ACTA OPTOP BPAS 14(5) - 2006

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Traba|ho receb|do em 24/04/06 aprovado em 07/07/06
ARTIGO ORIGINAL
RESUMO
Ob|et|vos: Foram ava||ados os ee|tos do uso de ce|u|as tronco
da medu|a ossea (CTM) e do p|asma r|co em p|aquetas (PPP) na
regenerao de nervos per|er|cos, ut|||zando um mode|o estabe-
|ec|do de regenerao de nervo c|t|co em ratos. Metodos: m
dee|to nervoso de 10 mm o| reconstru|do com a ut|||zao de um
tubo de s|||cone preench|do com CTM, PPP ou ambos. O grupo
contro|e recebeu somente o tubo de s|||cone. Fo| rea||zado a|nda
um qu|nto grupo no qua| o |nterva|o o| reconstru|do ut|||zando o
segmento ressecado do nervo. A uno motora o| testada se|s
semanas apos a c|rurg|a ut|||zando teste de marcha. Apos o teste
motor, os ratos oram anestes|ados, o nervo c|t|co e o tubo oram
ressecados e o| rea||zada m|croscop|a e|etron|ca de transm|sso.
Pesu|tados: A an||se quant|tat|va demonstra uma me|hora na recu-
perao unc|ona| no grupo CTM em comparao com os dema|s
grupos. Pegenerao nervosa o| demonstrada no grupo CTM
por m|croscop|a e|etron|ca de trasm|sso com uma recuperao
prat|camente comp|eta da anatom|a neura|. Conc|uso: Nossos
resu|tados sugerem que o uso de CTM assoc|ado com a tecn|ca
de tubu||zao promove uma sat|sator|a recuperao da uno
motora e regenerao nervosa.
Descritores: Clulas tronco; Nervos perifricos; Modelos
animais.
EFEITOS DAS CLULAS TRONCO ADULTAS DE MEDULA
SSEA E DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA
REGENERAO E RECUPERAO FUNCIONAL NERVOSA
EM UM MODELO DE DEFEITO AGUDO EM NERVO
PERFIFRICO EM RATO
JEFFERSON BRAGA-SILVA
1
, DANIEL GEHLEN
6
, JAVIER A. ROMAN
2
, CAROLINE MENTA
6
, EDUARDO DE ANDRADE ATKINSON
6
,
DENISE CANTARELLI MACHADO
3
, CHRISTIAN VIEZZER
6
, GUSTAVO LEIVAS BARBOSA
6
, CRISTIANE VON WERNE BAES
6
,
VINICIUS DUVAL SILVA
4
, JADERSON COSTA DA COSTA
5

Traba/ho rea//zado no Serv/o de C/rurg/a da Mo e M/croc/rurg/a Reconstrut/va, Pontf/c/a Un/vers/dade Cat//ca do R/o Grande do Su/, Braz// e lnst/tuto de Pesqu/sas B/omd/cas,
Pontf/c/a Un/vers/dade Cat//ca do R/o Grande do Su/, Porto A/egre, R/o Grande do Su/, Braz//
Endereo ara corresondnc/a: Av. l/ranga 6690 - Centro C/n/co PUCRS, Sa/a 216 , CEP 90610-000, Porto A/egre, Bras// - Ema//: jeffmao@terra.com.br
1 - Professor L/vre Docente em C/rurg/a da Mo e/a UNlFESP.
2 - Md/co Ortoed/sta e Traumato/og/sta.
3 - B//oga da Facu/dade da PUCRS.
4 - Professor de Pato/og/a da Facu/dade de Med/c/na da PUCRS.
5 - D/retor do lnst/tuto de Pesqu/sas B/omd/cas da PUCRS.
6 - Acadm/co em Med/c/na.
INTRODUO
Apesar do enxerto nervoso auto|ogo ser uma das opoes no trata-
mento de |n|r|as nervosas no qua| o reparo pr|mr|o no pode ser
rea||zado sem a ut|||zao de tenso excess|va, ex|stem a|gumas
d||cu|dades na ut|||zao desta tecn|ca, como o a|uste do com-
pr|mento e do d|metro do enxerto. lnmeras tentat|vas tem s|do
e|tas para |nduz|r a regenerao nervosa em dee|tos nervosos
ut|||zando mater|a|s no b|o|og|cos como tubos de s|||cone
(1,2,3)
. No
entanto, a capac|dade de |nduo de regenerao nervosa dos
mater|a|s no b|o|og|cos tem s|do cons|derada |nadequada, e o
desenvo|v|mento de nervos art||c|a|s comb|nando ce|u|as, como as
de Schwann
(4,5)
e atores neurotro|cos
(6,7)
|untamente com mater|a|s
no b|o|og|cos, tem s|do ut|||zado atua|mente.
O ob|et|vo deste estudo o| ava||ar o ee|to das ce|u|as da medu|a
ossea, do p|asma r|co em p|aquetas e da comb|nao de ambos na
regenerao de nervos per|er|cos em comparao com as tecn|cas
BONE MARROw AND PLATELET-RlCH PLASMA STEM CELLS EFFECTS ON NERvOUS REGENERATlON AND
FUNCTlONAL RECOvERY lN AN ACUTE DEFECT MODEL OF RATS' PERlPHERAL NERvE
SUMMARY
Oo/ec||.es. 7|e e//ec|s c/ ||e 0se c/ ocne ma||c. s|em ce||s (VSC;
ano o|a|e|e|-||c| o|asma (|P|; cn oe||o|e|a| ne|.es |eene|a||cn
.e|e assesseo o, 0s|n an es|ao||s|eo mcoe| c/ sc|a||c ne|.e |een-
e|a||cn |n |a|s. Ve||cos. / '0-mm ne|.c0s oe/ec| .as |eccns||0c|eo
o, 0s|n a s|||ccne |0oe /|||eo .||| VSC, |P| c| oc||. 7|e ccn||c|
|c0o |ece|.eo cn|, ||e s|||ccne |0oe. / /|/|| |c0o .as a|sc se|, |n
.||c| ||e |n|e|.a| .as |eccns||0c|eo o, 0s|n a o||eo semen| c/ ||e
ne|.e. Vc|c| /0nc||cn .as |es|eo s| .ee|s a/|e| s0|e|,, o, means
c/ a a|| |es|. //|e| mc|c| |es|, ||e |a|s .e|e anes||e||zeo, ||e sc|a||c
ne|.e ano ||e |0oe .e|e o||eo, ano ||e ||ansm|ss|cn e|ec||cn|c m|-
c|cscco, .as oe|/c|meo. Pes0||s. 7|e q0an|||a||.e ana|,s|s s|c.s
an |mo|c.eo /0nc||cna| |ecc.e|, |n VSC |c0o ccmoa|eo |c ||e
c||e| |c0os. Ne|.c0s |eene|a||cn .as |eoc||eo /c| VSC |c0o
o, means c/ ||ansm|ss|cn e|ec||cn|c m|c|cscco, .||| an a|mcs| /0||
|ecc.e|, c/ ||e ne0|a| ana|cm,. Ccnc|0s|cn. O0| |es0||s s0es| ||a|
||e 0se c/ VSC ccmo|neo .||| |0o|n |ec|n|q0e ,|e|os a sa||s/ac|c|,
|ecc.e|, c/ mc|c| /0nc||cn ano ne|.c0s |eene|a||cn.
Keywords: S|em Ce||s; Pe||p|e|a| Ne|tes; Vode|s, 4n|ma|.
Citao: Braga-Silva J, Gehlen D, Poman JA, Menta C, Atkinson EA, Machado
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|||p.//www.sc|e|o.o|/aoo.
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atua|mente ut|||zadas para o tratamento de
|esoes em nervos per|er|cos.
MATERIAIS E MTODOS
IsoIamento e CuItura das CIuIas
Tronco de MeduIa ssea
O |so|amento de ce|u|as tronco da medu|a
ossea o| rea||zado apos adm|n|strao de
uma dose |eta| de Ketam|na e C|orproma-
z|na. T|b|a e emur oram d|ssecados. A
medu|a o| ret|rada com 1 m| de DBPS (G|-
bco TM, lnv|trogen Corporat|on, Car|sbad,
CA) ut|||zando uma agu|ha de 0,8X25mm
(21 Gauze). As ce|u|as tronco da medu|a
ossea oram |avadas duas vezes com 1
m| de DBPS para me|os de centr|ugao
por 30 segundos a 700G. F|na|mente, as
ce|u|as oram ressuspensas a uma den-
s|dade de 10
7
ce|u|as/m| de DBPS.
Preparo do PIasma Rico em
PIaquetas
O p|asma r|co em p|aquetas o| prepa-
rado usando co|eo obt|da por puno
card|aca com um tubo contendo c|trato
de sod|o. A amostra o| centr|ugada em
160G. por 8 m|n e uma rao de 10 mm
sobre er|troc|tos, contendo a rao de
p|asma r|co, o| remov|da. G|uconato de
ca|c|o (10%) o| ad|c|onado e o tubo o|
|ncubado em 37
o
C ate a so|uo tornar-
se v|scosa. P|asma r|co em p|aquetas o|
ut|||zado para ressuspender as ce|u|as
tronco da medu|a ossea a uma dens|dade
de 10
7
ce|u|as.
Procedimento Cirrgico
Os proced|mentos exper|menta|s oram
aprovados pe|o Com|te de t|ca da nossa
|nst|tu|o e oram conduz|dos de acordo com o Gu|a de Pr|nc|p|os
para Pesqu|sa Envo|vendo An|ma|s e Seres Humanos, tomando
as med|das adequadas para m|n|m|zar a dor e o desconorto dos
an|ma|s. Quarenta e o|to ratos adu|tos emas da ||nhagem W|star
oram anestes|ados sob |n|eo |ntramuscu|ar de uma so|uo
composta por Ketam|na
TM
(Ketam|n-S() 50 mg/m|) 70mg/kg e
Xy|az|na (100mg/m|) 10 mg/kg. O nervo c|t|co o| abordado no
aspecto |atera| da coxa d|re|ta. m segmento de 10 mm do nervo
o| ressecado e dee|to o| |med|atamente reconstru|do. Os an|ma|s
oram d|v|d|dos em c|nco grupos de acordo com a tecn|ca ut|||zada
para reconstruo. Nos grupos 1 a 4, o dee|to o| reconstru|do
com um tubo de s|||cone |ex|ve|
(compr|mento med|o: 14 mm
e d|metro med|o: 0,8 mm). O
ep|neuro o| suturado a um pon-
to s|tuado a 2 mm de d|stnc|a
da extrem|dade do tubo. A ex-
trem|dade do nervo o| comp|e-
tamente |ntroduz|da no |nter|or
do |men do tubo produz|ndo
um compart|mento echado.
Os grupos oram d|v|d|dos
de acordo com a preparao
usada para preencher o |men
do tubo. Grupo 1: tubo vaz|o
(Tv), Grupo 2: ce|u|as tronco
da medu|a ossea (CTM), Grupo
3: p|asma r|co em p|aquetas
(PPP), Grupo 4 (CTM PPP):
assoc|ao de ce|u|as tronco da medu|a
ossea e p|asma r|co em p|aquetas. O
|nterva|o o| reconstru|do ut|||zando o
segmento ressecado do nervo como um
autoenxerto no grupo 5 (AE), o qua| o|
suturado ut|||zando tecn|ca convenc|ona|.
Em v|rtude da prev|s|b|||dade dos resu|ta-
dos nos grupos contro|e (grupos 1 e 5) o
nmero de an|ma|s o| a metade (n~06)
do estabe|ec|do para os dema|s grupos
exper|menta|s (n~12). Apos c|rurg|a,
todos an|ma|s permaneceram saudve|s
durante o estudo.
AnIise FuncionaI e HistoIgica
Testes de marcha oram obt|dos de
acordo com o metodo de Med|nace||
(8,9)
,
10 semanas apos a c|rurg|a. E|as oram
med|das ut|||zando um b|oco de d|g|ta||za-
o conectado a um computador pessoa|
ut|||zando um sotware morometr|co. O
lnd|ce de Funco C|t|ca (lFC) o| obt|do
para cada an|ma|. Os lFC de d|erentes
grupos exper|menta|s oram comparados
ut|||zando an||se de var|nc|a e Teste
de Tukey post-hoc. Em todas an||ses
estat|st|cas p0,05 o| cons|derado como
sendo estat|st|camnete s|gn||cat|vo. Os
an|ma|s oram sacr||cados |ogo apos
a rea||zao dos testes de marcha. Fo|
ut|||zada m|croscop|a e|etron|ca de trans-
m|sso para a ava||ao da regenerao
do nervo dentro do tubo preench|do com
CTM e no grupo contro|e (Grupo Tv), no
qua| o| ut|||zado apenas o tubo de s|||cone
sem CTM (F|guras 1 e 2).
RESULTADOS
O lnd|ce de Funco C|t|ca (lFC) o| obt|-
do para cada an|ma|, apos 10 semanas
do proced|mento c|rrg|co. Os grupos oram comparados todos
|untamente e, tambem, entre do|s a do|s. Os resu|tados so de-
monstrados na Tabe|a 1 e no Gr|co 1, conorme med|a DP.
A an||se quant|tat|va dos lFC, sugere uma me|hora da recuperao
unc|ona| no grupo CTM em comparao com os dema|s grupos,
demonstrada atraves da obteno de me|hores resu|tados no
teste de marcha, sendo segu|do pe|os grupos PPP e CTMPPP,
os qua|s oram estat|st|camente equ|va|entes. O segu|nte me|hor
resu|tado o| observado no grupo AE. O grupo Tv apresentou
os p|ores resu|tados, demonstrando uma ma|or d||cu|dade para
recuperao da uno motora.
A regenerao nervosa o|
demonstrada no grupo CTM
por m|croscop|a e|etron|ca de
transm|sso atraves de uma
quase comp|eta recuperao
da anatom|a neura|. Axon|os
m|e||n|cos e am|e||n|cos oram
|dent||cados em quant|dade
adequada dentro do tubo pre-
ench|do com CTM (F|gura1).
No grupo em que o| ut|||zado
apenas o tubo de s|||cone houve
regenerao, porem bem me-
nos s|gn||cat|va com re|ao ao
grupo anter|or. O grupo Tv apre-
sentou um cresc|mento ma|s
|ento e em menor quant|dade
de |bras nervosas, bem como
F/gura 1 - Microscopia e|etrnica e transmisso
e um nervo o grupo TV. Seco transversa| e
um nervo mostrano bainha e mie|ina (M), a|guns
axnios mie|nicos na regio centra| esquera (Ax 1)
e amie|nicos na regio centra| ireita (Ax 2).
F/gura 2 - Microscopia e|etrnica e transmisso
e um nervo regenerao entro e um tubo
preenchio com c|u|as tronco meu|ares. Seco
transversa| e um segmento e nervo entro o
tubo e si|icone emonstrano inmeros axnios
mie|nicos (Ax), bainhas mie|nicas (M) e nc|eos e
c|u|as e Schwann (N).
Tabe/a 1 - Mia o nice e funo citica e acoro com
caa tipo e tratamento.
Grupo de Tratamento
TV CTM PRP CTM +PRP AE
MDlA -85.1000 - 27.5164* - 43.1911 - 41.8642 -51.3200
E. P. 0.9798 0.8414 2.0810 1.0630 1.4906
D. P. 0.4000 2.7905 6.2431 3.6825 0.6666
lndice de Funo Citica: Mede a perda de funo. Quanto mais prximo de zero,
melhor funo de marcha.
Tv: Tubo vazio; CTM: Clulas Tronco derivadas da Medula ssea, PPP: Plasma
Pico em Plaquetas; AE: Autoenxerto.
E.P.: Erro Padro; D.P.: Desvio Padro
* p < 0,05
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Grf/co 1 - Inice e Funo Citica os iferentes
grupos observaos no estuo.
uma menor organ|zao dessas e
um menor nmero de axon|os m|e-
||n|zados (F|gura 2).
DISCUSSO
Ce|u|as tronco humanas adu|tas so
capazes de manter, gerar e subst|tu|r
ce|u|as term|na|mente d|erenc|adas
em seus tec|dos espec||cos como
uma consequenc|a do turnover
ce|u|ar |s|o|og|co ou regenerao
tec|dua| dev|da |n|r|a
(10)
. Estudos
recentes sugerem que ce|u|as tron-
co adu|tas geram ce|u|as d|eren-
c|adas a|em de suas capac|dades
tec|dua|s espec||cas, um processo chamado de "p|ast|c|dade
desenvo|vente"
(11)
.
J o| demonstrado que no apenas ce|u|as tronco der|vadas de
tec|do embr|onr|o ou neura|
(12)
, mas tambem outras ce|u|as tronco
espec||cas de orgos, podem gerar enot|pos neura|s
(13,14)
.
A ut|||zao de ce|uas tronco da medu|a em casos de |esoes
em nervos per|er|cos e cons|derada uma das a|ternat|vas ma|s
prom|ssoras em re|ao s a|ternat|vas reerentes ao tratamento
de |esoes nervosas. A|na|, as mesmas preenchem uma |acuna
terapeut|ca entre a poss|b||||dade de rea||zao de reparo pr|mr|o
mu|tas vezes no poss|ve| dev|do perda nervosa s|gn||cat|va
e a rea||zao de auto-enxerto auto|go, que, por sua vez, est
assoc|ada, mu|tas vezes, a d||cu|dades tecn|cas que |mposs|b|||tam
a rea||zao de ta| tecn|ca pe|o c|rurg|o. Nosso estudo demonstra
que a ut|||zao de ce|u|as tronco no somente e uma a|ternat|va
s|gn||cat|va, bem como apresenta resu|tados super|ores em re|ao
a outras tecn|cas tambem rea||zadas. Estudos |n v|vo tem mostrado
que as ce|u|as tronco de medu|a ossea tem um |mportante poten-
c|a| regenerat|vo apos serem transp|antadas em extrem|dades de
nervos c|t|cos transecc|onados
(15,16)
.
O presente estudo demonstrou que a perormance unc|ona|
ava||ada pe|a an||se do teste de marcha dos ratos tratados com
tubu||zao e ce|u|as tronco da medu|a ossea o| s|gn||cat|vamente
me|hor do que em todos os dema|s grupos. O ee|to bene|co do
PPP o| tambem demonstrado. Os
resu|tados do grupo CTM PPP
so ce|s de |nterpretar quando
comparados com o grupo CTM e
o grupo PPP.
O poss|ve| ee|to ad|c|ona| da pre-
parao de ce|u|as tronco quando
assoc|ado com PPP o| ana||sado,
| que os escores dos grupos PPP e
CTM PPP oram estat|st|camente
os mesmos. ma |nterpretao
poss|ve| e que a preparao de
PPP de a|guma orma |n|be os
ee|tos CTM, parc|a|mente ou ate
comp|etamente.
Nossos dados sugerem que as CTM |n|etadas dentro do tubo
de s|||cone |nduzem a pro||erao e d|erenc|ao de Ce|u|as
de Schwann promovendo uma regenerao ma|s rp|da e ma|s
abundante, com a ormao de um ma|or nmero de |bras m|e||n|-
zadas, perm|t|ndo ass|m uma ma|or recuperao unc|ona| quando
comparados aos dema|s grupos estudados.
CONCLUSO
Nossos resu|tados sugerem que o uso de ce|u|as tronco da me-
du|a ossea de ratos assoc|ado a tecn|ca de tubu||zao promove
uma me|hor recuperao da uno motora e uma regenerao
ma|s abundante em um mode|o de dee|to nervoso agudo quando
comparado aos dema|s grupos ava||ados nesse estudo.
O mecan|smo exato responsve| por este e|to no e comp|etamente
compreend|do. Pesqu|sas ad|c|ona|s so necessr|as para compre-
ender os mecan|smos de d|erenc|ao ocorr|dos no |nter|or do tubo
preench|do com a preparao de ce|u|as tronco adu|tas da medu|a
ossea capaz de promover a |nduo da regenerao nervosa.
O uso de ce|u|as tronco adu|tas auto|ogas e um orte cand|dato
para uso terapeut|co, podendo perm|t|r aos pesqu|sadores e|abo-
rar ensa|os c||n|cos a custos razove|s, sem conrontar qua|quer
questo et|ca, como as envo|v|das no uso de ce|u|as tronco embr|o-
nr|as, a|em de ev|tar reaoes |muno|og|cas que comprometer|am
o transp|ante.