Toxicologa Ambiental y Ecotoxicologa

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS LABORATORIO DE TOXICOLOGA AMBIENTAL

Dr. Fernando R. Cussi S.

2010

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CONTENIDO Objetivo del Laboratorio de Toxicologa Ambiental; Carrera de Ingeniera Ambiental de la Escuela Militar de Ingeniera. Objetivos generales y especficos del manual. Glosario. reas de aplicacin. Responsables. Relacin de procedimientos del Laboratorio de Toxicologa Ambiental. Procedimientos del Laboratorio de Toxicologa Ambiental. Ubicacin del Laboratorio.

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OBJETIVO DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGA AMBIENTAL; CARRERA DE INGENIERA AMBIENTAL DE LA ESCUELA MILITAR DE INGENIERA.

OBJETIVOS GENERALES DEL MANUAL El objetivo del presente manual de Toxicologa Ambiental es fortalecer la formacin acadmica de los alumnos de la carrera de Ingeniera Ambiental mediante una secuencia de actividades en el laboratorio, los cuales pretenden ser formativos y motivadores. De tal manera, que el trabajo en laboratorio, debe ser programado, calendarizado y organizado en cuanto a los apoyos humanos y materiales que permitan lograr las metas planeadas por los objetivos terminales de la materia.

OBJETIVOS ESPECFICOS Los objetivos especficos del presente manual de Toxicologa Ambiental, es tal, que el alumno conocer los efectos de los diversos agentes contaminantes en la salud humana, los principales estudios toxicolgicos que incluyen la caracterizacin del riesgo, evaluacin de la exposicin de dosis respuesta de los contaminantes, los procesos de toxicocintica y toxicodinmia que lo llevarn al entendimiento de los mecanismos de absorcin y biotransformacin de los contaminantes dentro del organismo humano. La formacin acadmica recibida por parte del profesor titular de la materia de toxicologa ambiental y el desarrollo de la actividad aplicativa fomentar y motivar la inquietud investigadora inherente a cada estudiante, en su afn de conocimiento para conocer y modificar su medio. GLOSARIO NDICE 1. Prctica 1. Determinacin de la concentracin letal media (LC50) del insecticida dimetoato utilizando la lombriz de tierra Eisenia fetida 2. Prctica

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2. Biomarcadores de exposicin a plaguicidas organofosforados: actividad carboxilesterasailizacin del ensayo de repulsin a un suelo contaminado con la lombriz de tierra Eisenia fetida. 3. Prctica 3. Utilizacin del ensayo de repulsin a un suelo contaminado con la lombriz de tierra Eisenia fetida. 4. Prctica 4.- Biomarcadores de exposicin a metales pesados: actividad glutatin-stransferasa. REAS DE APLICACIN DOCENCIA El docente de la carrera de Ingeniera Ambiental desempea actividades formativas prcticas docentes, en el laboratorio de Toxicologa Ambiental de la Carrera de Ingeniera Ambiental, para lo cual requiere de la infraestructura y material adecuado, lo que conlleva a un aprovechamiento integral por parte del alumno. Dicha actividad deber ser tal, que el alumno se sienta motivado y comprometido con su formacin acadmica. INVESTIGACIN Las actividades desempeadas en el laboratorio de Toxicologa Ambiental de la Carrera de Ingeniera Ambiental, involucran a los profesores investigadores, los cuales desarrollan proyectos de investigacin, de los cuales, son responsables de la implementacin, desarrollo, ejecucin y evolucin de los mismos, siendo parte fundamental en el fortalecimiento de la infraestructura del laboratorio. EXTENSIN El laboratorio de Toxicologa Ambiental de la Carrera de Ingeniera Ambiental, desarrollar funciones propias que presten servicios de asesora y asistencia a otros organismos pblicos y privadas, cuando as fuera necesario, pretendiendo en lo posible ser autosuficiente, tanto en recursos tcnicos y materiales, mediante dichas actividades, adems de fortalecer la infraestructura del laboratorio. RESPONSABLES El Coordinador del laboratorio, el docente titular.

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PRCTICA No 1 Nombre de la prctica: DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN LETAL MEDIA (LC50) DEL INSECTICIDA DIMETOATO UTILIZANDO LA LOMBRIZ DE TIERRA Eisenia fetida 1.- INTRODUCCIN Los ensayos de toxicidad constituye un elemento esencial en el esquema del proceso Evaluacin del Riesgo Ecolgico (ERA). stos son utilizados fundamentalmente para recibir los efectos agudos o crnicos de nuevas sustancias qumicas potencialmente peligrosas para el medio ambiente como los fitosanitarios, o bien para estimar el impacto ecolgico de una nueva fuente de emisin de residuos txicos al ambiente (efluentes). Si bien este enfoque de ERA es predictivo, podemos igualmente hacer uso de los ensayos de toxicidad para evaluar los efectos txicos de un ambiente histricamente contaminado que ocasione, o pueda ocasionar, un deterioro ecolgico. En estos casos estaramos empleando los ensayos de toxicidad bajo una perspectiva retrospectiva. 2.- OBJETIVO Aprendizaje del significado de LC50, como calcularlo, sus ventajas y limitaciones. Manipulacin de la lombriz de tierra. Aprendizaje en la ejecucin del ensayo de toxicidad aguda, contempla la utilizacin del ensayo de toxicidad aguda con la lombriz de tierra como criterio determinante para definir un suelo contaminado. . 3.- MARCO TERICO. En trminos generales, los ensayos de toxicidad constituyen el principal instrumento en la toma de decisiones acerca de la gestin ambiental de una matriz ambiental contaminada (agua, suelo, sedimento, etc.). Esto ha llevado al desarrollo de mltiples protocolos estandarizados dependiendo de la matriz
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ambiental considerada, la especie a utilizar en el ensayo o el tiempo de ejecucin del mismo, entre otros factores. En la relacin de la toxicidad de un suelo contaminado o de una sustancia que puede contaminar el suelo (ej.: plaguicidas), el ensayo de toxicidad emplea la lombriz de tierra como un organismo modelo. Estos organismos presentan cualidades ecolgicas y biolgicas que justifican su uso como bioindicadores de contaminacin del suelo. En trminos generales las lombrices de tierra representan el 80% de la biomasa del suelo; sus hbitos alimenticios y escavadores contribuyen a la aireacin del suelo, a una mayor filtracin del agua y estructuracin del suelo y favorecen la generacin de una importante capa de humus en la superficie del suelo, entre otras caractersticas. Desde el punto de vista ecotoxicolgico, Lanno et al. Destacan una serie de propiedades en relacin con la exposicin de las lombrices a contaminantes presentes en el suelo. Algunas de ellas son: presentan un tegumento muy vazcularizado y desprovisto de cutcula lo que le permite la entrada directa de contaminantes; son capaces de ingerir grandes cantidades de suelo o fracciones especficas del mismo (materia orgnica) lo que se traduce en una va importante de entrada de contaminantes; muchas especies tienen el tamao considerable lo que facilita no solo analizar residuos de contaminantes en diversos tejidos, sino determinar la respuesta de biomarcadores bioqumicos y moleculares; existe un amplio conocimiento de la fisiologa de estos organismos en la relacin a otros invertebrados. El porcentaje de supervivencia, la tasa de reproduccin o de crecimiento de la lombriz son los parmetros que comnmente de utilizan para estimar la potencia txica de un suelo contaminado y/o riesgo de efectos adversos en el ambiente edfico. Tales pruebas toxicolgicas tienen repercusiones importantes a la hora de realizar o establecer decisiones acerca de la peligrosidad de un contaminante en el suelo y en la puesta en marcha de medidas correctoras, de recuperacin (ej.: fitorremediacin), o incluso sancionadoras. Fundamentos de la Operacin Se desarrollara un protocolo de experimentacin empleando, un insecticida (dimetoato, organofosforado) a determinada concentracin, el compuesto organofosforado es ampliamente utilizado en agricultura y se determinar sus efectos al medio ambiente, especficamente a la fauna, mediante el empleo de la lombrices de tierra y determinando la dosis letal media.

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4.- MATERIALES Y MTODOS 4.1.- Materiales y Equipos El material necesario para el correcto desarrollo de la prctica es el siguiente: Lombriz de tierra (Eisenia fetida). Placas de petri. Inseticida dimetoato. Pipetas automticas y de vidrio. Papel de filtro. Matraz aforado. Tubo de vidrio (o plstico) de 10ml. Pinzas. 4.2.- Procedimiento 4.1.- Preparacin de las placas para el ensayo de toxicidad. Cortar un trozo de papel de filtro utilizando como molde la parte inferior (menor dimetro) de la placa de petri. Cada grupo deber identificar sus placas (marcador indeleble) con las concentraciones de dimetoato a ensayar. La placa estar lista para ser contaminada con el insecticida y liberar las lombrices. 4.2.- Preparacin del insecticida. El insecticida utilizado en la prctica es el dimetoato (organofosforado), un fitosanitario ampliamente utilizado en la agricultura. Las concentraciones que se emplearan en el ensayo de toxicidad se obtendrn a partir de un producto comercial. Las concentraciones a aadir en las pacas sern las siguientes: 0.1, 0.25, 0.5, 1 y 2 g i.a./ml. El insecticida ser disuelto en acetona.
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A cada placa de petri se aadir 1 ml de cada concentracin de dimetoato y se dejara bajo la campaa de gases hasta evaporar la acetona. A las placas control se aadir solamente 1 ml. de acetona. Evaporada la acetona, se aadir 1 ml de agua destilada al papel de filtro contaminado con el dimetoato. Las placas estn listas para alojar a las lombrices y dar comienzo el ensayo. 4.3.- Liberacin de las lombrices en las placas. Se liberan 2 lombrices, tomadas aleatoriamente del grupo, en cada placa petri. Las placas se colocarn en oscuridad a la temperatura del laboratorio. En este punto se dar por iniciado el ensayo de toxicidad aguda (24h).

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5.- INDICACIONES Tiempo estimado - 2 das Relacin con el programa terico - ensayos de toxicidad bioindicadores, principales contaminantes, evaluacin del riesgo ecolgico.

CLCULOS Para calcular el valor de la LC50 debemos proceder como sigue: Contar con el numero de lombrices muertas en cada placa (o concentracin) Calcular el porcentaje de mortalidad. Comprobar si existen individuos muertos en el grupo de control. Si fuese as debemos entonces corregir los valores de mortalidad haciendo uso de la frmula de Abbott: % M corr = (Mobs M control) x 10 c (100 - M control) Comprobar que el porcentaje de mortalidad es creciente en relacin a la concentracin de dimetoato, de no ser as debemos suavizar los datos, segn la frmula: Cuando Mt es menor que Mt-1, entonces: Mt 1 = (Mt + Mt- 1) 2 Realizar un grfico (papel milimetrado) representando la concentracin de dimetoato en el eje X, y el porcentaje de mortalidad o valor probit en el eje Y.

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6. REPORTAR *Cuestionario Transformar la concentracin de dimetoato en mg/ml ( ppm) a ug/cm. Calcular el LC50, si los resultados lo permiten. Cules son las limitaciones de este ensayo? Cules son las ventajas del ensayo? Cul ha sido la principal va de entrada del insecticida a la lombriz? Cul crees que ha sido el mecanismo de toxicidad del dimetoato en la lombriz? 7. - BIBLIOGRAFA 1. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). 1984. Earthworm, acute toxcity tests. Guideline for testing Chemicals. No. 207. Paris. France.

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2. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). 1984. Earthworm, reproduction tests. Guideline for testing Chemicals. No. 222. Paris. France. 3. International Standar Organization (ISO). 1993. Soil Quality effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxiciti using artificial soil substrate. ISO, Geneve, Switzerland. No. 11268-1. 4. International Standar Organization (ISO). 1998. Soil Quality effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction. ISO, Geneve, Switzerland. No. 11268-2. 5. International Standar Organization (ISO). 2004 Draft: Soil Quality avoidance tests for evaluating the quality of soils and the toxicity of chemicals. Tests winth earthworms (eisena fetida/andrei). Geneve, Switzerland. 6. Jongmans AG Pulleman MM, Balabame M. Van Oort F, Marinissen JCY. 2003. Soil structure and characteristics of organic matter in two orchards differing in earthworm activity. Appl Soil Ecol 24:219-232 7. Paoletti MG. 1999. The role of earthworms for assessment of sustainability and as bioindicators. Agric Ecosyst Environ 74:137- 155. 8. Lanno R. Wells J, Conder J, Bradham K, Basta N. 2004. The bioavailability of chemicals in soil for earthworms. Ecotoxicol Environ Saf 57:39-47

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PRCTICA No 2 Nombre de la prctica: BIOMARCADORES DE EXPOSICIN A ORGANOFOSFORADOS: ACTIVIDAD CARBOXILESTERASA. 1.- INTRODUCCIN Las carboxilesterasas (CbE) pertenecen a un grupo de enzimas esterasas que hidrolizan un amplio rango de steres de cidos carboxlicos. Las CbEs han sido detectadas en el hgado y muchas especies de vertebrados. Las CbEs participan en la detoxificacin de insecticidas carbamatos y piretroides (figura 3), por tener una estructura qumica similar a los cidos carboxlicos. Por ejemplo, los productos de la hidrlisis de los carbamatos son un alcohol y el cido crbamico, el cual se descompone rpido en CO2 y metilamina (fig. 3 A). Tales productos son fcilmente excretados por tener una solucin en agua mayor que el compuesto parental. PLAGUICIDAS

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2.- OBJETIVO. Los objetivos de la prctica son los siguientes: Aprendizaje en le ensayo de actividad CbE en plasma. Aprendizaje en el ensayo enzimtico discontinuo. Corroborar si existen diferencias en la actividad CbE entre las distintas especies que se utilizan en la prctica. Conocimiento de la funcin fisiolgica de las CbEs y su papel en el mecanismo de resistencia de las plagas a ciertos plaguicidas.

3.- MARCO TERICO En mamferos, existe un grupo de CbEs que son inhibidas por insecticidas organofosforados, carbamatos (Fig. 6) a este grupo de CbEs se les ha dado un papel de detoxificacin de estos plaguicidas tal y como ocurre con las colinesterasas plasmticas, es decir, actuando como sustrato suicidas puesto que la inhibicin es el caso de los insecticidas organofosforados es irreversible (Fig. 6B).

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Fundamento de la Operacin Se evaluar la actividad de las carboxiesterasas (CbE) en diversas especies, obtenidas a travs del plasma y se observar cul de ellas presenta una mejor actividad enzimtica.

4.- MATERIALES Y MTODOS 4.1.- Materiales y Equipos El material necesario para el correcto desarrollo de la prctica es el siguiente: Muestra de plasma de diferentes especies (aves, reptiles, peces). Tubo de vidrio (o plastico) de 10ml. Espectofotmetro UV-Vis. Cubeta de plstico. Micropipetas automticas. Vasos de precipitados de 100-250 ml. Reactivos: Tris. 1-nafil acetato. cido clorhdrico. Cloruro de calcio. Acetona. SDS. Tritn X-100. Fast Red ITR. 4.2.- Procedimiento

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4.2.1.- Preparacin de las muestras de plasma. Las muestras de plasma se toman de diferentes organismos y se centrifugan a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 C. Se prepara el Sobrenadante (plasma) y se deshecha el pellet o precipitado. Las muestras de plasma son diluidas en H2O destilada a una reaccin de 1/20. 4.2.2.- Preparacin de las soluciones o reactivos. Tampn Tris/HCI 25 mM/1 mM CaCl2, pH=7.6 Disolver 1.50 g de tris y 0.054 g de CaCl2 en 500 ml de agua destilada. Ajustar a pH=7.6 con HCl. Tener cuidado con el pH porque la actividad CbE es pH dependiente. SDS 2.5% (w/v). Disolver 2.5g de SDS en 100 ml de agua destilada Tritn al 2.5% (w/v). Disolver 2.5g de Tritn X-100 en 100 ml de agua destilada. Fast red ITR al 0.1% en Tritn 2.5% (w/v). Disolver, en el momento de su uso 0.01 g de Fast red ITR en 10 ml de Tritn X al 2.5% en agua. Proteger de la luz. 1-naftil acetato 3.46 mg /10 ml de acetona. Disolver 3.46 mg de 1 naftil acetato en 10 ml de acetona y conservar el tuvo de vidrio en hielo (se evita que se concentre el 1 naftil acetato por evaporacin de la acetona). 4.2.3.- Ensayo enzimtico. Aadir 1 L de suero diluido (agitar los eppendorf antes de tomarlos) en 1940 L de tampn Tris/HCI y agitar. Usar tubos de vidrio o plstico de 10 ml. Incubar la muestra durante 5 min a 25C (en bao de agitacin). Recordar hacer 2 blancos para tarar el espectrofotmetro.

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Aadir 50 L de 1-naftin acetato y agitar los tubos. Dejar transcurrir la reaccin enzimtica durante 10 min a 25C. Retirar los tubos del bao de agitacin y bloquear la reaccin con la adicin a cada tubo de 0.5 ml de SDS 2.5%.Agitar. Aadir 0.5 ml de Fast Red ITR en tritn 2.5% y agitar los tubos. Dejar reposar durante 30 minutos en absoluta oscuridad. Leer Absorbancia total a una longitud de onda de 530 nm

5.- INDICACIONES Tiempo estimado-- 4 horas

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Relacin con el programa terico--Biomarcadores, resistencia a los plaguicidas, evaluacin del riego ecolgico. 5.1.- Clculo de la actividad CbE La actividad CbE se calcula de la siguiente forma: Paso 1. Transformacin de la variacin de Abs/min a variacin de concentracin milimolar por minuto por ello, se divide el valor de Abs /min por el coeficiente de extincin molar del complejo que se forma entre el naftol y el Fast Red ITR, cuyo valor es de 33,22 mM -1cm-1

Paso 2. Considerar si la muestra diluida, es decir, el volumen final de la reaccin y el volumen de la muestra aadido a la cubeta , y si ste fue o no previamente diluido. Paso 3. Convertir la actividad desde mM a mol/ml. Teniendo en cuenta que 1mM = 1 mmol/L= 1mol/ml, entonces el resultado es el siguiente

6.- REPORTAR La actividad CbE *Cuestionario Qu animal tolerara mejor los insecticidas piretroides, carbamatos y organofosforados? Qu diferencia hay entre un ensayo enzimtico continuo y otro discontinuo?

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7. - BIBLIOGRAFA 1. Walter CH. 1998. In: Calow P. (ed), Handbook of Ecotoxicology, Blackwell Science Ltd, Oxford, United Kingdom. 2. Sogorb M.A., Vilanova E. (2002). Enzymes ionvolved in the detoxification of organophosphorus, carbamatos and pyrethroid insecticides through hydrylysis,, Toxicol, Lett., 128:215-228. 3. Jokanovic M. (2001). Biotransformation of organophosphorus Compounds. Toxicology, 166:139-160. 4. Satoh T., Hosokawa M. (1998). The mammalian carboxylesterases: from molecules to functions, Annu, Rev Pharmacol. Toxicol., 38: 257-288 5. Sanchez-Hernndez J.C. (2001). Wildlife exposure to organophosphorus insectidcides. 6. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 172:21-63.

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PRCTICA No. 3 UTILIZACIN DEL ENSAYO DE REPULSIN A UN SUELO CONTAMINADO CON LA LOMBRIZ DE TIERRA Eisenia fetida. 1.- INTRODUCCIN. Las lombrices de tierra evitan el suelo contaminado gracias a la existencia de quimiorreceptores en el prostomio (fig. 1). Algunos estudios experimentales han puesto de manifiesto que esta capacidad de repulsin de las lombrices pueden utilizarse como un ndice de contaminacin del suelo. De hecho, el protocolo de ejecucin de tal ensayo toxicolgico esta en el proceso de estandarizacin.

2.- OBJETIVO. Aprendizaje de la ejecucin del ensayo de repulsin con la lombriz de tierra. Comparar si existen diferencias entre la respuesta de repulsin de la lombriz al Cu y al Hg. Significado eco toxicolgico del ensayo de toxicidad.

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3.- MARCO TERICO. El ensayo de toxicidad consiste en colocar la lombriz entre dos suelos (uno de referencia y el otro contaminado) y permitir, durante 48 horas, que la lombriz elija el suelo. A la hora de llevar a cabo este sencillo ensayo, se han utilizado diversos diseos experimentales, desde dispositivos de 6 cmaras interconectadas y albergando 6 tipos de suelos hasta un diseo ms sencillo que emplea dos cmaras con dos suelos conectados entre si. Este ultimo diseo se empleara en la practica (fig. 2).

Fundamentos de la Operacin La comprobacin de la existencia de quimiorreceptores que presenta la lombriz de tierra, para evitar reas contaminadas por un metal pesado. 4.- MATERIALES Y MTODOS 4.1.- Materiales y Equipos Muestras de suelo no contaminado Placas de petri de 20cm de dimetro Esptulas de plstico desechables Balanza Papel de aluminio Estndares de Hg. (HgCl2) y Cu (cUSO4) Vasos de precipitado

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Pipetas de plstico o vidrio Un trozo de radiografa (separador) 4.2.- Procedimiento 4.2.1 Preparacin del suelo El suelo ser tamizado a un tamao de partcula < 5 Mm. para evitar particular gruesas que puedan daar el tegumento de la lombriz. El suelo se dividir en tantas fracciones como concentraciones de Hg y Cu se quiera ensayar. As, para realizar el ensayo de repulsin utilizando 5 concentraciones de Cu y 5 concentraciones de Hg, necesitaremos dividir la muestra desuelo en 12 fracciones considerando 2 submuestras para los controles de cada metal pesado. Las concentraciones de Cu y Hg a ensayar sern las siguientes: 5, 50, 100, 150, 200 ug/g peso seco. Una vez calculada las diluciones y preparados las soluciones de cada metal se proceder a contaminar los suelos segn el peso del suelo y la concentracin deseada. Los suelos contaminados se colocaran en bolsas de plstico hermticamente cerradas y se proceder a su homogenizado. Se aadir un volumen de agua tal que la humedad del mismo este entre el 30-40% en relacin a su peso (considerar el volumen de solucin acuosa conteniendo el metal pesado). Las submuestras de suelos tendrn un peso hmedo de 200 g y ocuparan la mitad de la placa de petri y tal como se muestra en la foto 1 4.2.2 Liberacin de las lombrices en las placas. Se liberaran 6 lombrices por placa. Colocndolas en la mitad de la mitad de la placa donde los suelos toman contacto entre ellos.

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Las placas se colocaran en oscuridad y a la temperatura del laboratorio. Colocando un ligero peso sobre las tapas de las placas para evitar que las lombrices se escapen. En este punto se dar por iniciado en ensayo de toxicidad aguda (24 h)

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5. INDICACIONES. Para estimar la toxicidad del Cu o Hg en los suelos, debemos proceder como sigue: Finalizado el ensayo (24 h despus), se coloca el separador en la placa permitiendo nuevamente separar los dos tipos de suelos (el contaminado y el control) Se cuentan las lombrices en cada suelo, en el caso de cortar una lombriz cuando se coloca el separador, este contabilizara como 0.5 para cada suelo. Calcular el porcentaje de lombrices en cada tipo de suelo y placa. Realizar un grafico tal y como se muestra en la fig. 3 El suelo se considera toxico cuando el porcentaje de lombrices en el suelo contaminado sea inferior o igual al 20%. En la fig. 3 se muestra este umbral con la lnea horizontal en el 80%

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6.- REPORTAR. *Cuestionario: Qu metal resulta ms txico a la lombriz? Cul, o cuales, seria la va de entrada del metal a la lombriz de tierra? Qu parmetros fisicoqumicos del suelo afectaran la biodisponibilidad y toxicidad de los metales a la lombriz? Qu significado ecotoxicolgico y ecolgico tendra la conducta de repulsin de la lombriz en el suelo?

7.- BIBLIOGRAFA 1 Lourerio S, Soares AMVM, Noriega AJA (2005). Terrestrial avoidance behaviour tests as escreening tool to assess soil contamination. Environ Pollut 138:121-131. 2 Lukkari T, Haimi J (2005). Avoidance of Cu-and Zn- contaminated soil by ecologically different earthworm species. Ecotoxicol envirom saf 62:35-41 3 ISO (2004). Draft:soil Quality- avoidance test for evaluating the quality of soils and the toxicity of chemicals. Test wih earthworms biomarkers riks assessment: current status and perspective. Reviews of environmental contamination and toxicology (en prensa).

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PRCTICA No. 4 BIOMARCADORES DE EXPOSICIN A METALES PESADOS: ACTIVIDAD GLUTATIN-S-TRANSFERASA. 1.- INTRODUCCIN. Las glutatin-S-transferasas (GST, EC 2.5.1.18) son una superfamilia polimorfita de enzimas multifuncionales. Estas enzimas son cruciales en la regulacin de la susceptibilidad a enfermedades como el cncer, gracias a su habilidad para inmovilizar metabolitos con capacidad cancergena. 2.- OBJETIVO. Los objetivos de la prctica son los siguientes: Aprendizaje del ensayo enzimtico de la GST segn el mtodo de Habig et al. (1974) Estudiar el efecto de la exposicin a Hg (HgCl2) sobre la actividad GST de la lombriz de tierra Eisenia ftida. Comparar los niveles de GST en las porciones anterior, media y posterior de la lombriz E. ftida.

3.- MARCO TERICO Desde el punto de vista de la ecotoxicologa las GST participan en el proceso de biotransformacin conjugando metabolitos electroflicos con el glutatin (tripptido), o en la inmovilizacin de los metales pesados (Fig. 3).

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Como biomarcador, su respuesta es variable dependiendo de la especie, del contaminante y de las condiciones ambientales de la exposicin a la sustancia contaminante, entre otros factores generalmente, la induccin de este enzima es la repuesta biolgica considerada biomarcador de exposicin a contaminantes. Las GST son particularmente abundantes en el hgado y otros tejidos con un elevado metabolismo, aunque tambin se detectan en la sangre. Adems de este papel en los procesos de destoxificacin de sustancias contaminantes. Las GST juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis oxidativa, funcionando como un mecanismo de defensa antioxidante (fig. 1)

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Fundamentos de la Operacin Observar el efecto a la exposicin al mercurio a diferentes concentraciones sobre la actividad de la Glutatin-S-transferasa de la lombriz de tierra, para lo cual, se extraer de tres secciones de su organismo (anterior, media y posterior) y comparar su nivel de Glutatin.S-transferasa en cada uno.

4.- MATERIALES Y MTODOS 4.1.- Materiales y Equipos El material necesario para el correcto desarrollo de la prctica es el siguiente: Muestras de suelo no contaminado Vasos de precipitado de 1L de capacidad Esptulas de plstico desechables

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Balanza Papel de aluminio Parafilm Estndares de Hg (HgCl2). Pipetas automticas y de vidrio Tubos de plstico o vidrio Reactivos para la relacin del ensayo enzimtico Nitrgeno liquido Material de diseccin Espectrofotmetro UV-Vis Cubetas de plstico 4.2.- Procedimiento Protocolo de exposicin al Hg Contaminar 5 muestras de suelo con 5 concentraciones de Hg. Las concentraciones de Hg sern las siguientes 50, 100, 200, 400, 1600 g/g peso seco. Considerar un suelo control no contaminado. Homogeneizar los suelos contaminados con la ayuda de una bolsa de plstico cerrada hermticamente. Colocar cada muestra de suelo contaminado en un vaso de precipitado de 1L de capacidad. Liberar 6 lombrices de tierra en cada vaso de precipitado. Tapar los vasos con parafilm permitiendo el intercambio de aire con perforaciones del papel. Colocar los vasos en oscuridad y a la temperatura del laboratorio.

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Preparacin de las muestras. Una vez finalizado de la fase de exposicin de las lombrices al Hg (2-3 das), se proceder al aislamiento de las GST y su medida. Las lombrices se extraern de cada suelo y se colocaran en placas de petri conteniendo un trozo de papel humedecido con agua destilada (Foto 2).

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Permanecern 24 h en oscuridad para su depuracin. Finalizada la fase de depuracin. Las lombrices sern cortadas en 3 porciones (anterior, media y posterior) rpidamente congeladas en nitrgeno liquido. Cada submuestra de lombriz ser pesada y homogeneizada en un volumen de tampn (1:4 p/v) con la ayuda de un homogeneizador Ultra- Turrax. El homogenado ser centrifugado a la 18.000 X g durante 20 minutos y a 4C. La GST se medir en el sobrenadante. 4.3 Preparacin de las soluciones para el ensayo enzimtico. 1. Tampn de homogenizacin: Tris/HCl 100 mM / 0.1 mM PMSF, pH= 7.6. Disolver 3.028 g de Tri, 0,093 g de EDTA-K2 y 21.39 g de sacarosa en 250 ml de agua destilada. Ajustar a pH = 7.6 con HCl. 2. Tampn de reaccin fosfato potsico 100 mM, pH = 6.5 Disolver 3.97 g de KH2PO4 en 250 ml de agua destilada y llevar a pH = 6.5. 3. PMSF 0.5 M en dimetilsufoxido (DMSO): Disolver 0.087 g de PMSF en 1 ml de DMSO. Aadir 50 L de la solucin en 250 ml de tampn (factor de dilucin 1/5000). 4. Glutatin reducido (GSH) 100 mM. Disolver 0.061 g de GSH en 2 ml de tampn fosfato pH = 6.5 5. 1-cloro, 3,4-dinitrobenceno (CDNB) 50 mM. Disolver 0.02 g de CDNB en 2 ml de etanol absoluto 4.4 Ensayo enzimtico. Las reacciones que tienen lugar en la cubeta se muestran en la figura 1, las concentraciones de GSH y CDNB en el medio de incubacin han de ser 5 mM y 1 mM, respectivamente. Al aadir 50 l GSH (50mM) y 20 l de CDNB (50 mM) a
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un volumen final de 1 ml (medio de reaccin), se consiguen esas concentraciones finales.

Agitar los reactivos con la ayuda de un trozo de parafilm (el volumen final en la cubeta es de 1 ml) Aadir 50 l del homogenado de lombriz y agitar nuevamente. Leer cintica a una longitud de onda de 340 nm.

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5. INDICACIONES 4.5 Calculo de la actividad GST. 1. transformacin de la variacin de Abs/min. A variacin de concentracin milimolar por minuto. Para ello, se divide el valor de Abs/min. Cuyo valor es de 9,6 mM-1 cm-1.

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A (min. X cm) (mM-1 x cm-1) = mM/min.

2. considerar si la muestra fue diluida, es decir, volumen final de la reaccin (1 ml) y el volumen de la muestra aadido a la cubeta (0.05), y si este fue o no previamente diluido. 3. convertir la actividad desde mM a mo1/ml. Teniendo en cuenta que 1mM = mmo1/L = 1mo1/ml, entonces el resultado es el siguiente:

mM/min. = mol/ml/min

4. Normalizar la actividad de la GST a peso de tejido utilizado. Para ello se divide entre el peso de lombriz por cada ml de homogenado (relacin 1:4 en el proceso de homogeneizacin).

mol/ml/min g/ml = mol/min/g de tejido

6.- REPORTAR. *Cuestionario: Qu efecto produjo el Hg en la actividad GST de la lombriz? Cul sera la funcin de la actividad GST en relacin al Hg? Qu significa para lombriz tener una actividad GST elevada?

7.- BIBLIOGRAFA 1 Wang W., Ballatori N (1998). Endogenus glutathione conjugates: ocurrente and bilogical funtions. Pharmacological reviews. 50:335-353.

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