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ELECTROFORESIS PARTE I FUNDAMENTOS: GELES DE AGAROSA

I. GENERALIDADES La electroforesis en agarosa o geles de poliacrilamida es el mtodo standard utilizado para la separacin, identificacin y purificacin de fragmentos de ADN. La tcnica es simple y rpida de realizar; es capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente por otros mtodos, tales como la centrifugacin en un gradiente de densidad. Adems, la localizacin del ADN dentro del gel puede determinarse directamente mediante tinciones con bajas concentraciones del colorante fluorescente intercalar: Bromuro de Etidio (BrEt); las bandas que contengan tan slo de 1-10ng de ADN no podrn detectarse por examen directo del gel bajo luz UV. (Sharp et al.,1973). Si resulta necesario las bandas pueden, asimismo, recuperarse del gel y utilizarse posteriormente con otros propsitos. Los geles de agarosa y poliacrilamida pueden confeccionarse de varias formas, tamaos y porosidad, y pueden correr en un nmero diferente de configuraciones. La eleccin dentro de estos parmetros depende principalmente del tamao de los fragmentos que se desean separar. Los geles de poliacrilamida son ms efectivos para separar fragmentos pequeos de ADN (5-500pb); su poder de resolucin es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos que difieren en apenas 1pb. Aunque este tipo de geles corre rpidamente y en comparacin a los geles de agarosa, pueden acomodarse un nmero mayor de muestras, poseen la desventaja de ser ms difciles de preparar y manejar que aquellos, y como caracterstica distintiva los de poliacrilamida se corren verticalmente en un campo elctrico constante. Los geles de agarosa poseen un poder resolutivo menor respecto de los de poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separacin. Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 hasta aproximadamente 500kb de longitud. Este tipo de geles usualmente se corren en configuracin horizontal, en un campo elctrico de fuerza y direccin constante. Fragmentos de longitud mayor, hasta 10.000 kb, pueden separarse mediante electroforesis de campo pulsante, en la cual la direccin del flujo elctrico cambia peridicamente.

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I.1.- ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA La agarosa es un polmero lineal, extrado de un alga marina, cuya estructura bsica se muestra en la Fig. 1. Tiempo atrs, la agarosa disponible comercialmente no

O HO CH2OH O O O HO D-galactosa 3,6-anhidro L-galactosa O HO O

Fig. 1: estructura bsica de la agarosa. era completamente pura, generalmente contena contaminantes tales como: otros polisacridos, sales y protenas. La cantidad de contaminantes variaba de lote a lote y de proveedor a proveedor. Estas diferencias afectan tanto a la migracin del ADN, como a la habilidad de recuperarlo del gel para utilizarlo posteriormente, como sustrato en reacciones enzimticas. Actualmente se disponen de agarosas especiales, de alta pureza, en donde se ha verificado la ausencia de inhibidores, nucleasas y en las cuales se ha logrado obtener un fondo mnimo (background) de fluorescencia luego de la tincin con BrEt. Asimismo, hoy existen formas de agarosa qumicamente modificadas que funden y gelifican a bajas temperaturas sin que esto ocasione ningn deterioro en la fuerza y dureza del gel (agarosas low-melting). Este tipo de geles se pueden utilizar para analizar fragmentos de ADN muy pequeos (10-500pb), con lo que adquieren un poder resolutivo mayor respecto a los geles preparados con agarosas comunes, no obstante nunca comparables con el poder resolutivo de los geles de poliacrilamida.

Los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido hasta que se consigue una solucin transparente y lmpida. Posteriormente la solucin se coloca en un molde y se deja solidificar. Una vez que esto sucede, la agarosa forma una matriz,
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cuya densidad est determinada por la concentracin misma de la agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el ADN, cargado negativamente a pH neutro, migra hacia el nodo. No obstante, existen una serie de factores que afectan o modifican la tasa de migracin del ADN en geles de agarosa, a saber:

1. Tamao de la molcula de ADN: Las molculas lineales de ADN doble cadena, migran a travs de la matriz del gel a tasas que son inversamente proporcionales al log10 del nmero de pares de bases que contienen (Helling et al., 1974). Las molculas ms grandes migran mucho ms lentamente debido a que sufren una gran friccin y resistencia en el avance ya que se arrastran a travs de los poros del gel durante la corrida menos eficientemente que las molculas pequeas. 2. Concentracin de la Agarosa: Un fragmento lineal de ADN de un tamao dado migra a diferentes tasas a travs de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. Existe una relacin lineal entre el logaritmo y la movilidad electrofortica del ADN ( ) y la concentracin del gel (), descripta por la siguiente ecuacin: Log = log 0 -Kr
Donde: 0 es la movilidad electrofortica libre del ADN y Kr es el coeficiente de retardo, una constante relacionada con las propiedades del gel y al tamao y forma de las molculas que migran. As mediante la utilizacin de los geles con diferentes concentraciones de agarosa, es posible resolver un amplio rango de tamaos de molculas de ADN. (Ver Tabla I).

3. Conformacin del ADN: Las diferentes formas de ADN circulares superhelicoidales (forma I), circular con nick (forma II) y lineales (forma III), del mismo tamao molecular, migran a travs de los geles de agarosa a diferentes tasas (Thorne 1966, 1967). La movilidad relativa de las tres formas depende primeramente de la concentracin de la agarosa en el gel, de la fuerza inica del buffer y en la forma I de la densidad de las torsiones superhelicoidales. (Jonson y Grossman 1997).

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Tabla I: Rango de separacin en geles conteniendo diferentes concentraciones de agarosa. Rango de separacin Cantidad de agarosa en el gel eficiente de molculas de (% p/v ADN lineal (KB)

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

Una forma ambigua para identificar las diferentes formas conformacionales del ADN es realizar electroforesis en presencia de cantidades crecientes de BrEt. A medida que la concentracin de BrEt crece, ms colorante se une al ADN. Progresivamente las vueltas superhelicoidales negativas, en la forma I, se remueven, el radio de la molcula incrementa y la tasa de migracin decrece. En el punto crtico de concentracin de colorante libre, donde no hay vueltas superhelicoidales, la tasa de migracin de las molculas de ADN con forma I alcanza su valor mnimo. Si se sigue agregando BrEt, se generan vueltas superhelicoidales positivas, la molcula de ADN se vuelve ms compacta, y su movilidad se incrementa rpidamente. Simultneamente la movilidad de las formas II y III decrece diferencialmente debido a la neutralizacin de cargas y la gran rigidez impartida al ADN por el colorante. Para muchas preparaciones de formas I de ADN, la concentracin crtica de BrEt libre est en el rango de 0.1g/ml a 0.5g/ml.

4. Voltaje aplicado: A bajo voltaje, la tasa de migracin de fragmentos lineales de ADN es proporcional al voltaje aplicado. No obstante, a medida que la fuerza del campo elctrico se incrementa, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto PM incrementa diferencialmente. As, el rango efectivo de separacin en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se incrementa. Para obtener una resolucin mxima de fragmentos de ADN mayores a 2Kb, los geles se deben correr a no ms de 5 V/cm. La distancia se mide como la va ms corta entre los electrodos, no es simplemente la longitud misma del gel. 5. Direccin del campo elctrico: Las molculas de ADN de longitud mayor a 50-100kb migran a la misma tasa a travs de geles de agarosa, si la direccin del campo elctrico se mantiene constante. 6. Composicin de bases y temperatura: El comportamiento del ADN en geles de agarosa (a diferencia de lo que ocurre con los geles de poliacrilamida) no est afectado significativamente por su composicin de bases ni por la temperatura a la cual se corre el gel. Por tanto en

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geles de agarosa la movilidad electrofortica relativa de fragmentos de ADN de diferentes tamaos no cambia entre 4C y 30C. Generalmente los geles de agarosa se corren a temperatura ambiente. No obstante aquellos geles con concentraciones de agarosa por debajo del 0.5% y los geles preparados con agarosa low melting son ciertamente frgiles y por tanto es mejor correrlos a 4C donde son ms fuertes. 7. Presencia de colorantes intercalares: El BrEt, colorante fluorescente, utilizado para detectar ADN en geles de agarosa y poliacrilamida (Sharp et al., 1973), reduce la movilidad electrofortica de ADN lineal en un 15%. Este colorante se intercala entre las bases apiladas, extendiendo la longitud del ADN lineal y ADN circular con nick tornndolos ms rgidos.
El BrEt es un agente carcinognico y debe manipularse con mucho cuidado, utilizando guantes. Todas las soluciones conteniendo BrEt deben decontaminarse antes de ser descartadas.

8.Composicin del Buffer de corrida: La movilidad electrofortica del ADN es afectada por la composicin y la fuerza inica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (p.e. si se omitiera el buffer de corrida por error) la conductividad elctrica es mnima y el ADN migra, si lo hace, muy lentamente. En buffers con elevada fuerza inica (p.e. si por error se utiliza el buffer de corrida al 10X) la conductividad elctrica es muy eficiente generndose calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Existen diferentes Buffers para electroforesis de ADN doble cadena, sus componentes son EDTA (pH 8.0) y Tris-acetato (TAE), Tris-borato (TBE), o Tris-fosfato (TPE) a una concentracin aproximada de 50mM (pH 7.5-7.8). Generalmente se preparan soluciones de trabajo concentradas y se conservan a T ambiente. El buffer ms utilizado generalmente es TAE aunque su capacidad de buffer es un tanto baja y en electroforesis prolongadas tiende a agotarse durante la corrida (el nodo se vuelve alcalino y el ctodo cido). TPE y TBE, aunque un poco ms caros, poseen una capacidad de buffer significativamente mayor. El buffer comnmente utilizado para electroforesis de ADN de simple cadena desnaturalizado es 50mM NaOH, 1mM EDTA (buffer para electroforesis alcalina, ver ms adelante). Ver Tabla II.

I.1.1- PREPARACIN Y SIEMBRA DE GELES DE AGAROSA Antes de efectuar la siembra de los geles, se debe constatar que no hayan quedado burbujas tanto en el cuerpo del gel como entre los dientes del peine. Es conveniente dejar enfriar la solucin de agarosa ms buffer hasta los 60C antes de volcarlo en el molde, el cual debe tener perfectamente obstruidos sus bordes. Nunca debe volcarse el gel muy caliente, ni por debajo de los 60C, pues aparecern
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ondulaciones debido al enfriamiento desigual que sufre el mismo, que luego provocarn distorsiones en la corrida.

Tabla II: Buffers comnmente utilizados en Electroforesis Buffer Tri-acetato (TAE) Tris-fosfato (TPE) Tris-borato1 (TBE) Alcalino2 Solucin de Trabajo 1X: 0.004 M Tri-acetato 0.001 M EDTA 1X: 0.09M Tris-fosfato 0.002M EDTA Solucin Stock (por litro) 50X: 242g Tris base 57.1 ml ac. Actico glacial 100ml 0.5M EDTA (pH 8.0) 10X: 108g Tris base 15.5ml 85% ac. Fosfrico (1.679g/ml) 40ml 0.5M EDTA (pH 8.0) 5X: 54g Tris base 27.5g ac. Brico 20ml 0.5M EDTA (Ph 8.0) 1X: 5ml 10N NaOH 2ml 0.5M EDTA (Ph 8.0)

0.5X: 0.045M Trisborato 0.001M EDTA 1X: 50mN NaOH 1 mM EDTA

1-cuando las soluciones concentradas se guardan por perodos prolongados suelen observarse precipitados. Para evitar problemas, preservar la solucin 5X en botellas de vidrio a T ambiente y descartarla cuando se observen precipitados. Originalmente el TBE se utilizaba al 1X para electroforesis de geles de agarosa. Aunque una solucin al 0.5X provee suficiente poder de buffer. TBE al 1X generalmente se utiliza para geles de poliacrilamida, pues los reservorios para el buffer son pequeos y la cantidad de corriente es considerable, por tanto se requiere un poder de buffer adecuado. 2- el buffer para electroforesis alcalina debe prepararse fresco.

Una vez solidificado el gel, ste debe sumergirse en la cuba de electroforesis y el mismo debe quedar cubierto por el buffer de corrida (1mm aproximadamente). Posteriormente se retira el peine, nunca hacerlo antes pues se pueden producir roturas en los pocillos generados por el peine con la consecuente prdida de la muestra cuando se siembra en esos lugares. Es conveniente dejar que el gel se estabilice con el buffer antes de efectuar la siembra. Utilizando una micropipeta se mezcla la muestra con un buffer de carga o loading buffer (Ver Tabla III) y lentamente se introduce la muestra en la muesca (slot) del gel sumergido. El volumen mximo de la solucin (muestra + buffer de carga) que puede ubicarse en el slot est determinada por las dimensiones de ste, que es consecuencia directa del tipo de peine utilizado en la preparacin del gel. No obstante para evitar contaminaciones con las muestras vecinas y en los casos en los que es necesario sembrar un gran volumen de solucin es conveniente realizar un gel un poco ms grueso o concentrar el ADN por precipitacin con etanol, antes que llenar por completo el slot. Generalmente en las corridas es necesario utilizar marcadores de ADN de tamao conocido (adquiridos, por lo general, comercialmente), que deben incluirse en la
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siembra a ambos lados (derecho e izquierdo) del gel y muchas veces en el medio del mismo. Esto facilita la determinacin del tamao de los fragmentos de ADN desconocidos, si es que ocurriera cualquier distorsin del gel durante la corrida.
Tabla III: diferentes tipos de buffers de carga o loading buffers TIPO DE BUFFER 6X BUFFER T DE PRSERVACIN
0.25% azul de bromofenol 0.25% xylen cyanol FF 40% (p/v) sucrosa en agua 0.25% azul de bromofenol 0.25% xylen cyanol FF 15% Ficoll en agua 0.25% azul de bromofenol 0.25% xylen cyanol FF 30% de glicerol en agua 0.25% azul de bromofenol 40% (p/v) sucrosa en agua Loading buffer alcalino 300 mN NaOH 6mM de EDTA 18% Ficoll en agua 0.15% verde de bromocresol 0.25% de xylen cyanol FF

4C

II

T ambiente

III

4C

IV

4C

4C

Los loading tienen tres propsitos: a) Incrementan la densidad de la muestra, b) Aseguran que el ADN caiga directamente dentro de la muesca del gel, c) Otorgan color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo elctrico migran hacia el nodo a tasas predecibles. El azul de Bromofenol migra a travs de geles de agarosa aproximadamente 2.2 veces ms rpido que el xylen cyanol ff, independientemente de la concentracin de la agarosa. El 1ro. corre en (TBE 0.5X) aproximadamente a la misma tasa que ADN lineal doble cadena de 300pb de longitud, mientras que el 2do. lo hace comparable a ADN lineal doble cadena de 4Kb de longitud. Cul de ellos utilizar es una cuestin de eleccin personal. Empero el verde de bromocresol es el utilizado en geles alcalinos muestra DE una coloracin ms viva respecto del azul de bromofenol a pH alcalino. 3.- CORRIDA DEpues GELES AGAROSA:

Una vez efectuada la siembra de todas las muestras, se procede a tapar la cuba de electroforesis, y a enchufar los cables correspondientes para aplicar el voltaje deseado. As el ADN migrar hacia el nodo (rojo). El voltaje aplicado ser de 1-5V/cm (medida como la distancia entre los electrodos). Si los electrodos se colocaron correctamente, se formarn burbujas en nodo y ctodo (debido a la electroforesis) y en unos pocos minutos el loading buffer comenzar a migrar desde el slot o well hacia el cuerpo del gel. El gel se corre hasta que el frente de corrida (formado por los colorantes del loading) haya migrado una distancia apropiada a travs del gel. Si los geles se corrieron en presencia de BrEt (tanto en el buffer como en el gel), ste migra hacia el ctodo (en direccin opuesta a la del ADN). As, electroforesis prolongadas pueden remover gran parte del BrEt del gel, tornando dificultosa la
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deteccin de pequeos fragmentos. Si esto ocurre, es conveniente teir el gel luego de la corrida en una solucin de BrEt (0.5l/ml) por 30-45m en el mismo buffer o simplemente en agua. La presencia del BrEt permite que el gel pueda ser examinado bajo luz UV en cualquier momento durante la corrida. No obstante, existen personas que consideran que se obtiene una corrida ms fiel de los fragmentos, en ausencia del colorante teniendo en cuenta que ste se intercala con las bases del ADN ocasionando un retardo en la corrida de los mismos. Por tanto en estos casos la corrida se efecta en ausencia del colorante tanto en el buffer como en gel y una vez finalizada la electroforesis se tie el gel como se describi ms arriba. I.1.2-TINCIN DE GELES DE AGAROSA La forma ms conveniente de visualizacin del ADN en geles de agarosa es teirlo con el colorante fluorescente BrEt (Sharp et al., 1973). Esta sustancia posee un grupo planar que se intercala entre las bases apiladas del ADN. La posicin fija de este grupo y su cercana a las bases causa la unin del colorante al ADN que muestra una fluorescencia comparable a aquella que posee el colorante libre en solucin. La radiacin UV a 254nm es absorbida por el ADN y transmitida al colorante, la radiacin a 302nm y 366nm es absorbida por el colorante unido. En ambos casos la energa es reemitida a 590nm en la regin rojo-naranja del espectro visible. Dado que la fluorescencia impartida por el complejo ADN:BrEt, es mayor a aquella emitida por el colorante libre, es posible detectar pequeas cantidades de ADN en presencia de BrEt libre en el gel. El BrEt se utiliza para detectar tanto ADN como ARN simple o doble cadena. No obstante la afinidad del colorante por c. nucleicos simple cadena es menor y por tanto la fluorescencia impartida es ms pobre. El BrEt usualmente se prepara como una solucin stock de 10mg/ml en agua y se mantiene a temperatura ambiente en botellas oscuras o cubiertas con papel aluminio. El colorante generalmente se incorpora al buffer de corrida a una concentracin de 0.5g/ml. No obstante, la movilidad electrofortica de las molculas de ADN doble cadena lineal se reduce aproximadamente un 15% en presencia del colorante, pero resulta muy ventajosa la posibilidad de examinar el gel bajo luz UV en cualquier momento de la corrida. Empero, el gel puede correrse en ausencia del colorante y
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teirse posteriormente, una vez que se completa la electroforesis. En este caso el gel se sumerge en el mismo buffer de corrida o en agua conteniendo BrEt (0.5g/ml) por 3045 minutos a temperatura ambiente. Normalmente no se destie el gel, pero la visualizacin de cantidades muy pequeas de ADN (10ng) se facilita si se reduce el background fluorescente originado por el BrEt no asociado al ADN y esto se consigue sumergiendo el gel en agua o en 1mM MgSO4 por 20min a temperatura ambiente.

I.1.3-FOTOGRAFIADO DE GELES DE AGAROSA: El fotografiado de geles puede efectuarse utilizando luz ultravioleta incidente o transmitida. Muchas de las fuentes de UV disponibles comercialmente emiten luz UV a 302nm. La fluorescencia emitida por el complejo ADN:BrEt es considerablemente ms alta a esa longitud de onda que a 366nm y ligeramente menor a 254nm. No obstante, la cantidad de roturas o nicks en el ADN es mucho menor a 302nm que a 254nm (Brunk y Simpson 1977). El film ms sensible y el ms utilizado es el Polaroid tipo 57 o 667 (ASA 3000), y una exposicin de apenas unos pocos segundos es suficiente para obtener imgenes de bandas conteniendo hasta 10ng de ADN. Con exposiciones ms prolongadas y con una buena fuente de luz UV, se podr fotografiar la fluorescencia emitida por tan slo un 1ng de ADN. PRECAUCIN!!!!: la radiacin ultravioleta es peligrosa, particularmente para los ojos. Para minimizar la exposicin se debe asegurar que la longitud de onda de la lmpara es la adecuada y se deben utilizar lentes o mscaras protectoras que bloqueen eficientemente la UV.

I.2.-GELES DE AGAROSA ALCALINOS: Los geles de agarosa alcalinos (Mc Donell et al. 1977) se utilizan para el anlisis de ADN simple cadena. Particularmente y entre los muchos propsitos se emplean para: a) Anlisis del tamao del ADNc en los hbridos ADN:ARN resistentes a la nucleasa S1. b) Para verificar el tamao de la primera y segunda cadena en la sntesis de ADNc mediante transcriptasa reversa. c) Para verificar la actividad de corte en preparaciones enzimticas utilizadas para clonado molecular.
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d) Para calibrar los reactivos utilizados en el nick translation del ADN. Debido a que la adicin de NaOH a una solucin caliente de agarosa provoca la hidrlisis de los polisacridos, la agarosa se funde en una solucin neutra en ausencia de buffer (usualmente agua) y se equilibra en buffer de electroforesis alcalino antes que el gel se vierta en el molde. No se utilizan ni formamida mi urea como desnaturalizantes debido que provocan un cambio en la agarosa tornndola gomosa. Una vez que la agarosa se disolvi perfectamente en agua, luego de ser calentada, se deja enfriar la solucin hasta los 60C y se le agrega NaOH 50mM y EDTA (pH 8.0) a 1mM, y posteriormente se vuelca el gel, como en el caso de geles de agarosa. Una vez solidificado el gel se coloca en la cuba de electroforesis y se le agrega el buffer correspondiente al 1X hasta que el gel quede debidamente cubierto. El BrEt se omite en este tipo de geles pues el mismo, no se une al ADN a pH elevados. Los geles alcalinos conducen mayor corriente que los geles de agarosa neutros a voltajes comparables, y se calientan durante la corrida. Por tanto stas ltimas deben efectuarse a un voltaje < 0.25 V/cm.

I.3- RECUPERACIN Y PURIFICACIN DE FRAGMENTOS DE ADN EN GELES DE AGAROSA: Se han desarrollado numerosos mtodos tendientes a recuperar ADN a partir de geles, pero ninguno ha resultado enteramente satisfactorio. Entre los problemas que se citan podemos resaltar: Presencia de inhibidores para reacciones enzimticas: antiguamente muchas de las agarosas presentaban contaminaciones con polisacridos pobremente descriptos, los cuales eran extrados del gel conjuntamente con el ADN. Estas sustancias son inhibidores potentes de muchas de las enzimas utilizadas comnmente en los pasos subsecuentes de clonacin. No obstante, con el advenimiento de agarosas de alta pureza se ha reducido considerablemente este inconveniente, pero pueden an existir ocasiones en las que el ADN recuperado se encuentre en forma no reactiva. Recuperacin ineficiente de fragmentos grandes de ADN: la eficiencia de recuperacin de fragmentos de ADN a partir de agarosa est en funcin de su peso molecular. Aunque muchos de los mtodos dan un rendimiento razonable
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para fragmentos de ADN que son menores a 5Kb de longitud (>50%), ninguno es enteramente satisfactorio para fragmentos mayores. A medida que el tamao del fragmento de ADN se incrementa el rendimiento decrece progresivamente, especialmente cuando la recuperacin del ADN involucra mtodos de unin a una matriz slida, tales como DEAE-Sefacel o DEAE-membrana de celulosa. Los fragmentos grandes se unen fuertemente a tales soportes y posteriormente es muy difcil eluirlos. Recuperacin ineficiente de pequeas cantidades de ADN: cuanto ms pequea es la cantidad de ADN colocada en el gel, menor ser su rendimiento en la purificacin. En ciertas ocasiones la prdida es tan grande que no se justifica intentar la recuperacin de bandas que contienen menos de 500ng de ADN. Imposibilidad de recuperar simultneamente varios fragmentos: muchas de las tcnicas son laboriosas y consisten en varias manipulaciones individuales. Por tanto es limitada la cantidad de fragmentos que pueden recuperarse.

Actualmente muchas de estas dificultades estn siendo superadas por la aparicin de Kits comerciales o resinas, que garantizan la eficiencia de recuperacin y purificacin de los fragmentos. De los muchos mtodos existentes slo se mencionar la recuperacin de fragmentos de ADN a partir de agarosas de bajo punto de fusin. Este mtodo posee la ventaja de que ciertas reacciones enzimticas (p.e. digestin con enzimas de restriccin y ligacin) pueden efectuarse directamente en el gel fundido. I.3.1- Recuperacin de ADN a partir de Agarosas low-melting: Existen un gran nmero de agarosas en las cuales se ha introducido un grupo hydroxietilen a la cadena de polisacrido. Esta sustitucin provoca que la agarosa gelifique aproximadamente a los 30C y se funda aproximadamente a los 65C -por debajo de la temperatura de fusin del ADN doble cadena-. Estas propiedades han sido explotadas para el desarrollo de una tcnica simple tendiente a la recuperacin de fragmentos de ADN del gel (Wieslander 1979; Parker and Seed 1980). As, una vez que se efecta la electroforesis con estos tipos de agarosa (generalmente la misma se lleva a cabo a 4C, para preservar al gel de fundirse durante la corrida), se coloca el gel sobre la
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UV y se corta la banda de inters utilizando una hoja de afeitar o un bistur, tratando de evitar la mayor cantidad posible de agarosa para reducir la cantidad de contaminantes que actuaran posteriormente como inhibidores (recordar que los fragmentos de ADN de un tamao dado corren ligeramente ms rpido en este tipo de geles respecto de aquellos con agarosas convencionales). Es conveniente fotografiar el gel despus de efectuar el corte para registrar cul fue la banda eluda. La lonja de agarosa conteniendo el ADN de inters se coloca en un tubo y se prosigue con el protocolo de recuperacin recomendado por el proveedor. Debido a que la agarosa low melting permanece en estado fluido a 37C, se pueden efectuar reacciones enzimticas tales como: ligacin, sntesis de sondas radioactivas, y digestiones con enzimas de restriccin, simplemente agregando porciones de la agarosa fundida, conteniendo el fragmento de inters, a la mezcla de reaccin. Actualmente existen mtodos alternativos que permiten recuperar fragmentos de ADN de alto peso molecular a partir de estos tipos de agarosa (Burmeister and Lehrach 1989).

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II- BIBLIOGRAFA:
Burmeister, M. and Lehrach, H. 1986. Long-range restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene. Nature 324:582.Brunk, C. R. and Simpson, L. 1977. Comparison of various ultraviolet sources for fluorescent detection of ethidium bromide-DNA complexes in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 82: 455. Helling R.B.; Goodman H.M. y Boyer H.W. 1974 Analysis of R. Eco RI fragments of AND from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14: 1235.Jonson, P.H. and Grossman, L.I. 1997. Electrophoresis of DNA in agarose gels. Optimizing separations of conformational isomers of double- and single stranded DNAs.

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