanogaster a 25C

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Drosophila melanogaster

Estructura externa de Drosophila melanogaster

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Drosophila melanogaster

Diferencias entre macho y hembra

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Herencia de un solo gen autosmico

Herencia de un solo gen autosmico.

En Drosophila la mutacin ebony produce el color de cuerpo negro brillante. Esta mutacin es recesiva (ee) frente a su alelo dominante (e+e+) que produce individuos de fenotipo silvestre. Se han analizado 10 cruzamientos de hembra ebony por macho silvestre y otros 10 recprocos, de hembra silvestre por macho ebony. Los cruzamientos se hicieron con lneas puras. Se aislaron hembras vrgenes, siguiendo el procedimiento descrito en la prctica anterior. La F1 result toda de fenotipo silvestre, como estaba previsto. Se cruzaron individuos machos y hembras F1 para producir la F2. Las proporciones esperadas en esta descendencia son de : 1/4 e+e+ : 1/2 e+e : 1/4 ee. Los fenotipos esperados son: 3/4 silvestres: 1/4 ebony. Las proporciones esperadas son exctamente iguales para ambos tipos de cruzamientos recprocos, ya que se trata de un gen autosmico. hembra e+e+ (silvestre) x macho ee (ebony) hembra ee (silvestre)) x macho e+e+ (ebony)

F1:

e+e (silvestre)

F1:

e+e (silvestre)

F2: 1/4 e+e+:1/2e+e:1/4ee (3/4 silvestre :1/4 ebony)

F2: 1/4 e+e+:1/2e+e:1/4ee (3/4 silvestre :1/4 ebony)

TRABAJO PRACTICO
Cada pareja de alumnos tendr una placa con moscas F2. Se contarn el nmero de individuos, distinguiendo el nmero de silvestres y el nmero de ebony. Los datos se utilizarn para la prctica de chi-cuadrado.

Cuestionario
1-Complete la siguiente tabla: N Placa N de hembras silvestres N de hembras ebony N de machos silvestres N de machos ebony 2-Por qu se utilizan hembras vrgenes para la realizacin de los cruzamientos? 3-Existe alguna diferencia en los cruzamientos recprocos ebony x silevestre, en F1 y en F2?

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Herencia de un solo gen autosmico

F1

F2

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Herencia ligada al sexo

HERENCIA LIGADA AL SEXO

INTRODUCCIN El anlisis gentico de los hechos de la transmisin de caracteres ligados al sexo conllev al descubrimiento experimental del enlace de los genes con los cromosomas. De esta manera, el propio concepto de sexo de los organismos y los procesos de su transmisin obtuvieron una explicacin inesperada a la luz del estudio sobre el papel de los cromosomas en los fenmenos hereditarios. La investigacin sobre la citologa de las diferencias sexuales demostr que un sexo contiene dos cromosomas XX idnticos y el otro, una pareja heteromrfica de cromosomas XY. En el anlisis del curso de la herencia de una multitud de caracteres de los organismos, result que algunos de ellos son transmisibles.

OBJETIVO Comprobar la correlacin entre determinados genes y los cromosomas sexuales de ciertos mutantes de D.melanogaster.

MATERIALES Mutantes de D.melanogaster Moscas silvestres de D.melanogaster Medio de cultivo para moscas

METODOLOGA

1.

De los frascos recibidos para el experimento de Drosophila, espere la F1 y si alguna caracterstica esta ligada al sexo se presentarn proporciones 1:1 en una de las caractersticas. 2. Si esto no sucede quiere decir que ninguna de las mutaciones est ligada al cromosoma X o el sexual. 3. Si obtiene una proporcin 1:1 en la F1 haga un conteo de las moscas que presentan esta mutacin teniendo el cuidado de determinar el sexo de estas. 4. Elabore un reporte completo de por qu se da esta proporcin de 1:1 de moscas Drosophila mutantes y silvestres.

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Herencia ligada al sexo

EVALUACIN

Cuadro. Informe de las cruzas

P F1

Hembra con mutacin #HM #MM

#HS

Macho silvestre #MS

Donde P = parental F = filial HM = hembras con mutacin MM = machos con mutacin HS = hembras silvestres MS = machos silvestres

Aplicar a los resultados la prueba de Chi cuadrado, discuta y concluya para cada cruza. En qu influye que la caracterstica mutante sea introducida por el macho o la hembra en la cruza?. Ver los dos siguientes casos :

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Herencia ligada al sexo

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Herencia ligada al sexo

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Prueba de Bondad de Ajuste

Prueba de Bondad de Ajuste o de Homogeneidad: X2

La prueba de X2 (chi o gi cuadrado) se utiliza para establecer en qu medida los resultados obtenidos en una experiencia se ajustan a los valores esperados segn una hiptesis establecida previamente. Con esta prueba se puede determinar si las discrepancias existentes entre proporciones fenotpicas observadas y esperadas, para un determinado patrn de herencia, son estadsticamente significativas o son tan pequeas que se pueden atribuir al azar. Adems, toma en consideracin el tamao de la muestra y el nmero de variables. Vamos a estudiar su aplicacin prctica con un ejemplo. La hoja ancha normal del caf (normofolia) es dominante sobre la hoja angosta (angustifolia). Se cruz una planta de caf normofolia homocigtica NN con una planta angustifolia nn, toda la F1 fue normofolia. En la F2 se produjeron 84 plantas de hoja normal y 20 de hoja angosta. La porporcin esperada era de 3:1. Para comprobar esta suposicin primeramente se formula una hiptesis que se llama hiptesis nula (H0), que sostiene que la herencia se debe a un solo gen con dominancia completa y no existe diferencia significativa entre las proporciones observadas y espereadas. La hiptesis alternativa (Ha) defiende que las diferencias son significativas y la proporcin no es de 3:1. Se aplica la frmula:
n (on-en)2 (oi-ei)2 (o2-e2)2 (o1-e1)2 X2 = = + + ..... + en e1 e2 i=1 ei

o = valor observado e = valor esperado El valor esperado se calcula multiplicando la proporcin terica por el total de individuos observado. En el ejemplo: Proporcin fenotpica 3 1 4 X2 = 1,84 El nmero de grados de libertad es igual al nmero de clases fenotpicas menos 1. En nuestro ejemplo las clases fenotpicas son 2: normofolia y angustifolia, luego tendremos 1 grado de libertad. Observada 84 20 104 Esperada 78 23 104 o-e 6 -6 (o-e)2 36 36 (o-e)2/e 36/78=0,46 36/26=1.28 1,84

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Prueba de Bondad de Ajuste A continuacin se mira en la tabla, para 1 grado de libertad, entre qu valores est 1,84. Est entre 1,662 y 2,706, que corresponde a las probabilidades 0,20 y 0,10, que se encuentran arriba de las columnas respectivas. El valor de X2 se convierte en la tabla en la probabilidad de que las desviaciones ocurridas se deban al azar. Convencionalmente una hiptesis nula en la mayor parte de los experimentos biolgicos es rechazada cuando la desviacin es tan grande que puede ser explicada por azar, menos del 5% de las veces. Es decir, la zona de rechazo o de diferencias significativas en la tabla est del 0,05 hacia la derecha. Por lo tanto, en nuestro caso, aceptaremos la hiptesis nula, la proporcin observada se ajusta a la esperada 3:1, ya que la probabilidad (entre 10 y 20%) supera el valor crtico del 5%. Este nivel de significacin nos da la probabilidad sobre la que podemos rechazar o aceptar una hiptesis, pero no nos da una prueba absoluta de que la hiptesis sea cierta o falsa. Limitaciones de la prueba de X2 1-Debe ser usada con datos numricos absolutos, nunca en porcentajes derivados de los datos. 2-No puede ser usada con propiedad en los experimentos donde la frecuencia esperada dentro de cualquier clase fenotpica sea menor de 5. 3-Se usa slo para datos de carcter cualitativo, no cuantitativo. Prueba de Homogeneidad Por regla general, una experiencia se repite varias veces, pudindose comparar entre s, las diferentes repeticiones mediante el mtodo de X2. La prueba de homogeneidad se realiza para comparar si todas las experiencias son semejantes, es decir, si todas las muestras provienen de una misma poblacin. El valor total de X2 representar un valor global, siempre que se hayan obtenido muestras tomadas de una misma poblacin. Para aplicar esta prueba se debe determinar: a)Discrepancia total b)Discrepancia dentro de las muestras c)Discrepancia entre muestras

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Prueba de Bondad de Ajuste

a)Discrepancia total El sumatorio de todas las X2 de las muestras da la discrepancia total (DT). Ejemplo: 3 38 49 29 18 35 42 28 28 267

Experiencia 1 2 3 4 5 6 7 8 Total

9 124 140 85 71 77 118 72 72 759

3 41 51 30 22 32 51 31 32 290

1 11 12 12 9 11 12 5 9 81

X2 0,662 1,278 0,626 1,392 2,870 2,732 3,137 1,940 14,637

g.l. 3 3 3 3 3 3 3 3 24

DT = X2 = 14,637 para 24 g.l. En la tabla nos da una probabilidad entre 95 y 90 % de diferencias debidas al azar. b)Discrepancia dentro de las muestras La discrepancia dentro de una muestra (DD) es la X2 considerando que la experiencia fuera una sola , sumando los resultados. Prop. 9 3 3 1 16 Observ. 759 290 267 81 1397 Espera. 785,81 261,94 261,94 87,31 1397 (o-e) -27 28 5 -6 0 (o-e)2 729 787 25 36 (o-e)2/e 0,927 2,992 0,095 0,413 2 X = 4,427

786 262 262 87 1397 P = 20-30%

X2 = 4,427 para 3 g.l. c)Discrepancia entre las muestras

Es la diferencia entre la discrepancia total y la discrepancia dentro de las muestras. DE = DT DD Para 24-3 = 21 g.l. X2 = 12,937 4,427 = 8,510 P = 99-100 %.

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Prueba de Bondad de Ajuste TRABAJO PRACTICO Se recogern los datos de las F2 de los cruzamientos monofactoriales de la prctica de herencia de un solo gen autosmico. Se contarn por separado los cruzamientos recprocos. Se realizar la prueba de homogeneidad de X2, calculando la discrepancia total, la discrepancia entre las muestras y la discrepancia entre muestras. Se recogern los datos de la prctica de las leyes de Mendel, Mendel simple y Mendel complejo; de los cruzamientos monofactoriales y bifactoriales y se realizar la prueba de homogeneidad de X2.

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Casos prcticos de las leyes de Mendel

LOS EXPERIMENTOS DE MENDEL

El concepto de gen fue propuesto por primera vez en 1865 por Gregorio Mendel. El trabajo de Mendel constituye el prototipo del anlisis gentico. En uno de sus primeros experimentos, Mendel utiliz polen de una planta de flores blancas para polinizar una planta de flores prpuras. Estas plantas de lneas puras constituyen la generacin parental (P). Todas las plantas resultantes de este cruzamiento tenan las flores de color prpura. Esta generacin de descendientes se denomina primera generacin filial (F1). 1. Plantas que difieren en un carcter (cruzamiento monohbrido) P Gametos F1 F2 A a A a AA Aa Aa aa AA slo A x aa slo a

(cigoto Aa)

AA: Aa: aa 2. Plantas que difieren en dos caracteres (cruzamiento dihbrido), en el que las lneas puras parentales difieren en dos genes que controlan dos diferencias de caracteres distintas. P Gametos F1 F2 AB Ab aB ab 9 A_B_ 3 A_bb 3 aaB_ 1 aabb AABB slo AB x aabb slo ab

(cigoto AaBb) AB AABB AABb AaBB AaBb Ab AABb AAbb AaBb Aabb aB AaBB AaBb aaBB aaBb ab AaBb Aabb aaBb aabb

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Casos prcticos de las leyes de Mendel

INTERACCIONES GENICAS Razones mendelianas dihbridas modificadas por interacciones gnicas Tipo de interaccin gnica Cuatro fenotipos distintos Accin gnica complementaria Supresin dominante de A sobre el gen B Epistasia recesiva de aa sobre los alelos B/b Epistasia dominante de A sobre los alelos B/b Genes duplicados

A-B9 9

A-bb 3

aaB3 7 3 4 3

aabb 1

13 (9+3+1) 9 12 15 3

1 1

Diferentes conceptos: Gen (factor heredable que determina una caracterstica biolgica de un organismo) Alelo (son los dos genes individuales de un par gnico) Cruzamiento prueba (es el cruce de un individuo con el homocigoto recesivo) Retrocruzamiento (es el cruce entre un individuo por cualquiera de sus parentales)

Trabajo prctico Material de trabajo Color Morado Blanco Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Endospermo Almidonado Almidonado Cereo Rugoso Almidonado Almidonado

Purple starchy White Starchy Yellow waxy Yellow sweet Red Starchy Yellow starchy

1. Cruces monohbridos (un solo carcter) Cruce1: Color R

P F1 F2 Purple RR x Rr ? Yellow rr F1 a) Rr x Rr (1/4RR,1/2Rr,1/4rr) (3 Purple: 1 yellow) b) Rr x RR (1/2Rr,1/2RR) (purple) c) Rr x rr (1/2Rr, 1/2rr) (1 purple: 1 yellow)

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Casos prcticos de las leyes de Mendel

Cruce 2:
P F1 F2

Color R Yellow rr

Cruce 3:
P

Color C Red x Cc ? White cc

Purple RR x Rr ?

CC F1 F2

Cruce 4: Color C
P F1 F2 Red CC x Cc ? White cc

Cruce 5: Endospermo
P F1 F2 Starchy Sweet SuSu x susu Susu ?

Cruce 6: Endospermo
P F1 F2 Starchy Sweet SuSu x susu Susu ?

Cruce 7: Endospermo
P F1 F2 Starchy Waxy WxWx x wxwx Wxwx ?

Cruce 8: Inhibicin del color

P F1 F2 Yellow Purple CC x CC CC ?

CC, CC Inhibe el color (color blanquecido) CC (no inhibe el color)

2. Cruces dihbridos (dos caracteres) Cruce 9: Alelos R y Su

P F1 F2 Purple Starchy Yellow sweet RRSuSu rrsusu RrSusu ? a) RrSusu x RrSusu b) RrSusu x RRSuSu c) RrSusu x rrsusu

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Casos prcticos de las leyes de Mendel

Cruce 10: Alelos R y Su

P F1 F2 Purple Starchy Yellow sweeet RRSuSu rrsusu RrSusu ? Inhibicin del color CC, CC Inhibe el color (color blanquecido) CC (no inhibe el color)

Cruce 11: Alelos C y Su

P F1 F2

Yellow sweet Purple starchy CCsusu x CCSuSu CCsusu (se autofecunda) ?

3. Interaccin gnica Cruce 12: Alelos Y y R (El alelo R es dominante sobre Y/y)
R (determina color purple) r (permite la manifestacin de los genes del loci Y) Y (determina el color white) y (determina el color yellow) P F1 F2 Purple Yellow YYRR x yyrr YyRr ? El fenotipo de la F2 ser: (purple:white:yellow)

Cruce 13: Alelos Pr y R

R (determina color purple y domina sobre los otros genes Pr/pr) r (permite la manifestacin de los genes del loci Pr) Pr (determina color red) pr (en homocigosis domina sobre la expresin de los otros genes, presentando color white) P F1 F2 Purple White RRPrPr x rrprpr RrPrpr ? El fenotipo de la F2 ser (Purple:red:white)

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Casos prcticos de las leyes de Mendel

Cruce 14: Alelos C e Y

C (determina color yellow, no permite la manifestacin de los genes del loci Y) c (permite manifestacin de los genes del loci Y) Y (determina color white) yy (en homocigosis domina sobre los genes del loci C permitiendo el color purple) P F1 F2 Yellow CCYY x Purple x ccyy CcYy ? El fenotipo de la F2 ser (yellow:White:purple)

Cruce 15: Alelos C y R (color)

La falta de color se produce por el alelo recesivo de cualquier pareja gnica (cc,rr), el fenotipo rojo se debe a la combinacin de los alelos dominantes de ambas parejas. P F1 F2 White CCrr White ccRR

x CcRr ?

El fenotipo de la F2 ser (Red:white)

Cruce 16:

Alelos C y R CC, CC ( no permiten la manifestacin de los genes del loci R) CC (permite la manifestacin de los genes del loci R)

Inhibicin del color

P F1 F2

Yellow Purple CCrr x CCRR CCRr ? El fenotipo de la F2 ser (yellow:purple)

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Extaccin de ADN genmico

EXTRACCIN DE ADN GENMICO

Existe un elevado nmero de protocolos para la extracccin de ADN que presentan diferencias dependiendo del tipo de organismo, del tejido de partida o de la calidad final deseada del ADN. La metodologa clsica consiste en una primera homogenizacin mecnica del tejido en un tampn de extraccin. Este tampn est generalmente compuesto por Tris, que proporciona las propiedades tamponadoras, un quelante (EDTA) para inhibir la accin de ADNsas, una sal (normalmente cloruro sdico) y un detergente que faciliten la ruptura de las membranas celulares y nucleares. El ADN puede separarse de las protenas y restos celulares mediante precipitacin de las protenas facilitada por la presencia de dodecil sulfato sdico (SDS) y acetato potsico (el ADN permanece en suspensin tras la precipitacin por centrifugacin), o alternativamente, utilizando cloroformo para separar las protenas de la fase acuosa, donde permanece el ADN. La extraccin con cloroformo permite obtener un ADN ms puro y menos sensible a degradacin, aunque tiene el inconveniente del manejo de disolventes orgnicos. El ADN en disolucin puede ser concentrado y purificado por precipitacin con etanol o isopropanol para posteriormente resuspenderse en un volumen apropiado de tampn TE o agua. Los tejidos vegetales presentan dos caractersticas especficas que hay que tener en cuenta a la hora de poner a punto un protocolo de extraccin de ADN: a) Contenido en fenoles. Al homogeneizar el material se liberan fenoles que se oxidan rpidamente y pueden provocar la prdida del ADN. Para evitarlo se aaden al tampn de extraccin compuestos antioxidantes como el beta-mercaptoetanol o el bisulfito sdico (este ltimo ms recomendable ya que el primero es voltil y txico). b) Contenido en polisacridos. Las paredes de las membranas celulares vegetales estn compuestas fundamentalmente por celulosa y otros polisacridos, que son muy solubles y precipitan con el ADN, por lo que son contaminantes muy difciles de evitar. Como consecuencia, el precipitado final de ADN adquiere una consistencia gelatinosa, lo que dificulta el pipeteo e incluso puede inhibir la digestin del ADN con enzimas de restriccin. Material y soluciones a utilizar: Soluciones 1.-Solucin de Lisis parte A (Buffer de extraccin de ADN: Tris y EDTA) 2.-Solucin de Lisis parte B (SDS 20% y .-mercaptoetanol) 3.-Solucin de Precipitacin (Acetato potsico 5M pH7 (KoAc + RNAsa) 4.-Solucin de unin al ADN (Resina) 5.-Solucin de lavado (etanol + sales + agua esteril) 6.-Solucin de elusin (10mM Tris pH8 y 10mM EDTA pH8.) Columnas de filtracin (Azules) Columnas de unin a cidos nucleicos (rojas) Tubos eppedorf + micelio del dicarionte Pleurotus ostreatus var. florida, + juego de micropipetas, bao de agua, centrfuga de mesa, tubos, hielo, gradillas. 50

Extaccin de ADN genmico

Instrucciones de preparacin: Antes de comenzar el procedimiento hay que hacer lo siguiente: -.Precalentar el bao a 65 C -.Precalentar la solucin de unin a cidos nucleicos (n 4) a 65C para que se disuelva bien la resina y dejar enfriar a temperatura ambiente. - Precalentar la solucin de elusin (n6). Procedimiento: 1. PULVERIZAR: 1 a 2 g. de micelio del hongo con N2 lquido. 2. LISIS CELULAR: Se aaden 350l de la Solucin de Lisis A (n 1) y 50l de la Solucin de Lisis B (n 2) a las muestras trituradas. Las muestras se agitan en un Vrtex y se introducen en un bao a 65C con el fin de romper las membranasa citoplasmticas y nucleares de las clulas y liberar as el material gentico. 3. PRECIPITACIN DE LOS RESTOS CELULARES: Se aaden 130l de Solucin de Precipitacin (n 3), se mezcla todo mediante inversin y se introduce en hielo durante 5 minutos. Se centrfuga durante otros 5 minutos en una microcentrfuga refrigerada a 4C para provocar la separacin de la fase acuosa y los restos celulares. 4. RECOGIDA DEL SOBRENADANTE: El sobrenadante se pipetea y se aade al eppendorf fque contiene la columna de filtracin (De color AZUL) que recoge los restantes residuos celulares que no han sido eliminados en el paso anterior. Dicha columna se desecha tras la centrifugacin a alta velocidad durante 1 minuto. 5. PREPARACIN PARA LA UNIN: Al sobrenadante del paso anterior se aaden 700l de la Solucin de Unin a cidos nucleicos (n4) y se mezcla mediante inversin. Dicha solucin lleva una resina (bolas de resina) que se pegan a nuestro ADN genmico. 6. RECOGIDA DEL ADN: La muestra se pasa a travs de una nueva columna de unin a cidos nucleicos (de color ROJO) que posee una membrana sobre la que se queda adherida la resina junto con el ADN genmico, por lo que en este paso se descarta el sobrenadante del tubo eppendorf despus de centrifugar 1 minuto a mxima velocidad. 7. LAVADO DE LA COLUMNA: La columna roja en donde se encuentra nuestro ADN genmico del paso anterior se coloca en un nuevo tubo eppendorf de 2 ml, y se aade 500l de la Solucin de Lavado (n 5). Tras esto se centrfuga a mxima velocidad durante 1 minuto y se vuelve a eliminar el sobrenadante. Esta operacin se vuelve a realizar una vez ms. 8. OBTENCIN DEL ADN GENOMICO: La columna roja donde se encuentra nuestro ADN genmico unido a la resina se introduce en un nuevo tubo eppendorf de 2ml, y al que se aaden 100l de Solucin de Elusin (n6) que se encuentra precalentada a 65C, se deja actuar durante 2 minutos y se centrfuga a mxima velocidad durante 1 minuto. De esta manera y tras la centrifugacin, conseguimos resuspender el ADN y obtener la solucin de ADN genmico procedente de la muestra de la cual partimos. CUESTIONARIO 1.Para qu se utiliza el Nitrgeno lquido en una extraccin de ADN? 2.Qu es y para que se utiliza el EDTA? 3. Realiza un esquema de todo el proceso de extraccin de ADN

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Cuantificacin de ADN y Electroforesis

CUANTIFICACIN DE ADN Y ELECTROFORESIS

Material a utilizar: - Espectofotmetro - Cubeta de electroforesis y fuente de energa - Agarosa , TAE 1X - Tampn de carga y marcador de peso molecular -E-H (80ng/l) Dos mtodos son usados para medir la cantidad de cidos nucleicos en una preparacin. Si la muestra es pura, (sin gran cantidad de sustancias contaminantes como protenas, fenol, agarosa, o cidos nucleicos), se toman medidas por espectofotometra de las cantidades de radiaciones ultravioletas absorbidas por las bases. Si la cantidad de ADN o ARN es muy pequea o si la muestra contiene gran cantidad de impurezas, la medida de cidos nucleicos puede ser estimada por la intensidad de fluorescencia emitida por el bromuro de etidio. Determinacin de la cantidad de ADN o ARN por espectofotometra Para cuantificar la cantidad de ADN o ARN , deben utilizarse longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm nos permite calcular la concentracin de cidos nuclicos de ADN de la muestra. Longitudes de onda de 1.0 corresponden aproximadamente a 50 g/ml para ADN de doble cadena, 40 g/ml ARN y ADN de cadena simple , y aproximadamente 20 g/ml de oligonucletidos para cadena simple. El cociente entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (OD260 /OD280 ) estima la pureza de los cidos nucleicos. En preparaciones puras de ADN y ARN se obtienen cocientes de OD 260 / OD 280 entre 1.8 y 2.0. Si hay contaminacin con protenas, fenoles ,etc. el cociente OD260/ OD280 ser menor. Trabajo a realizar: En un eppendorf poner 970l de agua estril y 30 l del ADN genmico extrado. Medirlo a 260 y 280nm y calcular la concentracin y pureza de dicho ADN. Calcular la cantidad que tenis que utilizar para obtener una muestra de 100l de dicho ADN genmico a una concentracin de 100ng/l. Cuantificacin de la cantidad de doble cadena de ADN mediante fluorescencia de bromuro de etidio. Algunas veces no hay suficiente ADN (< 250 ng/ml) para poder cuantificar mediante espectofotmetro, o el ADN est ltamente contaminado con otras sustancias que absorben la radiacin ultravioleta e impiden la realizacin del anlisis. Un camino rpido para estimar la cantidad de ADN en cada muestra es utilizar la fluorescencia inducida por luz ultravioleta que emiten las molculas de bromuro de etidio intercaladas en el ADN. Como la cantidad de fluorescencia es proporcional al total de la cantidad de ADN , la cuantificacin de ADN en una muestra puede ser estimada por comparacin de fluorescencia con marcadores estndar de tamao y concentraciones conocidas.

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Cuantificacin de ADN y Electroforesis

Precauciones: El bromuro de etidio es un potente mutgeno y es ltamente txico. Cuando se trabaja con soluciones que contienen bromuro de etidio es necesario la utilizacin de guantes, y tras su uso, estas soluciones deben ser neutralizadas. Por otro lado, la radiacin ultravioleta es peligrosa, es necesario el uso de protectores oculares como gafas, mscaras, etc.

Trabajo a realizar:
1. Disolvemos la agarosa (polmero lineal) en tampn TAE (400 mM Tris, 200 mM, 20 mM EDTA pH 8 y Actico glacial) a la concentracin deseada, normalmente entre el 0.8-2 %, en nuestro caso al 0.8 %) Fundimos la agarosa en un microondas hasta que la solucin est completamente transparente, dejamos enfriar un poco y aadimos bromuro de etidio, 5 ml de la solucin de bromuro de etidio 20 mg/ ml por cada 100ml de TAE 1X (recordar que el bromuro de etidio es un potente agente mutagnico, por lo que es necesario el uso de guantes). Cuando la solucin de agarosa est templada se vierte sobre el molde para que solidifique el gel. 2. En un eppendor ponemos 5l de la muestra de ADN genmico extrado y le aadimos 2 l de tampn de carga (glicerol+ 2 colorantes). 3. En uno de los pocillos del gel introducimos una muestra control (habitualmente ADN del fago lambda digerido con EcoRI y Hind III) que nos permitir conocer el tamao de las bandas de nuestra muestra tras la electroforesis. Fago -E-H 21.227, 5.148, 4.973, 4.268, 3.530, 2.027, 1.904, 1.584, 1.375, 947, 831, 564, 125 pb 4. Realizamos la electroforesis a un voltaje entre 70-100 V, en tampn TAE, durante aproximadamente 1 hora. CUESTIONARIO 1: Calcula la concentracin y pureza de tu muestra de ADN genmico de Pleurotus ostreatus mediante las longitudes de onda obtenidas en el espectofotmetro. 2. En la electroforesis, Hacia qu polo (positivo o negativo) migra el ADN? 3. Para que sirve el tampn de carga? 4. Cul es la funcin del marcador de peso molecular en un gel de electroforesis?

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Reaccin de la polimerasa en cadena

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Qu es la PCR? Es un mtodo enzimtico que permite copiar de forma exponencial una zona concreta de un genoma, pudindose obtener millones de copias de ella. La PCR permite obtener millones e incluso miles de millones de copias de cualquier secuencia seleccionada del DNA genmico en unas pocas horas. Una propiedad importante de esta tcnica es que no hace falta que el segmento de ADN elegido sea separado del ADN genmico antes de comenzar el procedimiento de amplificacin. Sin embargo, una vez se ha amplificado, el segmento puede fcilmente separarse del resto del ADN (que no se ha multiplicado) mediante la electroforesis en gel. El proceso de la PCR se lleva a cabo ciclicamente en un instrumento denominado termociclador y cada ciclo, est dividido temporalmente en tres fases trmicas: desnaturalizacin (separacin de las dos hebras componentes del ADN bicatenario), acoplamiento (unin de los cebadores o primers) y polimerizacin (sntesis de la cadena complementaria). Los elementos necesarios para tcnica de la PCR son: el ADN de la muestra, los oligonucletidos o primers, la enzima de la polimerizacin y un amortiguador que lleva como ion fundamental el Mg2+. La tcnica de PCR se divide en tres etapas que son: la extraccin , amplificacin y deteccin. Extraccin del acido nucleico Sea cual sea la muestra biolgica, debemos extraer los cidos nucleicos para su posterior amplificacin. Se puede extraer ADN de cualquier tipo de muestra (clulas epiteliales, pelo, fsiles). Existen muchos mtodos de extraccin de cidos nucleicos y entre ellos hay que seleccionar el ms apropiado para cada tipo de microorganismo o clula con la que vamos a trabajar. Cualquier mtodo de extraccin de cidos nucleicos , para ser bueno ha de cumplir las siguientes condiciones: ser rpido, ha de producir un alto rendimiento y ha de implicar la mnima manipulacin posible. Amplificacin Los componentes fundamentales que se utilizan en este proceso son la Taq polimerasa I, los dNTPs, el tampn de amplificacin, los primers o cebadores y el ADN diana. La Taq pol I es la enzima encargada de copiar el ADN diana. Se utiliza una ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus que vive en ambientes de aguas calientes a unos 75C de temperatura. (esta enzima es estable a una temperatura de 94C lo que le permite permanecer activa durante todo el proceso de PCR). Como cualquier polimerasa, esta enzima requiere para su actuacin la presencia de un pequeo cebador, iniciador o primer que forme con el ADN diana un duplex de 54

Reaccin de la polimerasa en cadena ADN y de esta forma le indique dnde comenzar la amplificacin. El rendimiento de la polimerizacin es de unos 35 nucletidos por segundo y por molcula a una temperatura de 72C. Solucin de nucletidos: En la reaccin de amplificacin son necesarios los cuatro desoxinucletidos que componen el ADN (dATP,dGTP,dCTP y dTTP). Tampn de amplificacin: Sus componentes fundamentales son Tris-ClH, KCl y MgCl2.Este ltimo es muy importante, ya que una ligera variacin en su concentracin puede afectar al rendimiento de la reaccin, al acoplamiento de los primers, al pH de disociacin de ADN diana y de los productos de PCR y a la formacin de uniones inespecficas entre primers. Iniciadores: Tambin llamados primers, cebadores u oligonucletidos. Son molculas de ADN monocatenario formados por 10 a 30pb. En la PCR se suelen utilizar dos, de manera que cada uno se acopla a cada una de las hebras complementarias del ADN diana. Los iniciadores son necesarios porque la polimerasa requiere pequeas fracciones de ADN doble para comenzar a polimerizar, as pues, el punto de inicio de la sntesis de nuevas cadenas de ADN lo establece la posicin del iniciador. Los primers, cuya secuencia es conocida, flanquean la porcin de ADN que interesa amplificar. Es condicin indispensable que los iniciadores sean especficos del ADN que vamos a amplificar. Longitud del oligonucletido: Los primers cortos disminuyen la especificidad de la reaccin y los demasiado largos, sin aumentar la especificidad, generan un coste adicional de su sntesis. Por ello, los primers idneos deben oscilar entre los 15 y 30pb. Temperatura de fusin (Tm): Respecto a la unin primer-ADN diana. Es la temperatura a la que el 50% de las hebras se encuentran separadas. A partir de ella obtendremos por diversas frmulas, la temperatura ptima de acoplamiento. La reaccin en cadena de la polimerasa se basa en un proceso enzimtico in vitro mediante el cual, a partir del ADN diana de la muestra, se pueden obtener mltiples copias de una zona concreta del genoma que representa. Esa zona estar delimitada por los dos iniciadores que necesita la enzima de polimerizacin para comenzar la reaccin. Las tres bases fundamentales de la PCR son: desnaturalizacin, acoplamiento y polimerizacin. Estas tres fases se repetirn n ciclos para obtener 2n copias de esa zona concreta del genoma. 1.Desnaturalizacin Cuando el ADN se calienta a temperaturas prximas a los 100C, se separan las dos hebras que forman la cadena, debido a la rotura de los enlaces que forman los puentes de hidrgeno por efecto del calor. Se dice que el ADN se ha desnaturalizado. Esta fase se lleva a cabo a una temperatura entre 93 y 95C y durante un tiempo de 30 segundos a 2 minutos.

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Reaccin de la polimerasa en cadena 2.Acoplamiento Se llama as al proceso por el que los iniciadores buscan la molcula de ADN diana y se unen, cada uno al lugar especfico de las hebras separadas. La temperatura para este paso oscila entre 45 y 65C y el tiempo de aplicacin es de 30 segundos a 2 minutos. 3.Polimerizacin En este paso la enzima polimerasa comienza a copiar la hebra de ADN diana, que acta como molde, a partir del extremo 3 que le indica el iniciador. La temperatura del proceso es de 70C a 74C durante 30 segundos a 3 minutos. Nmero de Ciclos: El nmero de molculas de amplificado que se obtiene viene representado por (1 + X)n, donde n es el nmero de ciclos y X el rendimiento de cada ciclo. El nmero de ciclos que se suelen realizar en cada PCR oscila entre 25 y 40. Con ms de 40 ciclos no se aumenta el rendimiento de la reaccin, incrementndose la cantidad de productos indeseables que causan ruido de fondo (efecto PLATEAU).

TRABAJO PRCTICO Vamos a localizar el gen vmh3 (que expresa una proteina llamada Hidrofobina que recubre la superficie de la seta para aislarla del medio acuoso Hidrofoba-). Para ello tenemos diseados unos oligonucletidos o primers que delimitan dicho gen. -Vamos a disear una reaccin para amplificar el fragmento de ADN que corresponde al gen de la hidrofobina y que se encuentra dentro del ADN genmico. Para su amplificacin utilizaremos los oligonucletidos o primers 5vmh3 directo y 3vmh3 reverso que se encuentran flanqueando el ADN del gen que queremos amplificar. De la extraccin de ADN genmico obtenido en la anterior prctica y una vez calculada su concentgracin, haremos una dilucin para PCR. Vamos a utilizar una muestra de ADN genmico de 100ng/l resuspendido en agua esteril. Por reaccin: Cl2Mg Buffer 10x dNTPs Taq Oligo reverso Oligo directo H2O estril 1 l 2,5 l 0.5 l 0.5 l 1 l 1 l 17,5 l 24 l + 2 l dilucin del ADN genmico (100ng/l)

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Reaccin de la polimerasa en cadena CUESTIONARIO 1. Para que se utilizan el oligonucletido directo y reverso en una reaccin en cadena? 2. De qu depende el valor de la temperatura de unin de los oligonucletidos en el paso Acoplamiento en la PCR? 3. Por qu se utiliza Taq polimerasa en la reaccin en cadena y no se utilizan otro tipo de polimerasas?

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