Manual Cultivo Celular

Manual de Prcticas de Cultivo de Clulas Animales.
Prof. Leticia Bucio Ortiz.
MANUAL DE PRCTICAS CULTIVO DE CLULAS ANIMALES
Leticia Bucio Ortiz, Vernica Souza Arroyo, Luis E. Gmez Quiroz, Ma. de los Angeles Aguilar Santamara y Ma. Concepcin Gutirrez Ruiz.
2013
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NDICE.
Nombre de la Prctica 1. Material de Laboratorio de Cultivo y Prueba de Esterilidad.
Pg. 1
2.
Descongelacin y Cultivo de Clulas Celulares.
3. 4. 5. 6.
Resiembra, Conteo de Clulas Cultivadas y Viabilidad Celular con un Colorante de Exclusin. Prueba de Citotoxicidad del MTT, en Cultivo Celular In Vitro. Prueba de Citotoxicidad del Rojo Neutro, en Cultivo Celular In Vitro. Determinacin de Protena (Mtodo BCA).
9 14 19 23
7. 8.
Cultivo de Linfocitos Humanos de Sangre Perifrica y Obtencin de Cromosomas. Congelamiento de Lneas Celulares.
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Introduccin:
PRACTICA 1. MATERIAL DE LABORATORIO DE CULTIVO Y PRUEBA DE ESTERILIDAD. Introduccin.

El cultivo celular in vitro es una tcnica de laboratorio que consiste en la proliferacin de una gran cantidad de clulas a partir de unas pocas, en condiciones controladas de temperatura, nutrientes, pH, humedad, etc. Surge desde principios del siglo XX, cuando Harrison en 1907 cultiva fibras nerviosas de embriones de rana y se ha perfeccionado da con da. Es una tcnica de gran importancia ya que en la actualidad se realizan cultivos in vitro de diferentes tipos celulares, tejidos y rganos, normales o tumorales, as como de diferentes especies de tipo animal, vegetal o de vertebrados e invertebrados. Que se emplean en investigacin cientfica para realizar diversos estudios de: Inmunologa, Farmacologa, Toxicologa, Genmica, Actividad intracelular, Flujo de sustancias intracelulares, Interacciones entre clula- clula, Obtencin de productos celulares, e Ingeniera de tejidos. En la realizacin del cultivo celular adecuado, se debe considera la asepsia y el uso de material y un ambiente estril, ya que la tasa de crecimiento de las clulas en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasma. Existen diversos mtodos para esterilizar los materiales y soluciones empleadas para el cultivo, stos pueden ser por: Calor Seco, Calor Hmedo, Irradiacin, Mtodos Qumicos, o Filtracin. Tambin es importante que la persona conozca algunas generalidades del laboratorio de cultivo, el material y el equipo, que se enlistan a continuacin:
Requerimientos bsicos
Campana de flujo laminar Incubadora Tanques de CO2 Autoclave Refrigerador Congelador (-20C) Microscopio invertido con Equipo de filtracin Centrifuga Termo con N2 Lquido Purificador de agua Parrillas de agitacin Hemocitmetro Bao Mara Material de vidrio
Benficos, no esenciales
Contador de clulas Bomba de vaco Pipeteador automtico Potencimetro Horno para esterilizar Termmetros Microscopio de contraste de fases Microscopio de fluorescencia Dispensadores automticos Carros con ruedas Hornos de secado
Complementos tiles
Mquina lavadora de equipo de vidrio Congelador a -70C Medidor de conductividad Osmmetro Centrifuga de alta capacidad Contador de colonias Cmara digital y monitor para microscopio invertido Equipo de video con time-lapse Esterilizador de plsticos FACS Microscopio confocal
Objetivos. Conocer el principal material y equipo para realizar cultivo celular. Hacer pruebas de esterilidad de medios y soluciones empleadas en el cultivo celular. Hiptesis.
Material. Todo el material debe estar en condiciones estriles. 5 Viales de 15-20 ml. 6 Pipetas serolgicas de 10 ml. 1 mechero Incubadora Pipeteador automtico o perillas. Reactivos. Solucin Buffer de fosfatos (PBS). Medio de cultivo (especfico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solucin de tripsina. Medio nutritivo, enriquecido. Nutrient Broth no. 3, Vegitone. De Sigma-Aldrich Procedimiento. A. Conocimiento del laboratorio de cultivo celular. 1.- Hacer un reconocimiento del laboratorio de cultivo celular, enumerando los equipos y material, empleado en esta tcnica, as como su funcin. B. Prueba de esterilidad. 1.- En la campana de flujo laminar, se colocan los frascos con medio y soluciones a los que se desea realizar la prueba de esterilidad, as como el medio nutritivo. Los frascos deben estar a temperatura ambiente y limpiarse con alcohol antes de introducirse a la campana. 2.- Para cada solucin o medio se debe emplear una pipeta especficamente. Al utilizar cada pipeta o abrir y cerrar cada frasco se debe flamear con la llama del mechero. 3.- Etiquetar los viales segn corresponda a cada solucin o medio as como un control. 4.- Colocar 3 ml medio nutritivo al vial que dice control y 2 ml a cada uno de los viales de la prueba de esterilidad.
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5.- Colocar a su vial correspondiente: 1 ml de solucin de PBS, o 1 ml de Medio celular, o 1 ml de SFB o 1 ml de solucin de tripsina.
6.- Cerrar los viales sin olvidar flamear la boca del frasco y la tapadera. Incubar por 48 h mnimo. Resultados. Has un listado de los equipos y materiales empleados en el cultivo celular. Equipo Funcin Material Funcin
Indica las observaciones de cada uno de los viales donde se realiz la prueba de esterilidad. Viales a las 72h de incubacin.
________________________________ ______________________________________________________________
________________________ __________
Transparentes.
Contaminado
Anlisis de Resultados.
Conclusin.
Bibliografa. Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Cultek. Seccin Tcnica de Clulas Madre. [Electrnico]. Obtenido el 26 de septiembre de 2012 de: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/celulas%20madre/celulas_madre_tecn icas.pdf
Cuestionario. 1. Define los siguientes trminos: a. Cultivo celular in vitro. b. Medio de cultivo. c. Solucin buffer. d. Condiciones de esterilidad. e. 2. En tus propias palabras, responde a. Cules son los principales requerimientos para realizar un cultivo celular? b. Menciona que factores o acciones errneas son ms comunes de cometer en el cultivo celular. c. En qu consiste la prueba de esterilidad y cual es su importancia? 3. Qu tipo de contaminacin se puede dar en los cultivos celulares?
PRACTICA 2. DESCONGELACIN Y CULTIVO DE CLULAS CELULARES. Introduccin. El cultivo celular puede ser realizado a partir de clulas disgregadas de tejido, al cual se le denomina: cultivo primario. Una vez que las clulas cultivadas han proliferado y alcanzan la confluencia celular son subcultivadas (pasaje), mediante la disgregacin enzimtica y resiembra en un rea mayor, de 1:2, o hasta 1:4 para continuar el cultivo. Las clulas subcultivadas durante varios pasajes pueden llegar a mantener estables ciertas caractersticas de tipo morfolgico, bioqumico y gentico, es cuando se les considera una Lnea celular. Las lneas celulares pueden ser adquiridas comercialmente y se venden tubos criognicos con clulas congeladas, a partir de las cuales se inicia y establece la proliferacin celular.
Estas lneas celulares las hay de diferentes tipos celulares normales o tumorales, de diversos rganos y especies, segn los requerimientos del investigador.
La criopreservacin celular a -80 C o -196 C disminuye las funciones vitales de las clulas y las mantiene en condiciones de vida suspendida por tiempos prolongados, estas clulas al colocarse en condiciones adecuadas de temperatura, medios, nutrientes y humedad son cultivadas y proliferan activamente con la finalidad de tener una poblacin celular suficiente para realizar diversos estudios en investigacin e incluso al tener una buena cantidad celular poder congelar clulas para su almacenamiento.
Objetivos. Aprender y manejar la tcnica de descongelamiento de clulas criopresevadas en nitrgeno lquido. Aprender y realizar el cultivo in vitro de una lnea celular. Hiptesis.
Material. Todo el material debe estar en condiciones estriles. Pipetas serolgicas de 10 ml o 5 ml. 1 Tubo cnico para centrfuga de 10 ml.
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Campana de Flujo laminar. Incubadora. Bao Mara (BM). Microscopio invertido. 1 Mechero. Pipeteador automtico o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. 1 Botella de cultivo de 75 cm2 o a una caja Petri. Reactivos. Solucin Buffer de fosfatos (PBS). Medio de cultivo (especfico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solucin e antibitico al 10%. Alcohol al 70 % Procedimiento. A. Preparacin de medio de cultivo suplementado. 1. A una botella de medio con 500 ml, agregar Suero Fetal de Bovino (o el requerido) para tener una concentracin al 8-10%. Recuerde que previamente realiz a cada solucin su prueba de esterilidad. 2. Agregar solucin antibitico al medio de cultivo, a una concentracin final del 1%. Etiquetar con Nombre del medio, Fecha de realizacin, persona responsable del medio. 3. En caso de que el medio se haya preparado con anterioridad y se haya almacenado en refrigerador, colocar en B.M. a 30-37oC, para que tenga una temperatura ms templada. B. Descongelamiento de Clulas. 1. Colocar previamente dentro de la campana, todos los medios, frascos, vasos, etc. limpios, para ello limpiar con alcohol al 70%. 2. Remover el criotubo con las clulas del nitrgeno lquido. 3. Limpiar el tubo con alcohol al 70% y colocarlo en la campana, se puede utilizar un pequeo BM para llevar el tubo a 37oC, tratar de hacer este paso en forma rpida pero sin que sea un cambio de temperatura brusco. 4. Una vez que el contenido del criotubo se ha descongelado, vaciarlo en el tubo de centrfuga de 10 ml. 5. Agregar medio suplementado para complementar un volumen de 10 ml. 6. Centrifugar a 1000 rpm, durante 5-8 min. 7. Despus de centrifugacin seguir trabajando en la campana. Desechar el sobrenadante, puede ser por decantacin o bien por aspiracin cuidando de no llevarse el paquete celular.
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8. Agregar 10 ml de medio suplementado fresco y homogenizar el botn celular. 9. Una vez homogenizado, pasar el medio con las clulas a una botellas de cultivo o a una caja Petri. 10. Colocar en la incubadora a 37oC, 5 % de CO2 y humedad a saturacin. 11. Realizar observaciones cada 24 h, utilizando el microscopio invertido. 12. Durante el cultivo, cambiar el medio por medio fresco, cada 48 h.
Resultados. Durante 8-10 das, realiza observaciones utilizando el microscopio invertido cada 24 h y anota los cambios que se pueden apreciar en cada uno de ellos
Da: cero
Da: 3
Da: 6
Da: 7 Da: 1 Da: 4
Da: 2 Anlisis de Resultados.
Da: 5
Da: 8
Conclusin.
Bibliografa. Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Cultek. Banco de muestras biolgicas. Criopreservacin. [Electrnico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/celulas%20madre/celulas_madre_tecn icas.pdf
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Wikipedia. Criopreservacin.[Electrnico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://es.wikipedia.org/wiki/Criopreservaci%C3%B3n Ramos Gmez M, Martnez-Serrano A. 2008. Universidad Autnoma de Madrid. Curso de Cultivos Celulares. [Electrnico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ldesviat/_private/BIOQ%20EXPIII/Curso cultivosUAM2008.pdf Lpez Gerne T, Ortiz Isla E, Alvarez Lemus M, Lpez Gonzalez M. 2012. Laboratorio de Nanotecnologa UAM- Xochimilco. Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga. [Electrnico]. Obtenido el 13 de octubre de 2012 de: http://www.labnano.org.mx/esp%20lineas%20celulares.htm
Cuestionario. 1. Define: a. Lnea celular. b. Criopreservacin. 2. Cul es la importancia de realizar una descongelacin celular adecuada? 3. Qu factores influyen para realizar un cultivo celular ptimo?
PRACTICA 3. RESIEMBRA, CONTEO DE CLULAS CULTIVADAS y VIABILIDAD CELULAR. Introduccin. Una vez que el cultivo celular llega a confluencia, las clulas son expuestas a tripsina para disgregar y homogenizar en un medio de cultivo, el cual es distribuido a un rea mayor de 1:2 o 1:3 para incrementar el nmero de clulas disponibles, o bien para sembrar un nmero especfico de clulas para realizar un ensayo. Cuando las clulas son resembradas para la realizacin de un ensayo o prueba bioqumica, es necesario sembrar un nmero definido de clulas para lo cual es necesario hacer el conteo celular, el cual se realiza de una alcuota del homogenado celular, utilizando la cmara de Neubauer (hemocitmetro) o bien por mtodos automticos como es la utilizacin de un equipo contador de clulas (Coulter Contens). Tambin es importante que las clulas que se siembran sean viables, lo cual es posible cuantificar mediante la utilizacin del colorante de exclusin azul de tripano, que tie clulas no viables y las viables permanecen sin color ya que la membrana impide la incorporacin del colorante.
Objetivos. Hacer resiembra de clulas cultivadas in vitro. Conteo de clulas y resiembra para incrementar el no. de clulas. Hiptesis.
Material. Todo el material debe estar en condiciones estriles. Campana de Flujo laminar. Incubadora. Bao Mara (BM). Microscopio invertido. Pipetas serolgicas de 10 ml o 5 ml. 1 Mechero. 1 Cmara de Neubauer. Pipeteador automtico o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. Botellas de cultivo de 75 cm2 o cajas Petri para cultivo.
Soluciones: Solucin Buffer de Fosfatos (PBS). Medio de cultivo (especfico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solucin de antibitico al 10%. Tripsina 2 mM Buffer de PBS con EDTA al 2 mM. Alcohol al 70 % Azul de tripano al ----.
Procedimiento. A. Resiembra de clulas. 1. Una botella o caja Petri de cultivo con clulas formando una monocapa o en crecimiento exponencial. 2. Desechar el medio de cultivo. 3. Agregar una alcuota de buffer de PBS, para lavar las clulas y desechar. 4. Repetir el lavado con PBS y desechar el excedente. 5. Agregar una alcuota de PBS con EDTA y dejar reposar 2-3 min, y desechar. Este paso depende del tipo celular, se emplea para cultivo de la Lnea celular HepG2. 6. Agregar una alcuota de Tripsina, (0.5-0.8 ml). Incubar 1-3 min, dependiendo de que tan activa est la tripsina. 7. Una vez despegadas las clulas, re-suspenderlas en un volumen de Medio de cultivo y homogenizar. B. Conteo Celular. 1. Homogenizar las clulas, tomar una alcuota y colocarla en lado A de la cmara de Neubauer. 2. Repetir el procedimiento anterior y colocar una muestra en el lado B. 3. Contar las clulas de los 9, 5, 3 o un cuadrante (esto depende la densidad celular) del lado A y del lado B. Se tiene que tener un nmero similar en ambos lados (por ejemplo 89 con 80, o 120 con 130), y obtener un promedio el cual se multiplica por el factor 1 X 104, para obtener el nmero celular por ml de medio. S el valor es muy diferente (por ejemplo 80 con 40 o 120 con 80) repetir el conteo.
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4. Obtener el nmero total de clulas, considerando el volumen total. 5. Realizar los clculos para re re-sembrar sembrar un nmero especfico de clulas por 2 cm . 6. Colocar en la incubadora a 37 37oC, 5 % de CO2 y humedad a saturacin. 7. Realizar observaciones cada 24 h, utilizando el microscopio invertido. 8. Durante el cultivo, cambiar el medio por medio fresco, cada 48 h. C. Viabilidad Celular. 1. A una alcuota de 1 ml de homogenado celular agregar 100 ul de azul de tripano. 2. Realizar el conteo celular en la cmara de Neubauer, contando slo las clulas refringentes (vivas). 3. Si se requiere determinar el nm nmero ero de clulas muertas, contar las que se observan en color obscuro (clulas muertas).
Resultados. A) Observaciones: Tomar una fotomicrografa de clulas en cultivo, antes de exponerlas a la tripsina y posteriormente de despegarlas.
Clulas en cultivo
Clulas tripsinizadas
B) Conteo celular. No. de clulas A B

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Promedio
No. de cls/ml
No. Total de Cls.
C) Viabilidad Celular: No. de clulas vivas A B No. de clulas muertas A B Porcentaje de Viabilidad Celular: ____________________________. Promedio No. de cls/ml No. Total de Cls. Promedio No. de cls/ml No. Total de Cls.
Conclusin.
Bibliografa. Bastida O. 2012. Technical Note - Neubauer Chamber Cell Counting. Celleromics. . [Electrnico]. Obtenido el 19 de septiembre de 2012 de: http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-articlechamber.php Cultek. Seccin Tcnica de Clulas Madre. [Electrnico]. Obtenido el 19 de septiembre de 2012 de: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/celulas%20madre/celulas_madre_tecn icas.pdf Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Ramrez Romero P, Mendoza Cant A. 2008. Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de sustancias qumicas en agua y suelo. La experiencia en Mxico. Instituto Nacional de Ecologa, SEMARNAT. 1ra ed. Mxico D.F., Mxico. Electrnico]. Obtenido el 20 de octubre de 2012 de: http://books.google.com.mx/books?id=wdJWUOj81isC&pg=PA247&lpg=PA247& dq=azul+de+tripano+preparar&source=bl&ots=DwWbWs0aqR&sig=xVL9MDSp6 X5HZrT2AazMke8euh4&hl=es&sa=X&ei=9SSGUNSQFsalqQGeo4GIAg&ved=0C FAQ6AEwBg#v=onepage&q=azul%20de%20tripano%20preparar&f=false
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Cuestionario. 1.- Indica que es la tripsina y cual es su efecto en las clulas en cultivo? 2.- Qu es el EDTA y cual es su funcin en las clulas en cultivo? 4. Qu es el azul de tripano y su funcin en la viabilidad celular? 4.- Cul es la importancia de realizar un conteo celular y en que casos tiene importancia?
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PRACTICA 4. PRUEBA DE CITOTOXICIDAD DE MTT, EN CULTIVO CELULAR IN VITRO. Introduccin.

Las pruebas de citotoxicidad son muy variadas y permiten conocer si las clulas estn siendo afectadas en su funcionalidad por la exposicin a un agente fsico o qumico En algunos casos estas pruebas permiten conocer que organelo o parte celular es la que se est alterando especficamente. Para determinar si las clulas estn experimentando citotoxicidad, es posible medir metabolitos o enzimas, dentro de las clulas o bien que sean excretados al medio, como lo son la Lactato deshidrogenasa, o bien las transaminasas glutmico pirvica o la glutmico oxaloactica, las cuales si estn incrementadas son muestra del dao que ha experimentado las clulas por accin de un xenobitico. Otra prueba utilizada para determinar citotoxicidad y viabilidad celular el del MTT, la cual es especfica para detectar un dao celular a nivel mitocondrial.
Nota: Estas pruebas son utilizadas para determinar la funcionalidad celular ante la exposicin de un tratamiento citotxico, por lo que es necesario contar con un control negativo (clulas que han sido cultivadas en ausencia del agente citotxico).
Objetivos. Determinar la funcionalidad celular, mediante las pruebas del MTT. Hiptesis.
Material. Campana de Flujo laminar. Incubadora. Bao Mara (BM). Microscopio invertido. Pipetas serolgicas de 10 ml o 5 ml. 1 Mechero. Pipeteador automtico o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. Placas multipozos o Cajas Petri.
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Reactivos: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium. (MTT). HCL. Isopropanol. Etanol.
Soluciones: Solucin Buffer de Fosfatos (PBS). Medio de cultivo (especfico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solucin de antibitico al 10%. Tripsina 2 mM Buffer de PBS con EDTA al 2 mM. Alcohol al 70 %. Solucin de MTT: 0.5 mg/ml en PBS a pH=7.5.* Solucin de HCl 0.04N en 2-isopropanol.
*Se recomienda preparar un estock 10X en PBS y diluir posteriormente en medio de cultivo celular.
Procedimiento. A. Prueba de MTT. 1. Sembrar las clulas en placas de cultivo de 6 pozos ----cm2, a una densidad de 50 000 clulas /cm2. 2. Incubar en las condiciones estndar y dejar que se adhieran al menos 24 h. 3. Ya adheridas las clulas. Aplicar un tratamiento con un agente citotxico (el que es de su inters), contar con el cultivo celular que servir como control (No contiene el agente citotxico). El tratamiento puede ser dependiente de diversos agentes, concentraciones o tiempos de exposicin. 4. Al trmino del tratamiento, lavar las clulas con una alcuota de solucin de PBS y desechar el excedente. 5. Agregar una alcuota de la solucin de MTT, suficiente para cubrir la monocapa celular. 6. Incubar las clulas con el MTT por 3 h a 37oC y 90 % de humedad. 7. Posteriormente, desechar la solucin de MTT. Lavar las clulas con PBS y desechar el volumen restante.
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8. Agregar 500 L de una solucin de HCl 0.04N en 2-isopropanol, y agitar la placa durante 15 min. 9. Obtener el formazn solubilizado y leer en espectrofotmetro a una longitud de onda de 570 nm. 10. Expresar la funcionalidad celular (mitocondrial) como porcentaje de la absorbancia con respecto a la absorbancia del control.
Resultados. Observaciones: Tomar una fotomicrografa de clulas en cultivo, del control y las expuestas a los diferentes tratamientos, antes de extraer los colorantes. MTT Control Tratamiento 1 Tratamiento 2
Graficar los resultados para MTT
Conclusin.
Bibliografa. Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Gmez Lechn M J, Avils Martn P M. 2010. Hospital la Fe. Valencia y Laboratorios Glaxo. Modelos in vitro y cultivos celulares/tisulares [Electrnico]. Obtenido el 28 de octubre de 2012 de: http://minnie.uab.es/~veteri/00009/cap21.pdf Loumbourdis N, Danscher G. 2008. Autometallographic tracing of Hg-S quantum dots in foros exponed to inorganic mercury. Biometals, 21: 311-319. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Inmunol. Methods 65: 5563. Omata, S., Kasama, H., Hasegawa, H., Hasegawa, K., Ozaki, K., Sugano, H. 1986. Species difference between rat and hamster in tissue accumulation of mercury after administration of methylmercury, Arch. Toxicol. 59: 249-254.
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Santos, A.C., Uyemura, S.A.,Santos, N.A., Mingatto F.E., Curti, C. (1997) Hg(I1)induced renal cytotoxicity: in vitro and in vivo implications for the bioenergetic and oxidative statuso f mitochondria, Mol. Cell. Biocllemi. 177: 53-59.
Cuestionario. 1.- Indica que es el MTT y la reaccin en que se basa su funcionalidad. 2.- Indica cual fue el agente citotxico empleado y su efecto sobre las clulas.
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PRACTICA 5. PRUEBA DE CITOTOXICIDAD DE ROJO NEUTRO, EN CULTIVO CELULAR IN VITRO.

Introduccin. Las pruebas de citotoxicidad son muy variadas y permiten conocer si las clulas estn siendo afectadas en su funcionalidad por la exposicin a un agente fsico o qumico En algunos casos estas pruebas permiten conocer que organelo o parte celular es la que se est alterando especficamente. La prueba de Rojo neutro permite conocer si las clulas han experimentado citotoxicidad particularmente a nivel de lisosoma.
Nota: Estas pruebas son utilizadas para determinar la funcionalidad celular ante la exposicin de un tratamiento citotxico, por lo que es necesario contar con un control negativo (clulas que han sido cultivadas en ausencia del agente citotxico).
Bibliografa. Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Gmez Lechn M J, Avils Martn P M. 2010. Hospital la Fe. Valencia y Laboratorios Glaxo. Modelos in vitro y cultivos celulares/tisulares [Electrnico]. Obtenido el 28 de octubre de 2012 de: http://minnie.uab.es/~veteri/00009/cap21.pdf Loumbourdis N, Danscher G. 2008. Autometallographic tracing of Hg-S quantum dots in foros exponed to inorganic mercury. Biometals, 21: 311-319. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Inmunol. Methods 65: 5563. Omata, S., Kasama, H., Hasegawa, H., Hasegawa, K., Ozaki, K., Sugano, H. 1986. Species difference between rat and hamster in tissue accumulation of mercury after administration of methylmercury, Arch. Toxicol. 59: 249-254. Santos, A.C., Uyemura, S.A.,Santos, N.A., Mingatto F.E., Curti, C. (1997) Hg(I1)induced renal cytotoxicity: in vitro and in vivo implications for the bioenergetic and oxidative statuso f mitochondria, Mol. Cell. Biocllemi. 177: 53-59.
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PRACTICA 6. DETERMINACIN DE PROTENA (MTODO BCA). Introduccin.

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula, constituyen ms del 50% del peso seco de la clula. Cada tipo celular, tiene un papel especfico determinado por su composicin proteica. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas, basados en: a) La propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV. b) La formacin de derivados qumicos. c) La capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. El primer mtodo para cuantificar protenas, fue establecido en 1959 por Biuret, el cual se hiso ms eficiente y sensible por Lowry y posteriormente se utiliza el de Bradford, cada uno de ellos con ventajas y desventajas. Actualmente es posible utilizar el mtodo del cido bicinconnico que permite determinar la cantidad de protenas en una muestra de hasta 5 uL, en placas multipozos con ahorro de tiempo y una mayor sensibilidad.
Objetivos. Determinar la cantidad de protenas en una muestra celular. Hiptesis. Procedimiento. A). Extraccin de protenas. Material. Soluciones: (A). Buffer de lisis para obtener Complete: una pastilla en 2 ml de protena: agua desionizada y estril. Hacer alcuotas y guardar en frasco obscuro (Puede usarse las protenas para WB) Agregar 80 uL de Complete / ml buffer lisis a - 4oC. Buffer de lisis 50 mM tris-HCl 0.394 g tris-HCl 0.197 g 120 mM NaCl pH= 8 0.350 g NaCl 0.1753 g 0. 05% IGEPAL 0.250 uL IGEPAL 0.125 g 50 ml 25 ml 100 mM NaF 200 uM NaOV3 Inhibidores de fosfatasas 0.210 g NaF 0.1049 g 0.0012 g NaOV3 0.0006 g Ajustar a pH 8.0 (ya agregado)
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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Caja Petri de clulas en semiconfluencia (2.5 x 106 clulas). Lavar con PBS fro. Poner previamente la botella de PBS en hielo. Quitar el exceso de PBS con micropipeta. Agregar 200 mL de buffer de lisis (A), (contiene inhibidor de proteasas), a cada una de las cajas Petri. Dejar las cajas con el buffer de lisis, sobre hielo durante 15, moviendo cada 5 minutos para que se lisen las clulas. Raspar con gendarme y homogenizar con la punta (20-30 veces). Poner todo el volumen en un eppendorf de 1.5 - 2 ml. Centrifugar durante 15 min a 14 000 rpm a 4oC. Recuperar el sobrenadante con cuidado de no tomar el pellet y alicuotar:
B). Cuantificacin de protena. Material: 1 Multicmara de 96 pozos. 1 Micropipeta de 100-1000 uL 1 Micropipeta de 1-20 uL. Puntas para micropipeta. 1 Bureta de 10 0 25 mL Kit comercial BCA Protein Assay Kit (Pierce). Soluciones: Reactivo de BCA (preparado 50:1 con los reactivos A y B).
1.- Se cuantificar la cantidad de protena en muestras de homogenado celular o de tejido, mediante la utilizacin del Kit comercial BCA Protein Assay Kit (Pierce), para ello, se utilizar una curva estndar de albmina con diferentes concentraciones: Estndar Concentracin final de BSA (L/mL) A 2,000 B 1,500 C 1,000 D 750 E 500 F 250 G 125 H 25 I 0
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2.- Se colocarn 25 L de cada estndar en una placa multipozos, y 5 L de las muestras problema ms 20 L de agua destilada. 3.- Adicionar 200 L del reactivo de BCA (preparado 50:1 con los reactivos A y B), y se incuba a 37C por 30 minutos. 4.- Posteriormente se lee la placa en un lector de placas DTX Multimode Detector (Beckman Coulter) a 562nm. Se realizan los clculos para determinar la cantidad de protena / mL de muestra.
Resultados. a) Hacer una tabla con los datos de absorbancia correspondientes a la curva patrn y a los problemas.
b) Hacer la grfica de la curva patrn.
c) Mediante la ecuacin de la lnea recta correspondiente a la curva patrn, determinar la cantidad de protena para cada una de las muestras problemas.
Conclusin.
Bibliografa.
21
Universidad Nacional de Quilmes. 2010. Extraccin y cuantificacin de protenas. Introduccin a Biologa Celular y Molecular. [Electrnico]. Obtenido el 1 de noviembre de 2012 de: http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf Fernndez Reyes E. Galvn Cejudo A. 2010. Mtodos para la cuantificacin de protenas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. Campus Universitario de Rabanales. Crdoba. Espaa.
Cuestionario. 1.- Indica que es una curva patrn. 2.- Refiere en que se basa la tcnica del BCA para reaccionar con las protenas. 3.- Por qu se leen las muestras a una longitud de 562 nm. 4.- Qu ventajas ofrece este ensayo con respecto al mtodo de Bradford y Lowry.
PRACTICA 7.
22
CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS DE SANGRE PERIFERICA Y OBTENCION DE CROMOSOMAS. Introduccin.

A mediados del siglo pasado gracias al avance de la biologa, especficamente de la gentica y la citologa, surgi una nueva ciencia, la llamada citogentica, que tiene como objetivo el estudio de los cromosomas y de sus alteraciones, as como el estudio de la relacin de estas alteraciones y la sintomatologa que presentan los pacientes. Es por tanto una ciencia de gran aplicacin en biologa y medicina, ya que muchas enfermedades tienen un origen citogentico, al igual que muchos abortos espontneos o malformaciones fetales. Desde mediados del siglo XIX hasta mediados del XX no se supo el nmero de cromosomas del ser humano, porque entre otras cosas, no se saba si el nmero de cromosomas era constante. EL problema era que en la placa metafsica los cromosomas estn muy juntos y es difcil verlos separados. En diversos recuentos se obtenan nmeros dispares: 29, 80, 48 etc. Hoy en da sabemos que el nmero de cromosomas es caracterstico de cada especie y que adems, hay genotipos muy variados. Pero no fue hasta 1956, cuando fue establecido por los investigadores Levan y Tijo, que la especie humana tena 46 cromosomas. Este descubrimiento fue posible gracias a diversos avances tcnicos y metodolgicos: Tcnicas de cultivo de tejidos: primero se realizaron con clulas de pollo, y posteriormente mamfero. Con estas tcnicas desarrolladas ya en 1930 y 1940, se permiti cultivar clulas vivas in vitro. La tcnica de choque hipotnico, que fue la ms importante. Esta tcnica consiste en suspender las clulas en una suspensin hipotnica, con la que se hinchan las clulas consiguiendo la separacin de los cromosomas. Aprovecharon adems la colchicina para inhibir la polimerizacin de microtbulos y por lo tanto, destruir el huso mittico. En 1960 Moorhead describi que los linfocitos se en la sangre perifrica, pero que podan entrar en mitosis en condiciones, in vitro. Con este descubrimiento, se pudo realizar el cariotipo a partir de sangre perifrica, lo que tuvo varias ventajas: Es un tejido fcil de obtener. Permite la obtencin de un gran nmero de clulas con lo que se obtienen abundantes metafases (Navarro Lpez, 2011). Los linfocitos son las clulas responsables de las respuestas inmunitarias (inmune, del latn, 'estar libre de carga'). Se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros y se dividen en dos grandes grupos, linfocitos B y linfocitos T, segn que estos progenitores linfoides maduren en la mdula sea (B) o en el timo (T), respectivamente. Los linfocitos B estn especializados en la produccin de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas inmunes mediadas por clulas, as como de funciones de cooperacin para que se desarrollen todas las formas de respuestas inmunes, incluida la respuesta de anticuerpos por los linfocitos B. Los linfocitos han sido intensamente estudiados y desde hace muchos aos son utilizados para una gran diversidad de investigaciones biolgicas. En el campo de la gentica los linfocitos han 23
sido de gran utilidad, particularmente para la obtencin de cromosomas mitticos, cuyo estudio representan la parte fundamental de la citogentica. El cultivo de linfocitos, por lo tanto es una prctica rutinaria en un gran nmero de laboratorios de gentica. Las tcnicas para cultivar linfocitos se basan en la capacidad que tienen estas clulas para proliferar en presencia de agentes inductores de la divisin celular (mitgenos) y el desarrollo de un gran nmero de medios de cultivos (Verma, 1995).
Objetivos. Conocer las bases del cultivo en suspensin mediante un cultivo de linfocitos en sangre perifrica. Observar en el microscopio los cromosomas obtenidos para calcular el ndice mittico. Hiptesis.
Material. Todo el material debe estar en condiciones estriles. Pipetas serolgicas de 10 ml o 5 ml. 1 Tubo cnico para centrfuga de 15 ml. Campana de Flujo laminar (opcional se puede trabajar entre 2 mecheros). Incubadora. Microscopio invertido. 2 Mecheros. 2 Jeringas 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. Centrfuga Pipetas Pasteur y bulbos Lminas portaobjetos y cubreobjetos Reactivos y Soluciones. Sangre completa. Medio Mc Coy 5A. Fitohemaglutinina. Solucin de antibitico al 10%. Sol. Hipotnica: KCl 0.4 %. Etanol. Acido actico. Alcohol al 70 %. Colorante de Giemsa.
24
Procedimiento. A. Cultivo o siembra 1) La muestra de sangre humana heparinizada. completa se obtiene en una jeringa estril
2) Se vacan en un tubo de 15 ml estril y etiquetado las siguientes soluciones en el orden aqu establecido: 2.5 ml de Medio Mc Coy 5a 0.16 ml de Fitohemaglutinina 0.016 ml de sol. antibitica 3 ml de sangre completa (6 gotas), las gotas de sangre se vacan quitando la punta metlica de la jeringa, para no romper ms la muestra celular. Se cierra el tubo y se homogeniza suavemente la mezcla. 3) Se lleva el cultivo a una incubadora a 37% C por 72 o 96 hrs mximo.
25
B. Cosecha y obtencin de cromosomas 1) Una hora antes del cultivo se aaden 2ml o 4 gotas de colchicina al cultivo.
2) Se saca el tubo de siembra de las condiciones de esterilidad y se centrifuga a 1,500 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se elimina. (Es posible apreciar el buffy coat o la fase en donde se encuentran los linfocitos)
3) Se vaca una solucin hipotnica de KCl al 0.4 % hasta llegar a 10 ml y se introduce a la incubadora durante 30 minutos. (Se recomienda vaciar un poco de solucin, resuspender y despus vaciar el resto y volver a resuspender y homogenizar)
26
4) Se centrifuga la muestra a 1500 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se elimina
5) Se vaca solucin fijadora compuesta de etanol: cido actico en proporciones 3:1 hasta llegar a 10 ml y se centrifuga a 1,500 rpm por 10 minutos. Se elimina el sobrenadante.
6) Se repite el lavado con solucin fijadora hasta 10m l(x 2) y se centrifuga a 1,500 rpm por 10 minutos. Se elimina la mayor cantidad de sobrenadante y el botn celular se resuspende con lo que queda en el tubo de fijador.
27
7) El botn celular se gotea sobre lminas portaobjetos sumergidas en solucin fijadora enfriada en el congelador a una distancia de altura considerable para favorecer el rompimiento de las clulas.
8) Se sopla un poco el contenido para distribuirlo y se espera a que seque.
9) Se tie la muestra con Giemsa al 4% durante 20 minutos. Y se llevan las preparaciones al microscopio de campo claro para monitorear la dispersin de los cromosomas en la metafase y el ndice mittico.
28
Resultados. Determinar el ndice mittico. Utilizando el microscopio de campo claro a un aumento de 100X para observar bien las mitosis. Elegir varios campos y calcular del ndice mittico usando la siguiente frmula: 100
Anlisis de Resultados. Conclusin.
Bibliografa. Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Navarro Lpez Carlos. Universidad de Valencia. Departamento de Biologia. El cariotipo humano. [Electrnico]. Obtenido el 6 de noviembre de 2012 de: http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/biologia/Tema35.pdf Verma, R.S., y Babu, A.1995. Human Chromosomes. Principles and Techniques. 2 Ed. Mc Graw-Hill. Estados Unidos. 419p.
29
PRACTICA 8. CONGELAMIENTO DE LINEAS CELULARES. Introduccin.

La criopreservacin tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas. La criobiologa se refiere a entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biolgico es una consecuencia de determinadas reacciones bioqumicas y el fro prolonga el tiempo biolgico puesto que enlentece estas reacciones. Sin embargo, este no es un proceso exento de problemas, ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades qumicas, trmicas y elctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interaccin clula-clula inherente en las clulas y tejidos a criopreservar. La estructura y composicin de las membranas plasmticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservacin, su comportamiento durante la congelacin y descongelacin definir los ndices de spervivencia de la clula congelada. Los periodos crticos para la sobrevida celular durante la criopreservacin son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiolgicas. El entender y aplicar adecuadamente la criopreservacin de material biolgico es fundamental para los bancos de clulas de humanos y de clulas animales, los laboratorios de cultivo celular (mantener una lnea celular en cultivo continuo por largos periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminacin as como la posibilidad de una alteracin gentica) y los laboratorios de farmacia, por lo cual hay una especial atencin a la conservacin de tejidos, rganos y embriones humanos para ser utilizados en investigacin y su posterior aplicacin teraputica (trasplantes) llegando a crear verdaderos archivos biolgicos. Sin embargo, aunque desde hace mucho tiempo se han implementado protocolos para criopreservacin, estos son an subptimos en la mayora de los casos. La obtencin de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoqumicas de la clula y o el tejido puesto que este proceso est afectado por diferentes variables como especie, tipo y estadio de la clula a congelar. Las clulas tienen diferente tamao y manejan diferente composicin de solutos y en general el xito de la criopreservacin es inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biolgicos congelados (vila-Portillo Bacter, 2006). Uno de los mtodos de preservacin por tiempo indefinido de clulas es por medio de la congelacin en nitrgeno lquido. Los pasos cruciales dependen de adecuadas velocidades de congelamiento y descongelamiento de las clulas. Para congelar las clulas los protocolos ms exitosos bajan la temperatura lentamente hasta los 70C evitando de esta manera la formacin de cristales intracelulares que puedieran daar a las clulas. Cuando la temperatura se baja bruscamente la velocidad de formacin de cristales intracelulares se incrementa y la viabilidad decae en forma considerable. En la preparacin se incluye, adems, un agente que limita la cristalizacin, como el dimetil sulfxido (DMSO). Para el descongelado en cambio, se incrementa abruptamente la temperatura para evitar que las clulas sufran grandes cambios de volumen y estallen (Universidad de Quilmes, 2010. 30
Objetivos. Realizar el congelamiento de una lnea celular para preservacin por tiempos prolongados (das, meses, aos).
Hiptesis. Material. Todo el material debe estar en condiciones estriles. Pipetas serolgicas de 10 ml o 5 ml. 1 Tubo cnico para centrfuga de 15 ml. Campana de Flujo laminar. Incubadora. Bao Mara (BM). Microscopio invertido. Mechero. Hemocitmetro o cmara Neubauer. Pipeteador automtico o perillas. 1 Vaso de precipitados o frasco para contener desechos. 1 Piseta con alcohol al 70%. 1 Botella de cultivo de 75 cm2 con clulas HepG2 confluentes 1 Val de plstico Criotubos, etiquetados con la lnea celular, el pasaje, la fecha y la persona que realiz el congelamiento.
Reactivos. Solucin Buffer de fosfatos (PBS). Solucin Buffer de fosfatos con EDTA (PBS-EDTA). Medio de cultivo: Medio Williams (especfico para su cultivo celular). Suero Fetal de Bovino (SFB), (o bien el requerido para su cultivo). Solucin de antibitico al 10%. Alcohol al 70 % Solucin de tripsina. Dimetil sulfxido (DMSO) Clulas: lnea celular en confluencia. Procedimiento. A. Tripsinizacin y conteo celular 1) Observar al microscopio el frasco (Superficie: 75 cm2) que se va a congelar para asegurarnos que no est contaminada y se puede congelar.
31
2) Flamear el frasco y decantar medio de cultivo en el matraz de desechos.
3) Lavar dos veces con PBS entre 5 y 10 ml, cubriendo monocapa y agitando suavemente. Decantar.
4) Lavar una vez con 4ml de PBS-EDTA, cuidando que cubra por completo la superficie de la monocapa y dejar actuar durante 1 minuto.
32
5) Cubrir la monocapa con una cantidad menor a 1ml de solucin de tripsina (0.5 a 0.8 ml aproximadamente) e incubar por dos minutos aproximadamente. Observar atentamente la monocapa una vez agregada la tripsina, esta tiene un tiempo de accin entre 2 y hasta 5 minutos.
6) Agregar 12 ml de medio Williams y homogeneizar la monocapa pipeteando enrgicamente. Teniendo cuidado de deshacer los cmulos celulares pipeteando reiteradamente.
7) Medir el volumen de la suspensin con la pipeta y tomar una alcuota de 500ul para contar las clulas en el hemocitmetro.
33
B. Congelamiento 1) Vaciar la suspensin celular a un tubo de 15 ml estril y centrifugar a 3,000 rpm durante 8 o 10 minutos.
2) Dividir el nmero de clulas obtenida en el conteo entre 5 millones, para saber cuntos tubos se van a preparar. Para cada tubo considere que se van a vaciar en total 1.5 ml que se componen de lo siguiente: 80 % de Medio Williams. 10% de SFB (suero fetal bovino). + 10% de DMSO. 100% de medio para congelar.
3) Etiquetar los criotubos con datos de la lnea celular pasaje fecha y quien congela dicha muestra.
34
4) Regresar a trabajar en la campana de flujo, desechar el sobrenadante. Primero agregar el 80% de medio y homogenizar. Despus aadir 10% de SFB y finalmente 10% de DMSO para tener un 100%. Homogenizar.
5) Vaciar en cada criotubo 1.5 ml de suspensin. Cerrar bien cada criotubo y llevar al congelador REVCO a -80C. 80C.
Resultados.
35
Anlisis de Resultados. Conclusin.
Bibliografa. vila-Portillo Bacter LM, Madero J I, Lpez Bacter C, Len Bacter M F, Acosta Bacter Luca, Gmez C, Delgado L G, Gmez C,Lozano J M, Reguero M T. 2006. Fundamentos de criopresrvacin. Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecologa 57: 291-300. Freshney, R. I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley & Sons Wiley-Liss, Inc. 5th ed. New York, USA. Universidad Nacional de Quilmes. 2010. Mantenimiento de lneas celulares. Biologa Celular y Molecular. [Electrnico]. Obtenido el 5 de noviembre de 2012 de: http://cancer.unq.edu.ar/Tpnro2bis.pdf
36

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MANUAL DE PRCTICAS CULTIVO DE CLULAS ANIMALES

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Nombre de la Prctica 1. Material de Laboratorio de Cultivo y Prueba de Esterilidad.

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PRACTICA 1. MATERIAL DE LABORATORIO DE CULTIVO Y PRUEBA DE ESTERILIDAD. Introduccin.

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Da: 7 Da: 1 Da: 4

Da: 2 Anlisis de Resultados.

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B) Conteo celular. No. de clulas A B

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PRACTICA 4. PRUEBA DE CITOTOXICIDAD DE MTT, EN CULTIVO CELULAR IN VITRO. Introduccin.

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Reactivos: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium. (MTT). HCL. Isopropanol. Etanol.

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Graficar los resultados para MTT

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