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INACTIVANTES Concepto: La inactivacion consiste en eliminar la capacidad reproductiva o txica de un inmungeno sin afectar, o hacindolo en el menor grado posible, su capacidad inmunognica y especificidad serolgica, Lo ideal es inhibir de forma irreversible las estructuras que determinan la capacidad de multiplicacin y/ o toxignica sin alterar la estructura y funcin de las protenas antignicas. Condiciones: Debe garantizar la eficacia Debe garantizar la inocuidad Debe determinar la total inexistencia de microorganismos viables o la detoxificacin de toxinas en forma irreversible. Modo de accin de los inactivantes A.-Dao al DNA: Cierto nmero de agentes antimicrobianos actan daando al DNA, entre stos se incluyen las radiaciones ionizantes, la luz ultravioleta y los compuestos qumicos que reaccionan con este cido. En la ltima categora estn los agentes alquilantes y otros compuestos que reaccionan en forma covalente con las bases pricas y pirimidnicas para formar secciones demasiado prximas de DNA o enlaces cruzados en la misma cadena. Las radiaciones daan al DNA de varias maneras: por ejemplo, la luz ultravioleta induce al

entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos cadenas de polinucletidos, formando dmeros de timina; las radiaciones ionizantes producen rupturas en las cadenas simples y en las dobles. Las lesiones al DNA inducidas por radiacin y compuestos qumicos , destruyen la clula, en particular por interferir en la replicacin del DNA. B.- Desnaturalizacin de la protena: Las protenas existen plegadas en un estado tridimensional, determinado por los enlaces disulfuro covalentes intramoleculares, y por los enlaces hidrfobos, inicos y de hidrgeno. Este estado se denomina estructura terciaria de la protena; sta es fcilmente fragmentada por diversos agentes fsicos o qumicos, que provocan que la protena deje de funcionar. La fragmentacin de la estructura terciaria de una protena se denomina desnaturalizacin de la protena. C.- Eliminacin de grupos sulfhidrilo libres: Las protenas enzimticas que contienen cistena (bMercapto-L-Cistena), tienen cadenas laterales que terminan en grupos sulfhidrilo (SH-). Adems, coenzimas como la coenzima A y el dihidrolipoato contienen grupos sulfhidrilo libres. Tales enzimas y coenzimas no pueden funcionar a menos que los grupos sulfhidrilo permanezcan libres y reducidos. Los agentes oxidantes, por lo tanto, interfieren en el metabolismo, ligando grupos sulfhidrilo vecinos para dar uniones disulfuro:-SS-.

Muchos metales, como el in mercrico, tambin interfieren por combinacin con los sulfhidrilos: Existen en la clula muchas enzimas que contienen grupos sulfhidrilo; por consiguiente, los agentes oxidantes y los metales pesados causan un dao considerable. Inactivacion bacteriana. Bsicamente, la clula bacteriana consiste en una pared celular que incluye al citoplasma envuelto en la membrana citoplasmtica. En condiciones favorables est sujeta a crecimiento y multiplicacin por simple fisin asexual y este ciclo es regulado y ordenado por virtud de la constitucin enzimtica. De acuerdo a Gale las enzimas de que esta equipada la clula tienen las siguientes funciones 1. liberar energa para su contnua existencia y divisin. 2. proveer nutrientes y metabolitos esenciales. 3. detoxificar productos metablicos txicos. 4. estabilizar el desarrollo interno en un medio externo variable. Por estas acciones el organismo es capaz de seleccionar nutrientes del medio que lo rodea y modificarlo, por ruptura y sntesis, en material para la estructura celular y su reproduccin. Regido por el cdigo gentico.

Estos procesos complejos comprenden el ciclo metablico de la clula. La funcin de las enzimas es actuar de catalizador para las reacciones especficas individuales y no es difcil de imaginar la multiplicidad de ellas que tienen que estar presentes en cada microorganismo. Las enzimas comparten la estructura y propiedades de las protenas. En general estn constitudas por dos fracciones: una de naturaleza proteica y un grupo prosttico ms pequeo que generalmente no es proteico, ligados por fuerzas que varan entre diversas enzimas. Porque las enzimas tienen composicin en la mayor parte proteica, es as que comparten sus propiedades y estn sujetas por lo tanto a inactivacin por coagulacin o desnaturalizacin por calor u otros medios fsicos y un grado amplio de agentes qumicos. Cualquier tratamiento que acte inactivando una o ms enzimas esenciales de la clula bacteriana o que afecte a un metabolito esencial hacindolo no disponible para la enzima produce una ruptura del ciclo de vida, de la cual resulta que sta no se reproduce y por definicin se presupone muerta. Pero este proceso no es de todo o nada y hay as varios grados de inactivacin y de ello puede resultar un efecto letal o solamente inhibitorio o bacteriosttico. Este postulado implica que el efecto letal o bacteriosttico es el resultado de diferentes procesos que envuelven reacciones diferentes y diferentes locus en la clula.

Cuando la accin es bacteriosttica el efecto es reversible y puede pasar que el organismo transferido a condiciones favorables pueda reiniciar su normal ciclo reproductivo. Cuando la accin es letal el dao del sistema enzimtico es ms extenso, o son afectadas enzimas esenciales, y la restauracin de la viabilidad no es posible lograrla bajo ninguna circunstancia. Hoy sabemos que el proceso de inactivacin no puede ser explicado en todos los casos en funcin de mecanismos de inactivacin enzimtica sino que tambin esta ligado a interferencias en el sistema reproductivo de la clula ,ligado a los cidos nucleicos.

Mtodos de inactivacin Fsicos * Calor: Raramente se utiliza como inactivamente. Antiguamente era utilizado como mtodo de inactivacin de autovacunas, generalmente somticas por ej Estafiloccicas. Tiene muchos inconvenientes debido a que las temperaturas de inactivacin( 60 a 65 C) permiten la aparicin de frecuentes controles positivos. Por otra parte la aplicacin de temperaturas ms altas o durante tiempo prolongado causan una gran destruccin de inmungenos con la correspondiente baja de inmunogenicidad. Es de aplicacin en algunas vacunas como la coqueluchosa donde el uso de inactivantes qumicos, si bien inactivan a los microorganismos, no le hacen perder totalmente la toxicidad debida a la toxina. El mtodo corriente de inactivacin es: 1) Colocar la suspensin en un frasco de paredes no muy gruesas, no sobrepasando la mitad del volumen. 2) Poner en bao de agua a 60-65 C totalmente sumergido ( los grmenes que quedan en el lquido de las paredes sin contacto con el calor ,escapan a la inactivacin), con agitacin contnua o bien cada 5 minutos en forma manual. 3) Aplicar el procedimiento durante 30 a 60 segn tcnica.

Qumicos

Condiciones. Para que el procedimiento sea efectivo se deben cumplir los siguientes pasos: 1. absorcin del compuesto 2. penetracin dentro del protoplasma. 3. reaccin del compuesto con uno o ms componentes celulares.

Fenol Penetra en la clula bacteriana. Desnaturaliza las protenas complejndose con ellas. Se deca que potenciaba la inmunogenicidad( no comprobado) Se utiliza al 5 %o. El cido Fnico es slido hay que licuarlo en bao mara hasta su estado lquido y luego medir con pipeta (5 ml / litro )( esto es aproximado, porque si se quiere hacer correctamente habra que pesarlo en estado lquido o hacer el clculo en base a su PE) Metales pesados Precipitan protenas. Actan en los grupos tiol -SH Los ms utilizados son los compuestos de mercurio y entre ellos el Metorgan,Tiomersal o timerosal ( etilmercurio tiosalicilato de sodio) El metal forma una capa externa con las proteinas que puede impedir la entrada de ms inactivante a la clula y actuar como bacteriosttico. El germen recobra viabilidad por lavados o por el agregado de azufre soluble.

Se utiliza ms como conservador de vacunas y sueros que como inactivante debido a las causas mencionadas. Es un polvo blanco que se diluye en agua o sol fisiolgica dando soluciones transparentes a las concentraciones habituales. Se prepara en solucin al 10% y normalmente se agrega 1ml / litro de vacuna o suero para concentracin final como conservador de 1/10.000. con variaciones permitidas entre 1/5.000 a 1/20.000. En los medios de control de esterilidad de vacunas y sueros esta incorporado al medio el tioglicolato de sodio que como posee azufre permite que se pongan de manifiesto grmenes que estn en estado de bacteriostasis pero no muertos por el conservador mercurial agregado. Actualmente est prohibido el uso de este conservador para preparaciones de uso humano. Formol Inactivante de uso muy corriente en bacterias, toxinas y virus. Como inactivante bacteriano es efectivo a concentraciones de 1 a 2 %o. Desnaturaliza las protenas y puede alterar la estructura antignica . Para toxinas o anavacunas el uso corriente es al 4-7 %o segn el germen a inactivar (ver toxinas) Para virus ( ver inactivacion viral ) esta siendo abandonado su uso por su efecto cola de inactivacion,

Detoxificacin o Inactivacin de toxinas En 1923 Ramon demostr que la toxina diftrica tratada con formalina no posee capacidad txica pero es capaz de producir una buena respuesta inmunognica Esta observacin fue de un inmenso valor y llev a la virtual eliminacin de la difteria en aquellos pases que introdujeron programas de inmunizacin controlados. Desafortunadamente en el pasado se han reportado muertes luego de la inyeccin de toxoide difterico. En Kyoto, Japn, luego de la inmunizacin con un batch txico de toxoide diftrico 600 nios exhibieron sntomas de intoxicacin por toxina diftrica con 68 muertos,. Este accidente fue explicado por una reversin del toxoide a toxina en ciertos frascos o por reversin in vivo, El estudio de la cintica de la detoxificacin muestra que ella comienza desde la adicin del formol. As para la toxina tetnica una disminucin notable de la toxicidad se observa 1 minuto despus de la adicin del reactivo. La detoxificacin puede seguir a un ritmo exponencial decreciente hasta las 24 hs., en la que la toxicidad es baja, ms no nula. Esta toxicidad residual decrece ahora, muy lentamente para ser nula al 5 da. En ste estado la reaccin del formol con la toxina no ha terminado (fase de fijacin rpida pero reversible) y la forma no txica puede ahora revertir parcialmente o totalmente hacia la forma txica (la reversin se observa por dilisis o dilucin). Es as que es indispensable

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prolongar el contacto del formol con la toxina a 37 C durante 15 das o ms, segn las toxinas. Durante este perodo las reacciones suplementarias que se producen llevarn a derivados irreversiblemente detoxificados. Para ciertas toxinas purificadas (toxina diftrica, colrica), la adicin de lisina es necesaria para la detoxificacin por el formol. Esta caracterstica se explica por la reaccin de ste aldehdo con la toxina. La detoxificacin induce transformaciones moleculares complejas. La molcula de toxoide es ms resistente a los agentes desnaturalizantes como los cidos y el calor que la toxina correspondiente. Esta estabilizacin reforzada de la estructura molecular est dada por la formacin de ligazones nuevas entre el formol fijado y los residuos aminocido de la protena. La formacin de polmeros se observa para ciertas toxinas (tetnica y enterotoxina estafiloccica).

Mecanismo qumico de la detoxificacin por el formol: Los fenmenos de reversin, polimerizacin y las caractersticas fsico qumicas de las anatoxinas pueden ser explicados por las propiedades particulares que caracterizan la reactividad del formol con las protenas. La elucidacin del mecanismo reaccional ha sido realizado gracias al anlisis qumico de hidrolizados de anatoxina y el empleo de formol radio marcado. En una primera etapa el formol (en solucin acuosa) da nacimiento a las metil aminas (o iminas) por reaccin con los grupos protnicos de los residuos aminoacil.

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Estos derivados son cido lbiles e inestables a la dilisis (estado de formol reversiblemente ligado). La incubacin prolongada con el formol entraa una segunda etapa donde se crean ligazones metilnicas (-C H2-) cido estables entre los grupos e-NH2 de residuos de lisina y los residuos aminoacil que poseen un H reactivo sobre los grupos ncleos amida, guanidil, imidazol, fenol e indol. Estas reacciones de condensacin irreversibles conocidas en qumica orgnica con el nombre de reaccin de Mannich , se efectan por eliminacin de una molcula de agua proveniente del oxgeno del formol y los dos tomos de Hidrgeno de dos grupos reaccionantes como lo muestra la reaccin siguiente entre residuos lisil y tirosil. Por ste mecanismo el formol se puede comportar como un agente de reticulacin si las ligazones Mannich se establecen entre dos molculas proteicas idnticas o no (puentes intermoleculares) que explican la polimerizacin de ciertas anatoxinas. Dentro de una misma molcula las mismas ligazones formarn puentes intercatenarios si existe ms de una cadena, contribuyendo as a dar a la protena formolada una estabilidad muy grande. Segn Selon Bizzini y Raynaud (1974), se puede representar esquemticamente el efecto del formol como conducente a la formacin en diferentes puntos de la molcula de toxina de uniones fijas representados por los puentes metilnicos, uniendo residuos aminoacil. La contribucin de grupos e-NH2 de la lisina permite una estimacin cuantitativa.

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Test de reversin. Despus del terrible accidente de Japn las autoridades japonesas introdujeron en 1973 en sus minimos requerimientos un test de reversin especifico pero no fue hasta 1983 que se incluyo en los manuales de la OMS. El test bsico es diluir el toxoide y guardar la muestra a 4 y 37 C por un periodo extenso, usualmente por un mnimo de 3 a 4 semanas . Luego son inyectados cobayos con 5 ml ( 50 Lf/ ml) subcutnea y se observan 21 dias. Si aparecen sntomas o muerte la especificidad de la reaccin puede ser confirmada mezclando antitoxina especifica con diluciones del toxoide problema ,si no enferman o mueren la toxicidad corresponde a toxina libre o revertida. Criterios de eficacia de las anatoxinas: Una anatoxina deber responder al ensamble de una serie de criterios , si va a ser usada eventualmente a los fines de la vacunacin: a.- Que est perfecta e irreversiblemente depurada de toda toxicidad b.- Que sea inmunognica y produzca anticuerpos neutralizantes en el hombre y los animales, a tasas sricas suficientes, y que posea una afinidad elevada que permita al enfrentarlos con la toxina pueda neutralizar en vivo todos los efectos biolgicos determinados por la misma.

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c.-Que induzca los anticuerpos apropiados (por ej. IgA) a nivel tisular ejercidos por el efecto de la toxina: mucosa intestinal, para las toxinas enterotropas ( toxina colrica y toxinas producidas por E. Coli y otras enterobacterias); msculo traqueal para la toxina coqueluchosa,etc. d.- Inducir respuesta inmunitaria durable e.- Que est desprovista de efectos secundarios, y en particular, que sea lo menos alergizante posible. La obtencin de anatoxinas que respondan a estos criterios no es posible para todas las toxinas. Como regla general las que provienen de grmenes G(+) se detoxifican fcilmente, con conservacin del poder inmunognico. La inmunogenicidad de las anatoxinas est fuertemente potenciada por la asociacin con adyuvantes, que se traducen en la aparicin de tasas sricas altamente elevadas de anticuerpos neutralizantes y precipitantes, como los descriptos por Raynaud. La situacin es diferente para los grmenes G(-) y para los venenos. El formol asegura bien la detoxificacin, pero las anatoxinas correspondientes no son, hasta hoy, buenos inmungenos

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Temperatura de Inactivacion Salvo casos especiales la temperatura de inactivacion con agentes qumicos es de 37 C durante un tiempo que es variable segn el sustrato a inactivar. Inactivacion fraccionada En algunas toxinas bacterianas la aplicacin de metodos clsicos de inactivacion como el agregado de formol por ej al 6%o ocasionan la inactivacion pero a su vez ,destruccin de parte o gran parte de su poder inmunogenico. En estos casos puede recurrirse a la inactivacion fraccionada, a la inactivacion a temperatura ambiente o a ambas. En la inactivacion fraccionada por ej toxoide botulnico C y D , Se agrega formol 2 %o al cultivo total luego se incuba cuatro a cinco dias a 37 C y se clarifica y luego vuelve a agregarse formol hasta completar en total el 6 %o. Otro metodo es agregar el total de formol pero incubar a temp. de laboratorio durante un tiempo mas prolongado hasta que los test de detoxificacin y reversin sean satisfactorios . Inactivacion de virus Historia: formol, fenol, secado sobre hidrxido de potasio, U.V., etc. Cintica de la inactivacin: Idealmente, la inactivacin debera seguir una relacin exponencial, por ej. El rango de supervivencia debera decrecer exponencialmente en funcin del tiempo. Sin

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embargo lo ms comn es la salida de esta ley, y esto se conoce como efecto cola, y se ha tratado de explicar de diversas maneras como por ej. agregacin de partculas de virus en grumos , resistentes al inactivante; adsorcin de virus en las paredes de los recipientes; presencia de gotas de aerosol en la superficie del lquido;etc. Segn la teora de Gard la permeabilidad estara reducida por la interaccin con la cubierta proteica, y esto ha encontrado asidero adaptndose a la ecuacin emprica y a los datos experimentales . La inactivacin viral se discute principalmente entre la teora de simples y mltiples impactos. En la primera, la sola modificacin de una base simple dentro del cido nucleico sera suficiente para inactivar la molcula entera; en la segunda; se requiere la acumulacin de un nmero de impactos subletales antes que el microorganismo sea aniquilado. Qu mecanismo se aplica a una mezcla de inactivantevirus, depender de un nmero de factores, incluyendo la naturaleza de la modificacin del cido nucleico, por ej. la predisposicn a la hidrlisis, y la presencia o ausencia de regiones genticamente inactivas en el genoma viral. Generalmente han sido y son usados como inactivantes de particulas virales agentes fisicos como los rayos ultravioletas o agentes qumicos como el formol, betapropiolactona, glicilaldehido, Hidroxilamina y un grupo conocido como aziridinas : etilenimina ( EI) Acetiletilenimina( AEI) etilenimina binaria (BEI) etc

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Aunque tericamente tambin el primer mecanismo podra asimilarse a una reaccin cintica de 1 orden, esto en la prctica no se cumple, y lo que aparece es una curva escalonada. Estos agentes actan como alquilantes cuya accin ya fue descripta. El formol acta reaccionando con los hidrgenos libres de los grupos aminos de las bases pricas y pirimdicas del cido nucleico el grado de inactivacin es relacionado con el grado de caida del RNA(en el caso de aftosa) infeccioso La curva de inactivacin del virus aftoso es muy similar al virus de la polio: una rpida cada inicial, un progresivo retardo en la declinacin que es una fase ms o menos prolongada y otro retardo al final de la reaccin que se realiza en zonas de concentracin no medibles por los mtodos habituales de control de inactivacin llamada efecto de cola que puede prolongarse por un tiempo largo haciendo difcil estimar cuando la inactivacin ha terminado realmente. Factores que influyen en el efecto cola de Inactivacin: a.- Ambientales: Almacenamiento prolongado Temperatura de agregado de formol Falta de homogeneidad de partculas Existencia de partculas protegidas Importancia de la clarificacin por filtros Purificacin PH b.- Propiedades de la partcula vrica

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Partculas parcialmente inactivadas que dificultan la accesibilidad del formol a la partcula. Efecto de retardo: puede simular una reaccin reversible para aumentar la seguridad, se aumenta el tiempo de contacto.

conc. viral

Rpida cada inicial

Reaccin no lineal o de 1 orden

Retardo progresivo

cola de inactivacin
Zona no medible

tiempo La persistencia de partculas infecciosas a bajas concentraciones pueden ocasionar cuando son aplicadas a campo sobre numerosos individuos :afecciones por vacuna. Naturalmente ello implica restos de virus activo que queden enmascarados en el adyuvante y estas fallas en la inactivacin pueden deberse a la forma y tiempo de inactivacin, la presencia de partculas gruesas (restos de clulas o tejidos donde quede enmascarado el virus, temperatura de inactivacin etc pero tambin puede ser ligado al tipo de inactivante

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Por muchos aos la mayora de las vacunas virales de antgeno inactivado fueron preparadas con formaldehdo como agente inactivante. El trabajo de Sven Gaud y col. sobre poliovirus en 19561958 demostr que la inactivacin de este virus con formaldehdo no es lineal o reaccin de primer rden y similares resultados fueron obtenidos para aftosa en 1963. Una reciente publicacin ha dado la linealidad de la inactivacin con formol como una conclusin errnea porque la titulacin de la infectividad en la curva de inactivacin fue basada en la lectura final de unidad formadora de placa a los 2 dias cuando un virus tratado por formol puede extender marcadamente el perodo de incubacin para su primera replicacin en cultivo de clulas. El perodo extendido de incubacin para virus tratado por formaldehdo puede tambin mostrar que el test de inocuidad en animales es inapropiado para detectar pequeas cantidades de virus infeccioso residual. Cuando el virus comienza a replicarse entre varios dias y 2 semanas, el animal inicia la produccin de Ac. El virus puede ser entonces neutralizado por estos y el animal abortar la infeccin o hacer enf. subclnica. Esta infeccin subclnica puede ser detectada testeando el animal para antgeno asociado a la infeccin viral, la viral RNA polimerasa (VIAA). En 1975 Alonso report que animales expuestos a aftosa, vacunados con virus inactivado con formol, de 18 animales, 5 fueron positivos, a VIAA y de 16 animales

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vacunados con vacunas inactivadas con AEI no hubo + a VIAA. Pinto y Gauland vieron ms tarde que en animales revacunados con vacunas con AEI hubo + a VIAA , pero la respuesta es mucho ms dbil y transitoria. Lo mismo fue confirmado para vacunas oleosas, pero slo luego de la revacunacin .

Inactivantes: QUIMICOS: 1.- AZIRIDINAS: Obedecen al desarrollo de gases mostaza en la I y II Guerra Mundial en particular, la beta-cloroetilamina o mostazas nitrogenadas. La etilenamina (EI) es comunmente preparada por ciclizacin de la Br-Etilamina hidrobromuro bajo condiciones alcalinas:

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Br-CH2-CH2-NH2 CH2

OHNa CH2

NH . HBr Propiedades de las aziridinas: Miscibles con el agua y la mayora de los lquidos orgnicos Estructura cclica abierta cuantitativamente por el tiosulfato La sustitucin de grupos alquilos en uno de los anilllos de tomos de carbono aumenta el rango de apertura de anillos La sustitucin en el anillo nitrogenado disminuye el rango de apertura de anillos a pesar que los grupos contiene un grupo electronegativo (ej. Acetil) cuando el rango es aumentado Los derivados comunes tienen un bajo punto de ebullicin ej. 56.7C para EI. La presin de vapor alta es suficiente para que sean un riesgo de inhalacin. Es objetable su olor amoniacal. La etilenimina es conocida por reaccionar con grupos alfa o epsilon amino, imidazol, carboxil, sulfidril y fenlicos de las protenas, fosfatos inorgnicos, glicero y hexosa fosfatos y grupos amino de adenina y tiamina.

imidazol

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Grupos epsilon amino etc

Usos: para la produccin de vacunas antiaftosas inactivadas, rbicas (0,05%,AEI-6.5 hs,37C), seudorabia y parvovirus porcino, tambin han sido usadas para inactivar hog clera y virus de influenza A. Hay

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alguna evidencia que AEI es menos efectiva con los virus de doble RNA. Tambin se usan aparte de AEI y EI , propilenimina y etiletilenimina. Condiciones operacionales: AEI y EI inactivan FMDV en una reaccin de primer orden. EI se prepara in vitro y se hace la ciclizacin en el momento previo a su adicin al cultivo. Preparada en forma reciente, EI es ms activa que AEI , probablemente debido a su vida media mayor. Hay reportes de Bahnemann de EI conservada a 20-40 C no perdi potencia. A temperatura ambiente y ms las aziridinas tienen tendencia la polimerizacin. No hay evidencia que sugiera que se afecte la inmunogenicidad de las cepas de virus estables por el tratamiento con las aziridinas . Cuando se hace la ciclizacin in situ el EI presenta menos riesgo potencial para el personal, pero la eficiencia de la inactivacin es ms baja. Segn Bahnemann, la presencia de bicarbonato en el medio tiene un efecto inhibitorio sobre la reaccin de ciclizacin. AEI y EI pueden ser neutralizados en el medio por la adicin de tiosulfato. Aziridinas: 1.- Acetiletilenimina: Ventajas: Accin rpida TC variable Sin efecto cola

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No afecta poder inmunognico Mantiene las propiedades serolgicas No degrada las protenas vricas Se puede neutralizar con tiosulfato de sodio Facilita la produccin industrial: se pueden mantener partidas inactivadas y conservarse por meses a 4C. Uso: 0,05% AEI- 26C, a pH 7.6 0,05% AEI a las 24 hs termina la inactivacin en otras 24 hs Inconvenientes: Alta toxicidad para humanos, falta de estabilidad a temperatura ambiente. 2) Etilenimina: Sin efecto cola Conserva poder inmunizante No degrada el virus Conserva propiedades serolgicas Curva de inactivacin ms lenta que AEI pero ms rpida que formalina. Ms estable que AEI Ms vida til. Un ao a temperatura ambiente. Difcil de obtener 3) Otros derivados de la aziridina: N- Carbenetani etilenimina N-acetil etilen imina

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Etilenimina: aumenta la velocidad de inactivacin, aumenta la estabilidad a tC ambiente. Iguales ventajas que la AEI, EEI y EI, sin peligro txico, no hay degradacin de partculas de 140 S. Propilenimina Glicidaldehdo: agente alquilante, grupos activos: epoxi y aldehdo 2.- FORMALDEHIDO Y OTROS ALDEHIDOS. Qumica y modo de accin: Muchos de los aldehdos, includos el formaldehdo y el glutaraldehdo, tienden a polimerizar en una serie de derivados de accin no bien definida. El formaldehdo reacciona con ambos cidos nucleicos y protenas a travs de grupos amino expuestos. A pesar de la adicin reversible del formaldehdo a los grupos amino, hay reacciones de enlaces cruzados ms lentos y estables de metilol aminos a travs de la condensacin con otras cadenas laterales de aminocidos por puentes metilnicos. Reacciones similares ocurren con los grupos amino de los cidos nucleicos y probablemente dan lugar a enlaces cruzados dentro del cido nucleico y entre el cido nucleico y la protena adyacente. En la inactivacin de poliovirus hay una considerable modificacin en la carga de superficie de la partcula viral con la probable formacin de puentes entre las molculas de protenas adyacentes. La partcula comienza a hacerse impermeable al formaldehdo durante la inactivacin, lo que explicara la presencia de

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partculas sin inactivar tanto en este virus como en aftosa. Las trgicas experiencias con este inactivante, ha hecho que se restringiera mucho su uso, sobre todo despus de los accidentes con vacuna antipolio. 3.- OTROS INACTIVANTES QUMICOS: Beta-propiolactona: CH2 -----CH2-------C = O O Ventaja: + rpida accin que el formol. Desventaja: zona estrecha entre la inactivacin y prdida de valor antignico. Conversin rpida a lactona, baja pH: detiene la inactivacin; solucin: incorporar buffer de glicina de pH 9. Cancergeno. Para evitar el efecto cola, complementar con rayos U. V. Hidroxilamina: Conserva propiedades inmunizantes. Desventaja: efecto cola; libera cido nitroso; tiene efectos mutagnicos. Glicilaldehdo: alquilante 0,05% Mantiene propiedades antignicas; inactivacin casi instantnea Ejemplos Sobre virus aftoso: Degradacin del antgeno: Por GDA aprox. el 10% ( gliceraldehdo) BEI: nula ( etilenamina primaria) Formaldehdo: 80%

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Accin sobre pptidos: GDA y BEI: ligera prdida de pptidos VP, y aparicin de VP1a y VP1b Formol: desprendimiento de pptidos externos VP1 y VP1b. Aumento de la densidad flotante de 140S. Beta-propiolactona: semejante al formol. La zona de prdida de valor antignico y la inactivacin es ms estrecha que para el formol. Formacin de lactona: detiene el efecto inactivante, baja el pH, con posible accin degradante de la protena 140S. Efecto cola. Hidroxilamina: Variacin de actividad segn el pH y los distintos medios de cultivo. Influencia deteriorante y mutagnica con el tiempo de por s o por productos de descomposicin , como cido nitroso. En la ltima dcada, la tecnologa del DNA recombinante ha supuesto la creacin de una nueva generacin de vacunas que permiten obviar las limitaciones de las clsicas. La disponibilidad de clonacin de genes ha permitido a los investigadores contemplar nuevas estrategias en el desarrollo de vacunas: 1.- Se pueden eliminar (curar) los genes de virulencia de un agente infeccioso y que mantenga la habilidad de estimular una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genticamente puede usarse como una vacuna viva sin las preocupaciones acerca de la

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reversin a la virulencia, ya que es imposible que un gen completo pueda ser readquirido espontneamente durante el crecimiento en cultivo puro. 2.- Se pueden crear sistemas vivos no patgenos que transporten determinantes antignicos de un agente patgeno con el que no estn relacionados. De esta forma el sistema transportador facilita la induccin de una fuerte respuesta inmunolgica dirigida contra el agente patgeno. 3.- Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, los genes que codifican para las protenas que tienen determinantes antignicos se pueden aislar, clonar y expresar en un huesped alternativo tal como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae o lneas celulares de mamferos. Estas protenas pueden ser formuladas en vacunas de subunidades. Las vacunas de subunidades utilizan slamente aquellos fragmentos antignicos ms adecuados para estimular una respuesta inmunitaria potente. Los genes de estas subunidades proteicas pueden ser introducidos en el genoma de una bacteria o levadura mediante las tcnicas de ingeniera gentica. La bacteria o levadura produce estas subunidades en cantidad y son despus recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas.

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INACTIVACIN GENICA Otro tema que es conveniente incorporar es la inactivacin gnica para las vacunas con genes modificados. Se han ensayado diversos mtodos desde la utilizacin de agentes mutagnicos como la luz ultravioleta o agentes qumicos, que no dieron los resultados esperados. Ms tarde se utilizaron tcnicas como el empleo de vectores adecuados que incluyen plsmidos, fagos , trasposones, que permiten la inactivacin de los genes por recombinacin homloga y la generacin de mutaciones al azar. Muchas veces en estos casos se utilizan vectores suicidas para introducir la modificacin que se desea, por ej. se trabaja con un plsmido con un gen que codifica para un producto que resulta en toxicidad o letalidad para la bacteria, este vector puede ser utilizado para introducir una copia inactivada del gen blanco, asegurndose que la recombinacin homloga resulte en un cromosoma recombinante en el cual el gen letal o txico se encuentre ausente. Si se produce una recombinacin parcial con integracin del plsmido en el cromosoma, la transcripcin resultante del gen letal impedir que se aislen recombinantes. Todo esto est en estudio para muchas bacterias vacunales y para su mejor comprensin se deberan tratar en detalle para cada caso particular.

g.m.g.2012_Inmuno II