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FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS Y DEL AMBIENTE DEPARTAMENTO DE TECNOLOGA DE ALIMENTOS

Asignatura:

Anlisis instrumental
Tema :

Cromatografa liquida Estudiantes:

Nidia Encarnacin 2003 -0125 Seleydi Pea R ..2008-0105 Damiana Encarnacin ...2009-0056 Carmen A Daz R ..2009-0061 Profesor : Ing. Milton Rodrguez Fecha 6 de abril del ao 2013 Santiago, Repblica dominicana.

Introduccin

Antes de definir los conceptos bsicos para entender los distintos tipos de separaciones cromatografas, haremos una breve introduccin y una explicacin general sobre la cromatografa. Los conceptos que ms adelante se explican se refieren a la cromatografa en columna, sin embargo, es importante sealar que como los equilibrios en los que se basan los dos tipos de cromatografa son idnticos, la teora desarrollada para la cromatografa en columna se adapta tambin fcilmente a la cromatografa liquida.

La Cromatografa lquida, tambin conocida como Cromatografa de lquidos, es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la adsorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla.

La cromatografa es un mtodo muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Ningn otro mtodo de separacin es tan potente y de aplicacin tan general como la cromatografa.

Es difcil definir rigurosamente el trmino de cromatografa, ya que se ha aplicado ese nombre a varios sistemas y tcnicas. Sin embargo, todos esos mtodos tienen en comn el uso de una fase estacionaria y una fase mvil.

En todas las separaciones de cromatografas, la muestra se desplaza con una fase mvil, que puede ser un gas, un lquido o un fluido sper crtico. Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie slida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez.

Objetivos
Objetivo general: Conocer los mtodos y uso de la cromatografa liquida en los alimentos.

Objetivos Especficos: Conocer el uso de la cromatografa liquida en los alimentos. Conocer los diferentes tipos de cromatografa

Conceptos bsicos
Cromatograma Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la concentracin del soluto y se registra su seal en funcin del tiempo (o del volumen de fase mvil aadido) se obtiene una serie de picos que representan un grafico denominado cromatograma. Este grafico es til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra; las reas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.

Tiempo de retencin tR: Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico de concentracin del analito alcanza el detector; es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna; es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un pico. Se representa con el smbolo tR:

Tiempo muerto tM: Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector; es el tiempo de migracin de la especie no retenida; es el tiempo necesario para que, por trmino medio, una molcula de la fase mvil pase a travs de la columna. De manera semejante la velocidad lineal promedio del movimiento de las molculas de la fase mvil.

En general, los equilibrios de distribucin implicados en cromatografa se describen por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de una analito entre las fases estacionaria y la mvil. La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribucin, la razn de distribucin o coeficiente de distribucin, y mide la distribucin del analito entre la fase estacionaria y la fase mvil.

Resolucin cromatografa: La resolucin cromatografa R S de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.

Tipos de separacin cromatografca Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y mvil se ponen en contacto, diferencindose as la cromatografa en columna de la cromatografa plana. En la cromatografa en columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a travs de la cual hace se pasar la fase mvil por presin o gravedad.

En la cromatografa plana, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad. Nos centraremos

principalmente en la cromatografa en columna, y como ya hemos dicho la teora que se desarrolle para la cromatografa en columna se adaptara tambin para la cromatografa plana. Otra clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatogrficos se basa en el tipo de fase mvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases. La relacin de las tres clases generales de cromatografa: cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como su nombre indica las fases mviles en las tres tcnicas son, respectivamente, lquidos, gases y fluidos supercrticos.

Hay que mencionar que solamente la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografa de gases como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna, de tal modo que las paredes de la columna contienen la fase mvil.

Mtodos de elucin: Se raspa la zona de la placa que contiene el analito con una esptula o una navaja, y se recoge el slido sobre un papel satinado. Se trasfiere a un tubo de ensayo u otro recipiente, donde el analito se disuelve con un disolvente adecuado y se separa de la fase estacionaria por centrifugacin o filtracin. La identificacin se realiza por tcnicas como la espectrometra de masas, la resonancia magntica nuclear o la espectroscopia de absorcin en infrarrojo.

Cromatografa en plano bidimensional: En este caso la muestra se coloca en una de las esquinas de una placa cuadrada y se realiza el desarrollo en direccin ascendente con el disolvente A. A continuacinse elimina este disolvente por evaporacin, y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo ascendente con el disolvente B. Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los componentes con un reactivo de revelado, tipo ninhidrina, y las manchas originadas se identifican comparando sus posiciones con las de los estndares.

En cuanto al anlisis cuantitativo, ste se puede hacer comparando el rea de la mancha del estndar con la del analito, se puede hacer una estimacin semicuantitativa de la cantidad del componente presente. Los mejores resultados se obtienen si se raspa la mancha de la placa, se extrae el analito del slido que forma la fase estacionaria, y se determina el analito por mtodos fsico o qumicos. Otro procedimiento consiste en usar un densitmetro de barrido que puede medir la radiacin emitida de la mancha por fluorescencia o reflexin. La cromatografa en columna es tambin un buen mtodo que proporciona informacin cuantitativa acerca de las especies separadas, basndose en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones. Pudindose hacer as anlisis cuantitativos basados en la altura del pico, en las reas del los picos, mediante el mtodo de calibrado y patrones, el mtodo del patrn interno, y por ultimo el mtodo de la normalizacin de las reas.

Cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC)

Fundamentos y principios bsicos El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografa liquida de alta resolucin, es una tcnica cromatogrfica usada para separar componentes usando una variedad de interacciones qumicas entre el analito y la columna cromatogrfica. Bsicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase mvil, bomba, inyector, columna de separacin y detector. El analito se pasa a travs de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase mvil liquida con alta presin.

La muestra se introduce en pequeos volmenes a la corriente de la fase mvil y all se retarda por medio de interacciones qumicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo se conoce como tiempo de retencin, nico para analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composicin de la fase mvil.

Los solutos ms comunes usados en la fase mvil son combinaciones de agua purificada con lquidos orgnicos, los ms comunes son Metanol y Acetonitrilo, tambin suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la separacin de componentes. Tambin se usa el Acido Trifluoroacetico para actuar como formador de pares inicos. Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elucin. Consiste en la variacin de la composicin de la fase mvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El gradiente separa la matriz del analito en funcin de la afinidad del analito por la composicin de la fase mvil. Cada analito tiene un gradiente de elucin ptimo para obtener la mxima separacin de picos en el detector. Existen varios tipos de HPLC: Cromatografa de fase normal Cromatografa de fase inversa Cromatografa de exclusin por tamao Cromatografa de intercambio inico Cromatografa de bioafinidad

Cromatografa de fase normal Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basndose en la polaridad. Este mtodo usa una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del analito y la interaccin entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elucin. La fuerza de interaccin dependen o solo de los grupos funcionales, sino tambin de factores estricos e ismeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retencin, mientras que disolventes hidrfobos aumentan el tiempo de retencin. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

En cuanto al anlisis cualitativo, la cromatografa proporciona informacin acerca de las especies de la muestra en cuanto a su tiempo de retencin o su posicin en la fase estacionaria tras el periodo de elucin. A pesar de todo la cromatografa no nos aporta mucha informacin de la identificacin positiva de las especies qumicas separadas, pero s que es un buen mtodo para evidenciar la ausencia de ciertos compuestos.

La cromatografa en columna: Es tambin un buen mtodo que proporciona informacin cuantitativa acerca de las especies separadas, basndose en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones. Pudindose hacer as anlisis cuantitativos basados en la altura del pico, en las reas del los picos, mediante el mtodo de calibrado y patrones, el mtodo del patrn interno, y por ultimo el mtodo de la normalizacin de las rea, un gradiente de elucin ptimo para obtener la mxima separacin de picos en el detector. Existen varios tipos de HPLC.

Cromatografa de fase normal: Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basndose en la polaridad. Este mtodo usa una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del analito y la interaccin entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elucin. La fuerza de interaccin dependen o solo de los grupos funcionales, sino tambin de factores estricos e ismeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retencin, mientras que disolventes hidrfobos aumentan el tiempo de retencin. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

Cromatografa de fase inversa: Este tipo de HPLC es el ms comn. En esta tcnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase mvil moderadamente polar. La fase estacionaria tpica es silicio tratado con RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.

La adicin de disolventes polares incrementa el tiempo de retencin y aadir disolventes hidrofbicos lo disminuyen. El tiempo de retencin es mayor para molculas no polares. El principio bsico de este mtodo est basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar. Las caractersticas del analito son importantes para sus propiedades de retencin. Las molculas muy grandes pueden causar que la interaccin no sea completa. El tiempo de retencin aumenta con el rea hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamao del soluto.

Los componentes ramificados e luyen ms rpido porque el rea total esta disminuida. Hay otros modificadores de la fase mvil que afectan a la retencin del analito. Aadir sales inorgnicas causa incremento lineal en la tensin superficial de soluciones acuosas, incrementando el tiempo de retencin.

El pH tambin es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un buffer como fosfato sdico para controlar el pH. Un cido orgnico como cido frmico o cido trifluoracetico. Sirven para muchas cosas, controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del silicato en la fase estacionaria y acta como formador de pares inicos para neutralizar la carga del analito.

Los efectos varan pero aumentan la calidad de la cromatografa. Las columnas de fase inversa son ms difciles de daar que las normales. Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales acuosas, destruiran el silicato. Pueden ser usados con cidos acuosos, pero no durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en bajo contenido para que la separacin de sustancias sea mejor.

Cromatografa de exclusin por tamao: Tambin conocida como cromatografa de gel permeante o cromatografa de gel filtrante. Separa las partculas en funcin del tamao. Es una cromatografa de baja resolucin y sirve para determinar estructuras

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terciarias y cuaternarias de protenas y es la tcnica comn para averiguar el peso molecular de polmeros sintticos y naturales.

Cromatografa de intercambio inico: La retencin est basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos.

Algunos

intercambiadores

de

iones

son:

Resinas

de

Poliestireno:

permite

entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena. Celulosa: Tiene tamao de poros ms grandes y bajas densidades de carga que los hacen ideales para la separacin de protenas. Poro controlado de vidrio o silicona porosa.

Los intercambiadores de iones favorecen la unin de iones de mayor carga y radio inferior. Un incremento en el contra-in (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de retencin. Un incremento del pH reduce el tiempo de retencin en el intercambio catinico, pero bajar el pH reduce la retencin en intercambio aninico. Se usa en la purificacin de agua, pre concentracin de componentes traza, cromatografa de intercambio de ligandos, cromatografa de intercambio de iones de protenas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y polisacridos.

Cromatografa de bioafinidad : Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de los complejos implica fuerzas moleculares como Van der Waals, electrosttica, dipolo-dipolo, hidrofbicas y puentes de hidrogeno. Una unin bioespecfica se forma por accin simultnea de estas fuerzas en los sitios de unin.

Instrumentacin
Bombas: La bomba tiene la funcin de proveer un flujo continuo del eluyente a travs del inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son: Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/min-. Rango de presin: de 1 a 5000 psi-.

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Pulsos de presin: Menos del 1% para HPLC normal e inverso y menos del 0,2% para el HPLC de exclusin de tamao. Existen distintos tipos de bombas: De presin constante: son fciles de usar y con bajo mantenimiento, adems evitan los pulsos de presin. El problema es que requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que las variaciones pueden producir fallos. De flujo constante: son capaces de mantener el flujo. Existen varios tipos: Pistn recproco: un pistn expela lquido a travs de una vlvula anti-retorno. Pistn dual: Usando dos pistones, provee un flujo constante y libre de pulsos Desplazamiento positivo (jeringuilla): un pistn controlado por motor que provee un flujo suave y sin pulsos.

Gradiente de elucin: Para crear el gradiente de la fase mvil, es necesaria una mezcla de los componentes. La capacidad de mezcla es vital para obtener el eluyente ptimo. Existen dos mtodos: Mezcla de alta presin: se usan bombas de alta presin individuales para cada lquido. Las salidas se conectan en una cmara de mezcla se usa un controlador electrnico para asegurar que la mezcla es ptima. Mezcla de baja presin: la mezcla ocurre antes de pasar por la bomba, el controlador electrnico regula la cantidad de lquido que pasa por los tubos.

Inyectores: Los inyectores deben introducir muestras liquidas en un rango de volumen desde 0,1 ml a 100 ml con una alta precisin y alta presin. Normalmente se usan inyectores Rheodyne que poseen vlvulas de 6 puertos con un bucle que permite no solo la inyeccin de muestra sino tambin la purga del sistema y la eliminacin de burbujas.

Columna: Normalmente compuesta de acero inoxidable del tipo 316, con dimetros internos desde 2,6 a 5 mm, normalmente con filtros de acero poroso.

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Tubos conectores: Todos aquellos tubos que transportan las sustancias de columna a columna, de columna a detector o de detector a detector. No deben superar los 0,634 mm de dimetro interno o causaran picos en las mediciones

Filtros: Situados entre la bomba y el inyector de muestras, para evitar la entrada de ciertas sustancias y evitar el colapso de la columna. Normalmente estos filtros estas compuestos de acero poroso.

Medidores de presin: Son indicadores de fallos en el sistema, nos indica cuando un flujo continuo falla por motivos de presin y si existe alguna fuga en la infraestructura del sistema.

Termostatos de columna: Son importantes para mantener la columna a una temperatura optima, sobretodo en anlisis cualitativo, puesto que las variaciones de temperatura pueden cambian la viscosidad del eluyente e influir en el volumen retenido.

Detectores: De conductividad electroltica el flujo pasa a travs de un capilar con dos electrodos, la conductividad vara en funcin de la composicin del eluyente y se miden. Muy comn en combinacin con el HPLC de intercambio inico.

Electroqumicos: Se basa en la reaccin de oxidacin/reduccin del analito con un electrodo, el nivel de reaccin es proporcional a la concentracin de analito, midiendo esto y comparndolo con el electrodo de referencia nos da datos que podemos usar para cuantificar.

De fluorescencia: Es el detector ms usado y el ms preciso, nos permite hacer un anlisis cualitativo, puesto que las sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en longitudes de onda en el espectro ultravioleta nicas para cada sustancia.

De ndice de refraccin: La deteccin implica la medida del cambio del ndice de refraccin de la columna de eluyente. Se mide la diferencia entre el ndice de refraccin de la fase mvil y la muestra.

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De luz visible/ultravioleta: El detector es bsicamente un espectrofotmetro que mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, midiendo la absorbencia de las sustancias.

De dispersin de luz evaporativa: Se nebuliza la muestra de la columna hasta formar un aerosol, despus se vaporiza el disolvente y se forman gotas de soluto, despus la clula de dispersin de luz detecta su composicin.

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Aplicaciones al anlisis de alimentos

Conservantes antioxidantes: Se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimtrico para medir simultneamente los nueve antioxidantes ms comunes.

Anlisis de carbohidratos en bebidas: La adicin de mono y disacridos a bebidas y zumos sirve como propsito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad aadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio inico con deteccin de pulso amperomtrico con detectores de refraccin o ultravioletas.

Ismeros de carotenoides: El HPLC en combinacin con detectores calorimtricos permite el anlisis de los carotenoides dietticos en tejidos animales y vegetales.

Flavonoides y fenole: En el vino la medicin de estas sustancias permite la determinacin del color la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinacin con colormetros, permiten la determinacin de hasta 22

compuestos diferentes simultneamente.

Lpidos: La determinacin de lpidos animales y vegetales como: colesterol, triglicridos, glicridos y esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersin de Luz Evaporativa (ELS).

cidos lipoico y cido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: Aun en estudio pero su deteccin combinando HPLC con detectores colorimtricos es importante ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular.

Medicin de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamnicas: El uso del HPLC permite la deteccin de mltiples vitaminas en alimentos suplementarios para neonatos.

Hidroxinonenal y otros aldehdos: Se forman como resultado de peroxidacin de lpidos, durante la coccin o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias queso citotxicas.

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Surfactantes no inicos: La deteccin de estas sustancias es crucial puesto que estn altamente reguladas debido a problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersin de luz evaporativa. Carbohidratos simples: usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtindose en un mtodo no destructivo.

Catequinas

del

t :

Las

catequinas

son

flavonoles

del t,

posiblemente

anticancergenos. Se usa HPLC con hidrlisis enzimtica para detectar estas sustancias tan beneficiosas.

Triglicridos: HPLC con ELSD permite la separacin y caracterizacin de todos los tipos de triglicridos.

Contaminantes triptfanos: El HPLC con ELSD y detectores colorimtricos permiten la deteccin de esta sustancia txica proveniente de plaguicidas

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Conclusin
Despus de haber investigado acerca de la cromatografa liquida podemos decir que es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la adsorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla, tambin es una tcnica muy utilizada ya que tiene diversos campos de aplicaciones en la industria mencionado. de los alimentos ya

Para un ingeniero en tecnologa de alimento es de vital importancia tener conocimiento acerca de este mtodo de anlisis de alimentos ya que a travs del mismo puede hacer diagnosticar y saber las caractersticas de los diferentes ingredientes con que se ha elaborado un determinado alimento.

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Bibliografa
1. Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental, Madrid: McGraw-Hill.

2. Mc Master, Marvin (1994) HPLC: A Practical User's Guide. Wiley-VCH.