Effet des bactries sur les sols riches en uranium Bioremdiation

Diversit des bactries et des mtabolismes

Solubilisation : biolixiviation

Fixation : rduction sous forme insoluble biominralisation chlation

Projet du LIPM

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Diversit bactrienne Bactries ubiquistes majorit de la biodiversit

109 bactries par g de sol. 10 000 espces <3 % sont cultivables Adaptation des environnements extrmes Naturels (fumeurs noirs, ) Pollus activit anthropique Diversit de mtabolismes

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Diversit bactrienne

LES CONDITIONS EXTREMES DE VIE Catgorie Chaud Froid Radiation Gravit Profondeur Acide Basique Espace Pression Salinit Record 121 C -15C 1500 fois la tolrance humaine 1 million de g 3,2 km sous terre 11000 m sous la mer pH=0,0 pH=12,8 6 ans 1090 fois la pression atmosphrique 300 g/l (10 fois la salinit de l'ocan) Haloarcula Organisme Strain 121 Cryptoendoliths Deinococcus radiodurans E. Coli Bacillus infernus Thiobacillus Bacillus subtilis Satellite de la Nasa Fosse des Mariannes Mer morte Lieu Fumeurs du Pacifique Antarctique Site de stockage nuclaire, Washington Centrifugeuse (laboratoire) Mines d'or, Afrique du Sud Fosse des Mariannes Glaces du Groenland

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Techniques molculaires pour dcrire la biodiversit ADN ARN Protine Transcription Traduction

Ribosome : machinerie universelle de synthse des protines

ADNr16s : lADN qui code pour une sous unit ADNr16s

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Techniques molculaires pour dcrire la biodiversit

Extraction directe de lADN du sol Amplification de lADNr16s Rgions trs conserves et rgions variables Squenage direct de lADNr16s (ht dbit) + analyse phylogntique Squenage aprs sparation (DGGE)

Bactries prsentes dans lenvironnement tudi : Hybridation avec des sondes fluorescentes Analyse de lARN : indique les populations actives dans le milieu

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volution des donnes de diversit bactrienne en 10 ans

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Diversit des microorganismes = diversit des mtabolismes

Diversit de mtabolismes nergtiques

Diversit de synthse de mtabolites secondaires

Synthse dATP directe (fermentation) indirecte: oxydation dun substrat et rduction dun accepteur transfert de- travers la membrane et gradient de proton source dnergie pour lATP synthase

Respiration arobie anarobie

accepteur final dlectron : oxygne sulfate, nitrate, CO2, Fe3+

nergie lumineuse : Photosynthse bactrienne anoxygnique, Photohtrotrophie nergie par oxydation de substrats inorganiques : lithotrophie
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Bactries chimiolithotrophes

Bactries chimiolithotrophes Bactries nitrifiantes Bactries oxydant Thiobacillus denitrificans le Soufre Thiobacillus ferrooxidans Bactries oxydant le Fe+

Subtrat(s) Oxyd(s) inorganique NH3 NO2H2S, S, S2O3Fe+ H2

Produit d'oxydation NO3NO3SO4Fe3+ H2O

Accepteur terminal dlectron O2 O2 O2 / NO3-/Fe3+ O2 O2 / NO3Fe3+/MnIV

Shewanella Bactries oxydant H2

Ractions doxydorduction qui impliquent directement ou indirectement les mtaux, les sulfures ou le soufre inorganique, les nitrates Croissance dans des milieux pauvres en matire organique
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Diffrents types dinteractions bactries - mtal

Biotransformation: catalyse de la reduction/oxydation de radionucldes Bio-sorption : sorption de radionucldes en formant des complexes avec des ligands
cellulaires la surface des cellules

Chimie-sorption: inclusion de cations mtalliques dans des prcipits inorganiques catalys par bactries. Bio-accumulation: accumulation des mtaux dans la cellule. Biominralisation: formation de prcipits insolubles (phosphates)
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Oxydation : biolixiviation
Extraction par lessivage chimique ou biologique pour supprimer les contaminants

Processus indirect bactries 14 Fe2+ + 3,5 O2 + 14 H+ 14 Fe3+ + 7 H2O MeS2 + 8H2O + 14 Fe3+ Me2+ + 14 Fe2+ + 2 SO42- + 16 H+
(Zn, Cd, Ni, Pb, Cu, Au, Mn, U)

ou processus direct bactries MeS2 + H2O + 3.5 O2 Me2+ + 2 SO42- + 2 H+ Acidothiophilus ferrooxidans est une des bactries les plus utilises pour la biosolubilisation dcouverte en 1947 des coulements acides de mines de houille grasse
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Acidithiobacillus ferrooxidans : le Fe2+ ou le S comme source dnergie

Parois externe

priplasme

Membrane interne

cytoplasme

Sources dlectrons pour la rduction de loxygne T. ferrooxidans peut aussi rduire le Fer3+ en prsence de sulfure en anarobie
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Microorganismes impliqus dans la biolixiviation de minerais duranium.

Substrat oxyd Thiobacillus ferrooxidans Thiobacillus thiooxidans Thiobacillus caldus Thiobacillus acidophilus Leptospirillum ferrooxidans Fe2+, S0, U4+, Cu+, Se2+, thiosulphate, tetrathionate, SS0,thiosulphate,tetrathionate idem So, composs organiques Fe2+, Pyrite fonctionne haut potentiel (forte [Fe3+])

pH 1.8-2 0.5-5.5

temp. < 40C 45-50C

1.5-1.8 45-55C 70-80C 1.5-2 70-90C

Sulfolobus thermosulfiooxidans Fe2+, So, SSulfolobus metallicus Fe2+, So, S inorganique Acidianus brierleyi So, carbone organique

Chemolithotrophes obligatoires ou facultatifs, arobie

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Biolixiviation : bactries des environnements acides

Rio Tinto
pH <3 analyse de la diversit :

30taine despces domin par

Acidithiobacillus ferrooxidans Leptospirillum ferrooxidans Acidiphillum spp. + Desulfosporinosus et Clostridium qui rduisent le fer et les sulfates + bactries htrotrophes

Rouge : forte [ Fe3+ ] due la biolixiviation des minraux par les microorganismes. pH 2.3, cette eau permet dextraire le Cu2+ de minerais Cu.
A. Garcia-Moyano, et al., (2007) Syst. Appl. Microbiol. Sous presse

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Stratgies dattaque de la pyrite

Thiobacillus ferrooxidans:
oxydation du Fe2+ et des sulfures

Biolixiviation sans contact oxydation Fe, S2Attaque par contact :

Microenvironnement rsultant de loxydation du Fe et pH trs acide de loxydation des sulfures (thiols organiques cys)

Cooprativit :
utilisation des drivs des sulfures production de Fe3+

Leptospirillum ferrooxidans :
accumulation de Fe3+ dans les EPS attaque lectrochimique. C. Berthomieu LIPM

H. Tributsch (2001) Hydrometallurgy 59, 177185.

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Biolixiviation de dpots

Arrosage par la liqueur recycle aprs rcupration du Cu2+ (+ phase dlectrochimie)

Film thermo et irrigation, Cerro Colorado, Chili

pH acide, chemilitotrophes : At thiooxidans et L. ferrooxidans + At. ferrooxidans en prsence de Fe2+

Revues : Rawlings D.E. (2002) Annu. Rev. Microbiol. 56, 65-91. Rawlings D.E. et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 38-44.

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Procd par agitation continue dans des tanks

Bio-oxydation flux continu : Au (arseno)pyrite. Minerais finement broy - concentr aurifre Ajout deau et de substrats inorganiques, forte aration Refroidissement Tank de dposition et rcupration de lor avec du cyanure. (4-5 j)

L. ferrooxidans, At. Caldus, At. ferrooxidans

Oprations commerciales de biolixiviation Au Brsil, en Chine, au Prou , au Ghana C. Berthomieu LIPM

Tanks en cramique composite pour bactries thermophiles 300 m3 Perring, Afrique du Sud.

Au, Co, Ni, Al, Cu, Zn

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Biolixiviation de minerais duranium

UO2 + 3Fe3+ UO23+ + 3Fe2+ UO22+ +3SO42- [UO2(SO4)3]4Importance des sulfates pour viter la prcipitation sous forme dhydroxydes. Utilisation de sulfate ferrique produit par biolixiviation de la pyrite par T. ferrooxidans et L. ferrooxidans. pH 1-2, fortes teneur en U, Th.

Ajout de 5kg/t de pyrite

Rentable conomiquement pour des minerais contenant 0.05% 0.15% U3O8

J.A. Munioz et al. (1995) Hydrometallurgy 38, 39-57

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Remdiation par immobilisation de luranium : rduction

Rduction dissimilatrice: UIV comme source dnergie

Geobacter metallireducens Shewanella oneidensis Desulfotomaculum reducens Thermoterrabacterium ferrireducens

Rduction sans apport dnergie

D. Desulfuricans Desulfovibrio vulgaris
Geobacter sulfurreducens U(IV) par bioreduction, Lloyd et al., 2002.

Anarobiose
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Rduction intracellulaire arobie et anarobie

Pseudomonad CRB5 : rduction anarobie et arobie Prsence dU dans le cytoplasme associ des granules de polyphosphate

McLean & Beveridge (2001) AEM 67, 1076-1084. C. Berthomieu LIPM SFRP Paris 18-19 fev. 2008 20

Rduction intracellulaire arobie et anarobie

Activit enzymatique : Chromate rductase capable de rduire luranyle Optimisation de cette activit par mutagnse R26

R26

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Rduction dautres mtaux lourds ou radionuclides

Accumulation de Pd bact. sulfato-rductrice

Rduction et accumulation de technetium la priphrie de Shewanella

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Biominralisation

Bioprcipitation de luranium Catalyse par une phosphatase Initiation implique les monophosphates des lipopolysaccharides de la paroi Forme des complexes UO2PO4 Acclration de la bioprcipitation en prsence de NH4+ Formation de NH4UO2PO4,

Citrobacter
L. E. Macaskie, et al. 2000 Microbiology 146, 18551867.

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Bio-sorption au niveau de protines de surface

Bacillus sphaericus

K. Pollman et al. (2006) Biotechnology Advances 24, 58 68

J. Raff S. Selenska-Pobell, Institute of Radiochemistry, Forschungszentrum Rossendorf

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Bio-sorption au niveau de protines de surface Rcupration dlments Dpollution des eaux / sols

Vanadium

Uranium

Inclusion de bactries dans un polymre

J. Raff S. Selenska-Pobell, Institute of Radiochemistry, Forschungszentrum Rossendorf

Amidoxime sur un substrat

T. Sugo, Radiation Processing Development Lab., Takasaki Radiation Chemistry Research Establishment, Japan

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Projet au Laboratoire des Interactions Protine Mtal

Natural exposure

1-Etude des interactions bactries uranium Sols uranifres et sols tmoins

Uc = 40 ppm Ur = 2500 ppm

Concentrations et compositions de sols contrasts

0 [UO2]

- 25 cm

Ur = 440 ppm

Uc = 30 ppm Ur = 37000 ppm

Limousin
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Effet de luranium sur la biodiversit ?

DGGE ADNrs16s isol-amplifi partir des sols

Gradient en dnaturant

Comparaison des profils : Spcificit des profils sols Ve U Squenage ADNr 16s Arbre phylogntique

Ve2 Ve1 Ve0

GC %

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Slection de bactries rsistantes luranium

7 espces identifies phylogntiquement Analyse gnomique Facteurs gntiques de la rsistance TSB 1/10 0 mM UO2 2 mM UO2

Cribles pour la rduction et la chlation intracellulaire de luranium Modle pour lanalyse de cibles de luranium ltude du mcanisme de rduction Croiser les rsultats des diffrents cribles Chromate rductase : rduction intracellulaire / protection stress oxydant
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2- Interactions protines - uranium

Analyse des sites mtalliques
Fe 3+ -moins-rien UO 2 -m oins-rien
O N

Me

O N
O

N N

A=1.10 -4
1800 1600 1400 Nom bre donde (cm -1 ) 1200

Spectromtrie de masse
Suivi dinteractions protine-cofacteur par change H/D
D D D D1

H2

H H H
H1

D2

D20 H H H
D1

D2

Fragment peptidique (2869.8 Da)

Intens. x10 5 1436.30 1.5 1435.81 1.0 1436.79 MS, 15.7-16.2min (#305-#314)

Fixation du fer

Fixation de luranyle

1437.28 0.5 1437.78 1438.29

Proprits liaisons Me-L : IR lointain

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0.0 1436 1438 1440 1442 1444 m/z

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Ingnierie darchitectures chlatantes spcifiques / affines

Test de lapport de ligands tyrosine et phosphate

Plateforme protine slectionne par une approche prdictive : domaine extracellulaire serine/thronine kinase PknD

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