ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA La electroforesis en gel es el mtodo convencional para separar muchas molculas de DNA de diferentes longitudes.

Tiene muchas aplicaciones en el anlisis del tamao de los fragmentos de DNA y tambin se le puede utilizar para separar molculas de RNA. Electroforesis se define como el movimiento de molculas con carga en un campo elctrico: las molculas con carga negativa migran hacia el electrodo positivo y las molculas con carga positiva, hacia el electrodo negativo. Al principio la tcnica se llevaba a cabo en solucin acuosa, en la que los factores predominantes influyen en la velocidad de migracin son la forma de la molecular y su carga elctrica. Esto no es de particular utilidad para separar ADN tiene la misma forma (lineal) y, aunque su carga depende de su longitud, las diferencias de carga no son suficientes para determinar una separacin eficaz. La situacin es diferente cuando la electroforesis se aplica en un gel, por que ahora la forma y la carga son menos importantes, y la longitud molecular es el determinante crtico de la velocidad de migracin. Esto se debe a que el gel es una red de poros a travs de los cuales deben viajar las molculas de DNA para alcanzar el electrodo positivo. Los poros obstaculizan menos a las molculas ms cortas que las molculas mas largas y, as, las primeras se mueven con mas rapidez a travs del gel. Por lo tanto, molculas de diferentes longitudes forman bases de gel. Se utilizan dos tipos de gel: geles de agarosa y geles de poliacrilamida. La agarosa es un polisacrido que forma geles con poros que varan de 100nm a 300nm de dimetro; el tamao depende de la concentracin de agarosa de gel. Por ende, la concentracin del gel determina el rango de fragmentos de DNA que se pueden separar. El rango de separacin tambin se ve afectado por el valor que la agarosa muestra en la electroendsmosis (EEO), que es un parmetro de la cantidad de aniones sulfato y piruvato unidos. Cuando mayor es el valor en la EEO, ms lenta es la velocidad de migracin de una molcula con carga negativa, como el DNA. Un gel de agarosa se prepara mezclando la cantidad apropiada de polvo de agarosa con una solucin de sustancia amortiguadora (buffer), calentndola hasta disolver la agarosa y , despus vertiendo el gel derretido sobre una placa Perspex con cinta alrededor de los lados para evitar los derrames. Se coloca un peine formador de pocillos para muestras en gel. Se permite que en el gel se asiente y, despus se practica la electroforesis con el gel sumergido bajo la sustancia amortiguadora. Para seguir el proceso de la electroforesis se aaden uno a uno los colorantes con velocidades de migracin conocidas a las muestras de DNA se visualizan embebiendo en gel en solucin de bromuro de etidio, compuesto que se intercala entre los pares de bases del DNA y emite fluorescencia cuando es activado por radiacin ultravioleta. Segn la concentracin de agarosa del gel, se puede separar en bandas definidas tras la electroforesis fragmentos de 100 pares de bases (pb) a 50 kb de longitud. Por ejemplo, se puede emplear un gel al 0,3% para molculas de 5 kb a 50 kb, y un gel al 5% para molculas de 100-500 pb de longitud. Los fragmentos de menos de 150 pb de largo se pueden separar en un gel de agarosa al 4% o al 5%, lo que permite distinguir bandas que representan molculas que difieren de tamao solo por un nucletido. En cambio, con fragmentos mas grandes, no siempre es posible separar molculas de tamao similar, aun en geles con concentracin mas baja de agarosa.

APLICACIONES CLINICAS

PCR Y RT-PCR. La PCR es una tcnica, inventada en 1985 de amplificacin enzimtica del ADN que se basa en la complementariedad de las bases que lo forman (adenina, timina y guanina y citosina) y en su capacidad para desnaturalizarse y renaturalizarse por efecto de la temperatura (separacin de sus dos cadena) para llevarla a cabo se sintetiza una pareja de oligonucletidos (fragmentos pequeos de ADN) que son complementarios de la regin que queremos amplificar, delimitan el tamao de lo que ser el producto de la PCR y determinan la especificidad de la tcnica para su diseo se necesita conocer previamente la secuencia de la regin que se quiere amplificar. Esta tcnica permite amplificar con rapidez cualquier segmento especifico dentro de una o varias molculas de DNA (copiadas muchas veces) en un tubo de ensayo. Gracias a estas maquinas automticas, la PCR puede crear miles de millones de copias de un segmento especifico de DNA en pocas horas a una velocidad significativamente mayor que la requerida para obtener la misma cantidad de copias a travs de la bsqueda n bsqueda sistemtica de un clon con el gen en cuestin en una gran genoteca de DNA y dejar que se replique dentro de las clulas husped. En el procedimiento de la PCR un ciclo de tres fases desencadena una reaccin en cadena que produce una poblacin de molculas de DNA y luego se enfra para permitir la hibridacin (enlaces de hidrogeno) de los cebadores cortos de DNA de cadena simple complementarios a las secuencias en cada extremo de las cadenas opuestas de la secuencia diana; por ultimo una DNA polimerasa termoestable extiende los cebadores en direccin 5-> 3. Si se empleara una DNA polimerasa convencional, la protena se desnaturalizara junto con el DNA durante el primer paso de calentamiento y debera sustituirse despus de cada ciclo. La clave que condujo la automatizacin de la PCR fue el descubrimiento de una DNA polimerasa termoestable poco comn, que se aisl por primera vez de procariontes que viven en manantiales calientes y pueden soportar el calor que se produce al comienzo de cada ciclo. La especificidad de la PCR es tan impresionante como su velocidad, solo se requieren cantidades mnimas de DNA en el material inicial, y este DNA incluso puede presentar una degradacin parcial.

El fundamento de eta gran especificidad solos cebadores, que solo forman enlaces de hidrogeno con secuencias en los extremos opuestos del segmento diana al final del tercer ciclo, una cuarta parte de las molculas es idntica al segmento diana y ambas cadenas tienen el largo adecuado. Con cada ciclo sucesivo se duplica la cantidad de molculas del segmento diana que tienen el largo adecuado y, en poco de estas superan en cantidad al total de molculas de DNA que participan en la reaccin. Pese a su velocidad y especificidad, la amplificacin con PCR no puede remplazar la clonacin de genes en clulas cuando se desea obtener grandes cantidades del gen. El desarrollo de errores ocasionales durante la replicacin por PCR limita la cantidad de copias adecuadas que cabe obtener con este mtodo. Sin embrago la PCR se usa cada vez con mas frecuencia para crear cantidades suficientes de fragmentos de DNA que posteriormente se pueden clonar tras la simple insercin de un vector. APLICACIONES CLINICAS Esta tcnica se emplea para amplificar DNA a partir de una amplia variedad de fuentes: DNA de huellas digitales o de cantidades nfimas de sangre, tejido o semen obtenido de una escena de crimen, DNA de clulas embrionarias para realizar un diagnostico prenatal rpido de trastornos genticos y DNA de genes virales prevenientes de clulas infectadas con virus que son difciles de detectar como por ejemplo VIH. RT-PCR La tcnica RT-PCR (del ingles reverse transcriptase) permite convertir el mRNA en DNA y copiar la secuencia de DNA especifica de inters Los retrovirus de RNA que, como parte de su ciclo vital, fabrican una copia de DNA de su genoma RNA. Este hecho se cumple por la accin de la enzima transcriptasa inversa (reverse transcriptase, RT). El agregado de una etapa RT anterior a la PCR hace posible amplificar y detectar RNA. Esto puede suceder en una reaccin tanto de una como de dos etapas. En la reaccin RT-PCR de dos etapas se usa una enzima RT separada antes del agregado de la DNA polimerasa, mientras que en la reaccin de una sola etapa se usa una nica DNA polimerasa termoestable que tambin tiene actividad RT. El cDNA creado por la transcriptasa inversa puede formarse usando cebadores oligonucletidos especficos o hexmeros de oligonucletidos al azar. Luego, se realiza la PCR como ya se describi. La RT-PCR es muy til para detectar virus de RNA, pero tambin puede usarse para detectar otros microrganismos por sealizacin del RNA ribosmico. La deteccin de RNAm es valiosa para estudiar la expresin gentica tanto de los microrganismos como de las clulas huspedes humanos. Del mismo modos que la PCR, se pueden obtener resultados cuantitativos con la PCRRT, y constituyen la base para las pruebas de carga viral para la VHI Y VCH con esta tcnica. APLICACIN MDICA Es probable que la deteccin de virus de RNA haya sido la ms importante de las aplicaciones clnicas de la RT-PCR hasta la fecha. Las pruebas cuantitativas de RT-PCR se han convertido en un procedimiento comn para la deteccin de VHC y VIH. La naturaleza cuantitativa de la amplificacin de acido nucleico, cuando se emplea junto con estndares cuantitativos externos, suele usarse para determinar la cantidad de estos virus en el paciente, lo que se conoce como carga viral. Los datos de la carga viral son importantes para control de respuesta del paciente a la terapia. Por ejemplo un paciente infectado de VIH debera tener un aumento del recuento de linfocitos T CD4 y una disminucin de la carga viral cuando se trata con la terapia antirretroviral adecuada.

La RT-PCR tambin se uso para la deteccin de las causas virales de la meningitis y de la meningoencefalitis como los enterovirus y el virus del Nilo Occidental. Varios de los enterovirus en el LCR de pacientes con meningitis. Los virus del dengue, Hantavirus, metaneumovirus humano y coronavirus del sndrome respiratorio agudo grave entre otros se han detectado mediante RT-PCR.

SECUENCIACION DEL ADN Los mtodos de secuenciacin del ADN se desarrollaron a finales de los aos 1970 y revolucionaron de forma significativa el mundo de la gentica molecular. Originalmente se describieron dos mtodos de secuenciacin: el mtodo de Maxan & Gilbert (1977) y el mtodo de Sanger (1977). Aunque ambos mtodos producen poblaciones de fragmentos marcados (originalmente con radioactividad) de distinta longitud, los cuales son separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida, estos mtodos son conceptualmente muy distintos. En este sentido, el mtodo de Maxan y Gilbert esta basado en la degradacin qumica parcial de la cadena original de DNA, mientras que el mtodo de Sanger se basa en la sntesis de una nueva cadena de DNA cuya elongacin se detiene mediante la incorporacin de una base modificada o terminador. Este ltimo mtodo constituye en la actualidad el mtodo de secuenciacin mas popular y mas utilizado de forma rutinaria en el laboratorio. El mtodo enzimtico de Sanger esta basado en la incorporacin de terminadores dideoxinucleotidos (ddNTPs, terminadores) a una nueva cadena de DNA mediante la actividad de una DNA polimerasa. Aunque los terminadores se incorporan a la nueva cadena de la misma forma que se incorporan los nucletidos convencionales, los terminadores carecen del grupo 3-OH necesario para la elongacin de la cadena. Por esta razn, cuando se incorpora un terminador a la nueva cadena creciente de DNA, la ausencia del grupo hidroxilo evita la formacin del puente fosfodiester con el siguiente nucletido y la elongacin de la cadena se termina en ese punto. En el mtodo original, cada uno de los cuatro terminadores se combina con una mezcla de los 4 nucletidos convencionales en presencia de la DNA polimerasa y de un cebador especifico (la proporcin de terminadores a nucletidos debe ser siempre favorable a estos ltimos) en el mtodo original, cada uno de los 4 terminadores se empleaban en 4 reacciones distintas en presencia de un nucletido marcado radioactivamente, de forma que se obtenan poblaciones de DNA de distinta longitud de nucletidos. Los fragmentos radioactivos obtenidos se separaban en un gel de poliacrilamida y la secuencia de DNA completa se determinaba mediante autoradiografa.

En los ltimos aos el mtodo original de Sanger se ha modificado y mejorado substancialmente, siendo los cambios mas importantes la aplicacin de la PCR, dando lugar a lo que se denomina secuencia cclica, y la sustitucin de la radioactividad por marcadores fluorescentes. En la secuencia cclica se copia la cadena original de DNA a partir del cebador hasta el lugar de incorporacin del terminador al igual que el mtodo original de Sanger. La diferencia radica en que en la secuenciacin cclica, esta reaccin tiene lugar unas 20-30 veces en un termociclador, lo que amplifica enormemente la seal y facilita su deteccin. Por otra parte, la sustitucin de la radioactividad por fluorocromos Ha permitido la automatizacin de su deteccin y anlisis, y la aparicin de secuenciadores automticos de DNA. As en el mtodo actual la fluorescencia esta asociada a los terminadores, es decir cada terminador esta asociado a un fluorocromo distinto, los cuales se incorporan a la nueva cadena de DNAA mediante PCR. Los nuevos fragmentos de DNA se separan en un gel de poliacrilamida y la seal emitida por cada uno de los fluorocromos al ser excitados por un laser es captada por unos detectores y analizada mediante soporte informtico. APLICACIONES MDICAS Una de la aplicaciones de secuenciacin de DNA esto se ha hecho para determinar, en un paciente en particular, la presencia de mutaciones adquiridas en el genoma del VIH que podran conferir resistencia a los agentes antirretrovirales. Tambin se aplic para identificacin de bacterias, microbacterias y hongos. El mtodo de referencia para la secuenciacin de ADN para su uso en el diagnstico gentico de enfermedades sigue siendo el mtodo de Sanger, en combinacin con la electroforesis capilar. El mtodo de Sanger, que es considerado como la "tcnica clsica" de secuenciacin es el nico que, por el momento, aparece en las directrices y estndares de calidad (Best Practice Guidelines) de los organismos internacionales que se encargan de supervisar el buen hacer de los laboratorios de diagnstico gentico.

ENZIMAS DE RESTRICCIN Y LIGACIN Enzimas de restriccin Las enzimas de restriccin, conocidas tambin como endonucleasas de restriccin, son nucleasas que hidrolizan molculas de ADN mediante el rompimiento de los enlaces fosfodiester internos de las mismas. Estas enzimas son las responsables en bacterias del fenmeno conocido como modificacin de restriccin controlada por el hospedero o modificacin fenotpica. Las endonucleasas de restriccin se dividen en tres categoras: tipo I, tipo II y tipo III. Las del tipo I y tipo III son enzimas complejas que poseen la actividad endonucleasa de restriccin y adems su correspondiente actividad metilasa en una sola molcula, mientras que las del tipo II poseen sistemas de restriccin y metilacin separados, motivo por el cual son las de uso en biologa molecular. Las enzimas de restriccin de tipo II se unen al ADN de doble cadena reconociendo una secuencia corta especfica de nucletidos y la restriccin se realiza dentro de la secuencia de la secuencia de reconocimiento o en sitios prximos a la misma. Las secuencias de reconocimiento son comnmente de 4 a 6 nucletidos de longitud, y generalmente se caracterizan por ser un palindrome exacto, es decir, la lectura de la secuencia de nucletidos en sentido 5 3 de una cadena es idntica a la lectura de la secuencia de la cadena complementaria en el mismo sentido. Una enzima tpica de este tipoi es la EcoRI, la cual genera extremos cohesivos o pegajosos al cortar en sitios diferentes en la doble hebra del ADN, de manera que se da lugar a la formacin de fragmentos cuyos extremos tiene una corta regin de la cadena sencilla y cuya secuencia es complementaria a la de los otros fragmentos. Existen otras enzimas de restriccin de tipo II como SmaI que generan extremos romo o enrazado, es decir que producen fragmentos cuyos extremos estn completamente apareados. Las endonucleasas son enzimas que cortan el DNA en secuencia especfica dentro de la molcula, en oposicin a exonucleasas, que digieren los extremos terminales de las molculas de DNA. Un tipo de endonucleasas, denominadas genricamente enzimas de restriccin por que su presencia en una bacteria determinada restringe el crecimiento de bacteriografos, representa una herramienta clave en la tecnologa de DNA recombinante. Estas enzimas cortan el DNA de cualquier origen en secuencias

muy especficas, al contrario que otras enzimas o mtodos qumicos o fsicos que lo hacen al azar. En la naturaleza protegen a la bacteria hospedadora de infeccin por fagos, impidiendo la replicacin del DNA forneo las enzimas de restriccin se denominan mediante varias letras que hacen mencin a la bacteria de la que proceden. Cada enzima de restriccin corta una secuencia especifica de DNA de doble cadena de 4 a 7 pares de bases dando lugar a la aparicin de extremos romos como es el caso de EcoRI o de extremos solapantes o cohesivos. Teniendo en cuenta que el DNA esta constituido por cuatro bases diferentes, una enzima de restriccin que reconoce una secuencia de 4pb corta una media de cada 4pb y una que reconoce una secuencia de 6pb corta cada 4. Por lo tanto, se puede elaborar en una determinada secuencia o fragmento de DNA un mapa de restriccin utilizando varias enzimas. Los fragmentos producidos pueden separarse y, posteriormente aislarse por electroforesis siendo este un paso esencial para la clonacin. DNA LIGASAS Los fragmentos de DNA, generados por tratamiento con endonucleasa de restriccin se puede volver a unir mediante una DNA ligasa. La DNA ligasa mas utilizada se obtiene de clulas de E. coli infectadas por el bacteriografo T4 su funcin natural es sintetizar enlaces fosfodiester entre nucletidos no unidos presentes en un poli nucletido de una molcula de doble cadena. Para unir los fragmentos de restriccin, la ligasa debe sintetizar dos enlaces fosfodiester, uno en cada cadena. Esto no supera de ninguna manera las capacidades de la enzima pero la reaccin solo puede tener lugar si los extremos por unir se acercan lo suficiente entre si por azar; la ligasa no puede tomarlos y juntarlos. Si las dos molculas tienen extremos cohesivos complementarios y los extremos se juntan por eventos de difusin aleatorios en la mezcla de ligamiento, se podran formar pares de bases transitorios entre los segmentos protuberantes. Estos pares de bases no son muy estables pero pueden persistir lo suficiente para que una enzima ligasa se fije a la unin y sintetice enlaces fosfodiester para fusionar los extremos. Si las molculas tienen extremos romos no pueden aparear entre si ni siquiera de manera transitoria y el ligamiento es un proceso mucho menos eficiente aun cuando la concentracin de DNA sea alta y los pares de extremos estn relativamente cerca. La mayor eficiencia del ligamiento de los extremos cohesivos ha estimulado la obtencin de mtodos para convertir extremos romos en extremos cohesivos. Uno de los mtodos une molculas cortas de doble cadena denominadas conectores o adaptadores a los extremos romos los conectores y los adaptadores trabajan en forma ligeramente diferente, pero ambos contienen una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restriccin y, por ende producen un extremo cohesivo despus del tratamiento con la enzima adecuada.

APLICACIN CLINICA La gentica molecular moderna con el aislamiento de ADN, la fragmentacin con enzimas de restriccin tiene numerosas aplicaciones en la medicina clnica. Si se conoce el gen responsable de la enfermedad, puede detectarse anomalas de su estructura y establece la presencia de una mutacin. En casos de enfermedades familiares en las que no se conoce la anomala gentica, es posible analizar la relacin de la enfermedad con regiones cromosmicas especificas y finalmente aislar el gen responsable

VECTORES DE CLONACION Un vector de clonacin es una molcula pequea de DNA que puede replicarse de manera autnoma en un husped (clulas bacterianas o de levaduras), a partir de las cuales es posible aislarlo en forma pura para el anlisis. Los vectores se utilizan para clonacin porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales de DNA sean incorporadas en su material gentico; se autorreplican utilizando la maquinaria enzimtica de la clula husped, y en este proceso, no se mezclan con el DNA genmico de la clula. Debido a que los vectores de clonacin pueden generar un gran numero de copias por clula, ya que los huspedes bacterianos o de levaduras pueden crecer indefinidamente en el laboratorio, es posible obtener grandes cantidades de secuencias de DNA de inters. Cierto nmero de vectores se utilizan de un modo comn para este propsito. Los vectores de clonacin son plsmidos o fagos o variaciones de ellos. Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena circulares cuya funcin natural mas importante es conferir ventajas adaptativas a las clulas que los contienen. Los plsmidos tienen varias propiedades que hacen que sean muy tiles como vectores de clonado. Por ejemplo estn presentes en las bacterias como copias nicas o mltiples que se replican independientemente del DNA bacteriano. Actualmente se conoce la secuencia completa de nmeros plsmidos, as como la localizacin precisa de los sitios de corte para diferentes enzimas de restriccin y, por lo tanto, los lugares en los que se es posible insertar DNA de otros organismos. Adems, los plsmidos, al tener un tamao muy distinto al del cromosoma bacteriano, pueden aislarse con facilidad. Los fago virus que atacan bacterias y estn constituidos usualmente por molculas de DNA lineal, con varios sitios de corte para enzimas de restriccin especificas los cuales puede insertarse DNA forneo, de forma que el conjunto se empaqueta en la cabeza proteica del virus. El DNA quimrico formado puede recogerse despus de que se complete el ciclo de lisis celular, de modo que se produzcan numerosas partculas infectivas. La ventaja de los fagos como vectores en el clonado molecular de DNA es que pueden aceptar fragmentos de DNA de 10-20 kpb mientras que los plsmidos tan solo pueden aceptar fragmentos de 6-10 kpb. Los cosmidos son plsmidos que contienen unas secuencias especficas, denominadas cos, necesarias para el empaquetamiento de DNA del fago lambda dentro de su cabeza. Estos plsmidos combinan las ventajas de los propios plsmidos y de los fagos, ya que crecen dentro de la bacteria como plsmidos, pero pueden almacenar, una cantidad mucho mayor de DNA dentro de la cabeza

del fago, ya que la mayor parte del genoma del fago lambda ha sido eliminada. Usualmente los cosmidos pueden llevar insertos de hasta 50 kpb. Otro tipo de vector de clonacin son los cromosomas artificiales de levaduras. Pueden llevar insertos mucho mas grandes, ya que se trata de segmentos cromosmicos de levaduras, por lo tanto lineales, que contienen la regin centromerica, siendo segregados de manera muy estable de acuerdo con patrones mendelianos. Los YAC permiten clonar segmentos de DNA de mas de 40 kpb, incluso hasta cientos de kpb y por lo tanto la amplificacin de grandes molculas de DNA con un fondo gentico simple. En las levaduras, adems de los YAAC, se utiliza para la clonacin de una serie de plsmidos (episomicos, centromericos etc.) APLICACIN MDICA. La terapia gnica emplea un vector retroviral, en este procedimiento se utiliza un retrovirus que se ha modificado para no producir dao al individuo.

CLONACION MOLECULAR DE UN GEN Una vez obtenida la informacin sobre la identificacin y localizacin de un gen, puede ser necesario para su aislamiento para la posterior utilizacin. La dificultad principal en esta etapa es la desproporcin entre el pequeo gen identificado y la enorme molcula de DNA. En otras palabras, es tcnicamente imposibles aislar suficiente cantidad de un gen mediante mtodos bioqumicos convencionales. Para poder hacerlo se desarrollaron las tcnicas de clonacin de genes, que consisten en la produccin de un gran numero de copias idnticas de DNA y en la separacin de una secuencia particular (a menudo de un solo gen) del resto del DNA de una clula. La produccin de DNA mediante la clonacin se puede realizar in vivo mediante la utilizacin de microrganismos, o in vitro con la tcnica de PCR gran capacidad reproductiva para la fabricacin a voluntad de una gran cantidad de copias de DNA de inters, Aunque generalmente se utilizan bacterias, tambin se pueden usar clulas eucariontes como levaduras u otras. Para ello se utilizan transportadores o vectores, que son fragmentos de DNA circular, en los cuales se inserta la secuencia del DNA que se dese producir y se incorpora el conjunto en la clula bacteriana. Luego de un periodo de cultivo intensivo, se separan las bacterias y se aslan los segmentos de DNA de inters. Los cultivos bacterianos que producen los genes de inters constituyen una genoteca de DNA.

APLICACIN MEDICA Clonacin molecular La clonacin de molculas puede realizarse por dos procesos, la clonacin acelular o la clonacin celular.

Clonacin acelular: se conoce tambin como mecanismo de amplificacin de ADN o ARN (PCR). Esta clonacin puede tener dos objetivos, obtener gran cantidad de ADN para distintos fines, o determinar la secuencia de una porcin pequea de ADN en una disolucin.

Su aplicacin es muy variada. Se usa para deteccin de secuencias de ADN, para la secuenciacin de ADN, para rastreo de mutaciones, diagnstico de enfermedades (parentales o no), para estudios evolutivos, deteccin de clulas tumorales, amplificacin de ADN para clonacin celular, etc.

Clonacin celular: este mecanismo utiliza clulas para clonar fragmentos de ADN, no es una clonacin de clulas. Para ello, previamente se ha tenido que amplificar (es decir, conseguir muchas copias clonadas) el ADN que se quiere clonar. Despus, insertar el ADN en vehculos, denominados vectores, que lo transportan e introducen en las clulas. El nombre que reciben estas clulas es anfitriones, y son las clulas que hay que cultivar, es decir, conseguir multiplicarlas en un medio de cultivo. Las clulas, cuando se multiplican, duplican el ADN propio y el fragmento que se desea clonar. De este modo se obtiene un elevado nmero de clulas que contienen el ADN que queremos clonar, llamado recombinante. El objetivo de este tipo de clonacin puede ser la amplificacin del ADN clonado con el fin de estudiar su secuencia, su estructura, para estudios filogenticos o para identificacin de mutaciones. Tambin se utiliza este mtodo para estudiar el mecanismo de regulacin de los genes, su transcripcin y su traduccin. Otra aplicacin est en la obtencin de la protena que codifica la secuencia de ADN clonado, ya sea para analizar la estructura de la protena, para alterarla o comercializarla en funcin de sus propiedades. sta es la tcnica utilizada para la obtencin de insulina.

Clonacin de clulas, tejidos u rganos Se utilizan clulas troncales, capaces de formar otras clulas diferenciadas, que pueden originar tejidos o podran formar rganos, debido a su totipotencia. Con este tipo de clonacin obtenemos clulas compatibles con el adulto, que podran diferenciarse a distintos tipos celulares, formando un tejido o recomponindole. Incluso un rgano. Esta tcnica puede utilizarse en el caso de quemados, para generar clulas epiteliales, a partir de clulas troncales y disminuir el rechazo de trasplantes de piel. Se ha intentado, en casos de diabticos, introducir en clulas madre del pncreas, un gen "normal" productor de insulina. Estas clulas se diferencian para formar clulas de pncreas y se injertan en el paciente. Tambin, se ha utilizado esta tcnica en pacientes que han sufrido infarto cardiaco. A las clulas troncales se las hace madurar para formar clulas musculares cardiacas; se injertan en el corazn y suplen a las clulas muertas, regenerando la zona daada por el infarto.

ANLISIS BIOINFORMATICO Bioinformtica es una disciplina cientfica emergente que utiliza tecnologa de la informacin para organizar, analizar y distribuir informacin biolgica con la finalidad de responder preguntas complejas en biologa. Bioinformtica es un rea de investigacin multidisciplinaria, la cual puede ser ampliamente definida como la interface entre dos ciencias: Biologa y Computacin y esta impulsada por la incgnita del genoma humano y la promesa de una nueva era en la cual la investigacin genmica puede ayudar dramticamente a mejorar la condicin y calidad de vida humana. Avances en la deteccin y tratamiento de enfermedades y la produccin de alimentos genticamente modificados son entre otros ejemplos de los beneficios mencionados ms frecuentemente. Involucra la solucin de problemas complejos usando herramientas de sistemas y computacin. Tambin incluye la coleccin, organizacin, almacenamiento y recuperacin de la informacin biolgica que se encuentra en base de datos. Segn la definicin del Centro Nacional para la Informacin Biotecnolgica "National Center for Biotechnology Information" (NCBI por sus siglas en Ingls, 2001): "Bioinformtica es un campo de la ciencia en el cual confluyen varias disciplinas tales como: biologa, computacin y tecnologa de la informacin. El fin ltimo de este campo es facilitar el descubrimiento de nuevas ideas biolgicas as como crear perspectivas globales a partir de las cuales se puedan discernir principios unificadores en biologa. Al comienzo de la "revolucin genmica", el concepto de bioinformtica se refera slo a la creacin y mantenimiento de base de datos donde se almacena informacin biolgica, tales como secuencias de nucletidos y aminocidos. El desarrollo de este tipo de base de datos no solamente significaba el diseo de la misma sino tambin el desarrollo de interfaces complejas donde los investigadores pudieran acceder los datos existentes y suministrar o revisar datos Luego toda esa informacin deba ser combinada para formar una idea lgica de las actividades celulares normales, de tal manera que los investigadores pudieran estudiar cmo estas actividades se vean alteradas en estados de una enfermedad. De all viene el surgimiento del campo de la bioinformtica y ahora el campo ms popular es el anlisis e interpretacin de varios tipos de datos, incluyendo secuencias de nucletidos y aminocidos, dominios de protenas y estructura de protenas. El proceso de analizar e interpretar los datos es conocido como biocomputacin. Dentro de la bioinformtica y la biocomputacin existen otras sub-disciplinas importantes: El desarrollo e implementacin de herramientas que permitan el acceso, uso y manejo de varios tipos de informacin El desarrollo de nuevos algoritmos (frmulas matemticas) y estadsticos con los cuales se pueda relacionar partes de un conjunto enorme de datos, como por ejemplo mtodos para localizar un gen dentro de una secuencia, predecir estructura o funcin de protenas y poder agrupar secuencias de protenas en familias relacionadas." La Medicina molecular y la Biotecnologa constituyen dos reas prioritarias cientfico tecnolgicas como desarrollo e Innovacin Tecnolgica. El desarrollo en ambas reas estn estrechamente relacionadas. En ambas reas se pretende potenciar la investigacin genmica y postgenmica as como de la bioinformtica, herramienta imprescindible para el desarrollo de estas. Debido al extraordinario avance de la gentica molecular y la genmica, la Medicina Molecular se constituye como arma estratgica del bienestar social del futuro inmediato. Se pretende potenciar la aplicacin de las nuevas tecnologas y de los avances genticos para el beneficio de la salud. Dentro de las actividades financiables, existen acciones estratgicas, de infraestructura, centros de competencia y grandes instalaciones cientficas. En esta rea, la dotacin de infraestructura se plasmar en la creacin y dotacin de unidades de referencia tecnolgica y centros de suministro comn, como

Centros de Bioinformtica, que cubran las necesidades de la investigacin en Medicina Molecular. En cuanto a centros de competencia, se crearn centros de investigacin de excelencia en hospitales en los que se acercar la investigacin bsica a la clnica, as como centros distribuidos en red para el apoyo a la secuenciacin, DNA microarrays y DNA chips, bioinformtica, en coordinacin con la red de centros de investigacin genmica y protemica que se proponen en el rea de Biotecnologa. En esta rea la genmica y protemica se fundamenta como accin estratgica o instrumento bsico de focalizacin de las actuaciones futuras. Las tecnologas de la informacin jugarn un papel fundamental en la aplicacin de los desarrollos tecnolgicos en el campo de la gentica a la prctica mdica como refleja la presencia de la Bioinformtica mdica y la Telemedicina dentro de las principales lneas en patologa molecular. La aplicacin de los conocimientos en gentica molecular y las nuevas tecnologas son necesarias para el mantenimiento de la competitividad del sistema sanitario no slo paliativo sino preventivo. La identificacin de las causas moleculares de las enfermedades junto con el desarrollo de la industria biotecnolgica en general y de la farmacutica en particular permitirn el desarrollo de mejores mtodos de diagnstico, la identificacin de dianas teraputicas y desarrollo de frmacos personalizados y una mejor medicina preventiva.

ANLISIS DE PROTENAS: VECTOR DE EXPRESIN.

EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES La expresin recombinante de la protena es la fabricacin de una protena derivada de la DNA recombinante. Es una tcnica comn en biologa molecular y en la produccin farmacutica de

reemplazos de la hormona. La DNA recombinante es una porcin especfica de un gene diseado para expresar un solo producto dentro de una clula husped, dirigida por factores qumicos especiales para expresar la protena derecha en granes cantidades. Muchas hormonas y enzimas que fueron derivadas histricamente de las fuentes animales ahora son sintetizadas por la expresin recombinante de la protena, despus cosechadas y refinadas de las clulas husped. Para expresar las protenas recombinantes, las secuencias cuidadosamente seleccionadas de DNA se deben introducir en el genoma de un anfitrin. Tomar porciones del cdigo gentico a partir de un organismo y la colocacin de stos en los ncleos de clula de otro es una forma de reproduccin. Esto se hace va la insercin de una secuencia de DNA recombinante que codifique para la protena deseada en el ncleo, que inicia la expresin del gene transcribindolo en el ARN. Las protenas recombinantes estn montadas cuando los pedazos de informacin que lleva del mRNA de la DNA emigran a los ribosomas del ncleo de clula, e inicia el produccin de una protena segn una plantilla especfica. Las clulas husped harn cantidades escasas de una protena recombinante a menos que la DNA se introduzca con vectores apropiados de modo que la informacin gentica correcta sea expresada en suficiente cantidad. Los factores de la expresin de la protena son las seales moleculares que deben acompaar la DNA recombinante cuando se insertan en las clulas husped para asegurarse de que la protena de la blanco sobre-ser expresada. sta es la nica manera que la expresin recombinante de la protena puede hacer bastantes de una sustancia para el uso farmacutico o del laboratorio. El montaje Ribosomal de la protena no termina el proceso de la expresin de la protena porque durante la cosecha de la clula bacteriana o de levadura el contenido consigue mezclado con el producto final. Las protenas recombinantes expresadas se deben purificar por la separacin de los pedazos de piezas destruidas de la clula. Una etiqueta molecular etiqueta a veces la protena as que puede atar a sustancia metlica u otra y ser aislada de la basura. Diversas tcnicas existen, dependiendo de factores como tamao de la protena y la complejidad de la clula husped. APLICACION MEDICA La expresin recombinante humana de la protena tiene usos comerciales y mdicos extensos. Muchas hormonas, anticuerpos, y enzimas fueron extrados de tejido del animal o del cadver pero ahora se producen previamente sinttico usar tecnologa de DNA recombinante. Dos especialmente ejemplos importantes son hormona de crecimiento humano e insulina. Muchas terapias de reemplazo de hormona confan en las protenas sintticas, al igual que los varios anlisis usados por los bilogos moleculares y celulares en sus laboratorios. En muchos casos, las bacterias se utilizan como clulas husped para los productos simples, mientras que una expresin recombinante ms compleja de la protena, especialmente de genes de animales, se puede hacer en hongos y levaduras. PURIFICACION DE PROTEINAS La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de sustancias diferentes, la molcula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visin general de las tcnicas ms usuales empleadas para la purificacin de protenas, aunque muchas de ellas son aplicables a la separacin de la mayora de las molculas biolgicas.

El conocimiento del proteoma, conjunto de protenas de un organismo, ha pasado a ser el reto de la comunidad cientfica y de las empresas biotecnolgicas, una vez que ya se ha completado la secuenciacin del genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor, si no se identifica cual es la funcin de dichos genes, en su caso, para que protenas codifican. El programa proteoma busca la caracterizacin de todas las protenas de la clula humana, identificando su secuencia de aminocidos. Cuando se obtenga toda la secuencia de aminocidos del proteoma humano se podr relacionar mediante potentes programas informticos la secuencia de aminocidos de una protena con el gen que la codifica. Los mtodos de secuenciacin tradicionales (basados en la degradacin de Edman) son demasiado lentos para abordar esta ingente tarea, la secuenciacin de los pptidos debe hacerse por espectometra de masas. Naturalmente las tcnicas de purificacin y aislamiento de protenas son esenciales para abordar toda esta tarea.

Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo de rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se va a aislar la protena, as como de su localizacin. Entre los distintos mtodos ellos estn: Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula, causando su hinchamiento y rotura. Destruccin mcanica. Entre estos mtodos se encuentran la homogenizacin (hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o almina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un pequeo orificio), la sonicacin (someter las clulas a vibraciones de ultrasonido). Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C). Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones especficos para protenas solubles o bien que contengan adems detergentes si se pretende purificar protenas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a muchos agentes que pueden daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo ms corto posible, adems en ocasiones es necesario aadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin (10.000 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas

solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena de inters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estn fijos. Para purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico y fcil de llevar a cabo. En este sentido es mucho ms cmodo trabajar con enzimas, pues se detectaran mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar protenas no enzimticas, se requieren mtodos de seleccin ms especficos.

ANLISIS ELECTROFORTICO EN GEL DE ACRILAMIDA. La electroforesis en gel de poliacrilamida se emplea para examinar las familias de molculas de DNA con cadenas terminadas que resultan de un experimento de secuenciacin. La electroforesis en gel de agarosa no puede utilizarse con este fin por que no tiene el poder de resolucin necesario para separar las molculas de DNA monocatenarias cuya diferencia de longitud es solo un nucletido. Los geles de poliacrilamida tienen poros de tamao ms pequeo que los geles de agarosa y permiten separaciones precisas de molculas de 10 a 1.500 pb de longitud. Se los utiliza no solo para la secuenciacin de DNA sino tambin para otras aplicaciones de las que se requiere la separacin de DNA en un nivel de gran precisin, por ejemplo en un examen de los productos de amplificacin de PCR dirigidas a loci de los microsatlites en los que los productos de diferentes alelos podran diferir de tamao en solo dos o tres pares de bases. Se pueden separar geles de poliacrilamida como planchas entre placas de vidrio que se mantienen distanciadas por separadores o en columnas largas y delgadas adecuadas para electroforesis capilar. Un gel de poliacrilamida esta formado por cadenas de monmeros de acrilamida (CH2=CHCO=NH2) que tienen enlaces transversales con unidades de N, N-metienbisacrilamida (CH2=CHCO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2), estas ultimas denominadas con frecuencia bis. El tama o de los poros del gel depende de la concentracin total de monmeros (acrilamida + bis) y de la relacin entre acrilamida y bis. En una plancha de gel de 1mm de espesor utilizada para secuenciacin de DNA, se suele emplearse un gel al 6% con una relacin acrilamida: bis 19:1 porque permite la resolucin de molculas de DNA monocatenario de 100 a 750 nucletidos de longitud. Por lo tanto se pueden leer alrededor de 650 nucletidos de secuencia a partir de un solo gel. Se puede aumentar la concentracin del gel al 8% para leer la secuenciacin mas cercana al cebador (lo que resuelve molculas de 50-400 nucletidos de longitud) o disminuirla al 4% para leer una secuencia mas distante (500-1500 nucletidos respecto al cebador). La polimerizacin de la solucin acrilamida:bis se inicia con el persulfato de amonio y catalizador TEMED (N, N, N, N tetrametiletilendamina). Los geles de secuenciacin tambin contienen urea, que es un agente de desnaturalizacin que impide la formacin de pares de bases intractenarios en las molculas secuenciadas enzimticamente. Esto es importante por que el cambio de conformacin secundario al apareamiento de las bases modifica la velocidad de migracin de una molcula de una sola cadena, de manera que se pierde la equivalencia estricta entre la longitud de una molcula y la

posicin de la banda crucial para leer la secuencia de DNA.

APLICACIN MEDICA

ENSAYOS WESTERN BLOT Y ELISA Los ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), que a veces se conocen como ensayos enzimticos (EIA) o Western inmunoblots, se usa rutinariamente en el laboratorio de diagnostico para detectar antgenos virales en las muestras clnicas y para identificar o cuantificar anticuerpos antivirales en el suero. Se basan en la unin de los anticuerpos a sus antgenos y en la deteccin de esta reaccin mediante anticuerpos comerciales conjugados con una enzima activa. La enzima reacciona con su sustrato y produce un cambio de color. La observacin y la medicin del color determinan el resultado de la prueba. El ELISA es un mtodo muy sensible y reaccionara incluso cuando solo 1 o 2 anticuerpos se hallen en la muestra de suero. Si la prueba ELISA es reactiva o positiva, debe confirmarse el estado de VIH positivo mediante Western inmunoblots o Western blot para abreviar se volvi un procedimiento importante para detectar las infecciones por VIH, HTLV-1, HTVL-2 y las hepatitis virales. Aunque los ELISA son muy sensibles y altamente especficos, se producen reacciones falsas positivas debido a las reacciones cruzadas de los anticuerpos. Se requieren eyaculaciones repetidas y una prueba de confirmacin mediante otro ensayo, generalmente Western blot.

El Western blot consiste bsicamente en la separacin de las protenas virales (a partir de viriones purificados que se expande en el comercio) a travs de un gel de acrilamida. Este procedimiento se denomina electroforesis en el gel de poliacrilamida-SDS o SDS-PAGE (SDS es el dodecil sulfato de sodio) un detergente fuerte que desnaturaliza las protenas. Durante la migracin a travs del gel de poliacrilamida, las protenas se separan segn su tamao (en este proceso, la carga tambin desempea un papel importante, ya que el SDS cargado negativamente cubre las protenas y le otorga a estas la misma proporcin de masa de carga) es caracterstico que las protenas pequeas migren a travs del gel mas rpidamente que las protenas grandes, una vez que las protenas han sido separadas, se las transfiere a nitrocelulosa en el mismo patrn en el que se encontraba el gel. Las protenas se unen a la nitrocelulosa, que despus se corta en tiras y se pone en contacto con el suero del paciente, o sueros positivos y negativos, como controles. Cualquier anticuerpo antiviral que se halle en la muestra del suero reaccionara con las protenas virales presentes en la membrana de nitrocelulosa. Un segundo anticuerpo, como una IG antihumana acoplada a una enzima, se incuba entonces con la nitrocelulosa (se realizan lavados astringentes de la nitrocelulosa entre cada paso del procedimiento) finalmente la membrana se incuba con el sustrato apropiado para la enzima. Las bandas de protenas que reaccionan con los anticuerpos antivirales de la muestra de suero, los cuales son reconocidos por los anticuerpos secundarios conjugados con la enzima, cambiaran de color cuando se adicione el sustrato. El Western blot se uso para detectar anticuerpos especficos contra numerosos virus. Es probablemente el ensayo confirmatorio mas aceptado para deteccin de VIH, y muchas autoridades lo consideran como el patrn para la validacin de los resultados de la infeccin por VIH, las reacciones falsas negativas son relativamente raras. Algunas veces los ensayos de Western blot pueden producir reacciones no especificas o indeterminadas en las que a menudo se detecta solo una banda. Estos resultados pueden deberse a causas subyacentes como una enfermedad autoinmunitaria que da lugar a la produccin de anticuerpos similares a los antgenos celulares y virales.

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