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MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA MDICA

por Miguel F. Torres

Portada interna: Microfotografa electrnica de Salmonella typhi en divisin. Muestra los flagelos, las fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibujos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.

1996, Miguel Francisco Torres Rubn Qumico Bilogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Posee Maestra en Microbiologa Mdica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte, Estados Unidos. Fundador del Laboratorio Microbiolgico de Referencia (LAMIR) y catedrtico titular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiologa, Escuela de Qumica Biolgica, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala. Por muchos aos fue microbilogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social (IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Academia de Ciencias Mdicas, Fsicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Academia Guatemalteca de Historia de la Medicina. Los criterios expresados en esta publicacin son de la exclusiva responsabilidad del autor e incluyen su experiencia personal. Impreso en Editorial Serviprensa C.A. 3a. avenida 14-68, zona 1 Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237 Guatemala, Guatemala, 1996

NDICE
PRESENTACIN / 11 AGRADECIMIENTOS / 13 PRLOGO / 15 Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch. CAPTULO 1: BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA / 21 El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad para el Laboratorio de Microbiologa. Medidas de Bioseguridad. Mtodos de Esterilizacin o Desinfeccin. Descontaminacin. Antisepsia. Uso efectivo de Antispticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilizacin. Resistencia de Microorganismos a Germicidas Qumicos. CAPTULO 2: INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA / 29 Cmo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriologa. Fig. 1 Mesa de Trabajo para Bacteriologa. La Coloracin de Gram. Foto: Hans Gram. Frmulas: Reactivos para la Coloracin de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiolgicas y su Uso, 1 Asas para Bacteriologa, 2 Asas para Micologa y Micobacterias. Fig. 3 Inoculacin de Medios Slidos por Estras. CAPTULO 3: COPROCULTIVO / 41 Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriolgica para Coprocultivo. Interpretacin de Resultados. Fig. 5 Observacin y Sealamiento de Colonias Sospechosas. Fig. 6 Tcnica para tomar Inculo de Colonias Individuales. Reacciones de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciacin de las Especies del Gnero Shigella. Diferenciacin de las Especies del Gnero Salmonella. Informe. Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Coleccin de Muestras Duodenales. La Epidemiologa y Etiologa de la Diarrea. Patgenos Frecuentemente Identificados en Nios con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros de Tratamiento, en Pases en Desarrollo.

CAPTULO 4: COPROCULTIVO PARA CLERA / 63 Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados. Fig. 7 Marcha Bacteriolgica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Frmulas: 1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair. CAPTULO 5: COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71 Propsito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretacin de Resultados. Informe. CAPTULO 6: INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori / 75 Propsito. Muestra. Observacin Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe. CAPTULO 7: UROCULTIVO / 79 Propsito. Manifestaciones Clnicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre. Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Nios Pequeos. Puncin Supra-pbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha Bacteriolgica para Urocultivo. Interpretacin de Resultados. Informe. Deteccin de Bacteriuria por la Coloracin de Gram de Orina no Centrifugada. CAPTULO 8: CULTIVO DE GARGANTA / 91 Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriolgica para Cultivo de Garganta/Exudado Farngeo. Interpretacin. Foto: Interpretacin de la Prueba de Bacitracina. Identificacin Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretacin de la Prueba de CAMP. Caractersticas Fsicas, Hematolgicas y Qumicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la Sangre de Carnero en el Laboratorio Clnico. CAPTULO 9: CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105 Propsito. Investigacin de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento. Interpretacin de Resultados. Informe. Investigacin de Neisseria meningitidis en Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretacin. Informe.

CAPTULO 10: CULTIVO DE ESPUTO / 121 Propsito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretacin del Frote Gram de Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretacin de Resultados e Informe. Etiologa y Sintomatologa de Neumona y Bronquitis. CAPTULO 11: HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129 Propsito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan el Diagnstico Bacteriolgico. Interpretacin de Resultados. Etiologa y Sintomatologa de Septicemia. Informe. CAPTULO 12: SECRECIONES DIVERSAS / 137 Propsito. Muestra. 1 Piel. Etiologa y Sintomatologa de Heridas Infectadas. 2 Ojos. Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Ocular. 3 Odos. Etiologa y Sintomatologa de Otitis Media. 4 Miscelneos. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e Informe. Principales Pruebas para la Diferenciacin de Tres Especies del Gnero Staphylococcus de Origen Humano. CAPTULO 13: SECRECIONES GENITALES / 147 Propsito. Diagnstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus Uretral Masculino. Diferenciacin de Dos Especies de Neisseria de Importancia Clnica. Diagnstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnstico Directo de la Sfilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos del Tracto Genital Femenino. Introduccin. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes Etiolgicos. CAPTULO 14: LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163 Propsito. Muestra. Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Osea y Articulaciones. Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriolgica para Lquido Cefalorraqudeo (LCR). Interpretacin de Resultados. Informe. CAPTULO 15: TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171 Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e Informe.

CAPTULO 16: PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177 Propsito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12 Marcha Bacteriolgica para Antibiograma. Antibiticos Aprobados (FDA-USA) que deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gramnegativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretacin de Resultados. Interpretacin de los Dimetros de las Zonas de Inhibicin (mm) para Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretacin de los Dimetros de las Zonas de Inhibicin (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Lmites Aceptables de los Halos de Inhibicin (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas Control. Fuentes Comunes de Error. CAPTULO 17: ANAEROBIOS / 193 Propsito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretacin de Resultados. Caractersticas Morfolgicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de Importancia Mdica. Interpretacin del Cultivo. Morfologa Microscpica. Fig. 12 Diversas Morfologas Bacterianas. Informe. CAPTULO 18: MICOBACTERIAS / 203 Propsito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gstrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras. Procedimiento. Procedimiento de la Coloracin de Ziehl-Neelsen. Frmulas: Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloracin de Kinyoun. Frmulas: Reactivos para Kinyoun. Interpretacin e Informe de Baciloscopas. Reporte de Frotes para Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestin y Descontaminacin de Esputos. Mtodo de Digestin y Descontaminacin con N-acetil-levo-cistena (NALC). Frmulas. Digestin y Descontaminacin de Esputos por el Mtodo Convencional de Hidrxido de Sodio. Frmulas. Procedimiento de Digestin/ Descontaminacin para Esputos de Pacientes cuyas muestras estn constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados Gstricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Farngeo. Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales. Interpretacin del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias Atpicas). BIBLIOGRAFA / 223

NDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA Fig.2 / 39 CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO 1 Asas para Bacteriologa 2 Asas para Micologa Fig.3 / 40 INOCULACIN DE MEDIOS SLIDOS POR ESTRAS Fig.4 / 45 MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO Fig.5 / 46 OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS Fig.6 / 48 TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES Fig.7 / 67 MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01 Fig.8 / 84 MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO Fig.9 / 94 MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA FIG.10 / 100 SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP Fig. 11 / 166 MARCHA BACTERIOLGICA PARA LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)

Fig.12 / 181 MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA Fig.13 / 201 DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS

Nota: Al centro del libro, a partir de la pgina 111 aparecen 32 fotografas a color y sus explicaciones correspondientes.

Guatemala, agosto de 1996

PRESENTACIN Las enfermedades infecciosas continan siendo la principal causa de morbimortalidad en Mesoamrica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud pblica de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las ms frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal de salud en diagnstico bacteriolgico, incide directamente en su mejor tratamiento y control. La Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA MDICA a la comunidad cientfica de Guatemala y Centroamrica. Como su ttulo lo indica, se trata de un libro fcil de leer, comprender y aplicar, dirigido a profesionales, estudiantes y tcnicos que estudian o trabajan directamente la bacteriologa en los laboratorios clnicos privados o estatales. El autor es catedrtico titular desde hace 22 aos en el Departamento de Microbiologa, Escuela de Qumica Biolgica de esta Casa de Estudios. Durante estos aos, ha tenido a su cargo la enseanza de la bacteriologa mdica a los estudiantes de Qumica Biolgica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no slo como catedrtico e investigador a travs de sus mltiples publicaciones en revistas cientficas nacionales e internacionales, sino tambin a lo largo de los aos ha demostrado su empeo por mejorar la microbiologa en nuestro medio. Uno de sus principales logros fue la creacin del Laboratorio Microbiolgico de Referencia -LAMIR- en 1991. La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigacin en bacteriologa, parasitologa y micologa, aunados a sus conocimientos y experiencia adquiridos durante varios aos de servicio como microbilogo clnico del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido del manual. Esta obra fue completada por el autor durante su ao sabtico de la Universidad de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos xitos. Atentamente, Lic. Jorge Rodolfo Prez Folgar Decano Lic. Gerardo Arroyo Cataln Director de la Escuela de Qumica Biolgica Licda. Heidi Logemann Lima Jefe del Departamento de Microbiologa

AGRADECIMIENTOS
El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados bacterilogos de Centroamrica y el Caribe, por su valiosa colaboracin al haber revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio, enriquecen la obra. Licda. Floridalma Cano Granados Supervisora del Laboratorio de Bacteriologa y Parasitologa Intestinal Laboratorios de Microbiologa Dr. Leonardo J. Mata Instituto de Nutricin de Centroamrica y Panam Guatemala Dr. Edmundo E. Poujol Ex-Director del Departamento de Microbiologa Universidad Nacional Autnoma Honduras Dr. Jaime Guevara R. Jefe de la Seccin de Laboratorios Direccin Tcnica de Servicios de Salud Caja Costarricense de Seguro Social Costa Rica Dra. Marion C. de Martin Vice-decana de la Facultad de Medicina Universidad Nacional Panam Dr. Gerardo F. Martnez Jefe del Departamento de Bacteriologa / Micologa Sub-Direccin de Microbiologa Instituto de Medicina Tropical Dr. Pedro Kour Cuba A los personeros del Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social de Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de la Segunda Edicin del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro mensaje acadmico y gua de trabajo a profesionales, tcnicos de laboratorio y estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriologa mdica en nuestros pases, debe ser la meta. Estas labores deben ser dinmicas y constantes.

PRLOGO A LA SEGUNDA EDICIN


Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin embargo, la bacteriologa mdica surgi como tal hacia fines del siglo XIX, con los geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propag una bacteria patgena en cultivo puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no slo estableci sta bacteria como causa del ntrax en el ganado vacuno, sino inaugur un mtodo de investigacin de las infecciones, actualmente vigente. Hoy en da, la bacteriologa clnica ha avanzado enormemente y en la ltima dcada del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesario extraer de la literatura actualizada los conocimientos, tcnicas y criterios interpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los anlisis bacteriolgicos ms frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son los propsitos fundamentales de la presente publicacin. Este MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA MDICA no es un texto exhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonoma bacteriana. Es una gua simplificada de trabajo, orientada hacia la obtencin de resultados lo ms rpido posible y con el mayor significado clnico. Al final del libro, se seleccionan las referencias bibliogrficas ms relevantes. Anteriormente se aceptaba que el buen bacterilogo clnico era aquel capaz de identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo. Hoy en da este concepto ha cambiado y el buen bacterilogo clnico es quien discrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patgenos de la microbiota normal, los identifica total o presuntivamente lo ms pronto posible y emite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual prctico se hace nfasis en los criterios actualizados de interpretacin. El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidad presente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriologa mdica, los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia, que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector. 15

Es imperativo hacer mencin del gran aporte que el invento del microscopio represent para las ciencias biolgicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo XVII fue el primer humano que observ las bacterias. Este personaje longevo, no slo efectu grandes descubrimientos con sus microscopios de lente de gota, sino tambin nos leg su ejemplo del valor de la palabra cientfica escrita. El microscopio compuesto que usamos hoy en da fue inventado posteriormente por los hermanos Hans y Zacaras Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler. Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa entretencin para cientficos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la bacteriologa, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los descubrimientos bsicos que han permitido el desarrollo de la bacteriologa mdica moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron mltiples, por lo que es muy difcil sumarizarlos. Conviene recordar que el increble avance de la bacteriologa en las postrimeras del siglo XX, y el que vivirn nuestros descendientes en el prximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discpulos. La Primera Edicin de este MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA MDICA, fue patrocinada por la compaa farmacutica Pfizer, en septiembre de 1996. Esta edicin se agot rpidamente entre profesionales y estudiantes de laboratorio clnico en Centroamrica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado como referencia del trabajo rutinario en bacteriologa clnica en mltiples laboratorios y es libro de texto en varias universidades. En 1999, el Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social de Guatemala, ha reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edicin, la cual llegar a todos los profesionales y tcnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clnicos, ahora como norma obligatoria a observar en bacteriologa mdica. El autor ha plasmado en el presente libro, treinta aos de experiencia en la materia, de manera simplista y expresando lo mnimo que es necesario efectuar en los laboratorios clnicos de Mesoamrica. Miguel F. Torres, Q.B., M.A. Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999

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El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo, antes de la invencin del microscopio, el hombre desconoci la vida microscpica y la estructura celular de los tejidos. Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda. Fabric ingeniosos microscopios con pequeos lentes fundidos en placas de diversos metales. Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser humano que observ las bacterias, los protozoos, los glbulos rojos y los espermatozoides. Durante 50 aos, inform peridicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental, dibuj y report por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.
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Carta a sus hermanas: La voluntad es algo grande, pues la accin y el trabajo generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se acompaa del xito. Estas tres cosas, trabajo, voluntad y xito, llenan la existencia humana. La voluntad abre la puerta al xito, ambos brillantes y felices, el trabajo pasa estas puertas y al final del viaje el xito corona nuestros esfuerzos. LOUIS PASTEUR, 1841 (Besanon, Francia)
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Roberto Koch fue un mdico rural alemn, nacido en 1843. Sus aportes a la bacteriologa mdica fueron enormes. Primero cultiv la bacteria causante del ntrax en humor vtreo de buey. Luego desarroll gradualmente tcnicas bacteriolgicas fundamentales, como el uso del agar extrado de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y as poder observar colonias. Con su discpulo Paul Ehrlich, aplic los colorantes derivados de la anilina a la coloracin de microorganismos. Descubri las bacterias causantes de el clera, la tuberculosis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueo.
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CAPTULO 1 BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA


La microbiologa es la ciencia que estudia a los seres vivos microscpicos, es decir que slo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeos organismos microscpicos son llamados vulgarmente microbios, pero la palabra correcta para designarlos es microorganismos. La microbiologa se aplica no slo a la ciencia mdica, sino tambin a la veterinaria, a la agronoma y a la industria, por lo que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias. Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican segn su estructura, manera de reproducirse y muchas otras caractersticas. Los grupos ms importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los hongos. Los virus son los microorganismos ms pequeos, se reproducen nicamente dentro de las clulas y tienen forma similar a cristales. La palabra microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre s. La microbiologa se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo taxonmico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos, pero su estudio se basa en estructuras microscpicas. Microbiologa Bacteriologa (bacterias) Micologa (hongos) Virologa (virus) Parasitologa Protozoologa (protozoos) Helmintologa (helmintos) Entomologa (insectos, caros, otros)

La mayora de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades en el hombre y se les llama por esta razn saprfitos o saprobios. Sin embargo, algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando un microorganismo es capaz de producir infeccin, se dice que es patgeno; la virulencia es la cuantificacin de la patogenicidad. La inmunologa naci ligada a la microbiologa como el estudio de los mecanismos de defensa contra los microorganismos. Ahora su campo de accin se ha extendido mucho y es una ciencia biolgica independiente. 21

En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las bacterias y los hongos son los ms abundantes; prcticamente todos los objetos que vemos y tocamos estn cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente donde hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), est cubierto de bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice que forman parte de alguna microbiota. Por microbiota se entiende aquel conjunto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin causarle ningn dao. La palabra flora no es correcta, y por lo tanto no debe utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas colonizan, no infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama oportunistas. EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS: Todos los nombres cientficos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran grupo, es el gnero y siempre se escribe la primera letra con mayscula. El segundo nombre es la especie y siempre se escribe con letras minsculas. Casi todos los nombres cientficos de los microorganismos se derivan del griego o del latn, por esta razn: a) b) Ejemplos: Staphylococcus aureus (bacteria) Escherichia coli (bacteria) Streptococcus pyogenes (bacteria) Pseudomonas aeruginosa (bacteria) Entamoeba histolytica (parsito, protozoo) Giardia lamblia (parsito, protozoo) Ascaris lumbricoides (parsito, helminto) Trichophyton rubrum (hongo) Microsporum canis (hongo) Adems del nombre cientfico, en algunos casos existe un nombre de uso comn o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse. Los nombres vulgares ms conocidos son los siguientes: 22 Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva Nunca se tildan

Nombre correcto: Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Enterobius vermicularis Trichuris trichiura Entamoeba histolytica Entamoeba coli Hymenolepis nana Candida albicans

Nombre vulgar: colibacilo (bacteria) neumococo (bacteria) gonococo (bacteria) oxiuro (parsito, helminto) tricocfalo (parsito, helminto) ameba histoltica (parsito, protozoo) ameba coli (parsito, protozoo) tenia nana (parsito, helminto) monilia (hongo)

Si se desea hacer referencia a todas las especies de un gnero se usa la abreviatura para especies: spp. y no se subraya. Si slo se refiere a una especie no determinada de un gnero dado, se usa: sp. abreviatura de especie. Ejemplos: Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen. Shigella sp. = una especie no determinada del gnero Shigella.

Tomado de:

RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de Ramrez Laboratorio Microbiolgico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistologa. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, Universidad de San Carlos.

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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Lavarse las manos frecuentemente Usar gabacha Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario Usar mascarilla cuando es necesario Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos No comer en el rea de trabajo No almacenar comida en el rea de trabajo No fumar Usar adecuadamente los desinfectantes Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material Clasificar los desechos Descontaminar el material biolgico antes de descartarlo Esterilizar o incinerar el material contaminado Destruir el material descartable o no reusable No utilizar materiales inflamables cerca del mechero Conocer el uso y manejo de los extinguidores Neutralizar los desechos qumicos Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte

Equipo necesario: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Campana bacteriolgica Campana de flujo laminar cuando es necesario Lmpara de pie Mechero o incinerador Incubadora bacteriolgica Autoclave Horno esterilizador Agitador de tubos Centrfuga

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Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigacin: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Extinguidores en lugares accesibles Basureros cerrados Lava-ojos Extractor de vapores Incinerador Recipientes con desinfectantes y descontaminantes Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes Recipientes plomados MTODOS DE ESTERILIZACIN O DESINFECCIN
Mtodo ESTERILIZACIN: Calor Hmedo (autoclave) Seco (horno) Gas Oxido de etileno Lquido Glutaraldehido Perxido de hidrgeno Formaldehido Dixido de cloro DESINFECCIN Calor Hmedo (incluye pasteurizacin) Lquido glutaraldehido perxido de hidrgeno formaldehido compuestos clorinados alcoholes (etanol, isoproplico) compuestos fenlicos compuestos yodados ANTISEPSIA alcoholes yodforos hexaclorofeno Concentracin o nivel 121 C a diferentes intervalos de tiempo 171 C por 1 hora; 160 C por 2 horas; 121 C por 16 horas 450-500 mg/litro a 55-60 C variable 6-30% 6-8% variable Actividad

75-100 C variable 3-6% 1-8% 500-5,000 mg de cloro libre/litro 70% 0.5-3% 0.1-0.2%

alta alta-media alta-media alta-media intermedia intermedia media-baja media-baja

70% 1-2 mg de yodo libre/litro 1-3%

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DESINFECCIN: Proceso generalmente menos letal que la esterilizacin. Elimina virtualmente todos los microorganismos patgenos pero no necesariamente todas las formas microbianas (esporas). El procedimiento de desinfeccin carece del margen de seguridad que se logra por los procedimientos de esterilizacin. Factores: 1. 2. 3. 4. Naturaleza y nmero de microorganismos contaminantes. El tipo y configuracin del material a desinfectar. Tipo y concentracin del germicida qumico usado. Tiempo y temperatura de exposicin.

DESCONTAMINACIN: Es un trmino usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este trmino abarca desde lavado con agua y jabn hasta la desinfeccin o esterilizacin. ANTISEPSIA: Un antisptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido vivo con el propsito de inhibir o destruir microorganismos. USO EFECTIVO DE ANTISPTICOS, DESINFECTANTES Y PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIN Factores para la eleccin de desinfectantes y procedimientos de esterilizacin. 1. 2. 3. Grado de muerte microbiana requerida. Naturaleza del material o la superficie a ser tratada. Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.

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ESTERILIZACIN: Uso de procedimiento fsico o qumico para destruir toda la vida microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas altamente resistentes. Tipos de esterilizacin: Calor hmedo: autoclave de vapor Calor seco: horno esterilizador Gas de xido de etileno Esterilizantes qumicos: germicidas basados en glutaraldehido. RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS AA GERMICIDAS QUMICOS (*) RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS GERMICIDAS QUIMICOS (*) ESPORAS BACTERIANAS Bacillus subtilis Clostridium sporogenes MICOBACTERIAS Mycobacterium tuberculosis var. bovis VIRUS PEQUEOS O NO LIPDICOS Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus HONGOS Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp. BACTERIAS VEGETATIVAS Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuis VIRUS DE MEDIANO TAMAO O LIPDICOS Herpes simplex - Cytomegalovirus Virus sincitial respiratorio Virus de Hepatitis B Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
(*) En orden descendente de resistencia

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CAPTULO 2 INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA


Las bacterias son microorganismos formados por una sola clula muy simple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentacin y reproduccin. Son uno de los grupos microbianos ms frecuentes y abundantes en casi todos los ambientes. La reproduccin de las bacterias ocurre por simple particin de una clula en dos clulas hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparacin con la reproduccin de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser mviles o inmviles. Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos que agitan en forma de ltigo. Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condiciones de laboratorio, debe proporcionrseles todas las sustancias nutritivas que requieren (protenas, azcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado segn cada medio de cultivo. Las bacterias se clasifican en base a diversas caractersticas. Segn sus requerimientos de oxgeno, las bacterias pueden ser: a. Aerobias: Crecen bien en la atmsfera que respiramos, es decir en presencia de oxgeno, el cual requieren para su sobrevivencia. Microaeroflicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxgeno. Para disminuir la concentracin de oxgeno en el microambiente en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un 5 al 10 % de anhdrido carbnico (CO2). Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxgeno, el cual les es sumamente txico e impide su crecimiento.

b.

c.

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d.

Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxgeno y tienen la facultad de tambin crecer en aerobiosis.

Segn la temperatura ptima de crecimiento, las bacterias pueden ser: a. Mesfilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la temperatura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En este grupo se incluyen todas las bacterias patgenas, por esta razn la temperatura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras bacteriolgicas es de 36 grados centgrados. Termfilas: Crecen a altas temperaturas (calor). Crifilas: Crecen a bajas temperaturas (fro). Psicrotrficas: Crecen a temperaturas de refrigeracin.

b. c. d.

Segn su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos: a. Cocos: Son bacterias de forma esfrica o redondeada. Ejemplo, Foto A pgina siguiente: Microfotografa de Staphylococcus aureus en divisin. Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o bastoncillo. Ejemplo, Foto B pgina siguiente: bacilos en divisin. Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o espiral. Ejemplo, Foto C pgina siguiente: Microfotografa de bacterias de la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos.

b.

c.

Dependiendo de su forma de agrupacin los cocos pueden clasificarse as: a. Diplococos: Agrupacin de bacterias esfricas en grupos de dos, o parejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae). En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.) En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)

b. c.

Este tipo de clasificacin no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.

30

C 31

CMO ORGANIZAR EL REA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGA Para poder trabajar bacteriologa mdica, se requiere del siguiente material y equipo bsico, segn se ilustra en la figura 1 (pg. 34). 1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto), material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo frmica. El lugar de trabajo debe estar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros. Contar con una silla cmoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado. 2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o Touch-OMatic. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translcida (no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estril el aire que est un pie (30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo ms cerca posible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. Tambin puede usarse incinerador. 3. Una campana bacteriolgica de madera o fibra de vidrio para aislar el rea de trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotarla por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos con alcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella, si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del mechero. 4. Un autoclave para esterilizar con calor hmedo a presin, material y medios de cultivo, matar material contaminado y cultivos (esterilizar previo descarte o limpieza). Puede ser pequeo, tipo olla de presin. Calibrarlo a manera de autoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presin por pulgada cuadrada. 5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con frmica, con las siguientes asas de nichrome (aleacin de nquel y cromo), segn se ilustra en la figura 2 (pg. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de platino puro en anillo pequeo para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos). Para trabajar Micologa (hongos) debe contarse tambin con asa espatulada, asa en L y dos agujas de diseccin. Las asas bacteriolgicas deben ponerse rectas y limpiarse diariamente. Esto se hace fcilmente hacindolas rodar en el suelo deslizando el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa. Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que ya est fra. 32

6. Una lmpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de cuello de ganso; colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuertemente el rea sobre la mesa, pero que la luz no d directamente a los ojos. 7. Microscopio ptico binocular de buena calidad, con condensador de campo oscuro. 8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscpico para observar bien las colonias. 9. Incubadora bacteriolgica que debe mantenerse constantemente a 36o C exactos (no a 37o C a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hoja de control diario de temperatura. 10. Balanza para pesar medios de cultivo. 11. Hornilla elctrica de dos discos y temperatura graduable. 12. Refrigerador con congelador. 13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tiendas, con tapadera metlica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras (velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres microaeroflicos. 14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis, catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios. 15. Agitador de tubos tipo vortex. 16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo segn se describe en cada captulo. 17. Gradillas para colocar tubos con medios de cultivo o muestras.

33

Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA

34

LA COLORACIN DE GRAM Las bacterias son microorganismos incoloros, por este motivo deben teirse para poder observarlos con ayuda del microscopio. Por esta razn, a continuacin se describe la tcnica ms importante que debe usarse para diferenciar bacterias: la coloracin de Gram. Se recomienda usar la modificacin de Hucker segn Bartholomew, de acuerdo con la bibliografa que aparece al final de este manual. a) Preparacin de frotes: Hans Gram

La coloracin de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos de vidrio (tambin llamados frotis) de todo tipo de muestras clnicas, o a frotes de suspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho sobre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque sobre una superficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayn graso por detrs de la lmina. Una vez que el frote ya est seco, fijar pasando levemente por la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no queme al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfre antes de colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes. Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debe hemolizarse con agua. Proceder as: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir completamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram. Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias. b) Tcnica de la coloracin de Gram:

1. Cubrir el frote ya fijado y fro con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto (ver preparacin de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de agua corriente. Escurrir muy bien. 2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo suavemente con agua corriente, escurrir bien. 3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 5 segundos, hasta que ya no salga ms cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve en frotes delgados y ms prolongado en frotes gruesos. 35

4. Cubrir el frote con safranina slo por 30 segundos. Enjuagar suavemente con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a 36 C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire obtenido de una pera de hule o un secador para manos. 5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersin, con aceite especial de viscosidad adecuada. c) Resultados:

Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro. Bacterias gram-negativo: rojo. La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es ms delgada en las bacterias gram-negativo. Esta coloracin slo es vlida para cocos y casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es vlida para espiroquetas. Si el frote es de material clnico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo a simple vista despus de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra stos deben ser rojos (gram-negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gramnegativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decolor adecuadamente. d) Informe:

El reporte correcto de una bacterioscopa (observacin de bacterias) con Gram debe contener los siguientes elementos y en este orden: 1. Identificacin del paciente (apellidos, nombres, nmero de registro o afiliacin, servicio y fecha). 2. Ttulo que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatmico de donde proviene. Por ejemplo: Secrecin de lcera en miembro inferior derecho. Coloracin de Gram: 3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase ms freuente en la muestra, indicar agrupacin y cantidad (muy escaso, escaso, regular cantidad, abundante o muy abundante +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocos gram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular cantidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo

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en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en plural. 4. Luego es muy importante para el mdico saber si hay glbulos blancos en la muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abundantes. Este dato indica que hay verdadera infeccin y que la muestra era purulenta. Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar intracelular en el reporte, lo que es de especial inters clnico en los frotes de secreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infeccin crnica o viral (no purulenta). 5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos (gram-positivo); de clulas epiteliales, de especial inters en frotes de esputo (se miran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y ncleo pequeo redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina, que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares. 6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrn incluirse al final comentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfologa observada es compatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (con mucha prudencia). Reactivos para la coloracin de Gram: (Modificacin de Hucker segn Bartholomew) 1. CRISTAL VIOLETA: Solucin A: Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos Alcohol etlico al 95 % ....................................................... 20 ml Solucin B: Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos Agua destilada ................................................................... 80 ml Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24 horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloracin. 2. LUGOL DE GRAM: Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos 37

Agua destilada ................................................................... 300 ml Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (en probeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregar el agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro (mbar). Slo dura una semana. 3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante): Mezclar volmenes iguales de acetona pura (para anlisis) y alcohol etlico al 95 %. 4. SAFRANINA: Solucin stock (concentrada): Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos Alcohol etlico al 95 %. ...................................................... 100 ml Solucin de trabajo: Diluir 1:10 la solucin stock (concentrada), as: Solucin stock .................................................................... 10 ml Agua destilada ................................................................... 90 ml

Solucin anticorrosiva para desinfectar bistures: Formaldehido (Formol) .................................................... 8 % Alcohol etlico .................................................................... 60-70 % Nitrito de sodio .................................................................. 0.2 % Para preparar un litro: En un baln aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio, luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luego aforar con 100 ml de agua destilada. Los bistures con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidos en esta solucin, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.

38

Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO


ASAS PARA BACTERIOLOGA:

1.

Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de nichrome. Sirve para siembra por estras e inoculaciones en general.

2.

Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de identificacin, o subcultivo.

3.

Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para urocultivo.

ASAS PARA MICOLOGA Y MICOBACTERIAS:

4.

Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.

5.

Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y procedimientos especiales.

6.

Aguja de diseccin con punta aguda, para purificar colonias pequeas y distribuir las preparaciones de hongos en fresco.

39

Fig . 3 INOCULACIN DE MEDIOS SLIDOS POR ESTRAS


1. Con asa o hisopo estril, estriar inculo original de aproximadamente 0.5 cm, en el borde de la caja de Petri.

2. Flamear primera vez al terminar el inculo original.

3. Segunda estra cruzada, debe tocar ligeramente el inculo original.

4. Flamear segunda vez, al terminar la segunda estra.

5. Tercera estra. Debe tocar ligeramente la segunda estra, y cubrir toda la superficie libre del medio sin tocar al final el inculo original.

40

CAPTULO 3 COPROCULTIVO
PROPSITO: Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatgenas, es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte. Las principales especies enteropatgenas que se buscan en el coprocultivo, en orden de importancia en Guatemala son: Shigella flexneri Salmonella typhi Shigella sonnei Salmonella enteritidis Shigella dysenteriae tipo 1 Shigella boydii Salmonella choleraesuis Arizona hinshawii Edwardsiella tarda Yersinia enterocolitica (Shigella grupo B) (agente de fiebre tifoidea) (Shigella grupo D) (Shigella A-1 o Bacilo de Shiga, causa severa disentera epidmica) (Shigella grupo C, rara en Guatemala) (rara) (muy rara) (muy rara)

Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el intestino humano, por lo que se conocen comnmente como enterobacterias. Forman aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacterias anaerobias. Por esta razn es muy importante que el laboratorio est en capacidad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatgenos de la lista anterior. MUESTRA: Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras: heces frescas (la mejor muestra) hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)

41

material obtenido por proctoscopa biopsia de mucosa intestinal

Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibiticos. Las heces debern procesarse lo ms pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas de ser emitidas; no es necesario que el paciente est en ayunas. El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa. En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estril 4 centmetros, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los nios, introducir el hisopo 2.5 centmetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es ms fcil tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y l mismo separndose los glteos. Los nios deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego introducir el hisopo. Cuando las heces, que se encuentran a 37 C dentro del intestino, son colectadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20 C), el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propsito colocar con hisopo estril una porcin anormal de las heces (con moco, sangre o pus) aproximadamente del tamao del hisopo bien cargado en tubos o viales con 3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36C por aproximadamente 18 horas antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de glicerol-salino bufferado. Glicerol salino bufferado Para transporte de coprocultivos Cloruro de sodio ...................................................................... 4.2 gramos Fosfato dipotsico (anhidro) ..................................................3.1 gramos Fosfato monopotsico (anhidro) ...........................................1.0 gramos Rojo fenol .................................................................................. 0.003 gramos Agua destilada .........................................................................700 ml Glicerina ...................................................................................300 ml 42

El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapn de rosca y luego autoclavear a 121C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica y vira a color amarillo. Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clnica. La coloracin de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de significado clnico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras (gram-positivo). PROCEDIMIENTO: Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es nio menor de 6 meses. Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que slo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo) y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce cido, lo que hace cambiar el color de las colonias y as las diferencia). Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen cido sulfhdrico. El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes, de preferencia uno ms inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella). En caso de heces con moco y sangre (disentera) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y proctoscopa. El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en estos tres medios que contienen el azcar lactosa (como agente diferencial) es el siguiente:

43

MEDIO

COLOR ANTES DE INOCULAR rosado rosado ligeramente amarillento verde claro rojo

COLONIAS LACTOSAPOSITIVO rojo (rosado)

COLONIAS LACTOSANEGATIVO incoloras

COLONIAS CON CIDO SULFHDRICO no cambian

MacConkey

SS

rojo

incoloras

negro

Hektoen XLD

anaranjadosalmn amarillas

verde azuladas rojas

negro negro

Efecte el coprocultivo as: 1Inocular una porcin anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inculo se coloca con asa en anillo (flameada y fra) o con hisopo en las cajas de ambos medios. Inocular slo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el MacConkey. Diseminar el inculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas mientras la otra se enfra (ver figura 3, pg. 40). Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas, incubar a 36C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura controlada diariamente (ver figura 4, pg. 45).

2-

3-

44

Fig. 4 MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO

Muestras: Material de proctoscopa, biospia intestinal Opcional

Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de enema salino INOCULAR Rutina

MacConkey

XLD SS

Hektoen

Medios:

Diseminar por estras, incubar a 36o C

Seleccionar colonias segn el caso, trasladar a TSI/LIA/urea


45

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: 1Despus de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada paciente simultneamente. Debe contarse con una luz de lmpara que ilumine las cajas por detrs y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcar por detrs con un crculo de crayn graso cada tipo diferente de colonias sospechosas as: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias ms pequeas (ms o menos 1 mm de dimetro). Si el paciente es un nio menor de un ao, se marcar adicionalmente en el MacConkey una colonia tpica de Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la parte de la caja donde las colonias estn ms separadas y ponerle con crayn graso por detrs C al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio el crecimiento ser ms escaso pues es ms inhibidor. Marcar por detrs una colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por las ms pequeas, e incluyendo una colonia con centro negro (cido sulfhdrico) si las hay. Si se inocul Hektoen, marcar una colonia pequea verde azulado (lactosa-negativo).

Fig. 5 OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS

Marcar colonias sospechosas por detrs de la caja de Petri

46

CR

AY

GR

AS

2-

El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscpico para hacer los sub-cultivos con asa en aguja o recta as: Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio estereoscpico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y fras, acostmbrese a usarlas segn se indica a continuacin: apoyndose en el borde del microscopio con los dedos meique y anular de la mano derecha (izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lpiz y bjela lentamente hasta que aparezca en el campo del microscopio y slo toque la superficie de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya toc la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo) con el dedo meique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y luego haga un estriado rpido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una estra en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colonia de igual morfologa). Si no cuenta con microscopio estereoscpico proceda as: Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedos pulgar, ndice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y meique). Colquela verticalmente a manera que la luz pase por detrs a travs de la caja, tome su asa recta agarrada como un lpiz con la mano derecha, apoye firmemente los dedos anular y meique en la palma de su mano izquierda que sostiene la caja. Acerque cuidadosamente el asa y toque con mucho cuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas. (ver figura 6, pg. 48). Inocule simultneamente una pareja de TSI/LIA y urea agar segn ya se describi. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm de fondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente, Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkey slo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descrtelo. Lo mismo se har con el Hektoen que slo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado salmn), o el XLD que slo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SS otras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersinia enterocolitica.

47

Fig. 6 TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES

3-

Incube a 36C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no quede duda de qu tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en incubacin de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente flojos para permitir la entrada de oxgeno. Las colonias marcadas g (E. coli, nios menores de un ao) pueden pasar slo a TSI, para ahorrar LIA y urea. Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultneamente; tome ambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsrvelos contra la luz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla. 48

4-

Reaccin ya ya Reaccin incubada incubada A=cido K=alcalino Medio sin Medio sin inocular inocular TSI (rojo) Amarillo rojo no aplicable no aplicable R=rojo N=neutro

Gas (g) (-a+++)

cido sulfhdrico (h) (-a+++)

burbujas o rupturas burbujas o rupturas

negro

LIA (morado)

Amarillo

violeta

Superficie roja

antre amarillo y morado

negro

Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte; negativo = no hay cambio

Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, segn la tabla anterior en este orden: superficie/ fondo, gas, cido sulfhdrico. Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan as: TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o TSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, hLas reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy tiles para la identificacin de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioqumicas en general. Reacciones a las cuales debe ponerse especial atencin: Bacteria Shigella spp. Salmonella sp. Yersinia enterocolitica TSI K/A,g-,hK/A,g+,h++ A/A,g-,hLIA K/A (N),g-,hK/K,g+,h+ A (K)/A,g-,hUREA +

49

5-

Los tubos de TSI, marcados g y que corresponden a coprocultivos de nios menores de un ao deben aglutinarse para investigar Escherichia coli enteropatgena (pools A, B y C) (Segn Dr. Myron Levine, U. de Maryland VI Congreso C.A. de Microbiologa, comunicacion personal). El informe final deber reportarse as: Se aisl Escherichia coli enteropatgena del grupo ___ . Debe hacerse notar que aunque el valor cInico de esta prueba ha sido puesto en duda, ya que tambin existen E. coli invasivas y productoras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la aglutinacin para demostrar la presencia de serotipos clsicos enteropatgenos en los nios pequeos. Inocule una asada pequea en caldo tripticasa soya o caldo BHI (infusin de cerebro y corazn de buey), proceda efectuar la prueba de susceptibilidad antimicrobiana segn el mtodo de Bauer-Kirby, descrito ms adelante. Si no se observa ninguna aglutinacin, ni se aisla Shigella o Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe redactarse as: Negativo para Shigella , Salmonella y Escherichia coli enteropatgena. (Slo para nios menores de un ao). Las claves sugeridas para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y aceleran el trabajo.

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REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA

Enterobacteria Escherichia coli Shigella spp.* Salmonella typhi* Salmonella spp.* Arizona hinshawii* Yersinia enterocolitica* Citrobacter sp. Edwarsiella tarda

TSI A(K)/A, g+ (-), hK/A, g-, h+ (poco) K/A, g-, h+ K/A, g-, h+++(-) K(A)/A, g+, h+++ A/A, g-, hK(A)/A, g+, h+++(-) K/A, g+, h+++ (indol +) A/A, g++, h(mucosidad ++) A/A, g++, hKA/A, g-, hA(K)/A, g+, h+++ K(A)/A, g+, h+++ K/A, g-(+), hK/A, g+ -, h

LIA K/KN, g-+, hK/A, g-, hK/K, g-, h-(+) K/KN, g-, h+ (-) K/KN, g-, h+ (-) A(K)/A, g-, hK/A, g-+, h+K/K, g-+, h+

UREA + +-

Klebsiella sp.

KN/KN, g+, h-

+ -(+) -+ + + + -

Enterobacter sp. Serratia sp. Proteus vulgaris Proteus mirabilis Morganella morganii (antes Proteus morganii) Providencia sp.

KN/KN, g+(-), hKN/KN, g-, hR/A, g-, h-(+) R/A, g-, h-(+) KR/A, g-, hR/A, g-, h-

Nota Importante: Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre parntesis. Todas las reacciones con reaccin roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clnica en coprocultivos y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es slo una gua, que debe actualizarse constantemente.

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DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DEL GNERO SHIGELLA: TSI y LIA = K/A,g-,hOler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a semen es caracterstico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la ms frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni cido sulfhdrico y tienen un color amarillo canario. La reaccin K (alcalino) de la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el crecimiento del TSI sospechoso, o del LIA as: Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ryela con crayn graso por detrs a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos de aproximadamente un centmetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA con reaccin sospechosa de Shigella, en orden numrico en una gradilla. En la misma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reaccin sospechosa de Salmonella y los TSI marcados C (Escherichia coli) para proceder a aglutinar. Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro de un cuadrito una gotita de antisuero Shigella grupo B (Shigella flexneri). Aglutine tomando una porcin pequea del crecimiento en TSI (puede ser tambin del LIA) con asa en anillo estril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en valo pequeo sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera de obtener una suspensin ligeramente lechosa. Observe inmediatamente despus de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrs la aparicin de aglutinacin franca y obvia. Slo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto despus de mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina siga aglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, que son muy caros: 1234Shigella flexneri, grupo B Shigella sonnei, grupo D - La ms frecuente en Guatemala - La segunda ms frecuente en Guatemala Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidmica, debe darse alerta al mdico. Shigella boydii, grupo C - Muy rara vez se aisla en el pas.

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DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DEL GNERO SALMONELLA: La taxonoma moderna del gnero Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines prcticos de diagnstico y de investigacin, se recomienda usar la clasificacin antigua simplificada as: Salmonella typhi: causa fiebre tifoidea con diseminacin generalizada de la bacteria (puede aislarse de heces, mdula sea, sangre, orina, etc). causa infeccin intestinal y puede diseminarse a la sangre. rara, causa infeccin en animales y rara vez en el hombre.

Salmonella enteritidis:

Salmonella choleraesuis:

Salmonella typhi presenta en TSI dos caractersticas muy importantes para su identificacin, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y aglutinacin: 12No produce gas. Produce poco cido sulfhdrico (una pequea mancha negra, a veces difcil de apreciarse en el rea del tubo donde empieza el inclinado). Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+) Es citrato-negativo. Aglutina con el antisuero anti-antgeno Vi.

345-

El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se prepara inclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada del crecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a 36C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan as: verde = negativo azul = positivo

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Diferencie presuntivamente las especies del gnero Salmonella con estas tres pruebas sencillas:

Prueba Especie Salmonella typhi Salmonella enteritidis Salmonella choleraesuis

Gas (TSI) + +

cido sulhdrico (TSI) + dbil +++ + (slo 60%)

Citrato

+ (+)

(+) = positivo lento, ms de 3 das de incubacin. En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos: 1Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y Salmonella spp. segn la tabla. Es muy importante notar la reaccin toda morado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo cual es tpico del gnero Salmonella. Anote la cantidad de cido sulfhdrico en el TSI. Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinacin y, segn ya se explic, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercial polivalente de Salmonella. Si la reaccin es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube, simultneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutine slo los tubos con aglutinacin franca en el antisuero polivalente a Salmonella en los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B, G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinacin positiva a este grupo, adems de las otras pruebas sencillas confirma esta especie. Si se investiga el grupo, ste debe informarse, por ejemplo: Se aisl Salmonella enteritidis del grupo B. Idealmente el laboratorio podr confirmar con ms seguridad y mayor 54

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3-

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trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de mltiples pruebas bioqumicas miniaturizadas, por ejemplo API, segn las condiciones de trabajo. INFORME: El informe del coprocultivo debe constar de 3 partes: 1Ttulo: coprocultivo, cultivo de biopsia colnica, etc. De preferencia debe escribirse con maysculas y centrado. Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en clave, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deber transcribir con el texto correcto, segn la prxima tabla. Incluir el grupo de Salmonella si se efectu. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo, slo la especie, par ejemplo: Se aisl Shigella flexneri. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibiticos de utilidad clnica para tratar infecciones por enterobacterias. Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:
CLAVE en libro de trabajo (tcnico) NP N-SSE Shigella A Shigella B Shigella C Shigella D Salmonella typhi Salmonella grupo ____ Salmonella choleraesuis Arizona Yersinia S/A = susceptibilidad antimicrobiana.

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3-

RESULTADO

TEXTO (Secretaria)

Coprocultivo negativo de adulto Coprocultivo negativo de nio menor de un ao Coprocultivo positivo

No se aislan enteropatgenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli enteropatgena Se aisl Shigella dysenteriae. S/A Se aisl Shigella flexneri. S/A Se aisl Shigella boydii. S/A Se aisl Shigella sonnei. S/A Se aisl Salmonella typhi. S/A Se aisl Salmonella enteritidis del grupo ____. S/A Se aisl Salmonella choleraesuis. S/A Se aisl Arizona hinshawii. S/A Se aisl Yersinia enterocolitica. S/A

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PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS (ENTEROTEST) PARA COLECCIN DE MUESTRAS DUODENALES El objetivo de este procedimiento es obtener una muestra de la bilis del paciente para cultivar especficamente Salmonella typhi; tambin puede usarse para examinar en fresco su contenido para trofozoitos de Giardia lamblia, huevos de Clonorchis sinensis, o larvas de Strongyloides stercoralis. El pH de la parte distal de la cuerda debe ser alcalino, si lleg al duodeno. El procedimiento consiste en dar al paciente (en ayunas) una cuerda de nylon absorbente (de 90 a 140 cm para adulto y 67 cm para nios) dentro de una cpsula, la cual debe tragarse con agua. Un extremo de la cuerda se pega por fuera a la cara del paciente con cinta adhesiva y el otro distal debe llegar hasta el duodeno, donde permanece cuatro horas para empaparse de bilis. El paciente slo debe beber agua, mnimo un vaso por hora. Procedimiento: 1El mdico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una traccin rpida pero suave. Luego cortar con tijeras estriles la punta de la cuerda (amarilla por la bilis), a manera de que caiga aspticamente en un tubo o botellita con caldo tetrationato. El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra para el aislamiento de Salmonella. Agitar e incubar 24 horas a 36 C. Despus de la incubacin, inocular por estras una asada del caldo tetrationato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aerbicamente a 36 C. Trasladar las colonias lactosa-negativo (incoloras) a TSI, LIA, urea y citrato, incubar 18 a 24 horas a 36 C. Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antgeno Vi y grupo D, segn ya se explic.

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5-

Medio de cultivo: Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante segn las instrucciones en el frasco de la base en polvo, as: 56

Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, calentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45 C y luego agregar: 10 ml de solucin de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml de solucin acuosa de verde brillante al 0.1 %. Medir 10 ml en frasquitos estriles (de los que vienen con el medio Thayer Martin) o tubos estriles con tapn de rosca. El medio debe quedar verde con precipitado blanco.

LA EPIDEMIOLOGA Y ETIOLOGA DE LA DIARREA


Adaptado de:

World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program. Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology of Diarrhea. Geneva. Usualmente se define a la diarrea como la eliminacin de tres o ms evacuaciones intestinales lquidas o blandas en un perodo de 24 horas. Existen tres tipos de diarrea: Diarrea aguda, lquida Disentera Diarrea persistente El problema que representan las enfermedades diarricas La diarrea es una de las causas principales de enfermedad y muerte en los nios menores de 5 aos de los pases en desarrollo, en donde ocurren aproximadamente 1.3 mil millones de episodios y 3.2 millones de muertes al ao por diarrea. En promedio, estos nios padecen 3.3 episodios de diarrea por ao, pero en algunas reas, el promedio pasa de nueve episodios por ao. Es comn que donde los episodios son frecuentes, los nios pasen el 15% de sus vidas con diarrea. Dentro de este grupo de edad, los nios menores de dos aos, son los que sufren la mayor morbilidad y mortalidad. Se estima que aproximadamente 80-90% de las muertes por diarrea ocurre en nios menores de dos aos. La causa principal de muertes por diarrea aguda es la deshidratacin, la cual resulta por la prdida de lquidos y electrolitos. Otras causas importantes de muerte son disentera, desnutricin y otras infecciones serias, como neumona.

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Disentera Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible en las heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importantes incluyen anorexia, prdida de peso rpida y daos a la mucosa intestinal causados por la bacteria invasora. La mayora de los casos de disentera aguda en nios, son causados por Shigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentemente Escherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoeba histolytica, puede causar disentera seria en adultos jvenes, pero es una causa muy rara en nios. En alrededor de 90% de los casos de infeccin intestinal por Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas. Los pacientes con disentera causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga), estn a menudo clnicamente muy enfermos. Este sndrome clnico casi siempre incluye fiebre alta, sntomas txicos y clicos abdominales intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se acompaa de complicaciones graves, como el sndrome hemoltico urmico. Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por este enteropatgeno. Esto ocurri en Centroamrica en los aos 1969 y 1970. La terapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad y duracin de la disentera y de la fiebre, as como la excrecin del patgeno. EPIDEMIOLOGA Transmisin de los agentes que causan diarrea Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminan por la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestin de agua o alimentos contaminados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales. Varios comportamientos especficos de las personas contribuyen a la propagacin de los enteropatgenos y por consiguiente incrementan el riesgo de sufrir diarrea. Estos incluyen: Falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4-6 meses de vida. 58

Usar biberones para alimentar a los nios. Guardar alimentos a temperatura ambiente. Beber agua contaminada con bacterias fecales. No lavarse las manos despus de defecar, despus de desechar las heces de los nios o de limpiar los paales y antes de preparar o servir alimentos. No desechar higinicamente las heces (incluyendo las de los lactantes).

Epidemias En las reas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el ao, aumenta su frecuencia durante los meses secos y ms fros, mientras que las diarreas bacterianas aumentan durante la estacin lluviosa y ms clida. La incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrn estacional de la diarrea aguda lquida. Hay dos enteropatgenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 que provocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todos los grupos de edad son altas. Desde 1961, el clera causado por el biotipo Eltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a pases de Asia, el Mediterrneo Oriental, Africa, y a algunos pases de Europa. Desde 1991, ha causado epidemias en prcticamente todos los pases de Amrica Latina y casos sin diseminacin secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo perodo de tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias de disentera grave en Centro Amrica (69-70) y, ms recientemente, en Africa Central y Sur de Asia. ETIOLOGA Enteropatgenos importantes: Virus: Rotavirus Bacterias: Escherichia coli enterotoxignica Shigella spp. Campylobacter jejuni Vibrio cholerae 01 Salmonella spp. Protozoos: Cryptosporidium parvum

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Patgenos frecuentemente identificados en nios con diarrea aguda, atendidos en centros de tratamiento, en pases en desarrollo
Patgeno Porcentaje de casos Antimicrobianos recomendados en base clnica* Ninguno*** Ninguno

Virus Bacterias

Rotavirus Escherichia coli enterotoxignica Shigella

15-25 10-20

5-15

Trimetoprimsulfametoxazol, cido nalidxico Ninguno Tetraciclina, Doxiciclina, otros Ninguno*** Ninguno

Campylobacter jejuni Vibrio cholerae 01

10-15 5-10**

Salmonella (no tifoidea) Escherichia coli enteropatgena Protozoos Ningn patgeno aislado Cryptosporidium parvum

1-5 1-5

5-15 20-30

Ninguno*** Ninguno***

* ** ***

Para cepas sensibles En reas endmicas; puede ser ms alto durante epidemias Ningn antimicrobiano efectivo

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Otros patgenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en nios en los pases en desarrollo es mnima, o no est bien definida. Estos incluyen: Virus: agente Norwalk adenovirus entricos Bacterias: Aeromonas hydrophila Escherichia coli enteroagregativa Escherichia coli enteroinvasora Escherichia coli enterohemorrgica Plesiomonas shigelloides Vibrio cholerae que no es 01 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Protozoos: Giardia lamblia Entamoeba histolytica Isospora belli Cyclospora cayetanensis Mecanismos Patognicos de los Agentes Etiolgicos de Diarrea Los enteropatgenos causan diarrea por varios mecanismos, algunos de los cuales se revisan a continuacin. Virus Los rotavirus se replican dentro de las clulas epiteliales maduras que cubren la porcin superior de las vellosidades intestinales, causando destruccin celular y acortamiento de las vellosidades. Bacterias Adherencia a la mucosa Produccin de toxinas que causan secrecin intestinal Invasin de la mucosa Protozoos Adherencia a la mucosa Invasin de la mucosa

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Shigella Shigella es la causa ms importante de disentera, encontrndose en alrededor de 60% de todos los episodios y en prcticamente en todos los episodios graves de esta forma de diarrea; tambin pueden causar diarrea lquida. S. flexneri es la especie ms prevalente en pases en desarrollo, sin embargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable de la disentera ms grave. La destruccin tisular y posiblemente la diarrea lquida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina de Shiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriae tipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisin de persona a persona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace con antimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es comn la resistencia antimicrobiana. Puede haber resistencia a mltiples antimicrobianos especialmente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos ms tiles son trimetoprim-sulfametoxazol y cido nalidxico; en algunas reas tambin es efectiva la ampicilina.

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CAPTULO 4 COPROCULTIVO PARA CLERA


PROPSITO: Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria causante del clera. Esta bacteria se adquiere por ingestin de bebidas o alimentos contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a la produccin de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos. En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la forma clnica del clera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a agua de arroz) y vmitos. Esto provoca en el paciente deshidratacin severa que puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratacin y antibiticos. El clera ha sido endmico en la India y en otros pases desde la ms remota antigedad. En 1961 se inici la sptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991 apareci en Per y a partir de all se ha diseminado a varios pases de Latinoamrica, donde ahora es una infeccin endmica, ms frecuente durante la poca lluviosa. Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 segn su antgeno somtico), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que an no se ha detectado en Latinoamrica. Generalmente si la epidemia se inicia con el serotipo Inaba, despus de algn tiempo se transforma en Ogawa, debido a cambio de antgenos. Esta clasificacin slo tiene inters epidemiolgico. Existen dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clsico. En Latinoamrica, durante la presente pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o asintomticos; tambin sobrevive ms tiempo en el medio ambiente, y es ms resistente a los agentes qumicos. El tratamiento principal del clera es evitar la muerte por deshidratacin, por medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por va oral y si es necesario por va intravenosa. El tratamiento con antibiticos ayuda a la recuperacin, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, adems evita portadores de la bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en nios el trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la furazolidona. 63

El diagnstico definitivo de clera se establece slo por la demostracin de V. cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indicativo de clera, pero no se considera un procedimiento diagnstico exacto. MUESTRA: Las muestras adecuadas para efectuar el diagnstico bacteriolgico de el clera son: heces diarricas (principalmente con apariencia de agua de arroz), hisopo rectal o vmitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horas de la enfermedad y previo a la administracin de antibiticos. Si las muestras de heces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas), deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plstico bien limpio, de preferencia estril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocularse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, que debe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeracin. En el medio hospitalario no es necesario usar intilmente el medio de transporte Cary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para su cultivo directo inmediato. PROCEDIMIENTO: Existen muchas variantes en la marcha bacteriolgica a seguir para el aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es, en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pg. 67). V. cholerae 01 puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejores si previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamado agua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiolgico del clera prolifera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), y otras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivos casi puros. 1. Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina, con un hisopo estril bien cargado de heces o vmito. Sacar el hisopo y agitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapn ligeramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36 C. Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey, XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella y Salmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dos gneros, clnicamente pueden semejar clera. 64

2.

3.

Despus del tiempo crtico de incubacin del APA, retirar el tubo cuidadosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo, tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no ms de 5 mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar sangre de carnero al 5%. Incubar aerbicamente 18 a 24 horas a 36 C.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventualmente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinnimo: sucrosa). Contiene dos indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colonias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, tambin producen colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia epidemiolgica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positivo, tambin pueden producir colonias amarillas, pero de morfologa distinta a las que produce V. cholerae 01. 1. Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de colonias grandes (de 2 a 3 mm de dimetro), de color amarillo canario (sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colonias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selectivo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria. Si hay crecimiento tpico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desarrollar un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incoloras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolticas. En el rea de la caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona de decoloracin del medio que semeja hemlisis; probablemente se debe al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemlisis especfica a los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01 del biotipo eltor; en todo caso, es una caracterstica adicional que ayuda a sospechar la presencia de la bacteria en este medio. Aglutinar las colonias tpicas y aisladas del agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las 65

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3.

colonias pequeas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las colonias son chiclosas, muy adherentes al medio, y no se pueden suspender bien en el antisuero, por lo que la aglutinacin slo es confiable a partir del crecimiento en agar sangre de carnero. 4. Si se obtiene una reaccin de aglutinacin positiva, franca e inmediata, generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado la presencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento tpico del agar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipo Ogawa; generalmente la aglutinacin es ms fina, pero evidente. Esto ltimo no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva; debe hacerse en caso de duda o confirmacin. Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01, se deber seleccionar una colonia tpica del TCBS, y subcultivar en TSI y LIA. En estos medios la reaccin despus de 18 a 24 horas de incubacin, generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni cido sulfhdrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratorio de referencia donde se efecta la confirmacin. Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibiticos, segn el mtodo de Bauer-Kirby. Slo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina y trimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algn otro antibitico, son optativos. Interpretar los dimetros de los halos de inhibicin igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensable, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con 50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibicin a este antibitico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, pertenece al biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamrica, ya que el biotipo clsico no est actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptible a polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia pertinente, para que confirme este hallazgo de inters nacional. El biotipo eltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.

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6.

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Fig. 7 MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01


Muestras:

Heces lquidas

Hisopo rectal

Vmitos

1. Inocular con hisopo estril bien cargado un tubo con APA, descartar el hisopo y agitar o 2. Incubar 5-6 horas a 36 C Vibro cholerae en la superficie del APA 3. Tomar inculo de la superficie del APA 4. Sembrar TCBS y agar sangre de carnero (ASC) 5. Incubar 18-24 horas o a 36 C ASC Colonias: - Grandes - No hemolticas

APA

No agitar

6. Interpretar simultneamente TCBS Colonias: - Amarillas - Grandes - Planas

Sembrar antibiograma

Hacer frote Gram: bacilos gram-negativo, algunos curvos. Aglutinar, si positivo dar informe STAT STAT: Vibrio cholerae 01

Nota: El diagnstico definitivo se puede obtener en 24 horas


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INFORME: En el caso de clera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica plenamente usar una tcnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para ahorrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el reporte de un cultivo positivo. Se recomienda informar as, lo ms pronto posible, y al lugar ms indicado: 1. Inmediatamente despus de una prueba de aglutinacin franca a partir del agar sangre de carnero: Se aisl Vibrio cholerae O1. Despus de aglutinacin positiva con antisuero polivalente anti- V. cholerae 01 y luego aglutinacin positiva con antisuero de serotipo Ogawa o Inaba: Se aisl Vibrio cholerae 01, serotipo Inaba (u Ogawa). Despus de interpretar la prueba de susceptibilidad, pero posteriormente a haber enviado un reporte preliminar: Se aisl Vibrio cholerae 01, serotipo Ogawa (o Inaba), biotipo eltor. Susceptible a: ... ; Resitente a: ...

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3.

FRMULAS: 1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA): Peptona ...................................................................... 10 gramos Cloruro de sodio. ...................................................... 10 gramos Agua destilada .......................................................... 1,000 ml Ajustar pH final a 9.0-9.2 con hidrxido de sodio 1N. Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapn de rosca. Autoclavear 15 minutos a 121 C (15 libras de presin por pulgada cuadrada).

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2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR: Tioglicolato de sodio ................................................ 1.5 gramos Fosfato dibsico de sodio ........................................ 1.1 gramos (Na2HPO4) Cloruro de sodio ....................................................... 5.0 gramos Agar. ........................................................................... 5.0 gramos Agua destilada .......................................................... 991.0 ml Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento, y con agitacin constante. Enfriar a 50 grados centgrados, y adicionar 9 ml de cloruro de calcio al 1%, recientemente preparado (0.1 gramos de cloruro de calcio + 10 ml de agua). Ajustar pH a 8.4 con hidrxido de sodio 1N, y distribuir 6 ml en tubos de 13x100 con tapn de rosca, a manera de dejar un pequeo espacio de aire entre el tapn y el medio. Autoclavear a 100 grados centgrados en Bao de Mara hirviendo, por 15 minutos. Enroscar bien el tapn y almacenar en refrigeracin y oscuridad.

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CAPTULO 5 COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni


PROPSITO: Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. A partir de 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarrea humana. C. jejuni es ms frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estudios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de nios menores de cinco aos de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10 por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Latino-amrica; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos vara del 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de un medio de cultivo y condiciones de incubacin especiales, su bsqueda no se efecta rutinariamente, lo cual debera hacerse debido a su importancia epidemiolgica. Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o en forma de S. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la clula, lo que le proporciona un movimiento rpido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manera de dardo. Es una bacteria estrictamente microaeroflica, oxidasa-positivo, que no fermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centgrados, pero se utiliza su capacidad diferencial (termfila) de crecer mejor a 42 grados centgrados, para su aislamiento. La infeccin intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal, fiebre y ocasionalmente vmitos. Puede haber sangre macroscpica en las heces, especialmente en las muestras peditricas. La infeccin se adquiere por va oral, al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y leche no pasteurizada. La infeccin puede adquirirse de otro humano, o ser una zoonosis, pues tambin puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuente en animales domsticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, adems de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis sptica, meningitis y otras infecciones. El diagnstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente por la observacin directa de bacterias con movimiento de dardo en las heces con 71

campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abundantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnstico definitivo se establece por medio del aislamiento e identificacin de C. jejuni. MUESTRA: En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientos especializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes de dos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas con orina. Tambin puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculacin se efecta inmediatamente. CONDICIONES NECESARIAS: El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir los siguientes aspectos: 1. Un agar sangre de carnero selectivo, recientemente preparado. Se recomienda el Agar Skirrow modificado, que contiene como inhibidores: vancomicina (10 mg/lt), polimixina-B (2,500 UI/lt) y trimetoprim (5 mg/lt). Idealmente debe prepararse con la siguiente base: Blood Agar Base No. 2 (Oxoid), adicionada de 10% de sangre de carnero desfibrinada/estril. La sangre de carnero remueve formas txicas de oxgeno en el medio de cultivo. La mezcla de antibiticos que hacen al medio selectivo para C. jejuni puede obtenerse comercialmente. Incubacin en microaerofilia estricta. Idealmente: 5% de oxgeno, 10% de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno. La forma ms fcil y efectiva de lograr esta atmsfera, es usar el jarro Gas-Pak (BBL), sin cataltico ni indicador. Segn las instrucciones del productor, usar el sobre rojo generador de anaerobiosis (BBL). La incubacin en jarro con candela no es adecuada, pues proporciona una atmsfera con demasiado oxgeno (12%-17%) para permitir el crecimiento de C. jejuni. Incubacin a 42 C por 48 horas. Inhibe la microbiota intestinal, y permite el crecimiento termfilo de Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis.

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PROCEDIMIENTO: 1. Analizar microscpicamente la muestra fecal, para buscar la presencia de leucocitos polimorfonucleares. Si no los hay, no vale la pena efectuar el cultivo para C. jejuni, pues las posibilidades de aislarlo son muy bajas. Analizar macroscpicamente la muestra fecal, y tomar con asa o hisopo estril, las porciones con moco, sangre o pus. Inocular por estras dos cajas de Agar Skirrow, y una de agar chocolate. Inmediatamente colocar las tres cajas en atmsfera microaeroflica, por medio del jarro Gas-Pak sin cataltico ni indicador, con sobre generador de anaerobiosis (BBL). Es necesario quitar la canastilla con paladio iridiado (cataltico) del jarro. Incubar a 42 grados centgrados exactos, por no menos de 48 horas.

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3.

4.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: 1. Retirar las cajas de la incubadora y del jarro Gas-Pak. Con microscopio estereoscpico, o al menos con lupa, examinar detenidamente las colonias aisladas. Buscar colonias con la siguiente morfologa tpica: hmedas o ligeramente mucosas, muy aplanadas, blanco-grisceas o incoloras, no hemolticas, rodeadas de un velo de crecimiento que se esparce sobre el agar circundante a la colonia, bordes irregulares y poco perceptibles. Menos frecuentemente las colonias son ms secas, convexas y amarillentas; con incubacin prolongada se transforman en rugosas. Si no se encuentran colonias tpicas, incubar por otras 24 a 48 horas antes de descartar el cultivo como negativo. De una colonia aislada con morfologa tpica, hacer inmediata y cuidadosamente un frote (de preferencia del velo circundante), en una pequea gota de agua. Colorear con Gram (dejar la safranina por tres minutos, pues la bacteria se tie plidamente), o con fuchsina bsica al 1% por 10 a 20 segundos, despus de fijar al calor. Si el frote presenta bacilos gram-negativo curvos, algunos en forma de gaviota, en forma de S, o en espiral (ondulante), presuntivamente se ha aislado Campylobacter jejuni. Reportar este hallazgo de inmediato. En los cultivos expuestos al aire predominan las formas cocoides. 73

2.

3.

4.

De otra colonia tpica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmsfera microaeroflica a 42 C, segn ya fue descrito. El cultivo puro que resulta del subcultivo en Skirrow o agar sangre de carnero generalmente es una capa blanquecina de crecimiento; sirve para confirmar de nuevo la morfolofa bacteriana tpica, y efectuar las siguientes pruebas confirmativas: Oxidasa y catalasa: ambas deben ser positivas, y se consideran como suficientes. Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis dan ambas pruebas positivas. El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin cido sulfdrico. No es indispensable, pero si existen facilidades, hacer la prueba de hidrlisis del hipurato. Es positiva para C. jejuni, y negativa para C. coli. C. jejuni es susceptible a un disco de 30 microgramos de cido nalidxico, mientras que C. laridis es resistente; esta diferenciacin tampoco se considera indispensable. Eventualmente algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden crecer en el medio Skirrow microaeroflico/termfilo, sin embargo, stas se diferencian por su pigmento verdoso y su olor caracterstico.

5.

INFORME: Al detectar la morfologa bacteriana tpica en las colonias que desarrollan a las 48 horas de incubacin, informar: Se aisl Campylobacter jejuni, confirmacin pendiente. Al efectuar las pruebas confirmatorias, reportar: Se aisl Campylobacter jejuni, se recomienda considerar el tratamiento con eritromicina. 74

CAPTULO 6 INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori


PROPSITO: Demostrar por medio de observacin, cultivo, o la tcnica indirecta de ureasa, la presencia de Helicobacter pylori. Esta bacteria se ha reconocido recientemente como agente causal de gastritis crnica activa tipo B, y predispone a la produccin de lceras ppticas. Anteriormente se clasificaba en el gnero Campylobacter, pero debido a varias diferencias en su estructura, composicin y susceptibilidad antimicrobiana, a partir de 1989, se clasifica en el gnero Helicobacter. Es un bacilo gram-negativo helicoidal o espiral, que presenta movilidad en forma de dardo debida a sus flagelos. Es una bacteria microaeroflica, cuyo crecimiento ptimo es a 36 C. Se observa o aisla a partir de biopsias de la mucosa gstrica. Su deteccin tiene actualmente mucha importancia clnica. El mecanismo ms probable para explicar la patologa gstrica que causa, es su gran actividad sobre las clulas parietales del estmago, lo que induce la produccin de gran cantidad de cido clorhdrico. Adems, la potente enzima ureasa que produce H. pylori, degrada la mucina del moco gstrico y libera gran cantidad de amonio. En Latinoamrica en general, la gastritis es una enfermedad muy frecuente. Se sabe que el 70 por ciento la poblacin guatemalteca sufre de infeccin gstrica asociada a H. pylori, lo que indica la importancia de su bsqueda en nuestro medio. Esta bacteria es susceptible a eritromicina, tetraciclina, penicilina, gentamicina, cefalotina, clindamicina, ciprofloxacina y otros antibiticos; tambin es susceptible a las sales de bismuto que contienen varios medicamentos contra la gastritis. Es resistente a las sulfonamidas, cido nalidxico y trimetoprim-sulfametoxazol. MUESTRA: La muestra siempre debe ser obtenida por el gastroenterlogo por medio de gastroscopa. Las biopsias, cepillados o aspirados, se toman por el gastroscopio, de antro pilrico, de cuerpo y de fondo del estmago. Las biopsias producen los resultados ms confiables. Tambin puede usarse la tcnica de la cuerda encapsulada o Enterotest para extraer moco gstrico. 75

OBSERVACIN DIRECTA: Puede efectuarse por medio de la observacin de la bacteria en fresco (en preparaciones con solucin salina), con microscopa de contraste de fases (o campo oscuro), o en frotes coloreados. En el caso de la observacin en fresco y contraste de fases, se buscan bacilos curvos muy mviles con el tpico movimiento en forma de dardo. La coloracin de Gram no se considera adecuada para teir H. pylori. Lo ms usado es la deteccin de la bacteria en el laboratorio de Patologa, donde se preparan cortes y frotes por aposicin de la biopsia, y se tien con Giemsa modificado, hematoxilina-eosina o la compleja impregnacin con sales de plata segn Warthin-Starry. Se buscan abundantes bacilos curvos o helicoidales directamente sobre la mucosa. PRUEBA DE UREASA: H. pylori produce abundante ureasa, enzima que acta sobre el sustrato urea, con produccin de abundante amonaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera presuntiva. Proceder as: 1. Macerar aspticamente la biopsia, idealmente en macerador pequeo de vidrio, con 0.3 ml de solucin estril de glucosa al 20%. Inocular masivamente un tubo de caldo urea, o agar urea de Christensen. Incubar a 36 grados centgrados por pocas horas. Se considera como una prueba positiva cuando el medio vira rpidamente a color rosado fuerte, al alcalinizarse.

2. 3. 4.

CULTIVO: El aislamiento de H. pylori por medio de cultivo, constituye la confirmacin definitiva de este diagnstico bacteriolgico. Para efectuarlo, se recomienda proceder as: 1. 2. Macerar la biopsia con 0.3 ml de solucin estril de glucosa al 20%. Inmediatamente inocular 0.03 ml del macerado en dos cajas de agar chocolate y dos cajas de Agar Skirrow. Diseminar por estras. 76

3.

Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin cataltico en la tapadera, ni indicador de anaerobiosis. Introducir segn las instrucciones del productor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el cataltico presente, proporciona una atmsfera microaeroflica adecuada para el cultivo de H. pylori. Incubar a 36 grados centgrados por cinco das. Despus de la incubacin prolongada, buscar con ayuda del microscopio estereoscpico o lupa, colonias con las siguientes caractersticas: muy pequeas (0.5 mm de dimetro, no mayores de 2 mm), circulares, translcidas y no pigmentadas. Efectuar observacin en fresco con contraste de fases o campo oscuro y/o frote Gram modificado (fucsina bsica al 1% como contraste). Si se observan bacterias con el tpico movimiento en forma de dardo y bacilos gram-negativo curvos o espirales, el cultivo es compatible con H. pylori. Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes: Ureasa: positivo fuerte. Catalasa: positivo Oxidasa: positivo Acido sulfhdrico en TSI: negativo (optativo) Otra prueba muy especfica pero no indispensable es la hidrlisis del indoxil acetato.

4. 5.

6.

INFORME: 1. Si la observacin directa arroja los resultados esperados, informar: Se observan abundantes bacilos de morfologa compatible con Helicobacter pylori. Si la prueba de ureasa es positivo fuerte en pocas horas, informar: Prueba de ureasa rpida: positivo fuerte, muy indicativa de la presencia de Helicobacter pylori. Si el cultivo presenta los resultados de observacin directa y pruebas confirmatorias con los resultados esperados, informar: Se aisl Helicobacter pylori.

2.

3.

77

CAPTULO 7 UROCULTIVO
PROPSITO: El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o urocultivo se efecta para demostrar la presencia de un nmero significativo de bacterias. En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razn, el criterio para interpretar el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado criterio de Kass, un nmero de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (unidades formadoras de colonia por mililitro de orina) se considera infeccin urinaria verdadera, es decir, es un recuento significativo. A diferencia de otros cultivos bacteriolgicos, las bacterias que causan la infeccin urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rpido. Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son las enterobacterias (bacilos gram-negativo). Escherichia coli es sin duda la bacteria que con ms frecuencia se aisla de urocultivos positivos, luego: Klebsiella spp. Enterobacter spp. Proteus spp. Pseudomonas aeruginosa (no es enterobacteria) De menor importancia son los cocos gram positivo: Enterococcus spp. Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes y Streptococcus sp. (raros) Staphylococcus epidermidis (puede ser contaminacin) Staphylococcus saprophyticus (puede ser contaminacin) Las infecciones mixtas causadas por dos o ms especies bacterianas son raras, por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminacin. La demostracin de la piuria (presencia de leucocitos polimorfonucleares en el sedimento urinario) y la bacteriuria (bacterias en la orina), son ambos de gran importancia para establecer el diagnstico de infeccin urinaria. 79

MANIFESTACIONES CLNICAS Y MICROORGANISMOS ASOCIADOS CON VARIOS TIPOS DE INFECCIONES URINARIAS MANIFESTACIONES CLNICAS Agudo: fiebre, calofros, dolor de cintura posterior, nusea, vmitos, cilindros leucocitarios, invasin tisular Crnico: asintomtico, moderado o agudo, lesiones, cilindros leucocitarios *Bacilos gram-negativo Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulasa-negativo Candida spp. (hongo) Mycobacterium spp. Mycoplasma hominis Sintomtico: disuria, frecuencia Asintomtico Disuria, frecuencia *Escherichia coli *Otros bacilos gram-negativo Enterococcus spp. Staphylococcus coagulasa-negativo *Escherichia coli Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus saprophyticus Trichomonas vaginalis (protozoo) Virus Herpes simplex tipo 2 Candida albicans (hongo) *Bacilos gram-negativo Ureaplasma urealyticum Chlamydia trachomatis MICROORGANISMOS ASOCIADOS CON LA INFECCIN CONTEO SIGNIFICATIVO (UFC/ml) Mayor o igual a 100,000 (criterio de Kass)

TIPO DE INFECCIN

Tracto urinario superior: pielonefritis

80 Agudo: fiebre, calofros, dolor de espalda

Tracto urinario inferior: cistitis

Mayor o igual a 100,000 (criterio de Kass) Mayor o igual a 100

Uretritis

Prostatitis

Mayor o igual a 100

* Aislamiento comn.

Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.

TOMA DE LA MUESTRA: Si en algn examen bacteriolgico la toma de la muestra es crucial, para obtener un resultado de cultivo con correlacin clnica, es en el urocultivo. El meato urinario, o sea el agujero de salida de la uretra (tubo que desagua la vejiga), est siempre colonizado por bacterias saprfitas, tanto en el hombre como en la mujer. Por esta razn, los genitales deben desinfectarse antes de tomar la muestra, segn se explica a continuacin. Tomar la muestra de orina para urocultivo despus de dos horas sin que el paciente haya orinado. Si la muestra se toma antes, la orina no ha pasado suficiente tiempo en la vejiga, para alcanzar cantidades significativas. TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE: 1. Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estril empapada en jabn antisptico no irritante. Remover el jabn con otra gasa estril, empapada en agua estril. Pedir al paciente que orine directamente en la taza del sanitario. Despus de transcurridos unos 3 a 5 segundos, destapar rpidamente pero con cuidado un frasco estril de boca ancha y tomar al vuelo una muestra de orina de la parte central de la miccin. Se deja correr la primera porcin de orina para que remueva las bacterias de la parte anterior del meato urinario, que contaminara el urocultivo. Tapar rpidamente el frasco. Si no es posible inocular el urocultivo antes de una hora de obtenida la muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeracin se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un mximo de 48 horas.

2. 3.

4.

TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER: En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la muestra, ya que sus genitales no estn expuestos y estn abundantemente colonizados por bacterias. Proceder as: 1. Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las piernas abiertas. Con los dedos ndice y medio de la mano izquierda debe separarse los labios genitales mayores. 81

2.

Con una gasa empapada en jabn antisptico no irritante limpiar bien toda el rea y luego remover el jabn con otra gasa empapada en agua estril. Obtener la muestra de orina al vuelo dejando al igual que en el caso del hombre, que corra el chorro de orina unos segundos y luego tomar de la porcin central de la miccin. Tapar rpidamente. Sembrar antes de una hora o refrigerar la muestra.

3.

4.

TOMA DE UROCULTIVO EN NIOS PEQUEOS: Con los nios que an no saben hablar para comprender instrucciones y orinar a voluntad, debe procederse as: 1. En los nios varones desinfectar bien, con jabn antisptico no irritante, todo el pene y el rea genital. En las nias desinfectar bien los labios mayores y el rea genital que los rodea. Quitar bien el jabn con gasa y agua estril, luego secar finalmente con una gasa estril seca. Pegar una bolsita de plstico estril y descartable, especial para tomar urocultivos infantiles. En los nios tener la precaucin de introducir todo el pene en el orificio del llenado y en las nias que el agujero de la bolsita quede pegado al centro por donde saldr la orina. Colocar los paales en su lugar y fijar la bolsita en su lugar con tiras de masking-tape. Generalmente se le pide a la madre o a quien lleve al nio al laboratorio, que espere hasta que orine. Algunos procedimientos que aceleran la miccin son: dar bebidas (agua, leche, etc.), aplicar presin sobre la vejiga. Tambin se puede estimular al nio segn el reflejo de Castaeda: cargar al nio boca abajo con la mano derecha y con el ngulo que forma el dedo pulgar doblando de la mano izquierda hacer presin en forma de rayas en la parte baja de la espalda del nio.

2.

3.

PUNCIN SUPRA-PBICA (PSP): Es la obtencin de la muestra de orina por medio de puncin directa a la vejiga, con una aguja larga. Por ser un procedimiento delicado que conlleva algunos riesgos debe hacerse slo por el pediatra. Se debe efectuar slo en estos casos: 82

Malformacin anatmica que evite la miccin normal del nio, causando contaminaciones. Urocultivo aerobio negativo varias veces, continan los sntomas, el sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infeccin urinaria causada por bacterias anaerobios.

Nota importante: Jams introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios aos que esta tcnica cay en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que estn colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la primera orina de la maana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse un mnimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta nmeros significativos dentro del sistema urinario. PROCEDIMIENTO: 1. Ya que la muestra ha sido colectada siguiendo estrictamente las instrucciones anteriores, sembrar la orina en dos medios de cultivo segn la tcnica del asa calibrada usada en la Clnica Mayo (Rochester, Minnesota, EUA). Los dos medios de cultivo a utilizar son: Agar sangre de carnero al 5%: crecen la mayora de bacterias. MacConkey: crecen slo bacilos gram-negativo aerobios (enterobacterias) pues es selectivo y diferencial. Alternativamente usar solamente el medio CLED si el microbilogo a cargo conoce su interpretacin, la cual puede ser confusa, por lo que no se recomienda. Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio) que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador vortex, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fra en la orina, justamente por debajo de la superficie. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja y pasando por el centro. Flamear e inocular en igual forma el MacConkey. Alternativamente, sembrar una biplaca de agar sangre de carnero y MacConkey, con 83 Agar sangre carnero MacConkey

2.

3.

Biplaca para urocultivo

Fig. 8 MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO


Muestra Orina colectada al vuelo

1. Agitar 2. Tomar 0.001 ml con asa calibrada de platino, verticalmente y justamente por debajo de la superficie INOCULAR DE RUTINA BIPLACA

ASC

MacConkey Medios: 1o: Agar sangre de carnero (ASC)

2o. MacConkey 4. Con asa corriente flameada y fra, estriar perpendicularmente toda la caja

3. En ambos medios, primero una estra longitudinal con asa de platino calibrada (0.001 ml)

Idealmente, incubar el agar sangre en jarro con candela a 36o C


84

Incubar aerbicamente a 36o C

0.001 ml en cada mitad segn la foto. Esto permite el ahorro de cajas de Petri. 4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inculo de orina, por ambas cajas, haciendo estras tupidas y perpendiculares a la estra dejada por el asa calibrada. Con el objeto de ahorrar cajas de Petri, alternativamente puede usarse una caja dividida por la mitad o biplaca, con agar sangre de carnero en un lado y MacConkey en el otro; estriar de la misma manera. Idealmente, incubar el agar sangre a 36 C en jarro de boca ancha con un trozo de papel absorbente hmedo y una veladora o candela encendida, cerrar bien. Incubar el MacConkey sin jarro en la incubadora a 36 C.

5.

5.

6.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: 1. Despus de incubar ambas cajas durante 18 a 24 horas, interpretar resultados de ambas cajas simultneamente y con buena luz. Tericamente cada bacteria origina una colonia en la superficie del medio, pero esto no es estrictamente cierto, pues cadenas o grupos de bacterias tambin pueden originar una sola colonia. Por esta razn se deben contar y reportar unidades formadoras de colonias o UFC. La cantidad de colonias, en el agar sangre debe ser igual o muy similar en el MacConkey. Si en el MacConkey crece una enterobacteria, en el agar sangre tambin deber aparecer, es decir, debe haber correlacin entre ambas cajas. De all se deriva la importancia de interpretar el crecimiento de ambas cajas simultneamente y de usar un medio selectivo/diferencial y otro rico no inhibidor, cuando se trata de una bacteria grampositivo, slo crece en agar sangre. Contar el nmero de colonias presentes y multiplicar por 1000, si se us el asa calibrada de 0.001 ml. Multiplicar por 100 si se utiliz una asa calibrada de 0.01 ml. Ejemplos con asa de 0.001 ml:

2.

3.

85

No. colonias contadas 25 78 100 en adelante 4.

UFC/ml de orina 25,000 78,000 ms de 100,000

En la mayora de urocultivos positivos, se observa el crecimiento de 100 ms o colonias rojas (lactosa-positivo), brillantes pero no mucosas en la superficie del MacConkey, con correlacin en el agar sangre.

En este caso informar presuntivamente:


CLAVE : (en libro de registros) E. coli ms de 100,000 UFC /ml. S/A (susceptibilidad antimicrobiana) TEXTO DEL INFORME:

Se aisl Escherichia coli, ms de 100,000 UFC /ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.

De una colonia tpica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para confirmar la identificacin presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la misma colonia y otras idnticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o antibiograma, segn la tcnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de E. coli fermentadoras lentas de lactosa y debern identificarse con TSI y LIA, no presentan diseminacin en cepas en el agar sangre. Si las colonias en el MacConkey son rojas (lactosa positivo) pero mucosas, informar:
CLAVE: Klebsiella-Enterobacter ms de 100,000 UFC /ml. S/A. TEXTO: Se aisl Klebsiella-Enterobacter ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.

Inocular TSI y susceptibilidad. La diferenciacin de estos dos gneros y de las enterobacterias en general debe hacerse por medio de pruebas bioqumicas, de preferencia con el sistema API-ATB/VITEK (Bio Meriux) o SENSIDENT (Merck). 6. Si las colonias en MacConkey son lactosa-negativo (incoloras), hay correlacin en el agar sangre (donde las colonias son grandes, beta 86

hemolticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o gipil nuevo (telas tpicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular para confirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar:
CLAVE: Pseudomonas aeruginosa ms de 100,000 UFC /ml. S/A. TEXTO: Se aisl Pseudomonas aeruginosa, ms de 100,000 UFC/ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.

Si las colonias son lactosa-negativo (incoloras) en MacConkey, no huelen a perraje o gipil nuevo, y en el agar sangre de carnero presentan diseminacin en capas, inocular TSI, LIA y urea y susceptibilidad, informar:
CLAVE: Proteus sp. ms de 100,000 UFC ml. S/A. TEXTO: Se aisl Proteus sp. ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.

Despus de 18 a 24 horas de incubacin a 36 C de las pruebas de identificacin interpretar para confirmar su reporte inicial con las reacciones en TSI, LIA y urea segn el Captulo del coprocultivo. Notar reaccin roja (R) en la superficie de LIA y urea positivo para el gnero Proteus. 8. Los cocos gram-positivo no crecen en MacConkey, por lo que aparecen formando colonias slo en el agar sangre. Para tomarlos en cuenta y reportarlos como agentes causantes de infeccin urinaria deben aparecer en cultivos puros en el agar sangre. Identifique as:

Primero notar la presencia de hemlisis alrededor de cada colonia. Hemlisis es la accin causada por algunas sustancias producidas por las bacterias que destruyen total o parcialmente los eritrocitos del medio. Hay dos tipos de hemlisis, los cuales se discuten en detalle en el Captulo 8:
TIPO DE HEMLISIS Alfa Beta SE OBSERVA Un halo verde Un halo claro, del color del medio

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Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de dimetro), pueden o no ser hemolticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloracin de Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificar con dos pruebas especficas descritas en el Captulo 8: coagulasa y manitol-sal. Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibiticos para gram-positivo segn la tabla del captulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa y manitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportar slo si est presente en cantidad significativa y en cultivo puro. Streptococcus pyogenes: colonias pequeas (1 mm o menos), la hemlisis es beta, sta caracterstica es muy importante. Coloracin de Gram: cocos gram-positivo ligeramente alargados y agrupados en cadenas cortas o parejas. Identificacin especfica: ver prueba de inhibicin por disco de bacitracina en prximo captulo. Streptococcus sp. alfa hemoltico, slo debe tomarse en cuenta si se presenta en conteos altos y en cultivo puro. 9. Si no se observa ningn crecimiento a las 24 horas de incubacin, descarte las cajas y reporte as los urocultivos negativos:
CLAVE: N-24 TEXTO: Urocultivo negativo a las 24 horas de incubacin a 36 C.

No se debe perder tiempo y esfuerzo en reincubar los urocultivos rutinarios hasta las 48 horas, porque las bacterias cuasantes de infeccin urinaria son aerobios de crecimiento rpido. En casos especiales pueden efectuase urocultivos para anaerobios, hongos o micobacterias. INFORME: Deben establecerse los siguientes criterios para reportar o no los crecimientos de los urocultivos as:

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UFC/ml 10,000 - 10,000 * 10,000 - 50,000

CRITERIO PARA REPORTAR Negativo a las 24 horas de incubacin a 36 C Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de muestra y correlacin de leucocitos en el sedimento urinario. Se aisl _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el nmero de UFC contado y la especie bacteriana con su S/A). Se aisl_________ , ms de 100,000 UFC/ml. Infeccin urinaria verdadera de acuerdo con el criterio de Kass. S/A.

50,000 - 100,000

100,000 o ms

*30 a 50 por ciento de mujeres con infeccin vesical y/o uretral con disuria, urgencia y frecuencia (sndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass. En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el lmite para hacer diagnstico correcto, en asociacin ntima con el mdico tratante. (Segn Jacobo Sabbaj K., VI Congreso Centroamericano de Microbiologa, Guatemala, 5-9 de diciembre de 1983). DETECCIN DE BACTERIURIA POR LA COLORACIN DE GRAM DE ORINA NO CENTRIFUGADA: En aquellos laboratorios en donde no es posible efectuar urocultivo, este mtodo fcil y barato lo sustituye. La coloracin de Gram de orina puede detectar tanto la presencia de bacterias como de leucocitos. Proceder as: 1. En un porta-objetos de vidrio (limpio) colocar 10 l (una gota) de orina no centrifugada bien mezclada. Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrs con un crculo de crayn graso y colorear cuidadosamente con Gran. Observar con aceite de inmersin. Informar la cantidad de bacterias por campo en inmersin. La presencia de una o ms bacterias por campo de inmersin correlaciona bien con un urocultivo mayor o igual a 100,000 UFC/ml (criterio de Kass). 89

2.

3. 4. 5.

6.

La presencia de muchas clulas epiteliales (citoplasma grande y claro, ncleo pequeo) y diferentes tipos de bacterias indican contaminacin y el examen debe repetirse.

90

CAPTULO 8 CULTIVO DE GARGANTA

PROPSITO El cultivo de garganta, se efecta para demostrar la presencia de Streptococcus pyogenes (Streptococcus que pertenece al grupo A de Lancefield y es beta hemoltico). No debe llamarse orocultivo, pues este trmino significa literalmente cultivo de boca. Algunas otras bacterias mucho menos importantes en infecciones de la faringe, son: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Otras enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Estos microorganismos slo deben reportarse si predominan sobre la microbiota normal de la garganta, que es abundante y muy variada. Streptococcus agalactiae del grupo B y los estreptococos de los grupos C, F y G de Lancefield tambin son beta hemolticos (generalmente presenta poca hemlisis beta). Pueden ser agentes etiolgicos de faringitis, por lo que debe identificarse adecuadamente. Los sntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe por Streptococcus pyogenes son: dolor de garganta, ganglios linfticos del cuello agrandados, dolor de cabeza, nusea, vmitos y dolor abdominal. La infeccin de la faringe causada por virus provoca tos, secrecin nasal y nariz tapada. Sin embargo, con mucha frecuencia no es posible establecer diagnstico slo en base a observaciones clnicas. MUESTRA: No es necesario que el paciente est en ayunas; sin embargo, conviene dejar pasar 1 a 2 horas para que se vuelva a formar la secrecin que fue deglutida. Debe tomarse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibiticos. El cultivo de garganta debe tomarse con sumo cuidado. Es indispensable examinar bien las le-

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siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones: 1. Colocar al paciente sentado y pedirle que trague saliva fuertemente dos veces. Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y diga aahh. Con un bajalenguas, presionar fuertemente la lengua hacia abajo y simultneamente iluminar bien el fondo de la garganta (detrs de la vula o campanilla), con una lmpara porttil de bateras o flash light. Localizar en el fondo de la garganta y en las amgdalas (que se encuentran a los lados), las siguientes lesiones: Inflamacin (enrojecimiento) Pus (secrecin blanquecina o amarillenta) lceras blanquecinas Con un hisopo estril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos (cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.

2.

3.

4.

5.

PROCEDIMIENTO: 1. Inocular inmediatamente una caja (o placa) de agar sangre de carnero al 5%; hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja; orientar las cortadas de la orilla de la caja al centro. En este caso no flamear el asa entre cada estra (ver figura 9, pg. 90). El propsito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para alejarlos del oxgeno atmosfrico y as incrementar la hemlisis tipo beta. Anteriormente se acostumbraba enriquecer previamente por 2 horas en caldo Todd-Hewitt, pero los resultados indican que no vale la pena. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcous pyogenes, sin necesidad de hacer sub-cultivos, proceder as: Con pinza flameada y fra, colocar en la zona de ms fuerte inoculacin en el agar sangre de carnero (primera estra), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8-10 mm de distancia, colocar un 92

2.

disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibitico neomicina, por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Como el disco de bacitracina (tambin llamado taxo A) se encuentra muy cerca frecuentemente puede acelerarse la identificacin presutiva. Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30) pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (segn: Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953). Este mtodo sencillo que clarifica la interpretacin, puede aplicarse para facilitar el aislamiento, y efectuar la identificacin presuntiva rpida de Streptococcus pneumoniae. 3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel hmeda, colocar la caja con el medio arriba y luego introducir sobre una tapa de caja de Petri una veladora o candela corta encendida. Cerrar el frasco bien, sellarlo con masking-tape. La vela se apagar sola. Es conveniente aplicar (una vez a la semana) un poco de cera a la boca del frasco y a la rosca interna de la tapadera, para que sellen bien. Incubar por 18 a 24 horas a 36 C. Es indispensable el uso del jarro con candela y humedad, para obtener reacciones hemolticas correctas. Si no se usa, la recuperacin de Streptococcus pyogenes ser mucho menor.

4.

El propsito de usar sangre de carnero en el medio, es aumentar la beta hemlisis caracterstica e inhibir a Haemophilus haemolyticus que puede confundirse con Streptococcus pyogenes. Con sangre de carnero se obtiene una excelente diferenciacin entre alfa y beta hemlisis, entre otras ventajas (ver pg. 103). Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cultivos bacteriolgicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano por contener anticoagulantes, anticuerpos o antibiticos, adems del peligro potencial de la transmisin del virus del SIDA, hepatitis B, etc. No hacer frotes Gram directos de faringe, pues su interpretacin es muy difcil debido a lo abundante de la microbiota y no tiene significado clnico.

93

Fig. 9 MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA/EXUDADO FARNGEO


1. Muestra: Tomar un hisopo farngeo con buena luz y bajalenguas

vula Amgdala Farnge posterior

2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estras, con dos cortadas de 1 cm, sin flamear entre cada estra 3. Colocar sobre la primera estra, un disco de bacitracina de 0.04 unidades y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre s 4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C

Cortada 1 Disco de bacitracina Disco de neomicina


N 30

Cortada 2

5. Despus de 18-24 horas de incubacin, interpretar con buena luz. Buscar e identificar colonias beta hemolticas
94

INTERPRETACIN: La microbiota de la faringe es sumamente variada; predominan Streptococcus sp. alfa hemolticos (hemlisis verde) llamados por esta razn grupo viridans y neisserias no patgenas. Estos grupos bacterianos nunca deben reportarse. Con el objeto de no perderse en la interpretacin de este cultivo, que siempre presenta muchos tipos de colonias, utilice los siguientes criterios: 1. Tener presente que el patgeno ms importante es Streptococcus pyogenes que es beta hemoltico. Tomar la caja de agar sangre de carnero con la mano izquierda entre los dedos pulgar y medio sosteniendo por detrs de la caja con el dedo ndice. Con una lupa en la mano derecha examinar cuidadosamente la caja con buena luz transmitida (por detrs), segn la foto. En primer lugar notar si hay o no hemlisis beta (clara) en las cortadas (ver fotografa en la portada de este manual). Si la hay, buscar con cuidado colonias separadas beta hemolticas pequeas y brillantes, sospechosas de Streptococcus pyogenes. Aunque slo se observe una de estas colonias, debe tomarse en cuenta. Con una asa recta estril y siguiendo la tcnica ilustrada en la figura 6, pg. 46, trasladar una sola colonia tpica al centro de otra caja de agar sangre de carnero. Slo tocar la superficie del medio rotando el asa (no pinchar el medio). Luego con una asa en argolla estriar en tres direcciones opuestas y luego colocar con pinzas estriles en el centro del inculo un disco de bacitracina de 0.04 unidades (taxo A, o disco B segn la marca). La bacitracina es un antibitico originalmente aislado de Bacillus licheniformis. La prueba presuntiva de la inhibicin selectiva por este antibitico tiende a ser sustituida por otras pruebas. Sin embargo, se sigue usando debido a su facilidad y alto porcentaje de exactitud. Si las colonias beta hemolticas no estn aisladas, hacer una purificacin as: con una asa recta o aguja de diseccin flameada, tomar las colonias beta hemolticas con cuidado, aunque se tome de otras colonias que estn muy cercanas o adyacentes. De preferencia hacer esto bajo el microscopio estereoscpico. Trasladar el inculo dos o tres veces a un extremo de una caja de agar sangre de carnero y luego con dos asas en 95

2.

3.

4.

anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo inicial. Colocar con pinzas estriles un disco bacitracina en el inicio de la segunda estra. 5. Para interpreter correctamente los crecimientos de cultivos de exudados farngeos memorizar esta tabla: Apariencia de halo Verde (incompleta) Claro, del color del medio (completa)

Tipo de hemlisis Alfa Beta 6.

Interpretar resultados slo para Streptococcus beta hemolticos as: Reportar * Se aisl Streptococcus pyogenes beta hemoltico del grupo A de Lancefield. Streptococcus sp. beta hemoltico no del grupo A de Lancefield (hacer prueba de CAMP).

Inhibicin por disco de bacitracina + (si produce halo), ver foto abajo

- (no inhibicin)

La inhibicin por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier dimetro de halo de inhibicin se considera significativo. Efectuar simultneamente susceptibilidad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibitico, lo que aumenta la certeza de la identificacin, junto con la prueba de CAMP negativa (tcnica adelante).

Interpretacin, con buena luz transmitida por detrs del sub-cultivo en agar sangre de carnero. Se observa el halo de inhibicin del crecimiento alrededor del disco de bacitracina (halo oscuro sin hemlisis). 96

7.

Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infecciones de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacterias que se citan a continuacin solamente cuando predominan por encima de la microbiota normal. Examinar la ltima estra que presenta colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay ms colonias que Streptococcus sp. alfa hemoltico y Neisseria sp., de: Streptococcus pneumoniae (neumococo): coco gram-positivo ovalado o lanceolado, agrupado en parejas. Colonias alfa hemolticas aplanadas o ligeramente mucosas (debido a la presencia de cpsula). Al pasarlo a otro agar sangre de carnero es inhibido por el disco de optoquina Taxo P o Disco N). Ver tabla adelante en nmero 8. Esta bacteria es parte de la microbiota normal de la garganta, en bajas concentraciones. Staphylococcus aureus: coco gram-positivo esfrico, en racimos, coagulasa positivo; crecimiento amarillo en agar manitol-sal. No causa frecuentemente faringitis como errneamente se cree. Enterobacterias: principalmente Klebsiella sp., Enterobacter sp. y Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa: bacilo gram-negativo aerobio, colonias grandes, generalmente beta hemolticas con pigmento verdoso y olor caracterstico. TSI/LIA no viran (no fermentador), y el pigmento que se nota en la superficie del crecimiento fluorece bajo la luz ultravioleta. Haemophilus influenzae: bacilo gram-negativo muy corto y fino, pleomrfico (es decir formas cocobacilares y formas largas juntas). Crece en agar chocolate con jarro con candela y en agar sangre de carnero colonias muy pequeas slo alrededor de colonias de Staphylococcus aureus, a lo que se llama satelitismo.

8.

Para diferenciar en cultivo de garganta o en cualquier otro cultivo bacteriolgico (L.C.R., hemocultivo, esputo, secreciones oculares, etc.) las colonias alfa hemolticas planas que crecen en el agar sangre de carnero, memorizar esta tabla:

97

Inhibicin por disco de optoquina + (presencia de halo)* - (no inhibe) * ** 9.

Informar Se aisl Streptococcus pneumoniae Streptococcus sp. alfa hemoltico **

Si se usa un disco impregnado de optoquina de 6 mm de dimetro, se considera significativa una zona de inhibicin slo si es mayor de 14 mm de dimetro. En cultivo de garganta es microbiota normal, no informarlo.

El cultivo de garganta negativo es aquel que: no presenta colonias beta hemolticas no presenta beta hemlisis en las cortadas no predomina ninguna de las bacterias citadas el crecimiento consiste principalmente de colonias alfa hemolticas no aplanadas y pequeas colonias amarillentas que se desprenden fcilmente del agar con el asa (Neisseria, Branhamella.)

Informar cultivos de garganta negativos as: Clave NP (en libro de registro) Informar No se aislan patgenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal.

10.

En la garganta pueden existir Streptococcus sp. beta hemolticos no del grupo A de Lancefield. A los Streptococcus pyogenes del grupo A de Lancefield no se les debe hacer prueba de susceptibilidad, ya que por lo general son muy susceptibles a la penicilina que es el antibitico de eleccin. Por el contrario, a los Streptococcus sp. beta hemolticos no del grupo A de Lancefield s debe efectuarse prueba presuntiva de susceptibilidad a la penicilina, con un disco del antibitico en agar sangre de carnero. Adems, debe hacerse la prueba de CAMP para Streptococcus sp. beta hemolticos no del grupo A de Lancefield. Existen procedimientos de agrupamiento serolgico, los cuales pueden usarse dependiendo de los recursos del laboratorio.

98

ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIONES RESPIRATORIAS SUPERIORES SIGNOS Y SNTOMAS Sinusitis/Rinitis: Cefalea Dolor/eritema en regin malar Rayos-X: Consolidacin, nivel de lquido, engrosamiento de la pared de los senos Garganta y faringe: Eritema y edema de mucosas Pus en amgdalas Pseudomembranas Edema de la vula Lengua con cubierta griscea Linfadenitis cervical BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes (grupo A) Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae Klebsiella spp. y otras enterobacterias Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis) Streptococcus pyogenes (grupo A) Corynebacterium diphtheriae Neisseria gonorrhoeae Bordetella pertussis

IDENTIFICACIN PRESUNTIVA DE Streptococcus agalactiae (GRUPO B). PRUEBA DE CAMP: 1. Esta bacteria es resistente al disco de 0.04 unidades de bacitracina. Es indispensable contar con agar sangre de carnero al 5% para hacer la prueba de CAMP. En una caja de este medio hacer con el asa en argolla una estra recta a lo largo de toda la caja con una cepa de Staphylococcus aureus productor de doble zona de beta hemlisis. Luego con sumo cuidado, hacer una estra con el Streptococccus beta hemoltico a identificar, perpendicular a la estra de S. aureus pero que no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeo de hemlisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar. Incubar en jarro con candela y humedad de 18 a 24 horas a 36 C. Interpretar como Streptococcus agalactiae del grupo B de Lancefield si se produce una flecha de intensa beta hemlisis que apunta hacia la estra de Staphylococcus aureus (B). 99

2.

3.

Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP

Strepto.

Strepto.

Flecha

Staph.

Staph.

A. Siembra prueba de CAMP

B. Flecha de beta hemlisis indica B: prueba de CAMP positiva

4.

Hacer la prueba con un control positivo (cepa conocida de S. agalactiae) y un control negativo (cepa conocida de S. pyogenes). Estas cepas control y la cepa de S. aureus de doble zona de beta hemlisis, deben conservarse suspendiendo masivamente cultivos puros en aproximadamente 3 ml de sangre de carnero pura, en tubos estriles y congelar. Streptococcus agalactiae es un agente etiolgico de vaginitis y meningitis neonatal, por lo que tambin debe buscarse cultivando en agar sangre de carnero al 5% las secreciones vaginales y lquidos cefalorraqudeos.

5.

100

Tomado de:

CARACTERSTICAS FSICAS, HEMATOLGICAS Y QUMICAS DE LA SANGRE DE CARNERO Miguel F. Torres, Q.B., M.A.

La sangre desfibrinada y estril de diversos animales, se ha utilizado desde el siglo XIX como enriquecimiento para el cultivo de diversas bacterias patgenas. El agar sangre como se utiliza hoy en da, fue introducido por primera vez en Francia en 1903, por Bezanon y Griffon. Posteriormente en 1919, Brown demostr la exactitud de la sangre ovina para clasificar al gnero Streptococcus segn el tipo de hemlisis. En vista de la comprobada utilidad de la sangre de carnero en la bacteriologa del Laboratorio Clnico actualizado, es conveniente conocer las caractersticas de la sangre en la especie Ovis aries (oveja/carnero). Para este propsito, debe compararse con la sangre humana. La revisin de literatura especializada, indica que el peso especfico, viscosidad relativa, presin osmtica y punto de congelacin son idnticos a la sangre humana. Las principales caractersticas hematolgicas de la sangre de carnero completa, son: hemoglobina 9-15 g/dl (promedio: 11.5); hematocrito 27-45% (promedio: 35); glbulos rojos 9-l5 millones/mm3 (promedio: 12); leucocitos

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4,000-12,000/mm 3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad de sedimentacin 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito disminuyen con la edad y se elevan cuando el animal est excitado. Los glbulos rojos ovinos son ms pequeos que los humanos. La membrana celular de los pequeos eritocitos de carnero es muy susceptible a la accin de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el caso de las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta caracterstica aunada a su fragilidad ligeramente mayor en comparacin a los eritrocitos humanos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemlisis in vitro. La sangre de carnero presenta velocidad de sedimentacin mucho menor en comparacin con la sangre humana. Esta caracterstica es deseable, ya que los eritrocitos de la sangre desfibrinada, suspendidos en su propio suero y almacenados en refrigeracin durante menos de 21 das, no se compactan tanto como en el caso de la sangre humana. Esto permite que se preserven mejor. Se sabe que el aumento de glucosa en el suero de la sangre desfibrinada utilizada para enriquecer medios de cultivo slidos, es inversamente proporcional al dimetro de los halos de hemlisis. Por este motivo su bajo contenido de glucosa es la caracterstica bioqumica que hace a la sangre ovina ideal para demostrar los amplios y tpicos halos de hemlisis alrededor de las colonias productoras de hemolisinas. Los valores normales se encuentran en el rango de 30 a 57 mg/dl. El resto de los valores qumicos es muy similar a la sangre humana, excepto en el caso del cido rico, que es muy bajo en los carneros. El rango normal de esta sustancia oscila entre 0.05 y 1.9 mg/dl.

Tomado de:

POR QU SANGRE DE CARNERO EN EL LABORATORIO CLNICO?


Por Miguel F. Torres, QB, MA. Guatemala, 1992.

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VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNERO EN EL LABORATORIO CLNICO La palabra hemlisis deriva del griego (haima=sangre) y (lysis=disolver). Se refiere a la accin de ciertas bacterias sobre los glbulos rojos. La ruptura eritroctica la provocan toxinas proticas llamadas por su efecto hemolisinas. Muchas bacterias producen hemolisinas, pero probablemente la nica que provoca hemlisis in vivo sea la toxina alfa de Clostridium perfringens, la cual es una alfa lecitinasa que causa lisis de la lipoprotena de la membrana celular del eritrocito humano (aparte de la hemlisis causada por anticuerpos o drogas en presencia de complemento). En Streptococcus pyogenes, una citolisina thiol-activada, llamada estreptolisina -O (oxgeno lbil), altera la permeabilidad de la membrana eritroctica al unirse con el colesterol. Esto provoca destruccin completa de los eritrocitos, y su efecto macroscpico es llamado hemlisis beta. La estreptolisina -S (oxgeno estable) tambin causa hemlisis beta en presencia de oxgeno en la superficie del agar sangre. Las reacciones hemolticas, as como los crecimientos bacterianos tpicos y exuberantes, son fundamentales en el diagnstico bacteriolgico. Debe usarse sangre de carnero para preparar el agar al 5% y obtener las siguientes ventajas tcnicas:

1 2 3

Debido a que los eritrocitos de la especie Ovis aries (carnero: macho, oveja: hembra y cra: cordero) son sumamente susceptibles a la accin de las hemolisinas bacterianas, se incrementan considerablemente las hemlisis de tipo beta. Se evitan reacciones hemolticas dudosas, que dificultan la interpretacin de los cultivos, pues en agar sangre de carnero se diferencian perfectamente las hemlisis verdosas de tipo alfa, de las reacciones de hemlisis completa tipo beta. En los cultivos de garganta es muy importante su uso, pues la sangre de carnero por su bajo contenido de nucletidos de piridina (factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produce colonias idnticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita falsos positivos.

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La sangre de carnero desfibrinada aspticamente, no contiene anticoagulantes (como la sangre vencida de Banco), ni anticuerpos contra las bacterias patgenas del hombre o antibiticos, por lo que en general permite mejores crecimientos. Se evita manipular volmenes considerables de sangre humana, por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otras infecciones humanas, durante la preparacin del agar sangre.

Referencia: Torres, M.F. 1986. Estandarizacin de la Bacteriologa Mdica en Guatemala (Conferencia magistral). En: Memorias, III Congreso Nacional de Microbiologa, pgina 20. Guatemala 2-6 diciembre.

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CAPTULO 9 CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES


PROPSITO: Demostrar por medio de cultivo la presencia de dos bacterias que solamente deben investigarse en casos especiales y justificados: 1. Corynebacterium diphtheriae: es la bacteria causante de la difteria. Debe investigarse solamente en pacientes cuya sintomatologa clnica es compatible con esta infeccin. Los sntomas de la difteria larngea son: formacin de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta, que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el paciente se encuentra severamente intoxicado (debido a la potente toxina que produce la bacteria). Actualmente en Latinoamrica la difteria es muy rara, debido a la efectividad de la vacuna llamada triple o DPT (difteria, pertusis, ttanos). Neisseria meningitidis: es la bacteria causante de severa y muy contagiosa meningitis (infeccin de las membranas que cubren el cerebro), y por lo tanto se investiga principalmente en lquido cefalorraqudeo. Su presencia debe investigarse por cultivo de garganta en parientes, mdicos, enfermeras, o tcnicos de laboratorio que han estado en contacto directo con pacientes (generalmente nios) con meningitis meningocccica. A estas personas se les llama contactos. El propsito fundamental es erradicar la bacteria de la garganta de los contactos con tratamiento antibitico adecuado, para evitar la diseminacin de la infeccin que puede llegar a ser epidmica. INVESTIGACIN DE Corynebacterium diphtheriae: MUESTRA Y PROCEDIMIENTO: El diagnstico de la difteria es primordialmente clnico. De ninguna manera es aceptable que el mdico delegue esta responsabilidad en el laboratorio de microbiologa, por medio de un frote de exudado farngeo coloreado con Gram. C. diphtheriae es un bacilo gram-positivo en forma de maza (un extremo ms 105

2.

ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de las pseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros difteroides de igual morfologa. Proceder a tomar la muestra as: 1. Debe contarse con buena iluminacin (lmpara porttil de mano), para poder examinar bien la garganta. Deprimir la lengua con bajalenguas de madera estril, y buscar reas necrticas o grisceas (pseudo-membranas). Con un hisopo estril, frotar firmemente las lesiones descritas. Retirar el hisopo de tal manera que no toque las paredes internas de los carrillos, ni la lengua. Inocular con el hisopo, un tubo de medio inclinado de Loeffler (suero animal ms caldo glucosado, coagulado). Este medio debe ser color crema plido. Incubar aerbicamente a 36 C durante 18 a 24 horas. Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar chocolate-telurito de potasio. Incubar aerbicamente a 36 C por 18 a 24 horas. Tomar un tercer hisopo de las pseudo-membranas, e inocular directamente una caja de agar sangre de carnero al 5%, con cortadas, para investigar la presencia de Streptococcus pyogenes. Incubar en jarro hmedo con candela a 36 C.

2.

3.

4.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: El objeto del medio de Loeffler es permitir que C. diphtheriae crezca ms abundantemente que la microbiota de la garganta, slo durante las primeras ocho horas de incubacin, y sobre todo con su morfologa tpica. Proceder as: 1. Despus de incubar el tubo de Loeffler solamente de dos a ocho horas a 36 C, preparar dos frotes del leve crecimiento. Al efectuar los frotes, tratar de remover lo menos posible el escaso crecimiento al suspenderlo en una pequea gota de agua, pues es necesario preservar la forma de agrupacin tpica de C. diphtheriae.

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2.

Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y teirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen. Buscar en el frote Gram: bacilos gram-positivo pleomrficos y en forma de maza. Se agrupan en forma de letras chinas o en ngulos en forma de V o Y. No se agrupan en empalizadas (paralelos) como otros difteroides. En el frote coloreado con azul de metileno, se observa el mismo tipo de agrupacin y adems coloracin discontinua en forma de bandas azules causada por los corpsculos metacromticos de polimetafosfato, que son reservas alimenticias de la bacteria. Despus de 18 a 24 horas de incubacin, C. diphtheriae forma en el medio agar chocolate-telurito colonias de color negro intenso. Un frote Gram de estas colonias revela bacilos gram-positivo pleomrficos. No descartar como negativo antes de 48 horas de incubacin. Si la morfologa de las colonias negras no es muy tpica en el agar chocolate-telurito, pero si las hay en el Loeffler, hacer un pasaje de una asada del crecimiento en Loeffler a otra caja de chocolate-telurito para confirmar. C. diphtheriae es catalasa y nitratos positivo. Para efectuar estas pruebas, subcultivar las colonias negras del chocolate-telurito, a agar sangre de carnero. Al obtener cultivo puro con morfologa compatible en Gram, suspender sobre un porta objetos una asada del crecimiento en una gota de agua oxigenada, y observar la aparicin de burbujas de oxgeno. Debe tenerse la precaucin de tomar solamente del crecimiento y no del medio de cultivo, pues sangre o suero dan reacciones positivas falsas de catalasa. La prueba de reduccin de nitratos a nitritos, puede hacerse en caldo nitratado, si se cuenta con l y los reactivos necesarios, pero no es indispensable.

3.

4.

5.

6.

INFORME: 1. Si la morfologa del crecimiento en Loeffler (incubado slo de 2 a 8 horas) es muy tpica, y no se cultiv en chocolate-telurito, informar: Se aisl un bacilo gram-positivo, de morfologa compatible con Corynebacterium diphtheriae.

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2.

Si la morfologa microscpica del crecimiento en Loeffler es tpica y hay colonias negras en chocolate-telurito, reportar: Se aisl Corynebacterium diphtheriae. Identificacin preliminar, pendiente de demostrar la produccin de toxina in vitro o in vivo.

INVESTIGACIN DE Neisseria meningitidis EN CULTIVOS DE GARGANTA DE CONTACTOS: MUESTRA Y PROCEDIMIENTO: Neisseria meningitidis sobrevive pobremente en el medio ambiente y su nico hospedero es el hombre, por lo tanto los portadores humanos son el principal reservorio. La transmisin ocurre por contacto directo con secreciones respiratorias, o por pequeas gotas suspendidas en el aire, que acarrean la bacteria. El porcentaje promedio de portadores de N. meningitidis en la orofaringe y nasofaringe es de 5 a 15 por ciento, y usualmente slo durante algunas semanas en cada individuo. En un pequeo porcentaje de personas, la bacteria se disemina de la nasofaringe hasta el torrente circulatorio, y produce meningococcemia, meningitis, o ambas. Adems de los sntomas de meningitis, en el 75 por ciento de los casos, hay profundos efectos vasculares, que provocan petequias o exantema purprico, lo que ayuda al diagnstico clnico, que debe ser confirmado siempre por Bacteriologa. El cultivo de garganta/nasofaringe para el aislamiento de N. meningitidis, debe obtenerse exclusivamente de contactos (personas que han tenido contacto directo con algn paciente en el cual se ha demostrado la presencia de la bacteria en su lquido cefalorraqudeo). Se logra mayor porcentaje de aislamientos si la muestra se obtiene de la nasofaringe en lugar de la garganta. De ninguna manera es un procedimiento de rutina. Proceder as: 1. Con hisopo estril y buena iluminacin, frotar firmemente el fondo de la garganta. Si es posible, usar un hisopo largo y curvo, que llegue lo ms profundo posible. Con otro hisopo delgado y curvo, tomar muestra de la nasofaringe (por la nariz). Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio ThayerMartin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.

2.

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3.

Introducir los tubos, con el tapn de rosca ligeramente flojo, dentro de un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24 horas a 36 C.

INTERPRETACIN: 1. Despus del perodo de incubacin, observar el crecimiento de colonias pequeas, grises, brillantes y ligeramente mucosas. Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeo frote Gram de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negativo en forma de granos de caf, agrupados en parejas. Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta morfologa microscpica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores), e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas. Efectuar la prueba de oxidasa, ya sea agregando el reactivo directamente sobre la caja, o frotar las colonias con palillo de madera sobre discos hmedos con el reactivo de oxidasa. La aparicin de coloracin morado oscuro-negro, indica una prueba positiva. Si este es el caso, proceder a efectuar la prueba de oxidacin de maltosa y sacarosa, segn se indica en el captulo de secreciones genitales. N. meningitidis oxida la maltosa, pero no la sacarosa (sucrosa). Neisseria lactomica que tambin crece en el medio Thayer-Martin y tiene inters clnico, debe identificarse con la oxidacin positiva de la lactosa. Desde el punto de vista epidemiolgico, es muy conveniente saber a cual grupo pertenece el aislamiento (A,B,C,D,X,Y,Z, y otros). Por este motivo, si el laboratorio no cuenta con los antisueros de tipificacin, debe remitir el cultivo en agar chocolate (bien sellado) al laboratorio nacional de referencia correspondiente.

2.

3.

4.

5.

INFORME: Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se est seguro que no se trata de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota normal de la garganta, informar: Se aisl Neisseria meningitidis. Si se cuenta con los antisueros de tipificacin, realcela e informe: Se aisl Neisseria meningitidis del grupo __. (segn el que haya aglutinado) 109

Fotografas a Color

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FOTOGRAFAS Foto 1. Listeria monocytogenes, en contraste de fases. Los bacilos aparecen incoloros y brillantes . No es una coloracin, sta tcnica de observacin en fresco proporciona excelente contraste. Foto: CDC, Atlanta, Georgia, EUA. Foto 2. Listeria monocytogenes , coloracin de Gram. Aislamiento de lquido cefalorraqudeo. Bacilos regulares de coloracin slida. Presentan el tpico color morado negruzco las bacterias gram-positivo. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A. Foto 3. Staphylococcus aureus, coloracin de Gram de cultivo puro obtenido de secrecin de herida infectada. Son cocos esfricos de una micra de dimetro, agrupados en forma de racimos. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A. Foto 4. Streptococcus pyogenes, frote Gram de secrecin de oreja necrtica. Presenta abundantes cocos gram-positivo pequeos y ligeramente ovalados, sueltos, en parejas y cadenas cortas. Infeccin infantil mortal, Laboratorio de Microbiologa, Hospital General del IGSS zona 9, agosto de 1982. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 5. Streptococcus pneumoniae, frote Gram de esputo purulento de paciente con neumona lobar. Imagen tpica de esta bacteria: cocos gram-positivo agrupada en parejas. Foto: Institut Pasteur, Pars, Francia. Foto 6. Streptococcus pneumoniae, frote de sedimento de lquido cefalorraqudeo (LCR) de paciente con meningitis grave. Presenta abundantes cocos gram-positivo ovalados; se insina la cpsula como un halo claro difuso alrededor de las clulas. Aparecen dos leucocitos polimorfonucleares (gram-negativo). Foto: Rubn Mayorga Peralta, Guatemala. Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo. Bacilos gram-negativo, regulares, de coloracin slida y bordes redondeados. Esta morfologa es tpica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A. Foto 8. Bacteroides fragilis, coloracin de Gram de cultivo puro. Presenta coloracin rojo plido (tpica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A. Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics. Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciacin. Las colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmn; las lactosa-

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negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde plido. Las colonias productoras de cido sulfhdrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 10. Arizona hinshawii y Escherichia coli en MacConkey (izquierda) y Hektoen (derecha). Cultivo mixto de miositis necrotizante severa en un paciente peditrico, Hospital General del IGSS zona 9, 1982. Este cultivo semeja un coprocultivo positivo a Salmonella enteritidis. En MacConkey las colonias lactosa-positivo son rojas y las lactosanegativo incoloras. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 11. Reacciones tpicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina (rojo), fondo cido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta abundante gas (burbuja y fondo separado) y cido sulfhdrico (negro). El LIA (arriba) es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilacin del aminocido lisina, tambin presenta precipitado negro debido al cido sulfhdrico. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 12. Reacciones tpicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina (rojo), fondo cido (amarillo), no presenta gas ni cido sulfhdrico. El LIA (arriba) es alcalino/cido (K/A), sin gas ni cido sulfhdrico. En Shigella spp. frecuentemente el color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 13. Reacciones de tres enterobacterias en TSI. De izquierda a derecha: medio no inoculado (K/K), Escherichia coli (A/A,++,-), Salmonella enteritidis (K/A, +,+++) y Salmonella typhi (K/A,-,+poco). Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con clera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS. Colonias tpicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 15. Efecto del enriquecimento de coprocultivo en APA para el aislamiento de Vibrio cholerae 01. Izquierda: cultivo en TCBS de enriquecimiento en APA, muestra crecimiento puro y masivo. Derecha: cultivo de heces sembradas directamente en TCBS, sin enriquecimiento, presenta crecimiento ms escaso de cultivo mixto. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 16. Prueba de susceptibilidad segn el mtodo de Bauer-Kirby. El biotipo eltor de Vibrio cholerae 01 es resistente al disco de 50 UI de Polimixina-B, que se observa en el centro. Fotografa: Miguel F. Torres, previamente publicada en Torres, M. et al. 1991. Etiologa y Diagnstico de Laboratorio de el Clera. OPS/OMS, Guatemala.

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Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, ms de 100,000 UFC/ml, en agar MacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestra colonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cpsula. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, ms de 100,000 UFC/ ml, en agar MacConkey. Esta imagen es la ms frecuente en urocultivos positivos. Las incontables colonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con un disco de bacitracina. Este cultivo fu incubado en jarro hmedo con candela a 37 grados centgrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibicin del crecimiento provocada selectivamente por este antibitico, como un halo rojo (sin destruccin de los eritrocitos ovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensa hemlisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangre de carnero. Las estras verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemlisis presentan crecimiento blanco. Las estras perpendiculares de varias cepas de S. pyogenes son beta hemolticas, pero la hemlisis no se incrementa en forma de flecha donde el crecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 21. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae, cultivo de LCR en agar sangre de carnero. Las colonias tpicas son pequeas, redondas, planas, de bordes enteros y francamente alfa hemolticas. Las colonias jvenes son elevadas; a medida que el cultivo envejece, las colonias se aplastan y su centro se deprime debido a la accin de enzimas autolticas; esto no ocurre con otros estreptococos viridans.La tpica hemlis alfa se incrementa al incubar en microaerofilia con jarro hmedo con candela. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina. El halo de inhibin mayor de 14 mm de dimetro, identifica presuntivamente a Streptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco con neumona lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas que poseen cpsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de ste caso. Las colonias confluentes presentan la tpica hemlisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco de optoquina. Se observa un amplio halo de inhibicin del cultivo por el hidrocloruro de

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etil cuprena (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan tambin las reacciones tpicas de inhibicin y alfa hemlisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 25. Haemophilus influenzae, prueba de satelitismo de sub-cultivo de aislamiento de LCR. Paciente guatemalteco de un ao con meningitis mortal. H. influenzae crece slo muy cerca de la estra de Staphylococcus aureus. En el agar sangre de carnero el factor V (nucletidos de piridina o nicotinamida adenina dinucletido) se encuentra dentro de los eritrocitos, el factor X (hemina) s se encuentra libre en el medio. S. aureus libera factor V, por lo que causa satelitismo de ciertos Haemophilus spp. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad segn el mtodo de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutricin de Centroamrica y Panam, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto: Leonardo J. Mata, Costa Rica. Foto 27. Demostracin del mtodo para preparacin de frotes de esputo entre dos portaobjetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriologa II, Laboratorio de Microbiologa, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: annima. Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la tcnica de ZiehlNeelsen. Los bacilos alcohol-cido resistentes aparecen teidos de color rojo. La coloracin de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds, Inglaterra. Foto 29. Colonias de Mycobacterium tuberculosis, acercamiento con microscopio estereoscpico. Este tipo de colonias rugosas y de bordes irregulares, son llamadas eugnicas. No presentan pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordn. Las cepas ms virulentas de M. tuberculsis manifiestan esta caracterstica. Se observa el crecimiento en forma de cordones sinuosos. Foto: Rubn Mayorga Peralta. Foto 31. Mycobacterium kansasii, crecimiento eugnico en el medio de Lowenstein-Jensen. Fu cultivado en la oscuridad por varias semanas, con el tubo cubierto por papel negro de manera que no tuviera contacto con la luz. No presenta pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 32. Mycobacterium kansasii, cultivo en Lowenstein-Jensen despus de exposicin a la luz. Es fotocromgeno, es decir que presenta pigmento anaranjado fuerte slo en presencia de luz. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.

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CAPTULO 10 CULTIVO DE ESPUTO


PROPSITO: Demostrar por medio de frote coloreado con Gram y cultivo, la presencia de bacterias causantes de infeccin respiratoria inferior. La neumona bacteriana, o infeccin del pulmn causada por bacterias puede ser de dos tipos: a. b. Neumocccica: causada por Streptococcus pneumoniae. No neumocccica: causada por Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, y ocasionalmente por otras bacterias.

MUESTRA: La infeccin bacteriana de trquea y bronquios produce abundante esputo. Debe obtenerse el primer esputo de la maana, pues es ms espeso y no est contaminado por comida. Indicar al paciente que al despertar, se enjuague la boca con agua corriente (sin usar antispticos ni pasta dental) y luego acostado en su cama (boca abajo) debe desgarrar esputo con fuerza, y depositarlo directamente en un recipiente estril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. Para este propsito, el laboratorio debe contar con recipientes estriles de plstico, descartables. Si no se cuenta con este material, deben esterilizarse suficientes frascos de vidrio, pequeos y de boca ancha. En el caso del cultivo de esputo, para obtener resultados confiables, es crucial la obtencin de una buena muestra. Si el cultivo se efecta de material inadecuado como saliva, el resultado confundir al mdico tratante porque no se detect el verdadero patgeno, o se recuper de la microbiota de la saliva un patgeno potencial que no es el agente etiolgico primario de la neumona. Por este motivo, el laboratorio deber rechazar sin vacilar las muestras que se consideren insatisfactorias, segn los criterios que aparecen ms adelante. Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para efectuar el frote Gram y cultivo de rutina, pero son insuficientes para el cultivo de

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micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarse por no ms de tres horas. Debe ponerse atencin en el color, olor y consistencia del esputo. Las muestras hialinas y completamente lquidas deben rechazarse de inmediato pues no son esputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar la presencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, pero el esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presentes por el paso de la muestra a travs de la boca, donde son muy abundantes. En caso de sospecharse infeccin pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestra por puncin trans-traqueal. Al laboratorio pueden remitirse otras muestras que provienen del aparato respiratorio inferior, las cuales se procesan de manera similar al esputo, en busca de las mismas bacterias y adems anaerobios (en caldo tioglicolato). Estas muestras obtenidas por tcnicas invasivas, siempre son obtenidas por el mdico neumlogo: aspirado traqueal, lavado bronquial, cepillado bronquial, biopsia bronquial, lavado bronco-alveolar, aspirado trans-traqueal, aspirado pulmonar, y biopsia pulmonar. Al procesar estas muestras, que frecuentemente son pequeas, debe tomarse en cuenta su importancia y la dificultad de su obtencin, por lo que con frecuencia son imposibles de repetir. EL FROTE GRAM DE ESPUTO: En primer lugar debe procederse a evaluar la calidad de la muestra, es decir determinar si es adecuada y confiable para ser cultivada o no. Proceder as: 1. Vertir aspticamente el esputo en una caja de Petri estril y colocarla sobre un fondo obscuro. Quebrar los extremos de dos aplicadores de madera estriles. Con ayuda de las puntas irregulares, seleccionar las partculas anormales: con pus (blanquecino), o sangre (rojizo). Con cuidado, colocar la partcula anormal en el extremo de un porta-objetos. Con otro porta-objetos, presionar la muestra varias veces a manera de cortar el esputo, y luego deslizar ambos porta-objetos uno sobre otro, para obtener dos frotes delgados. Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor 122

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sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen, si as fue solicitado por el mdico. 5. Observar varios campos en el microscopio con un aumento de 100X (seco dbil). Descartar el esputo si presenta: a. b. Ms de 10 clulas epiteliales/campo, y Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clnica Mayo, de Murray y Washington, y de Van Scoy).

En el verdadero esputo, se observan en fresco abundantes leucocitos y macrfagos alveolares. 6. Si el esputo es aceptable para ser cultivado, ponerle una gota de aceite y observarlo con lente de inmersin, segn los siguientes criterios.

INTERPRETACIN DEL FROTE GRAM DE ESPUTO: 1. Al interpretar un frote de esputo coloreado con Gram, debe tenerse en cuenta que esta muestra siempre va a presentar bacterias de la microbiota de la boca. Sin embargo, deben reportarse cuantitativamente todas las bacterias observadas, segn los criterios que aparecen en este manual, en la tcnica e informe de la coloracin de Gram. No debe sobre interpretarse la presencia de bacterias. Es muy importante detectar y reportar principalmente el tipo de bacterias que predomina. Los cocos gram-positivo usualmente se localizan alrededor de las clulas epiteliales. El predominio de un tipo de bacterias, permite distinguir simple colonizacin de infeccin verdadera. El mdico debe relacionar estos datos con las observaciones clnicas. La morfologa bacteriana observada en el esputo nunca identifica la especie (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, etc.), el hacerlo causa errores en el tratamiento del paciente. Sin embargo, la presencia de abundantes cocos gram-positivo lanceolados, solos, en pares o cadenas cortas, cuya cpsula se insina pero no se tie con Gram, y abundantes leucocitos polimorfonucleares, permite sospechar la presencia 123

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de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de la neumona. 5. Observar cuidadosamente la presencia de pequeos cocobacilos gramnegativo (Haemophilus influenzae), hongos filamentosos que son grampositivo, y filamentos gram-positivo delgados y ramificados (Nocardia asteroides o Actinomyces israelii). Los hongos intracelulares deben detectarse con la coloracin de Giemsa. Los cristales de Charcot-Leyden, que provienen de los grnulos de los eosinfilos, son alargados y terminados en punta. Deben reportarse si se observan.

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CULTIVO DE ESPUTO: El esputo vertido en una caja de Petri estril (para poder seleccionar mejor la fraccin de la muestra a analizar), debe procesarse as: 1. Seleccionar con las puntas irregulares de dos aplicadores estriles de madera, las partculas anormales (con pus y/o sangre). Pasar estas partculas y unirlas en un espacio seco de la caja de Petri. Tomar la muestra seleccionada con el asa en argolla (flameada y fra) y estriar con cortadas en la superficie de una caja de agar sangre de carnero al 5%. Si an queda muestra de la partcula seleccionada, inocular una caja de MacConkey. Si esto no es posible, seleccionar otra partcula anormal. Si el frote coloreado con Gram indica la posible presencia de Haemophilus influenzae, debe inocularse tambin agar chocolate. Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo con candela, y el MacConkey aerbicamente, por 18 a 24 horas a 36 C.

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INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME: 1. Examinar las cajas simultneamente, con lupa y buena luz o microscopio estereoscpico. En primer lugar, buscar en el agar sangre de carnero colonias de Streptococcus pneumoniae, con las siguientes caractersticas: 124

alfa hemolticas (hemlisis verdosa), planas (deprimidas en el centro y con los bordes ligeramente ms elevados), brillantes, transparentes, y pequeas (menos de un milmetro de dimetro). Algunas veces las colonias de S. pneumoniae no son tpicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm), convexas y muy mucosas (debido a la cpsula). Siempre presentan la hemlisis verdosa (alfa) caracterstica. 2. Con la tcnica ya indicada para sub-cultivar Streptococcus beta hemoltico en cultivos de garganta, trasladar con el asa en hilo, una o dos colonias a una caja de agar sangre de carnero. Estriar en varias direcciones, y con pinzas flameadas colocar en el centro un disco de optoquina (Taxo P o disco O). Incubar en jarro con candela a 36 C por 18 a 24 horas, e interpretar as: a. Inhibicin positiva (si hay halo); slo se considera significativa una zona de inhibicin mayor de 14 mm de dimetro. Reportar: Se aisl Streptococcus pneumoniae. Inhibicin negativa (no hay halo); se trata de un Streptococcus alfa hemoltico (grupo viridans), no debe reportarse pues es microbiota normal.

b.

Se ha demostrado que aproximadamente en el 45 por ciento de pacientes con neumona neumocccica, no se asla la bacteria responsable. Por este motivo, un cultivo de esputo negativo, no descarta definitivamente la presencia de esta infeccin. 3. Buscar colonias beta hemolticas en el agar sangre de carnero. Si las hay, proceder de acuerdo con las recomendaciones para la identificacin de Streptococcus pyogenes en el captulo de cultivo de garganta. No efectuar antibiograma a esta bacteria, por su susceptibilidad prcticamente uniforme a la penicilina, que es el tratamiento de eleccin. Haemophilus influenzae crece bien en agar chocolate, presenta colonias pequeas (frecuentemente menos de un milmetro de dimetro), brillantes y circulares. En agar sangre de carnero crece solamente alrededor de las colonias de otras bacterias (Staphylococcus aureus, etc.), a lo que se conoce como satelitismo natural, el cual de preferencia, pero no necesariamente, debe observarse con microscopio estereoscpico. Si hay duda, sub-cultivar en otra caja de agar sangre de carnero, con una estra de Staphylococcus aureus , para observar el satelitismo artificial (creci125

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miento slo muy cerca de la estra de S. aureus). El frote Gram del crecimiento de las pequeas colonias satlites presenta predominio de cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasapositivo. 5. Buscar en el MacConkey colonias lactosa-positivo (rojo-rosado) mucosas (bacterias capsuladas), indicativas de la presencia de Klebsiella pneumoniae. Si el crecimiento predominante son este tipo de colonias grandes, francamente mucosas, trasladar con el asa en hilo a TSI, LIA, MIO, urea y citrato e interpretar segn las indicaciones en el captulo de coprocultivo. Si las pruebas son compatibles, reportar: Se aisl Klebsiella pneumoniae. En el caso de Streptococcus pneumoniae: debe efectuarse prueba de susceptibilidad antimicrobiana a la penicilina. Cada vez aparecen ms reportes en la literatura de cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina por la produccin de beta lactamasa. Hacer la prueba para determinar la susceptibilidad a la penicilina en agar Mueller-Hinton + 5% de sangre de carnero en jarro con candela, con un disco de 1 g de oxacilina; se interpreta como susceptible la presencia de un halo de inhibicin mayor o igual a 20 mm (NCCLS, M100-56, 1995). Si es posible, detectar la produccin de beta lactamasa por un mtodo confiable. En el caso de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otras enterobacterias o Haemophilus influenzae (en este caso en agar chocolate), s efectuar prueba de susceptibilidad. Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtienen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neumona humana, solamente si su crecimiento predomina. El cultivo de esputo para aislar Legionella pneumophila, debe efectuarse por procedimientos especiales, y slo en casos plenamente justificados. Para este propsito, deber consultarse literatura especializada. Si en la interpretacin del cultivo de esputo no se toman en cuenta los criterios anteriores, es un examen intil que puede conducir a graves errores en el tratamiento del paciente. Si no se aisla S. pneumoniae o S. pyogenes (aunque sea escaso), u otras bacterias predominantes sobre la microbiota, reportar: No se aislan patgenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal. 126

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ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE NEUMONA Y BRONQUITIS SIGNOS Y SNTOMAS Tos Dolor torxico Disnea Consolidacin pulmonar Sonidos anormales Disminucin de sonido respiratorio Infiltrado (Rayos-X) Matidez a la percusin Cavitacin Empiema BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias Legionella spp. Mycobacterium spp. Fusobacterium nucleatum Bacteroides melaninogenicus y otros anaerobios

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CAPTULO 11 HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO


PROPSITO: El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se estn reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo de mdula sea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. La septicemia es una de las enfermedades infecciosas ms graves, por esta razn la deteccin efectiva y rpida de la bacteria causante, constituye una de las funciones ms importantes del diagnstico bacteriolgico. La deteccin de bacterias en sangre o mdula sea tiene importancia diagnstica y pronstica. En el caso de fiebre tifoidea, causada por S. typhi, su hallazgo en la sangre, o ms efectivamente en mdula sea, constituye el diagnstico de sta severa infeccin, y permite instituir tratamiento con el delicado antibitico de eleccin (cloranfenicol). En condiciones normales no se detectan bacterias en la sangre. Las bacterias penetran hacia el torrente circulatorio desde sitios extravasculares, por los vasos linfticos. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema reticulo-endotelial para removerlas de la sangre, ocurre la septicemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio, la cual ocurre cotidianamente durante el cepillado dental, contacto sexual, etc. Actualmente existe la tendencia por usar estos dos trminos (septicemia y bacteremia) indistintamente Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. Sin embargo, la septicemia polimicrobiana se presenta con una frecuencia no despreciable. MUESTRA: Los sntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo son: aumento sbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, calofros, postracin y presin baja. La recuperacin de las bacterias de la sangre depende de estos factores:

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La cantidad de sangre que se cultiva. En nios debe ser al menos 2.5 ml y en adultos usualmente 5 ml, aunque sera preferible cultivar 10 ml. La relacin entre sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10, es decir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar la coagulacin de la sangre. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero, tales como anticuerpos, complemento o antibiticos. Los mtodos de cultivo en el laboratorio de microbiologa. La caracterstica de la bacteria de ser fastidiosa, es decir que requiere un medio de cultivo enriquecido y complejo.

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El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibiticos. No es crucial obtener la muestra de sangre cuando sube la temperatura del paciente; si es posible, deber tomarse antes del alza esperada de temperatura o inmediatamente despus del calofro. En algunos casos, se justifica obtener varias muestras del paciente, en tiempos y de sitios diferentes, es decir seriado. Los hemocultivos seriados, obtenidos antes de la antibioticoterapia, son especialmente tiles en el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, neumona bacteriana, pielonefritis y endocarditis. Debido a que la piel humana normal est constantemente cubierta de abundante microbiota, es muy importante tomar la muestra con precauciones especiales. Para obtener la muestra no es necesario utilizar campo estril, pero s observar todas las indicaciones necesarias para la toma asptica de la muestra. Al obtener la sangre para hemocultivo, deben seguirse cuidadosamente las siguientes instrucciones: 1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapn de hule perforable. Dejar la tapadera a un lado, y con un algodn empapado en solucin de yodo al 3 por ciento en alcohol (tintura), limpiar bien el tapn perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisin el sitio donde se va a puncionar. Es una buena prctica rutinaria lavar con agua y jabn el brazo del 130

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paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con un algodn empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar y luego limpiar el sitio de puncin con un algodn empapado en alcohol, con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio de puncin. Despus de esta prepacin no se debe volver a tocar la vena. 4. Con aguja y jeringa estriles, puncionar la vena y obtener aspticamente 5 ml o ms de sangre. Nunca debe cambiarse aguja despus de obtener la sangre, excepto cuando se falla en el intento de hacerlo, y se punciona en otro sitio. Inyectar exactamente 5 ml de sangre en el frasco que contiene 45 ml de caldo, o 10 ml en un frasco con 90 ml de caldo. En los hemocultivos peditricos, inyectar 2.5 ml de sangre en 25 ml de caldo. El caldo preparado comercialmente que debe usarse, es el caldo thiol, especialmente diseado para efectuar hemocultivos de pacientes que pudieran haber recibido penicilina, estreptomicina o sulfonamidas. El caldo debe contener de 0.025 por ciento a 0.05 por ciento de polianetol sulfonato de sodio (SPS). Esta sustancia acta como anticoagulante, y adems inhibe la actividad bactericida del suero y la fagocitosis de los leucocitos, inactiva el complemento y neutraliza lisozimas y antibiticos aminoglucsidos. Tambin debe tener vaco parcial y atmsfera enriquecida con anhdrido carbnico. Los frascos comerciales deben mantenerse en la oscuridad y a temperatura ambiente. En caso de no contarse con frascos o botellitas comerciales para hemocultivo, stas pueden prepararse en el laboratorio, en recipientes de vidrio esterilizables y con doble tapn, el interno perforable. Los caldos BHI (infusin de cerebro y corazn de buey) o Tripticasa-soya dan buenos resultados. Usualmente el hemocultivo para anaerobios no se efecta, a menos que se cuente con botellitas anaerobias comerciales; sin embargo, algunos anaerobios aerotolerantes eventualmente pueden crecer. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas, e incubar a 36 C. Las muestras de mdula sea para efectuar el mielocultivo siempre deben ser obtenidas por el mdico, quien puncionar el esternn o la cresta

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ilaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que el hemocultivo. PROCEDIMIENTO: 1. Incubar los hemocultivos y mielocultivos a 36 C por siete das, excepto en casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubacin, por ejemplo para el aislamiento de Brucella spp. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar alguno de los siguientes signos visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de bacteria que est creciendo: OBSERVACIONES EN HEMOCULTIVOS QUE ORIENTAN EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
Signo visible Turbidez Posible bacteria Bacilos gram-negativo aerobios Staphylococcus spp. Bacteroides spp. Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Listeria spp. Clostridium spp. Bacillus spp. Bacilos gram-negativo aerobios Anaerobios Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Pseudomonas spp. Bacillus spp. Levaduras Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa

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Hemlisis

Formacin de gas Colonias visibles como motas de algodn Formacin de pelcula

Formacin de cogulo gelatinoso Coloracin verdosa (raro)

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En caso de observar cualquiera de estas caractersticas, agitar suavemente, limpiar el tapn perforable con algodn y alcohol, puncionar con jeringa y aguja estriles (puede ser de tuberculina) y aspirar una pequea cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate; incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres gotas del hemocultivo, pero slo estriar una. Si no se observa crecimiento en las gotas no rayadas y lo hay en las estras, posiblemente se trata de contaminacin. Simultneamente, dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta-objetos; colorear con Gram. Observar cuidadosamente el frote Gram con lente de inmersin, pues la observacin de las bacterias es la base de su caracterizacin. Adems, algunas bacterias como Haemophilus influenzae no producen signos visibles en el caldo. Si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativo, inocular adicionalmente una caja de agar MacConkey; incubar aerbicamente. Esto es especialmente importante para el aislamiento e identificacin de Salmonella typhi. Si se observan cocos gram-positivo esfricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estra del agar sangre de carnero, para acelerar la identificacin presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes. Rutinariamente, revisar los hemocultivos y mielocultivos aparentemente negativos. Proceder as: hacer aspticamente un frote Gram del caldo a las 48 horas, y tambin al sptimo da de incubacin. La incubacin prolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.

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6.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS; 1. Con siete das de incubacin a 36 C se recupera el 95 por ciento de las bacterias clnicamente significativas. Identificar los crecimientos bacterianos segn el caso, con las tcnicas descritas. Si se observa en MacConkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-Salmonella, anti-Salmonella 133

grupo D, y anti-antgeno Vi. Si hay aglutinacin franca, reportar inmediatamente la presencia de Salmonella typhi. 2. Algunas bacterias frecuentes en hemocultivos positivos, son las siguientes: 3. Salmonella typhi Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae

Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos, como contaminantes provenientes de la microbiota de la piel, son los siguientes bacilos gram-positivo: Bacillus sp. (esporulado) Corynebacterium sp. (no esporulado, difteroide)
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE SEPTICEMIA

SIGNOS Y SNTOMAS Fiebre en picos Calofros

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Streptococcus pyogenes (grupo A) en todas las edades Streptococcus alfa hemoltico (endocarditis)

Murmullo cardaco (endocarditis) Streptococcus grupos A, B y D neonatos Petequias en piel y mucosas Hemorragia puntiforme en uas Malestar Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Salmonella typhi (fiebre tifoidea) Escherichia coli Bacteroides fragilis y otros anaerobios Pseudomonas aeruginosa Listeria monocytogenes Haemophilus influenzae

134

INFORME: 1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan bacterias en el segundo control por coloracin de Gram, a los siete das de incubacin, nunca antes. Reportar as: Negativo a los siete das de incubacin a 36 C. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubacin, reportar cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible hasta especie, aunque la identificacin sea presuntiva. Reportar as: Se aisl ___________ , susceptibilidad pendiente. En el caso del aislamiento e identificacin de Streptococcus pneumoniae o Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar as: Se aisl Streptococcus ___________ , se recomienda tratamiento con penicilina. Si se trata de S. pneumoniae si hacer la prueba de susceptibilidad a la penicilina. Despus de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, enviar otro reporte, as: Se aisl: ___________________ Susceptible a: ______________ Intermedio a: ______________ Resistente a: _______________

2.

3.

4.

Si el laboratorio tiene capacidad econmica suficiente, es conveniente utilizar el sistema para deteccin de bacterias por lisis-centrifugacin (ISOLATOR, Laboratorios Wampole), o algn sistema automatizado para efectuar hemocultivos (por ejemplo BACTEC, Becton Dickinson).

135

CAPTULO 12 SECRECIONES DIVERSAS


PROPSITO: Detectar por medio de frote Gram y cultivo aerobio, la presencia de bacterias que causan infecciones con presencia de pus en la piel, ojos, odos, tejido subcutneo, heridas infectadas y otros sitios anatmicos diversos. A las bacterias que provocan la formacin de pus se les llama pigenas. En este tipo de infecciones, son de especial inters los llamados cocos pigenos gram-positivo, que son los siguientes: Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae

Menos frecuentemente pueden aislarse de este tipo de lesiones, otras bacterias tales como: Pseudomonas aeruginosa (de importancia en quemaduras infectadas) Escherichia coli Haemophilus influenzae Haemophilus aegyptius (en infecciones oculares) Neisseria gonorrhoeae Salmonella typhi (raro) Mycobacterium tuberculosis (raro)

MUESTRA: La muestra deber obtenerse segn el sitio anatmico, siempre con material estril y antes de tratamiento con antibiticos. En la mayora de los casos puede usarse hisopo estril (envuelto en papel individual, no dentro de frasco). Cuando la cantidad de pus es muy escasa, tomar la muestra con el extremo puntiagudo y delgado de un aplicador de madera estril que ha sido quebrado por los extremos. Tambin puede usarse la punta de una asa espatulada flameada y fra, bistur pequeo (nmero 15), o una lanceta estril.

137

Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frote para Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar las bacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con alguna microbiota normal adems de algn patgeno. 1. PIEL: Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesin intacta y madura, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el rea de donde se tomar la muestra para frote Gram y cultivo, con algodn empapado en alcohol y exprimido. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estril o bistur pequeo, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario (usar guantes de hule estriles) presionar a los lados de la lesin, hacia el centro, para exprimir el pus hacia afuera. Tomar una pequea gota de pus con el asa espatulada estril, punta de aplicador de madera estril (quebrado) o hisopo estril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden: Primero: Agar sangre de carnero al 5% Segundo: Agar chocolate Tercero: Agar manitol-sal (en caja de Petri) Cuarto: Agar MacConkey Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos. Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de la caja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidores del MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate, que no son inhibitorios.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE HERIDAS INFECTADAS SIGNOS Y SNTOMAS Secrecin serosa o purulenta Absceso: subcutneo o submucoso Eritema y edema Crepitacin (gas en tejidos) Dolor Ulceracin y formacin de fstulas BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Clostridium spp., Bacteroides spp. y otros anaerobios Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Enterococos

138

2. OJOS: Tomar la muestra con hisopo estril, as: bajar el prpado inferior, haciendo presin hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar guantes de hule estriles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden. Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra. Hacer un frote pequeo sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesivamente. En los cultivos oculares es muy importante incluir siempre agar chocolate, para lograr el crecimiento de las bacterias fastidiosas (difciles de cultivar) que causan conjuntivitis. Si en el frote Gram se observan diplococos gram-negativo, inocular un tubo de medio Thayer-Martin, selectivo para N. gonorrhoeae.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIN OCULAR SIGNOS Y SNTOMAS Secrecin conjuntival serosa o purulenta Hiperemia ocular Dolor ocular BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Haemophilus spp., especialmente H. aegyptius Moraxella lacunata Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa (reportar stat)

3. ODOS: En los casos de otitis media, generalmente no es necesario que el mdico otorrinolaringlogo puncione el tmpano (timpanocentesis). Este procedimiento jams debe practicarse por el personal del laboratorio. Proceder as: con un hisopo empapado en alcohol, y luego exprimido con papel absorbente, limpiar bien el odo externo. Introducir en el canal auditivo otro hisopo estril, despacio y sin tocar el pabelln de la oreja, con cuidado de no llegar al tmpano. No debe haber sangrado. Con el hisopo empapado en pus, inocular los siguientes medios: agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manito-sal y agar MacConkey, en ese or139

den. Con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra y sin frotar mucho, hacer un pequeo frote sobre porta-objetos limpio.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE OTITIS MEDIA SIGNOS Y SNTOMAS Secrecin tica purulenta Dolor agudo en odo y mandbula Cefalea pulstil Tmpano rojo y abultado BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Agudo: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Crnico: Pseudomonas aeruginosa Proteus spp. Anaerobios

4. MISCELNEOS: Antes de obtener la muestra, debe ponerse especial cuidado en desinfectar bien las reas que se espera estn colonizadas por abundante microbiota. El objeto de esta operacin, es evitar contaminaciones innecesarias que dificultan la interpretacin del frote Gram y el cultivo. El material para tomar las muestras debe ser estril. La toma de muestra debe ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesin seca y no de un sitio representativo, es completamente intil. El sangrado debe evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difciles o invasivas, que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervencin del microbilogo o del mdico. Los lquidos acuosos y de volumen grande, deben centrifugarse y luego hacer frote Gram y cultivo del sedimento. Inocular el medio de Thayer-Martin si se sospecha la presencia de Neisseria gonorrhoeae, y el medio de Lowenstein-Jensen si se sospecha la presencia de Mycobacterium tuberculosis. En el captulo 17 sobre Anaerobios, se explica que tipo de muestras deben sembrarse en anaerobiosis y como deben procesarse.

140

PROCEDIMIENTO: Teir el frote con la coloracin de Gram, segn el captulo correspondiente. Las muestras obtenidas siguiendo las instrucciones anteriores, y que fueron inoculadas directamente en un extremo de cada caja, deben diseminarse aspticamente en la superficie de los medios de cultivo. Para este propsito, usar dos asas en argolla (bien rectas y con la argolla circular y cerrada). Mientras una asa se flamea, la otra se enfra en el soporte que la mantiene vertical. Segn se indic, trabajar cerca del mechero encendido y con buena luz. Si en el frote Gram de una secrecin purulenta (especialmente de piel), se observan abundantes cocos gram-positivo, ligeramente ovalados, con tendencia a agruparse en pares o cadenas cortas y acompaados de abundantes leucocitos polimorfonucleares, inocular el agar sangre de carnero con cortadas (igual que el cultivo de garganta). Luego colocar con pinzas flameadas un disco de bacitracina de 0.04 unidades en la segunda estra, para acelerar y facilitar el aislamiento e identificacin de Streptococcus pyogenes. Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate a 36 C en jarro con candela encendida y humedad (papel absorbente hmedo en el fondo del jarro). La boca del jarro, donde enrosca la tapadera, debe frotarse espordicamente con la misma candela, para que la cera o parafina forme un sello. Cerrar bien el jarro, y luego sellar con masking tape. Incubar el agar manitol-sal y MacConkey aerbicamente. INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME: Es importante observar el frote lo ms pronto posible, ya que en base a este resultado se puede iniciar tratamiento preliminar. Observar los frotes Gram con aceite y el lente objetivo de inmersin. Es de gran importancia observar cual es la bacteria que predomina en el frote. Informar la cantidad de bactrias observadas, la cantidad de leucocitos y de qu tipo son. En el frote, los leucocitos deben observarse gram-negativo (rojos); si aparecen gram-positivo (morados), falta decoloracin y debe aplicarse ms alcohol-acetona. Examinar los cultivos despus de 18 a 24 horas de incubacin, con microscopio estereoscpico o lupa y buena luz. En el agar sangre buscar colonias pequeas beta hemolticas; si las hay, identificar un subcultivo en agar sangre de carnero con discos de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol y prueba de CAMP. Si hay co-

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lonias planas alfa hemolticas (hemlisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agar sangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae. De diversas secreciones, pueden aislarse Enterococcus spp. alfa hemolticos o no hemolticos, que pertenecen al grupo D de Lancefield. Son llamados enterococos por su probable origen fecal, y los ms importantes son: E. faecalis, E. faecium, E. durans y E. avium. Sub-cultivar a agar bilis-esculina; un color negro a las 24 horas de incubacin a 36 C indica hidrlisis de la esculina positiva. Debe tomarse en cuenta que esta reaccin tambin la dan positiva E. bovis y E. equinus, que no son enterococos. Para identificar correctamente a los enterococos, debe sembrarse en un caldo con 6.5% de cloruro de sodio y observar el crecimiento halfilo (soporta la sal), antes de 48 horas de incubacin, con viraje del prpura al amarillo y turbidez. El caldo con cloruro de sodio al 6.5%, se prepara fcilmente as: Caldo tripticasa soya ......................................15 gramos Cloruro de sodio .............................................. 32.5 gramos Agua destilada .................................................50 ml Servir 6 ml en tubos con tapn de rosca, esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos. Enterococcus spp. son cocos gram positivo, catalasa-negativo, se agrupan en pares y cadenas (no en racimos o ttrodos), y son halfilos (turbidez en el caldo con 6.5% de cloruro de sodio). Si se observa crecimiento de colonias grandes (ms de 1 mm de dimetro), blancas o amarillentas (tanto en el agar sangre de carnero como en el manitol-sal), identificar a Staphylococcus aureus por medio de la prueba de coagulasa. Colocar en porta-objetos o caja de Petri, una gota de plasma humano citratado (del que se usa para tiempo de protrombina). Suspender all una asada pequea del cultivo en agar sangre de carnero. Si se observa franca aglutinacin, la prueba de coagulasa es positiva; reportar: Se aisl Staphylococcus aureus, y efectuar la prueba de susceptibilidad. Si la prueba de coagulasa en lmina es dudosa, pero hay coloracin amarilla alrededor de las colonias en el agar manitol-sal (acidificado por la fermentacin del manitol), debe efectuarse la prueba en tubo. Proceder as: en un pequeo tubo de hemlisis, medir 0.5 ml de plasma citratado, suspender all una asada del cultivo en agar sangre, incubar de 4 a 24 horas a 36 C. Un cogulo bien formado indica prueba positiva de coagulasa en tubo. Observar la presencia de cogulo a las 4 horas de incubacin a 36 C; si no lo hay, reincubar a temperatura ambiente, para evitar la lisis del cogulo por la enzima estreptokinasa. La prueba de coagulasa en 142

tubo es ms sensible y confiable, pero si la reaccin da positiva en lmina es suficiente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por ciento de correlacin. Si la prueba de coagulasa es negativa, y la fermentecin del manitol tambin es negativa (colonias rosadas en manitol-sal), puede reportarse presuntivamente Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus coagulasa-negativo. Hacer el reporte de esta bacteria con prudencia, ya que en la gran mayora de los casos no causa infeccin, pero se aisla con frecuencia pues es miembro importante de la microbiota de la piel. Si la coagulasa es negativa y la fermentacin del manitol positiva, puede tratarse de Staphylococcus saprophyticus, hacer susceptibilidad a un disco con novobiocina, que debe presentar inhibicin. Si es necesario, hacer pruebas adicionales segn la tabla a continuacin. En caso de cocos gram-positivo con agrupacin en pares, paquetes o grupos de cuatro bacterias, descartar Micrococcus sp. por la prueba de OF-glucosa, es oxidativo.
PRINCIPALES PRUEBAS PARA LA DIFERENCIACIN DE TRES ESPECIES DEL GNERO Staphylococcus DE ORIGEN HUMANO* PRUEBA Coagulasa Fermentacin del manitol (produccin de cido) DNAsa Resistencia a novobiocina Crecimiento en anaerobiosis Hemlisis
*

S. aureus + + + + +

S. epidermidis + -

S. saprophyticus +/+ -

Tomado de: Isada, C.M. et al.: Infectious Diseases Handbook, 1995-96.

Si hay duda entre los gneros Staphylococcus y Streptococcus, hacer la prueba de catalasa, que es positiva en el caso de los estafilococos y negativa en los estreptococos. El gnero Haemophilus est formado por cocobacilos gram-negativo pleomrficos, que requieren el enriquecimiento de los medios de cultivo con sangre, para poder desarrollarse. Esto se debe a que como su nombre lo indica, requieren de varios factores sanguneos para su nutricin y reproduccin. La mayor parte de los aislamientos clnicos de este gnero de bacterias, puede identificarse hasta 143

gnero por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciacin hasta especie requiere de pruebas ms complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos microaeroflicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de los eritrocitos. Hacer la identificacin de Haemophilus sp. por medio de la prueba de satelitismo, as: 1. En agar chocolate se observan colonias muy pequeas, puntiformes, de menos de un milmetro de dimetro, translcidas y ligeramente mucosas. Hacer un frote Gram a estas pequeas colonias, con cuidado de tomar slo de ellas; predominan cocobacilos gram-negativo pequeos, casi esfricos y escasos bacilos largos y filamentosos (pleomorfismo). Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriarla en el centro de una caja de agar sangre de carnero al 5%, slo en una direccin. En sentido perpendicular a la estra efectuada, hacer una estra de Staphylococcus aureus, recta y a lo largo de toda la caja. Esta cepa pura puede provenir de otro cultivo, o de preferencia tener una cepa tpica de S. aureus, en cualquier agar inclinado en tubo, conservada en refrigeracin. Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36 C en jarro hmedo con candela. Una prueba positiva de satelitismo consiste en el crecimiento de las pequeas colonias del Haemophilus slo muy cerca de la estra de S. aureus. Hacer frote Gram a este crecimiento satlite para confirmar la morfologa.

2.

3.

4.

Si en el cultivo original tambin hay colonias de Staphylococcus sp., enterobacterias o algunas otras bacterias, puede observarse el satelitismo natural. Este consiste en el crecimiento de las pequeas colonias puntiformes de Haemophilus alrededor de colonias grandes. Este fenmeno se aprecia bien con el microscopio estereoscpico o lupa al efectuar la interpretacin.

144

Con fines prcticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismo positivo as: Cultivo de ojos, reportar: Se aisl Haemophilus aegyptius. Cultivo de cualquier otra secrecin: Se aisl Haemophilus influenzae. Hacer susceptibilidad en agar chocolate. Diseminar sobre toda la superficie de la caja varias asadas del crecimiento en el agar chocolate original, o de colonias satlites, con mucho cuidado de no tocar la estra de S. aureus. Las enterobacterias aisladas de cualquier secrecin en cantidad considerable, deben identificarse con medios diferenciales (TSI, LIA, MIO, urea y citrato), o de preferencia con el mtodo API (Bio Meriux). Bacilos gram-negativo no fermentadores pueden eventualmente aislarse de secreciones; efectuarles antibiograma y si es posible identificarlos.

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CAPTULO 13 SECRECIONES GENITALES


PROPSITO: Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos que infectan los rganos genitales femeninos y masculinos, en especial los siguientes: Neisseria gonorrhoeae Bacteria, causante de la gonorrea. Treponema pallidum Bacteria, causante de la sfilis. Gardnerella vaginalis Bacteria, bacilo gram-negativo causante de vaginosis. Candida albicans Hongo levaduriforme, causante de vulvovaginitis. Trichomonas vaginalis Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal. DIAGNSTICO DE GONORREA Muestra: La gonorrea es una enfermedad de transmisin sexual que en el hombre generalmente causa el aparecimiento de pus cremoso, amarillento o verdoso que sale de la punta del pene. En la mujer, este sntoma puede no ser evidente, lo que hace ms difcil el diagnstico. El agente causal de la gonorrea es la bacteria Neisseria gonorrhoeae un diplococo gram-negativo (rojo). Las neiserias presentan forma arrionada y se agrupan en pares que semejan granos de caf. El diagnstico de laboratorio de la gonorrea consiste en la obser147

Neisseria gonorrhoeae, frote Gram de pus uretral masculino.

vacin de la morfologa tpica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (slo en el hombre, no as en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae. Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se aislan de heces, sangre, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc. Los nios que nacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canal vaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En el pus de los ojos de estos nios puede observarse y cultivarse la bacteria. La toma de la muestra es diferente en el hombre y en la mujer. Obtener la muestra antes de tratamiento, as: Hombres: 1Tener listo el siguiente material: hisopos estriles, porta-objetos limpios, una caja de agar sangre y una caja o botellita de medio Thayer-Martin. Pedir al paciente que se ponga de pie y con ambas manos exprimir el pene hacia adelante, a manera de forzar a salir el pus de la uretra. Con hisopo estril de madera (quebrado) o palillo de dientes, tomar una gota del pus, tratando de no tocar la piel. Preparar cuidadosamente un frote delgado sobre porta-objetos de vidrio limpio, haciendo rodar el palillo o hisopo sobre la lmina, no frotar. El propsito de preparar el frote con estas precauciones es no romper los leucocitos presentes ni alterar la posicin de las bacterias. Tomar una gota de pus con la punta de algodn de un hisopo estril. Inmediatamente inocular la caja o botellita de Thayer-Martin; en botellitas frotar el hisopo en la superficie del medio desde el fondo. Simultneamente sembrar una caja de agar sangre de carnero, para aislar otros patgenos. Transportar las muestras rpidamente al laboratorio.

2-

3-

4-

5-

Mujeres: 1Idealmente la muestra debe obtenerse por el gineclogo, con la paciente acostada en posicin y en cama ginecolgicas, usando espculo para separar las paredes vaginales y observar el cuello uterino. Tener listo el mismo material que para la toma de muestra masculina. 148

2-

Con la punta de algodn de un hisopo estril tomar pus de donde se localice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra. Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un portaobjetos de vidrio. Tomar ms pus con otro hisopo estril, e inocular una caja o botellita de Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.

3-

Procedimiento: 12Colorear los frotes con Gram segn la tcnica ya explicada. Con asas flameadas y fras, diseminar por estras el inculo sobre toda la superficie de cajas o botellitas. Incubar tanto el agar sangre como el Thayer-Martin de 24 a 48 horas a 36 C en jarro hmedo con candela encendida. Si el Thayer-Martin est en botellitas, tomar la precaucin de dejarlas semi-abiertas, nunca bien cerradas.

3-

Interpretacin de resultados: Gram: buscar diplococos adosados en forma de granos de caf y gram-negativo (rojos). Anotar si se encuentran adentro de los leucocitos polimorfonucleares (intracelulares), o libres fuera de estas clulas (extracelulares). En el pus uretral masculino, la presencia de estas bacterias tpicas indica gonorrea. Reportar la cantidad y clase de leucocitos observados. En los frotes masculinos, los diplococos gram-negativo intracelulares se asocian a gonorrea aguda; extacelulares se asocian a gonorrea crnica. El frote Gram endocervical es de diagnstico limitado y correlaciona con el cultivo en Thayer-Martin en 65 por ciento de los casos. En el caso de las mujeres por lo general la imagen microscpica no es tpica y se observan muchas clases de bacterias, tanto gram-positivo como gram-negativo, de la abundante microbiota normal de la vagina. Algunas bacterias de esta microbiota pueden ser idnticas a Neisseria gonorrhoeae . Por estas razones el diagnstico de gonorrea femenina se basa en el cultivo y no en el frote Gram. Cultivo: Despus de 24 a 48 horas de incubacin a 36 C en jarro con candela, exami149

nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sustancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sustancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general slo crece este microorganismo en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeas (menos de 1 mm de dimetro), translcidas, brillantes y de bordes lisos. Hacer una coloracin de Gram de las pequeas colonias en Thayer-Martin, suspenderlas en una pequea gota de agua destilada o solucin salina fijar con calor y luego colorear. Si se observan diplococos gram-negativo, el cultivo es muy sospechoso de N. gonorrhoeae y debe efectuarse la prueba de oxidasa. Esta prueba demuestra la presencia de la enzima indofenol-oxidasa, que da al reactivo (dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua, 0.1 g en 10 ml de agua) un color morado o negro. La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo lquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnados con el reactivo. Para efectuar la prueba en discos de papel, proceder as: con pinzas flameadas, colocar un disco de oxidasa en una caja de Petri vaca. Humedecerlo con una gota de solucin salina. Con el asa calibrada de platino o palillo de dientes de madera tomar una o dos colonias tpicas frotar este crecimiento sobre el disco hmedo. Si aparece una coloracin morado-negruzco antes de 10 segundos en la parte del disco donde se frotaron las colonias, la prueba es positiva. Esta prueba debe interpretarse antes de 10 segundos, pues el oxgeno del aire puede ocasionar falsos positivos. Nunca usar el asa corriente en esta prueba, pues el alambre con hierro o nichrome causa por s solo una reaccin positiva. Efectuar la prueba con el reactivo lquido as: aplicar unas gotas del reactivo recin preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias toman rpidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es positiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia tpica sin reactivo, o una colonia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas a 36C en jarro hmedo con candela. Despus de incubar, hacer frote Gram al crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arrionados gramnegativo. Identificar la especie N. gonorrhoeae por medio de la prueba de oxidacin de los tres azcares: maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa) en el medio base de CTA (cistina-tripticasa agar). El medio CTA es un medio semi-slido; al medio base estril se le adiciona el carbohidrato en solucin acuosa (esterilizado por filtracin) 150

hasta una concentracin de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapn de rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo slo unos pocos milmetros por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapn de rosca e incubar de 48 a 72 horas a 37 C. Una coloracin amarilla en la superficie del medio indica reaccin positiva. Interpretar resultados segn esta tabla: Diferenciacin de dos especies de Neisseria de importancia clnica Especie Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis* *
Ver captulo 14

Glucosa + +

Maltosa +

Sacarosa -

Las pruebas de CTA frecuentemente dan resultados dudosos, tienen la desventaja que para preparar los medios en tubo se requiere esterilizar por filtracin la solucin del carbohidrato que debe ser muy puro. Es adecuado usar por lo menos slo el tubo con maltosa, que diferencia bien las dos especies. En trminos generales y segn las caractersticas del trabajo bacteriolgico en nuestro medio, se considera adecuado reportar (aunque sea presuntivamente) como Neisseria gonorrhoeae a aquellos aislamientos de secreciones genitales con morfologa tpica de Neisseria, oxidasa positivo y un frote Gram de la secrecin que indique la presencia de esta bacteria. Efectuar la prueba de susceptibilidad inoculando masivamente la bacteria en cultivo puro, en la superficie de una caja de agar chocolate (base Mueller-Hinton caliente + 5% sangre de carnero). Informe: Tomando en cuenta los procedimientos y comentarios anteriores, si se est seguro aunque sea presuntivamente, reportar la presencia de N. gonorrhoeae. Debe tomarse en cuenta que un reporte de este tipo implica que el o la paciente contrajeron una infeccin por contacto sexual. Un error del laboratorio puede por lo tanto causar serios problemas conyugales o dejar a un paciente infectado sin tratamiento.

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DIAGNSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE) Muestra y Procedimiento: El chancro blando o chancroide es una infeccin de transmisin sexual causada por una bacteria fastidiosa (difcil de cultivar) llamada Haemophilus ducreyi. Es un bacilo pequeo gram-negativo, que en frotes de lesiones genitales o cultivos se presenta formando cadenas de 5 a 20 bacilos, paralelas entre s o entrelazadas, por lo que se ha descrito esta agrupacin caracterstica como cardmenes de peces o huella digital. Las lesiones en los genitales son generalmente lceras bien circunscritas dolorosas con base necrtica y bordes socavados y blandos. De estas caractersticas se deriva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifiltico tpico). Las lesiones rara vez son ms grandes de 2 cm de dimetro, pueden haber lesiones mltiples por autoinoculacin y en ms de la mitad de los casos, los ganglios de la ingle estn endurecidos. El diagnstico del chancro blando se basa en las caractersticas clnicas y en el frote Gram directo de la lesin . Para efectuar el diagnstico de laboratorio del chancro blando, proceder as: Frotar un hisopo estril en los bordes y el fondo de la lesin y luego rodarlo cuidadosamente sobre un porta-objetos bien limpio, slo en una direccin para no destruir la agrupacin caracterstica de la bacteria. Dejar secar, fijar con calor y colorear con Gram. Interpretacin de Resultados e Informe: Observar cuidadosamente el frote Gram del material de la lesin con el lente de inmersin y aceite. Buscar bacilos gram-negativo agrupados en cadenas largas, paralelas o entrelazadas (cardmen de peces), los cuales deben predominar sobre otras formas de bacterias. Si se observa esta morfologa tpica reportar inmediatamente as: Se observan (escasos, regular cantidad o abundantes) bacilos gram-negativo, agrupados en cadenas largas (o cortas segn el caso) de morfologa compatible con Haemophilus ducreyi. Esta morfologa se considera presuntivamente diagnstica de chancro blando.

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DIAGNSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS La sfilis es una enfermedad que se transmite por contacto sexual. Es causada por Treponema pallidum, una bacteria del grupo de las espiroquetas, con forma alargada, enrollada a manera de tirabuzn y muy mvil. T. pallidum no se puede colorear con Gram ni cultivar in vitro, por estas razones es indispensable utilizar tcnicas especiales para demostrar su presencia. Generalmente la deteccin de anticuerpos inespecficos o reaginas, por la prueba de V.D.R.L. (Venereal Diseases Research Laboratory) y la deteccin de anticuerpos especficos contra esta bacteria por FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibodies-Absorbed), establecen el diagnstico de sfilis. Sin embargo, debe transcurrir algn tiempo despus del contagio para que las pruebas serolgicas se positivicen.

Treponema pallidum, campo oscuro de chancro.

En la mayora de los casos de sfilis primaria aparece una lesin tpica en los rganos genitales, llamada chancro. El chancro se caracteriza por ser una lcera no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una lesin muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse con guantes. Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colorantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observacin microscpica en fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no haya recibido tratamiento con antibiticos especialmente penicilina, que hace desaparecer rpidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede as: 1Tener listo el siguiente material: guantes de hule estriles, gotero con solucin salina, tubos capilares no heparinizados, bulbo de hule peque153

o para tubos capilares (de los que vienen en kits de serologa), portaobjetos, cubre-objetos, solucin salina estril en frasco, gasa estril y algodn con alcohol. 2Es imprescindible examinar bien al paciente en un cubculo privado con buena luz para localizar bien el chancro ms tpico. Usar los guantes puestos para este procedimiento, limpiar suavemente la superficie del chancro con gasa estril seca para causar ligera abrasin. Si hay costra levantarla con cuidado. Llenar un tubo capilar, aproximadamente un centmetro con solucin salina estril, dejarle puesto el bulbito de hule y tomarlo con la mano derecha. Con la mano izquierda, tomar la lesin entre los dedos pulgar e ndice y presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesin un lquido translcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe soportar el dolor sin anestesia. Causar leve abrasin con el tubo capilar sin causar sangramiento, rpidamente dejar caer en el centro de la lesin una gota de solucin salina del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesin, dos o tres veces ms. Debe usarse lo menos posible de solucin salina para no diluir la muestra, que debe ser un lquido lechoso ligeramente hemorrgico que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa estril si se considera ms fcil de manejar. Colocar con cuidado una gota de la muestra as obtenida en un portaobjetos limpio, cubrir con cubre-objetos a manera de no dejar burbujas en la preparacin en fresco. Descartar el tubo capilar en un lugar adecuado, tomando en cuenta que es material muy infectivo. Limpiar el bulbito de hule con algodn y alcohol, lo mismo que los guantes antes de quitrselos. Transportar la muestra con su respectiva solicitud de laboratorio lo ms pronto posible, y examinarla inmediatamente con campo oscuro. No debe retrasarse la observacin porque las espiroquetas pierden su movilidad tpica.

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Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el microscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de inmersin de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire. Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por debajo de la lmina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de la luz del microscopio al mximo, luego enfocar la muestra con seco dbil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el mximo de contraste, es decir los objetos ms brillantes y el campo ms oscuro. Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar de nuevo con el tornillo micromtrico y la altura del condensador. Una vez claramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura 12) con las siguientes caractersticas: a) b) c) d) e) f) Tamao ligeramente mayor al dimetro promedio de un eritrocito (8 micras). Muy finas alargadas y en forma de espiroquetas (como saca-corchos). Espiras regulares que no desaparecen al moverse. De 8 a 14 espiras en cada bacteria. Movimiento rpido de flexin en el centro y rotacin sobre su eje mayor (en la mayora de las muestras). Movimiento activo hacia adelante y hacia atrs (especialmente en muestras de chancros bien desarrollados con abundante material mucoide y viscoso).

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Dependiendo del estado de la lesin, puede observarse de un slo microorganismo en 20 campos hasta 50 por campo. El procedimiento de campo oscuro tambin sirve para observar T. pallidum de lesiones en piel de pacientes con sfilis secundaria. Para tomar la muestra forrar ambas ramas de una pinza con tubo de hule. Morder la lesin firmemente a manera de forzar la salida de lquido transparente el cual se observa en campo obscuro segn el procedimiento descrito.

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Interpretacin de resultados e informe: Debe tomarse en cuenta que espiroquetas de idntica morfologa forman parte de la microbiota de los genitales y la boca, por lo que son indiferenciables y pueden causar falsos positivos. Este factor debe ser tomado en cuenta por el mdico e interpretarse segn la sintomatologa del paciente, no es responsabilidad del laboratorio que debe reportar lo observado. Si la observacin en campo obscuro coincide con la mayora de las caractersticas descritas en el punto 10 anterior, reportar as: Campo oscuro: POSITIVO, se observan (escasas, regulares, abundantes) espiroquetas de morfologa compatible con Treponema pallidum. En caso que slo se observen leucocitos y eritrocitos escasos, pero no espiroquetas, reportar as: Campo oscuro: NEGATIVO, no se observan espiroquetas. Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difciles de colorear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnacin con sales de plata para observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisados para la preparacin del presente manual menciona este tipo de coloraciones, que han cado en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases, pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no se cuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que s cuente con esta facilidad.

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AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO Gerardo Arroyo, QB, CMIAC, MSc. Director de la Escuela de Qumica Biolgica Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia Universidad de San Carlos de Guatemala

INTRODUCCION Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el motivo de consulta ms frecuente en las clnicas de Ginecologa. Se manifiestan clnicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son importantes adems de las molestias que causan a la paciente, por las potenciales complicaciones al diseminarse a otros rganos como el tero o las trompas de Falopio y porque representan tambin un riesgo para el feto en la mujer embarazada. Segn el rea anatmica afectada por los procesos infecciosos, stos pueden clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis, salpingitis, enfermedad plvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ovricos. Esta clasificacin brinda las bases para el manejo clnico y tambin orienta sobre la etiologa, epidemiologa y tratamiento de los mismos. Es tambin importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiolgicas de la vida de la mujer (niez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se presentan con mayor o menor frecuencia algn tipo de microorganismos en particular. VAGINITIS La etiologa de la vaginitis depende de la edad y de la etapa fisiolgica de la paciente, por lo que debe dividirse en vaginitis en nias premenrquicas, vaginitis en la mujer en edad reproductiva y vaginitis en la mujer postmenopusica. Los sntomas y signos clnicos de la vaginitis incluyen flujo vaginal, prurito, eritema de la mucosa vaginal y exocervical y sangrado anormal. Estas manifestaciones son interpretadas de diversas maneras por las pacientes que pueden aceptar condiciones patolgicas como normales, o

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viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos que permiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso y cuando son situaciones fisiolgicas. La vaginitis es definida objetivamente cuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginal y/o sntomas asociados a la presencia de microorganismos patgenos. Los cambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba de amina positiva y presencia de clulas clave. 1. Vaginitis en nias premenrquicas

La vagina de las nias despus de 30 das de nacidas, es susceptible de infectarse con Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, as como por otros microorganismos como Streptococcus spp. y enterobacterias. Las infecciones por Candida spp. son sumamente raras en nias antes de la pubertad. El origen de las infecciones gonoccicas y clamidiales en nias, es el abuso sexual; y por el contrario, las infecciones por estreptococos y enterobacterias son por contaminacin ano-vaginal. Existen procesos inflamatorios no infecciosos que se diagnostican con mayor frecuencia en nias e incluyen vaginitis a cuerpo extrao, vaginitis atrfica, (asociada muchas veces a mala higiene perianal), as como cierto nmero de casos de vaginitis por Enterobius vermicularis. 2. Vaginitis en la mujer de edad reproductiva

Durante los aos de la vida reproductiva de la mujer, la vaginitis se presenta con una frecuencia de hasta 40% en embarazadas, 25% en mujeres de clnicas de planificacin familiar y 18% en adolescentes. Ms del 80% de los casos de vaginitis infecciosa son causadas por Trichomonas vaginalis (protozoo), Candida spp. (hongo) y la llamada vaginosis bacteriana (VB). Adems de estos microorganismos, tambin pueden aislarse estreptococos, estafilococos y enterobacterias. Otras etiologas incluyen la vaginitis ulcerativa que acompaa al Sndrome de Choque Txico, vaginitis asociada al uso de tampones, vaginitis por cuerpos extraos, vaginitis alergica al Nonoxinol-9 (espermicida) y otros tipos de vaginitis idioptica.

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3.

Vaginitis en mujeres postmenopusicas

Durante la etapa postmenopusica, el epitelio atrfico es susceptible de inflamaciones que tienen su origen principalmente en la falta de maduracin epitelial por ausencia de estmulo estrognico. La ms comn e importante en este grupo de pacientes es la vaginitis atrfica, la cual es en la mayora de los casos no infecciosa y responde satisfactoriamente al tratamiento local o sistmico con estrgenos. A. Tricomoniasis

La tricomoniasis es una enfermedad de transmisin sexual, que se presenta clnicamente con flujo vaginal profuso, de color amarillo-verdoso, a veces espumoso, de mal olor, acompaado de prurito, y eritema de la vagina y exocrvix. El eritema del exocrvix ha sido descrito como cuello en fresa. El pH del flujo vaginal es arriba de 5.0, la prueba de amina es generalmente positiva y al examen en fresco es posible observar Tropozoitos mviles de Trichomonas vaginalis, con un alto grado de sensibilidad y especificidad. La tricomoniasis ha sido identificada en 10.3% de mujeres embarazadas, 7.3% de mujeres en clnicas de planificacin familiar y en 8.5% de mujeres adolescentes (12 a 18 aos). B. Candidosis vulvovaginal

La candidiasis vulvovaginal, generalmente causada por Candida albicans, puede transmitirse sexualmente, la mayora de los casos se deben a contaminacin ano-vaginal. Clnicamente se presenta con prurito, irritacin vulvar y un flujo espeso de color blanco espeso que semeja leche cortada y que se adhiere a las paredes vaginales. El pH es muy parecido al normal o menor y la reaccin de amina es negativa. El examen en fresco revela la presencia de levaduras, micelio y pseudomicelio asociado a variable cantidad de leucocitos polimorfonucleares. En diferentes grupos de mujeres guatemaltecas se ha reportado una frecuencia de 12.6% en embarazadas, 5.3% en pacientes de planificacin familiar y 6.8% en adolescentes.

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C.

Vaginosis bacteriana

La VB es el tipo ms frecuente de vaginitis infecciosa. Se ha reportado en 20.1% de mujeres embarazadas, 13.5% de pacientes en planificacin familiar y en 1.7% de adolescentes. Esta enfermedad ha recibido diversos nombres, entre ellos vaginitis inespecfica, vaginitis por Gardnerella y vaginosis inespecfica entre otros, de los cuales el trmino VB es quizs el ms apropiado en vista de que el epitelio escamoso no muestra generalmente infiltracin leucocitaria. La VB se define como el sobrecrecimiento de otras bacterias sobre la microbiota normal de bacilos de Dderlein. Entre las bacterias que han sido aisladas de casos de VB se encuentran Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Eubacterium lentum, Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Mycoplasma hominis, Mobiluncus curtisii y Mobiluncus mulieri. La presentacin clnica incluye secrecin vaginal acuosa homognea, de color blanco grisceo que se adhiere a las paredes vaginales, con mal olor. El pH del flujo vaginal es generalmente mayor de 5.0, la reaccin de amina es positiva y es caracterstica la presencia de clulas clave. El frote Gram revela la ausencia de bacilos de Dderlein (gram-positivo) y abundantes bacilos pleomrficos gram-negativo. Los frotes Gram son de utilidad cuando se interpretan como presencia de microbiota normal, microbiota mixta o compatibles con VB. El diagnstico de esta condicin se establece cuando se encuentran presentes tres criterios de los antes mencionados, incluyendo entre ellos la presentacin clnica caracterstica. Los cultivos in vitro no son tiles para el diagnstico, en vista de que es posible aislar la mayora de los microorganismos mencionados en pacientes sanas. CERVICITIS La cervicitis es la inflamacin del canal endocervical y las glndulas endocervicales y en la mayora de los casos, los sntomas son vagos e inespecficos. Los agentes infecciosos ms importantes son Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Adems de estos microorganismos son importantes el virus Herpes simplex y por extensin de los procesos infecciosos vaginales, Trichomonas vaginalis y Candida albicans. En nuestro medio se ha reportado cervicitis en un 10.6% de mujeres embarazadas (gonorrea=0.7% y clamidia=5.3%), 9.2% de pacientes en clnicas

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de planificacin familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de las adolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%). El diagnstico clnico de cervicitis no es posible en muchos casos pues adems de que los sntomas no son siempre caractersticos, los signos pueden confundirse con otras condiciones. Por esta razn es importante hacer nfasis en los aspectos objetivos que correlacionan mejor con el diagnstico de cervicitis. Entre ellos se encuentra la observacin de muco-pus procedente del canal endocervical. Esto se efecta por medio de la prueba del hisopo endocervical, la cual se basa en que al retirarlo del canal muestra coloracin amarilla, verde o roja que indica muco-pus o friabilidad de la mucosa, y la presencia de ms de 10 leucocitos polimorfonucleares por campo de 40X. El diagnstico etiolgico debe buscar la presencia de N. gonorrhoeae y C. trachomatis. El diagnstico microbiolgico de clamidia se basa en la deteccin de antgenos del microorganismo mediante tcnicas de ELISA o pruebas rpidas. Las tcnicas citolgicas que utilizan Papanicolaou o Giemsa para identificar clulas con inclusiones, han demostrado muy baja sensibilidad aunque una especificidad aceptable, por lo que no deben utilizarse para diagnstico.

OTROS AGENTES ETIOLGICOS Mycobacterium tuberculosis Actinomyces spp. y Arachnia sp. Entamoeba gingivalis (protozoo) Entamoeba histolytica (protozoo) Enterebius vermicularis (helminto) endometritis, salpingitis colonizacin uterina en pacientes con dispositivos intrauterinos vaginitis, cervicitis vaginitis en nias

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CAPTULO 14 LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y FLUIDOS CORPORALES


PROPSITO: Demostrar por medio de bacterioscopa con Gram y cultivo, la presencia de bacterias en estas muestras, que normalmente deben ser estriles. Las bacterias que tienen mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son: Gram negativo: Neisseria meningitidis (causa meningitis meningoccica severa) Haemophilus influenzae (especialmente en nios de 6 meses a 4 aos de edad) Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos y post-craneotoma) Pseudomonas aeruginosa Gram-positivo: Streptococcus pneumoniae (muy importante) Staphylococcus aureus Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos) Streptococcus pyogenes Listeria monocytogenes (raro) Otros microorganismos importantes: Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans y Treponema pallidum (bacterias). Cryptococcus neoformans y Candida albicans (hongos levaduriformes) V arios virus (enterovirus, paperas y otros). MUESTRA: Las muestras incluidas en los fluidos corporales son: Lquido cefalorraqudeo (conocido tambin como fluido espinal o LCR) 163

Lquido ventricular (lquido cisternal, lquido craneal) Fluido abdominal (lquido peritoneal o asebico, lquido de parasentesis, lquido de dilisis, bilis) Lquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del trax) Lquido pericrdico Lquido sinovial Mdula sea, sangre (ver captulo de hemocultivo y mielocultivo) Por lo general estas muestras son obtenidas por el mdico que solicita su anlisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibiticos y las debe colectar en recipientes estriles proporcionados por el laboratorio. Las muestras deben transportarse inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no despus de 30 minutos de recolectadas. Rotular con el nombre del paciente, nmero de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el mdico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol-cido resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio. Los sntomas de irritacin de las meninges (membranas que cubren el cerebro y la mdula espinal), que puede ser causada por microorganismos son: fiebre, dolor de cabeza, vmitos, rigidez y dolor de nuca, reflejos aumentados, estupor a coma y petequias en la piel. En los nios estos sntomas son vagos e inespecficos, por esta razn slo los resultados del laboratorio pueden establecer el diagnstico. En caso de meningitis bacteriana, el lquido cefalorraqudeo (LCR) generalmente es purulento (turbio), con abundantes leucocitos (generalmente ms de 1,000 por milmetro cbico), con predominio de neutrfilos polimorfonucleares y glucosa disminuida (consumida por las bacterias). En la meningitis tuberculosa, generalmente el LCR es lmpido y su glucosa normal.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIN SEA Y ARTICULACIONES SIGNOS Y SNTOMAS Edema articular Eritema y calor Dolor al movimiento Dolor a la palpacin Rayos X: sinovitis u osteomielitis BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae Streptococcus pyogenes Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pneumoniae Enterobacterias Micobacterias

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PROCEDIMIENTO: 1. El mdico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo) en dos tubos estriles 13 x 100 con tapn de rosca o frasquitos estriles que cierren bien. Enviarlos inmediatamente al laboratorio. Mantener la muestra dentro de la incubadora a 36C mientras se procesa. En caso de recibirse un solo frasquito separar aspticamente en dos porciones. Uno de los tubos no se centrifuga, enviarlo a donde corresponda para citologa (recuento total de clulas), recuento diferencial (frmula) y anlisis qumico. El otro tubo sirve para el anlisis microbiolgico. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm). Decantar aspticamente, tapar agitar y procesar slo el sedimento. Sembrar una asada del sedimiento en cada uno de estos medios: Agar sangre de carnero al 5% Agar chocolate MacConkey Sabouraud (hongos), no Micosel Tioglicolato Lowenstein-Jensen (slo si se solicita) Diseminar por estras en toda la superficie de los medios slidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo con candela encendida. Incubar todos los medios a 36 C, excepto el Sabouraud que se incuba a 27C (o a temperatura ambiente para aislamiento de hongos patgenos especialmente Cryptococcus neoformans). En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotes pequeos (de aproximadamente un centmetro de dimetro) en el centro de la lmina. Si el material es muy escaso poner una gota del sedimiento, dejar secar, luego colocar otra gota encima y dejar secar de nuevo. Colorear un frote con Gram y otro con Ziehl-Neelsen.

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Fig. 11 MARCHA BACTERIOLGICA PARA LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)

Muestra: LCR obtenido siempre por el mdico, en dos recipientes estriles, ya sea tubos o frasquitos preparados por el laboratorio. 1. Enviar un recipiente sin centrifugar a Citologa y Qumica 2. Centrifugar 15 minutos, decantar aspticamente y procesar sedimento GRAM ZIEHL-NEELSEN sedimento

3. RUTINARIAMENTE SEMBRAR EN

OPCIONAL

agar sangre agar MacConkey de carnero chocolate Sabouraud 4. Incubar en jarro con candela

Tioglicolato Lowenstein-Jensen NO INCLINAR

5. Incubar aerbicamente a 36o C, Sabouraud a 27o C

6. Aislamiento e identificacin de bacterias, micobacterias u hongos


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INTERPRETACIN DE RESULTADOS: Lo ms pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente de inmersin. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inmediato de pacientes con infeccin grave de las meninges, su observacin debe hacerse con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologas: 1. Diplococos gram-negativo (rojos), arrionados, dispuestos en parejas como granos de caf, idnticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfologa compatible con N. meningitidis. Dar alerta al mdico inmediatamente. Cocobacilos gram-negativo (rojo plido) pleomrficos, con escasas formas bacilares: morfologa compatible con H. influenzae, agente de meningitis en nios de 6 meses a 4 aos; raro en adultos. Cocos gram-positivo (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en parejas o cadenas cortas, la cpsula se insina como un halo claro alrededor de las bacterias: En LCR morfologa compatible con S. pneumoniae . En otros fluidos puede ser S. pyogenes con mayor frecuencia. Bacilos gram-negativo (rojos) de coloracin slida, no pleomrficos, bacilos alargados: morfologa compatible con enterobacterias o pseudomonas (E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, etc.) Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales, gram-positivo, se insina cpsula, hacer tinta china para demostrar la presencia de la levadura capsulada C. neoformans. En el Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-cido resistente (rojos), cortos, algunos con coloracin dispareja en forma de grnulos: morfologa compatible con M. tuberculosis.

2.

3.

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5.

6.

Si hay bacterias en los frotes, el laboratorio est en la obligacin de alertar al mdico de inmediato. Reportar el Gram segn se indic. Es muy importante sealar la cantidad y clase de leucocitos presentes. Si la morfologa es tpica, informar con que bacteria es compatible segn las explicaciones anteriores. Si no hay seguridad, reportar slo el tipo y cantidad de bacterias observadas.

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Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubacin a 36C. Si no se observa crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubacin tampoco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar Negativo a las 48 horas de incubacin a 36C en aero-anaerobiosis. Si se observa algn crecimiento a las 24 48 horas, comparar con la siguiente tabla:
Crecimiento en BACTERIA Agar Sangre N. meningitidis H. influenzae S. pneumoniae Enterobacterias y pseudomonas Cryptococcus neoformans Anaerobios -/+ + + Agar Chocolate + + + + MacConkey + Tioglicolato +/+ Sabouraud + +

+ -

Hacer frote Gram de las colonias para confirmar morfologa e identificar segn los captulos anteriores, as:
BACTERIA N. meningitidis COLONIAS Pequeas (1 mm de dimetro o menos) brillantes, bordes enteros, no hemolticas) Muy pequeas (puntiformes) brillantes, bordes enteros, no hemolticas) Pequeas (1 mm de dimetro o ms) aplanadas, alfa hemolticas Grandes, brillantes, bordes lisos crecen en todos los medios. Notar en MacConkey si son lactosa positivo (rojas) o negativo (incoloras) PRUEBAS DE CONFIRMACIN Oxidasa*, azcares en CTA (ver tabla en captulo 13)

H. influenzae

Prueba de satelitismo con Staphylococcus aureus** Inhibicin por disco de optoquina (ver captulo 8) TSI/LIA/MIO/urea/citrato; o API. Aglutina-cin con antisueros

S. pneumoniae

Enterobacterias

* **

Aglutinar con antisueros especficos, los grupos ms frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo. Prueba de satelitismo para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).

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Efectuar la prueba de satelitismo as: 1. 2. 3. Obtener un cultivo puro en agar chocolate en jarro hmedo con candela, a 36 C. Tomar una asada y estriar en la superficie de una caja de agar sangre, slo en una direccin. Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus (de otro cultivo cualquiera o de preferencia una cepa pura mantenida en refrigeracin). Hacer con el asa en argolla una sola estra recta, perpendicular a las estras del Haemophilus. Incubar en jarro con candela 24 horas a 36 C y luego examinar con lupa y buena luz. Una reaccin positiva se manifiesta por el crecimiento de pequeas colonias puntiformes y translcidas que crecen slo muy cerca de la estra de S. aureus.

4. 5.

INFORME: El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el da en que se recibi la muestra. Despus informar lo ms pronto posible el resultado del cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observadas (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo: Primer informe, entregar el mismo da de obtencin de la muestra: Frote Gram: Se observan escasos diplococos gram-positivo, lanceolados y capsulados, de morfologa compatible con S. pneumoniae. Leucocitos polimorfonucleares: regular cantidad. Cultivo: Pendiente Segundo informe, entregar el da que termina la identificacin: Cultivo: Se aisl S. pneumoniae. Antibiograma.

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CAPTULO 15 TEJIDOS Y BIOPSIAS


PROPSITO: Demostrar por frote y cultivo la presencia de bacterias en piezas de tejidos de sala de operaciones, o piezas an ms pequeas obtenidas por biopsia. Las bacterias que pueden estar presentes son muy variadas. Anteriormente slo se efectuaba histopatologa de estas muestras, en la actualidad el examen microbiolgico es tambin de gran ayuda diagnstica. Adems, la microbiologa post-mortem contribuye a elucidar las infecciones mortales. MUESTRA: Este tipo de muestras son exclusivamente obtenidas por el mdico en condiciones aspticas, y depositadas en recipientes estriles de boca ancha con un poco de solucin salina estril, proporcionados por el laboratorio. Debe obtenerse suficiente cantidad y no debe adicionarse ninguna sustancia fijadora como formol. Despus de procesarse, la muestra debe almacenarse en refrigeracin o congelacin, en solucin salina estril para que no se deseque, con el propsito de preservarla para nuevos estudios, ya que generalmente hay riesgo para el paciente al tomar nueva muestra. De lcera o tractos fistulosos debe efectuarse curetaje profundo tomando parte del tejido de la pared del tracto fistuloso. Debe desinfectarse la piel circundante e introducir un catter venoso de plstico estril, y luego aspirar con jeringa estril. De las lceras obtener material de la base. Si se justifica, el material de estas muestras debe obtenerse en algn medio de transporte anaerbico adecuado (ver captulo 17). En el caso de material de fstulas, debe hacerse una preparacin en fresco para buscar grnulos de Actinomyces, Nocardia u hongos. Para obtener cultivos de material de autopsia, la piel debe ser desinfectada aplicando una esptula caliente para quemar la piel. Si se trata de un rgano, debe sumergirse en agua hirviendo por 5 a 10 segundos, y luego debe disecarse con instrumentos estriles y tomar para cultivo material del centro. La mitad de la

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muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estril con un poco de solucin salina estril al laboratorio de microbiologa. PROCEDIMIENTO: No es adecuado inocular los medios slo tocando o frotando la pieza con una asa. Debe hacerse de la siguiente manera: 1Colocar la pieza con pinzas estriles en una caja de Petri estril. Con tijeras estriles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de tejido estril o, si no lo hay, a un pequeo mortero estril. Usar arena esteril para triturar bien la muestra. Si se hace en un mortero, adicionar una pequea cantidad de solucin salina estril. Dejar sedimentar para cultivar el sobrenadante. Si se sospecha la presencia de hongos, no triturar, slo picar finamente con tijeras estriles. Con aguja y jeringa estriles, aspirar aspticamente una porcin del sobrenadante. Inyectar aproximadamente un mililitro en un frasco de caldo para hemocultivo. Seleccionar los otros medios de cultivo a inocularse con base en el o los microorganismos sospechados, u observados en una coloracin de Gram. Si se desconoce la historia del paciente inocular con una gota del resto de la muestra en la jeringa los siguientes medios: agar sangre de carnero al 5%, agar chocolate, MacConkey, manitol-sal, tioglicolato, Sabouraud, mycosel y Lowenstein-Jensen. Incubar a 36C el agar sangre y el agar chocolate en jarro hmedo con candela; MacConkey, manitol-sal, tioglicolato y Lowenstein-Jensen, aerbicamente a 36C, y los tubos de Sabouraud y mycosel a 27C o a temperatura ambiente. Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen. Las muestras de sangre de autopsia deben procesarse como hemocultivo, sin importar la presencia de cogulos.

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INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME Si se observa crecimiento en los medios despus de 24 a 48 horas de incubacin, hacer las coloraciones y sub-cultivos adecuados para efectuar la identificacin segn el caso. Pueden encontrarse los siguientes microorganismos con inters clnico: anaerobios como Actinomyces sp., bacterias aerobias comunes, Nocardia sp., hongos sistmicos y Mycobacterium sp. Descartar cultivos para bacterias a las 48 horas de incubacin, cultivos para hongos despus de dos semanas y el LowensteinJensen despus de 6 semanas de incubacin. Reportar segn las normas de los captulos anteriores.

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ANUNCIO ZITHROMAX

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DOCUMENTO ZITHROMAX

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CAPTULO 16 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)


PROPSITO La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in vitro a qu antibiticos es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente. Este mtodo permite al mdico escoger el antibitico ms adecuado con base cientfica proporcionada por el laboratorio, y evita dar tratamientos tiles. Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infeccin son inhibidos por concentraciones de antibitico obtenidas con un rgimen usual de dosificacin. Moderadamente susceptible: Cuando los microorganismos son inhibidos por concentraciones altas de antibitico. Resistente: Si los microorganismos que causan la infeccin, toleran concentraciones de antibitico superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por medio de un rgimen usual de dosificacin. Intermedio (Indeterminado): Hoy en da se considera como prueba errtica que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una poblacin bacteriana resistente. El nombre Antibiograma es adecuado para designar esta prueba, pero no lo es Prueba de sensibilidad, pues las bacterias no sienten la accin de los antibiticos, son susceptibles a estos medicamentos. La tcnica que debe usarse es la de Bauer-Kirby, ligeramente modificada por el Comit Nacional de Estndares para Laboratorios Clnicos de Estados Unidos (NCCLS). MEDIO DE CULTIVO Por medio de la tcnica de Bauer-Kirby modificada se obtienen resultados confiables, reproducibles y de gran utilidad clnica siempre y cuando se sigan al pie de la letra las instrucciones de este captulo. Es una tcnica relativamente sen177

cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentracin del inculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta tcnica slo sirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aerbicas o facultativas de crecimiento rpido: Staphylococcus aureus Enterobacterias Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp. y Neisseria spp. debe hacerse en MuellerHinton con 5% de sangre, achocolatado. Preparar el agar Mueller-Hinton segn las indicaciones del productor y con las siguientes caractersticas: 1Las cajas de Petri de tamao estndar (100 mm de dimetro), deben llenarse con aproximadamente 25 ml del agar lquido ya autoclaveado, a manera de dar un medio de 4 mm de grueso. Idealmente deben usarse cajas de Petri descartables de plstico, de 150 mm de dimetro con la misma profundidad, para poder colocar los discos ms separados 2Deben guardarse en la refrigeradora dentro de bolsas plsticas selladas, (de 2 a 8 C), por no ms de 7 das. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con potencimetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un pequeo beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario, antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N. De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36 C para comprobar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas para efectuar antibiograma despus de ser incubadas. Inmediatamente antes de usar el medio Mueller-Hinton, secarlo a 36 C. Colocar las cajas en la incubadora por 20 minutos con el medio arriba y la tapadera ligeramente abierta. 178

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Almacenaje de discos con antibiticos Para que el procedimiento proporcione datos con verdadera correlacin clnica, en primer lugar debe tomarse la siguiente precaucin para el almacenaje de los discos de papel impregnados con los diferentes antibiticos, que se obtienen comercialmente. Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones, para que no pierdan su potencia: 1Congelar (idealmente a -20 C) los discos de penicilina, ampicilina, carbenicilina y cefalosporinas. Descongelar peridicamente slo los discos que sern usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos dos horas antes de usarse. Los discos del resto de antibiticos pueden almacenarse refrigerados sin congelacin. De preferencia con una pastilla desecante. Si se usan los cartuchos de discos montados en dispensador, introducir dos pastillas desecantes de las que vienen con los discos y cerrar bien despus de usar.

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PROCEDIMIENTO: Efectuar el antibiograma as: 1Con el asa flameada y fra tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual morfologa del cultivo original en cualquier medio slido. Debe trasladarse siempre un cultivo puro. Inocular un tubo con 4 ml de caldo tripticasa soya o caldo infusin de cerebro y corazn (BHI). Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36 C, hasta que aparezca una ligera tubidez. Ajustar la turbidez del caldo a la turbidez del estndar de MacFarland 0.5. Si el caldo es ms turbio que el estndar agregarle ms caldo o solucin salina estril. Comparar ambos tubos (muestra y estndar) con buena luz y frente a un fondo blanco con una lnea negra para evaluar visualmente la turbidez.

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Preparar el estndar 0.5 de MacFarland as: mezclar 0.5 ml de cloruro de bario 0.048 M (1.175 g BaCl2. 2H2O en baln de 100 ml, aforar con agua destilada), ms 99.5 ml de cido sulfrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 en baln de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierren bien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevo estndar cada 6 meses. 5Antes de quince minutos de diludos los caldos, inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton as: introducir un hisopo estril en el caldo de turbidez igual al estndar; exprimir bien el hisopo presionndolo firmemente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en tres direcciones opuestas sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. En caso de urgencia puede sembrarse la prueba con la muestra directa, slo si el frote Gram revela una sola clase de bacteria (LCR o secreciones varias), pero esto debe evitarse y considerarse preliminar. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos, pero no ms de 15 minutos, con la tapadera cerrada. Con pinzas estriles o dispersador especial, colocar los discos impregnados de antibiticos a manera de que queden lo ms separados entre s que sea posible. Con las pinzas flameadas y fras presionar los discos ya colocados para adherirlos bien al medio de cultivo. Escoger los antibiticos a colocar dependiendo de la bacteria estudiada, segn el listado bsico actualizado de cada laboratorio y de acuerdo con los listados oficiales del NCCLS (1995), que aparecen en las pginas 182 y 183 de este manual. Es preferible usar discos comerciales y no los obsequiados por el productor del antibitico. Al recibir discos obsequiados por el productor del antibitico, debe verificarse que stos sean elaborados por una compaa especializada (por ejemplo: DIFCO o BBL), y no por la misma compaa productora del antibitico. Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas a 36 C, nunca usar jarro con candela (excepto para Haemophilus spp. y Neisseria spp.)

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Fig. 12 MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA

1. Tomar 4 5 colonias de igual morfologa del cultivo original 2. Inocular un tubo con 4 ml de caldo

Cualquier medio slido

3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36 C hasta alcanzar la turbidez del estndar 0.5 de MacFarland Agar Mueller-Hinton 5. Sembrar caja pre-secada en tres direcciones opuestas

4. Empapar hisopo estril, exprimir bien contra las paredes del tubo

7. Incubar por 16 a 18 hrs a o 36 C y medir dimetros de halos de inhibicin; interpretar segn tablas
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6. Dejar secar de 3 a 5 minutos (no ms de 15) y colocar discos de antibiticos para gram-positivo o gram-negativo

ANTIBITICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBEN USARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS Segn: NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), M7-A3 (M100-56), 1995. Enterobacterias: Grupo A, prueba inicial, reportar siempre: 11. Ampicilina* 12. Cefazolina* 13. Cefalotina* 14. Gentamicina* Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente: 15. Mezlocilina o piperacilina 16. Ticarcilina 17. Ampicilina-sulbactam* o amoxicilina-cido clavulnico 18. Piperacilina-tazobactam 19. Ticarcilina-cido clavulnico 10. Cefmetazol 11. Cefoperazona 12. Cefotetan 13. Cefoxitina* 14. Cefamandol/cefonicida/cefuroxima 15. Cefotaxima*/ceftizoxima/ceftriaxona 16. Imipenem 17. Amikacina 18. Ciprofloxacina* 19. Trimetoprim-sulfametoxazol* * De utilidad en infeccin urinaria, adems de carbenicilina, cinoxacina, lamefloxacina/norfloxacina/ofloxacina, loracarbef y nitrofurantona.

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Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de la familia Enterobacteriaceae: Grupo A, prueba inicial, reportar siempre: 11. Mezlocilina o ticarcilina 12. Piperacilina 13. Gentamicina 14. Ceftazidima Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente: 15. Ticarcilina-cido clavulnico 16. Cefoperazona 17. Aztreonam 18. Imipenem 19. Amikacina 10. Tobramicina 11. Ciprofloxacina 12. Trimetoprim-sulfametoxazol Staphylococcus spp.: Grupo A, prueba inicial, reportar siempre: 11. Penicilina 12. Oxacilina o meticilina Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente: 13. Azitromicina 14. Vancomicina 15. Clindamicina 16. Claritromicina 17. Eritromicina 18. Trimetoprim-sulfametoxazol

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: 1Despus de 16 a 18 horas de incubacin, examinar con buena luz las cajas ya crecidas. Medir en milmetros el dimetro de los halos de inhibicin completa 183

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con una regla por detrs de la caja de Petri, o con patrones especiales. No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhibicin o crecimiento muy dbil (80% de inhibicin). Sin embargo, si se observan mltiples colonias dentro del halo de inhibicin, stas deben sub-cultivarse para descartar contaminacin. En caso de tratarse de la misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias que crecen dentro del halo. El velo de crecimiento de Proteus sp. dentro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el mrgen donde se inicia el crecimiento grueso. 3En el caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual no debe tomarse en cuenta. En caso de urgencia puede efectuarse una lectura preliminar despus de 5 6 horas de incubacin, siempre y cuando la caja se reincube y posteriormente se enve el informe definitivo. Transformar las medidas de los dimetros de los halos de inhibicin en milmetros, a: resistente, intermedio, moderadamente susceptible o susceptible por medio del uso de tablas actualizadas. Se deben utilizar las tablas de interpretacin que son oficiales en Estados Unidos: National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Para este propsito, utilice las tablas de las pginas 185, 186 y 187 de este manual.

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INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIN (mm) PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae
Agente antimicrobiano Amikacina Amoxicilinacido clavulnico Ampicilina Ampicilina-sulbactam Aztreonam Cefamandol Cefazolina Cefmetazol Cefonicida Cefoperazona Cefotaxima Cefotetan Cefoxitina Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona Cefuroxima (oral) Cefuroxima (parenteral) Cefalotina Cloranfenicol Ciprofloxacina Gentamicina Imipenem Kanamicina Mezlocilina Netilmicina Piperacilina Tetraciclina Ticarcilina Moderadamente Contenido Resistente Intermedio Susceptible susceptible del disco (mcg) 130 20/10 110 10/10 130 130 130 130 130 175 130 130 130 130 130 130 130 130 130 130 135 110 110 130 175 130 100 130 175 14 13 13 11 15 14 14 12 14 15 14 12 14 14 14 13 14 14 14 12 15 12 13 13 17 12 17 14 14 15-18 15-19 13-14 18-20 14-17 18-20 13-14 14-15 13-17 16-20 15-16 14-17 14-16 12-14 16-21 15-17 15-17 13-15 15-17 16-20 15-22 13-15 15-17 15-17 15-19 14-20 15-22 15-17 15-17 17 18 17 15 22 18 18 16 18 21 23 16 18 18 20 21 23 18 18 18 21 15 16 18 21 15 21 19 20

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(Continuacin)
Agente Antimicrobiano Ticarcilina-cido clavulnico Tobramicina Trimetoprimsulfametoxazol Reportar slo en urocultivos: Carbenicilina Cinoxacina Nitrofurantona Norfloxacina Ofloxacina Sulfisoxazol Trimetoprim 100 100 300 310 315 250 300 315 19 14 14 12 12 12 10 15-18 15-16 13-16 13-15 13-16 11-15 20-22 23 19 17 17 16 17 >16 Moderadamente Contenido Resistente Intermedio Susceptible del disco (mcg) susceptible 75/10 310 1.25/23.75 14 12 10 13-14 11-15 15-19 20 15 16

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIN (mm) PARA Staphylococcus spp.
Agente antimicrobiano Amoxicilina- cido clavulnico Ampicilina Ampicilina-sulbactam Cefazolina Cefotaxima Ceftriaxona Cefalotina Cloranfenicol Ciprofloxacina Clindamicina Eritromicina Gentamicina Imipenem Contenido del disco 120/10 mcg 10 mcg/ml 10/10 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 35 mcg 32 mcg 15 mcg 10 mcg 10 mcg Resistente Intermedio 19 28 11 14 14 13 14 12 15 14 13 12 13 15-20 14-22 13-14 14-15 13-17 16-20 15-17 15-17 15-22 14-20 15-17 12-14 Moderadamente Susceptible susceptible 20 29 15 18 23 21 18 18 21 21 23 15 16

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(Continuacin)
Agente antimicrobiano Meticilina Ofloxacina Oxacilina Penicilina G Rifampicina Tetraciclina Trimetoprimsulfametoxazol Vancomicina Nitrofurantona Norfloxacina Sulfisoxazol Trimetoprim Contenido del disco 135 mcg 315 mcg 311 mcg 10 U 315 mcg 330 mcg 1.25/23.75 mcg 330 mcg 300 mcg 310 mcg 250 300 mcg 315 mcg Resistente Intermedio 9 12 10 28 16 14 10 39 14 12 12 10 10-13 12 11-12 28 17-19 15-18 10 10-11 15-16 13-16 Moderadamente Susceptible susceptible 9 13-15 10 28 16 314 11-15 39 14 12 13-16 11-15 14 16 13 29 20 19 16 312 17 17 17 16

Reportar slo slo en uro: Reportar en urocultivos:

Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basado en: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova, Pennsylvania, U.S.A.

CONTROL DE CALIDAD Para controlar la efectividad y reproducibilidad de la prueba, cada laboratorio debe mantener refrigeradas en agar inclinado y sub-cultivar semanalmente las siguientes dos cepas bacterianas estndar, que producen patrones de suscepti-bilidad conocidos: a) b) Escherichia coli ATCC 25922 (gram-negativo) Staphylococcus aureus ATCC 25923 (gram-positivo)

La susceptibilidad de las dos cepas patrn debe probarse con cada lote nuevo 187

de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivos refrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre. Las zonas de inhibicin de los patrones conocidos sirven para evaluar la precisin de la prueba. Los halos de inhibicin de las dos cepas control deben estar entre los rangos de la siguiente tabla:
LMITES ACEPTABLES DE LOS HALOS DE INHIBICIN (mm) QUE DEBEN OBTENERSE CON LAS CEPAS CONTROL Y ALGUNOS ANTIBITICOS Antibitico Amikacina Ampicilina Ampicilina-sulbactam Aztreonam Ceftazidima Clindamicina Cloranfenicol Eritromicina Gentamicina Penicilina-G Tetraciclina Tobramicina Trimetoprim-sulfametoxazol S. aureus ATCC 25923 -------27 - 35 29 - 37 --------------24 - 30 19 - 26 22 - 30 19 - 27 26 - 37 19 - 28 -------24 - 32 E. coli ATCC 25922 19 - 26 16 - 22 20 - 24 28 - 36 25 - 32 -------21 - 27 -------19 - 26 -------18 - 25 18 - 26 24 - 32

FUENTES COMUNES DE ERROR: 12345Usar otro medio que no sea Mueller-Hinton. Mala estandarizacin de la turbidez del inculo. Mala preparacin del medio, no ajustar el pH entre 7.2 y 7.4. Usar medio vencido o cajas mal almacenadas. Mal almacenaje de los discos con antibiticos. 188

161718191011121314151617-

Mala preparacin o almacenaje del estndar 0.5 de MacFarland. No exprimir el hisopo en las paredes del tubo. Retraso entre la preparacin del inculo y la siembra (aumenta la concentracin bacteriana). Retraso en la aplicacin de los discos en las cajas ya inoculadas. Exceso de incubacin de las cajas. Uso de jarro con candela o incubacin a otra temperatura que no sea 36 C. Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubacin. Mala medicin de los halos de inhibicin. Cultivos mixto, no puros. Aplicacin de la tcnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento. No usar las cepas control. Errores de transcripcin de resultados.

La prueba de susceptibilidad antimicrobiana de difusin sobre agar, propuesta desde 1966 por Bauer, Kirby, Sherris y Truck, contina siendo aceptable y prctica. Es indispensable hacer notar el enorme avance que se ha logrado recientemente en la miniaturizacin y automatizacin del antibiograma. Si el laboratorio tiene posibilidades econmicas y tcnicas, debe utilizar alguno de los procedimientos modernos de antibiograma por dilucin, miniaturizado e idealmente automatizado. El autor tiene conocimiento de dos mtodos de este tipo, disponibles en nuestro medio que dan buenos resultados: ATB/VITEK de Bio Meriux y SENSIDENT de Merck.
ESPECIFICACIONES PARA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD* DE DOS ANTIBITICOS DE PFIZER (Para bacilos gram-negativo facultativos y Staphylococcus spp.)
Nombre genrico Azitromicina (macrlido, azlido) Nombre comercial Contenido del disco Interpretacin del dimetro del halo (mm) Intermedio Susceptible Resistente 13 14-17 18

Zithromax

15 mcg 10 mcg de ampicilina + 10 mcg sulbactam

Ampicilinasulbactam Unasyn (Sultamicilina)

11

12-14**

15

** Mtodo de difusin en disco sobre agar segn Bauer-Kirby. ** Moderadamente susceptible.

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ANUNCIO UNASYN (blanco y negro, cara de nio)

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DOCUMENTO UNASYN (blanco y negro columna vertical, debe decir UNASYN al principio)
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CAPTULO 17 ANAEROBIOS
PROPSITO: Demostrar por medio de cultivo con procedimientos especiales, la presencia de bacterias anaerobias, es decir aquellas que no crecen en presencia de oxgeno del aire. Estas bacterias son normales y predominan en las microbiotas de las mucosas (boca, intestino, heces, vagina, etc.) En determinadas circunstancias llegan a sitios anatmicos diferentes y causan infeccin, generalmente en asociacin con bacterias aerobias tales como enterobacterias, pseudomonas o cocos gram-positivo. Por esta razn, siempre debe hacerse frote Gram del material clnico y cultivo aerobio, adems del cultivo en anaerobiosis (ausencia de oxgeno). MUESTRA: Si en algn tipo de anlisis bacteriolgico es de vital importancia la toma de la muestra y su transporte al laboratorio, es en el caso de los anaerobios. Esto se debe principalmente a dos factores: La muestra debe tomarse con mucho cuidado a manera de no contaminarla con bacterias de los sitios colonizados normalmente por anaerobios. Por esta razn, el mdico a veces debe tomar muestras de secreciones del pulmn por puncin trans-traqueal (para evitar los anaerobios de la orofaringe), o puncin suprapbica de la vejiga (para evitar los anaerobios de la uretra). Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxgeno del aire. Si los anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pierden muy rpidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.

Hallazgos clnicos que sugieren infeccin causada por anaerobios: 12Pus con mal olor. Infeccin cerca de membranas mucosas. 193

131415161718191011121314-

Tejido necrtico, gangrena o formacin de pseudo-membranas. Gas en tejido o secrecin. Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos. Infeccin asociada con cncer u otros procesos que causan destruccin de tejidos. Infeccin relacionada con uso de antibiticos aminoglucsidos. Tromboflebitis sptica. Bacteremia con ictericia. Infeccin causada por mordidas humanas o de animales (investigar Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio). Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus). Presencia de grnulos de azufre en pus de lesiones en mandbula u otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii). Signos y sntomas de gangrena gaseosa. Entidades clnicas que generalmente implican anaerobios como aborto sptico, o ciruga gastrointestinal infectada.

TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE ANAEROBIOS: Si se sospechan anaerobios en la muestra, sta debe manejarse de manera especial. Los sitios anatmicos de donde se requiere tomar muestra son muy variados, generalmente las muestras aceptables para cultivo de anaerobios son: 1234567Pus aspirado. Tejidos varios (biopsia, ciruga, autopsia). Fluidos corporales (LCR, lquido pleural, paracentsis, pericrdico, sinovial). Aspirado por puncin trans-traqueal. Aspirado por puncin pulmonar directa. Orina aspirada por puncin supra-pbica. Grnulos de azufre de pacientes con sospecha de actinomicosis.

Las muestras no aceptables para cultivo de anaerobios, pues contienen normalmente estas bacterias y siempre deben ser rechazadas si se solicita este tipo de cultivo, son: 123Hisopos de garganta o boca. Esputo espectorado. Material de broncoscopa no colectado con catter de doble lumen. 194

45678-

Heces, contenido intestinal, hisopo rectal. Hisopo de lesiones superficiales (lceras de decbito, etc.) Material contiguo a mucosas. Orina colectada al vuelo. Hisopos vaginales o cervicales.

En todo caso, evitar contaminaciones con microbiota anaerobia normal. No deben pasar ms de 10 minutos para transportar este tipo de muestras al laboratorio. Si no es posible transportarla con esta rapidez la muestra debe inocularse en un frasco o dispositivo especial que la mantenga en anaerobiosis. El laboratorio de microbiologa debe ser alertado que se tomar una muestra para anaerobios, para que tenga listo el material necesario y la muestra se siembre cuanto antes. El personal del laboratorio debe conocer bien los procedimientos especiales para toma de muestra y aislamiento de anaerobios. Tomar las muestras con hisopo es menos satisfactorio que aspirar. Esto se debe a que el hisopo puede exponer a los anaerobios al oxgeno del ambiente, tiende a secarse rpidamente y permite colectar una muestra muy pequea. En resumen para lograr el cultivo de las bacterias anaerobias deben tomarse las siguientes precauciones. 1234Cultivar el material clnico inmediatamente despus de obtenido. Emplear medios frescos. Obtener condiciones anaerobias adecuadas. Efectuar el sub-cultivo de colonias inmediatamente despus de sacarlas del medio anaerobio.

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIO: Si la muestra no va a ser inoculada antes de 10 minutos de obtenida, debe colocarse en ambiente anaerobio para su transporte. Para este propsito, usar recipientes especiales obtenidos comercialmente (de preferencia culturettes, para transporte de anaerobios). En caso de no contarse con este material, por lo menos colocar la muestra lo ms pronto posible en caldo tioglicolato. Este medio lquido contiene tioglicolato de sodio que reduce el medio y lo hace anaerobio en el fondo. Siempre debe usarse medio fresco, calentar el tubo por 10 minutos (tapn de rosca flojo) en bao de agua hirviendo, y luego enfriar en agua fra. El caldo debe quedar amarillo con una capa rosada delgada en la superficie.

195

Si la muestra se aspir con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no queden burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapn de hule. PROCEDIMIENTO: La muestra recin tomada, o adecuadamente transportada al laboratorio, debe procesarse as: 1En primer lugar, siempre hacer un frote y colorearlo con Gram. Sembrar la muestra por estras en una caja de agar sangre de carnero al 5% fresca y en el fondo de un tubo de caldo tioglicolato (hervido y enfriado).

2-

3-

Introducir rpidamente la caja con el medio hacia arriba y el tioglicolato en un jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrir un sobrecito indicador de anaerobiosis Jarro Gas-Pak y colocarlo dentro del jarro a manera de que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmediatamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hidrgeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla), agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura hacia arriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza de tornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metlica que puede desenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladio iridiado que acta como cataltico para combinar el oxgeno dentro del jarro con el hidrgeno producido por el sobre generador y formar agua. Con el uso, el cataltico se inactiva, por lo que una vez a la semana deben calentarse los trocitos a 100 C por treinta minutos (en cpsula de porcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secarlo peridicamente. Adicionalmente, toda la muestra que llega al laboratorio para cultivo de anaerobios debe sembrarse por estras en otro agar sangre de carnero, MacConkey y manitol-sal, los cuales se incuban aerbicamente.

4-

196

H2+CO2

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: Hallazgos bacteriolgicos que sugieren la presencia de anaerobios: 12Morfologa sugestiva en el Gram directo de la muestra. Ausencia de crecimiento aerobio de las bacterias observadas en el Gram directo. Crecimiento en el fondo del tioglicolato hace sospechar anaerobios. Ausencia de crecimiento en tioglicolato no descarta definitivamente la presencia de anaerobios. Gas o mal olor en la muestra o el cultivo. Colonias caractersticas en el agar sangre incubado en Gas-Pak. Colonias negras despus de incubacin prolongada indican Bacteriodes melaninogenicus; las colonias jvenes pueden dar fluorescencia roja bajo luz ultravioleta.

3-

456-

La identificacin hasta especie de todas las bacterias anaerobias de inters clnico es una tarea compleja y altamente especializada. Se recomienda seguir las siguientes claves para efectuar la identificacin presuntiva. En primer lugar, una interpretacin correcta y acuciosa del frote de la muestra original coloreado con Gram, permite sospechar qu bacterias anaerobias se deben aislar, y en algunos casos permite la deteccin de anaerobios cuyo aislamiento no se logra por alguna causa. Observar y reportar el frote Gram segn lo indicado y luego correlacionar con las bacterias anaerobias y aerobias aisladas. Observar y registrar en el frote Gram del material clnico, lo siguiente: 1La reaccin al Gram, el tamao, la forma y la cantidad relativa de las bacterias presentes. La presencia de esporas, su forma y posicin en la clula. Cualquier caracterstica morfolgica especial como ramificacin pseudoramificacin, formacin de cadenas, filamentos, cuerpos esfricos o diminutas formas granulares. 197

23-

4-

Comparar con la siguiente tabla como gua, y correlacionar con el cultivo anaerobio.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE ALGUNOS BACILOS ANAEROBIOS GRAM-NEGATIVO DE IMPORTANCIA MDICA ESPECIE Bacteroides fragilis MORFOLOGA MICROSCPICA Bacilos regulares con extremos redondeados*, pueden ser pleomrficos (agar sangre); comnmente vacuolados (tioglicolato); pueden presentar cuerpos esfricos en su interior. Cocobacilos* (agar sangre); pleomrficos, vacuolados, bacilos degenerados (tioglicolato). Bacilos pequeos con extremos redondeados*; vacuolados. COLONIA En motas, circular, entera y brillante.

Bacteroides melaninogenicus

Colonias negras en agar sangre despus de 4-5 das de incubacin. Colonias circulares, enteras, brillantes u opacas con bordes translcidos. Umbonada (con centro ms alto que el resto de la colonia), opaca, con borde translcido circular. Circular, entera.

Bacteroides variabilis

Fusobacterium necrophorum (Sphaerophorus necrophorus)

Bacilos pleomrficos con extremos redondeados*; esfrulas y cuerpos redondeados.

Fusobacterium fusiforme

Bacilos delgados con extremos adelgazados terminados en punta; algunos o la mayora filamentosos (agar sangre y tioglicolato).

Ver figura 12: Diversas Morfologas Bacterianas

INTERPRETACIN DEL CULTIVO 1Despus de no menos de 48 horas de incubacin, destapar el jarro: Antes de abrirlo notar que el indicador debe estar blanco y la superficie interior del jarro con gotas de agua. Si el indicador est celeste y no hay agua de condensacin, significa que no se produjo anaerobiosis y deben revisarse los procedimientos. Notar un fuerte olor ptrido caractersti198

co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hidrgeno y CO2. 2Examinar simultneamente la caja de agar sangre y el tubo de tioglicolato. Debe tenerse a mano el resultado de los crecimientos aerobios, ya que muchas bacterias facultativas crecen tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Es de esperarse que enterobacterias, pseudomonas, estafilococos y estreptococos tambin crezcan en el agar sangre anaerobio, pues son facultativos. Examinar las cajas con buena luz, con lupa y microscopio estereoscpico. Hacer inmediatamente frote Gram y sub-cultivo en agar sangre de carnero al 5% y en tioglicolato (hervido y enfriado) de cada tipo de colonias que no corresponda a aerobios ya previamente identificados. Tambin sembrar un sub-cultivo en agar sangre aerobio donde los anaerobios verdaderos no crecen. Es muy frecuente que se encuentran en la misma muestra dos o ms anaerobios adems de varios aerobios. Incubar aerbicamente el agar sangre de carnero donde se efectu el sub-cultivo y el tioglicolato original. Si no se observa crecimiento en el agar sangre aerobio a las 24 a 48 horas, se trata verdaderamente de un anaerobio. Hacer frote Gram del crecimiento en tioglicolato y referirse a la tabla para confirmar la identificacin presuntiva de los anaerobios. La presencia de colonias con doble zona de beta hemlisis. Y que microscpicamente son bacilos gram-positivo gruesos, generalmente poco o no esporulados, indican la presencia de Clostridium perfringens. Esta bacteria se aisla de lesiones gangrenosas y heridas contaminadas con tierra (gangrena gaseosa). Debe reportarse inmediatamente. La mayora de anaerobios que causan infeccin verdadera en humanos son gram-negativo, en especial Bacteroides fragilis . Identificar presuntivamente a los anaerobios gram-negativo segn la tabla que aparece en la pgina siguiente.

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IDENTIFICACIN PRESUNTIVA DE VARIOS ANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MDiCA MORFOLOGA MICROSCPICA Bacilos gram-negativo, pleomficos; se colorean plidamente algunos presentan cuerpos esfricos o predo minio de cocobacilos*. Bacilos plidamente gram-negativo, finos con los extremos en punta*. Pequeos diplococos* gram-negativo, semejantes a Neisseria pero mucho ms pequeos. Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas las cuales no se tien con Gram. Cocos gram-positivo ovalados o lanceolados* con tendencia a agruparse en cadenas; semejantes a Streptococcus sp., pero anaerobios. Cocos gram-positivo redondos con tendencia a agruparse en racimos*; semejantes a Staphylococcus sp., pero anaerobios Bacilos gram-positivo no esporulados. REPORTAR Bacteroides sp.

Fusobacterium sp.

Veillonella sp.

Clostridium sp.

Peptostreptococcus sp.

Peptococcus sp.

Se aisl un bacilo anaerobio gram-negativo no esporulado. Actinomyces sp.

Bacilos gram-positivo no esporulados, ligeramente ramificados; colonias en forma de muelas.

Ver figura 13: Diversas Morfologas Bacterianas

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Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS

Cocos sueltos

Cocos en parejas (diplococos)

Cocos en cadenas (estreptococos)

Cocos en racimos (estafilococos)

Cocos en ttradas

Cocobacilos

Bacilos en forma de maza (difteroides)

Bacilos con bordes redondeados

Bacilos con bordes cuadrados

Fusobacterium sp.

Vibrio sp.

Spirillum sp.

Borrelia sp.

Treponema sp.

Leptospira sp.

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En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo en agar sangre de carnero y colocar en las primeras estras los siguientes discos: Kanamicina Vancomicina Colistina (1,000 mcg) (5 mcg) (10 mcg)

La presencia de halo de inhibicin indica susceptible (S), no hay halo es resistente (R), V = variable. Interpretar los resultados junto con otras pruebas confirmatorias, as:
Bacteria Bacteroides fragilis Otros Bacteroides sp. B. melaninogenicus B. ureolyticus Fusobacterium nucleolatum F. necrophorum F. mortiferum F. varium Fusobacterium sp. Kanamicina R R R S S S S S S Vancomicina R R R R R R R R R Colistin R V V S S S S S S

Se sugiere que en los laboratorios clnicos, sea el profesional microbilogo quien efecte la identificacin definitiva o presuntiva de los anaerobios. INFORME: Segn los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura especializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efecta prueba de susceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una tcnica sencilla que pueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio. 202

CAPTULO 18 MICOBACTERIAS
PROPSITO: Demostrar por medio de coloraciones y cultivos especiales la presencia de bacterias pertenecientes al gnero Mycobacterium especialmente Mycobacterium tuberculosis, llamado comnmente BK (Bacilo de Koch). Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tien con dificultad por el alto contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teirlas deben usarse colorantes con fenol y/o calor. Una vez teidas con fuchsina carblica (fenolada) no se decoloran con alcohol acidificado. Por esta caracterstica muy particular se les llama bacilos alcohol-cido resistentes (abreviado BAAR). No usar el trmino cido-alcohol resistentes. Las micobacterias son aerobios estrictos, no mviles, no poseen cpsula ni producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento; la mayora de las especies patgenas crecen despus de 2 a 6 semanas de incubacin a 36 C en el medio de Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian a infeccin humana. En nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especie ms importante. Las micobacterias en general producen granulomas destructivos de crecimiento lento, que pueden sufrir necrosis o cavitacin. La deteccin de micobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiologa, ya que un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para el paciente y afecta su vida con un tratamiento especfico por varios meses, o incluso aos. MUESTRAS 1. Esputo: La tuberculosis es en nuestro medio la infeccin humana ms importante causada por micobacterias. Esta infeccin crnica generalmente ocurre en los pulmones por la inhalacin del agente causal, el cual por lo general es M. tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. kansasii). Por esta razn, el esputo es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigacin de tuberculosis.

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El esputo debe colectarse temprano en la maana, inmediatamente al despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en das alternos. El primer esputo de la maana es la muestra ms adecuada para el anlisis, pues es concentrada y menos contaminada, ya que el paciente no ha comido o bebido durante la noche. Un slo esputo es ms adecuado que un pool o mezcla de varias muestras. Colectar la muestra de esputo as: el esputo, al igual que cualquier otra muestra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que puede inhibir el crecimiento. Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua corriente; no usar pasta dental o cualquier otro antisptico. Acostado boca abajo en su cama, el paciente debe desgarrar esputo lo ms profundamente posible; as como estar consciente de que descargas nasofarngeas o saliva no son esputo. El esputo se produce despus de un acceso de tos que expulsa material exudativo de los pulmones; 5 a 10 ml de esputo es la cantidad adecuada para anlisis, pero cualquier volumen debe procesarse. El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. De preferencia debern usarse recipientes especiales de plstico descartables, del tipo que incluye adentro un tubo grueso para efectuar el proceso. El buen esputo para anlisis de micobacterias es caseoso (apariencia de queso), puede ser verdoso o amarillento. Si no se remite o procesa rpidamente, adicionar aproximadamente 0.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3), para disminuir el crecimiento de contaminantes y luego debe refrigerarse o congelarse. Se debe identificar bien la muestra con una etiqueta que tenga el nombre y nmero de registro del paciente, la fecha y tipo de muestra. Debido a que el exterior del recipiente puede contaminarse durante la obtencin de la muestra, debe colocarse en una bolsa plstica y luego llevarse al laboratorio. Si el paciente produce muy poca cantidad de esputo, puede examinarse un pool de 24 a 48 horas de coleccin continua, aunque no es lo deseable. 204

En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios mtodos: a) Nebulizacin de solucin salina hipertnica (cloruro de sodio al 10%, sin propilenglicol), es excelente para inducir la produccin de esputo, generalmente diludo. Los hisopos farngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para nios pequeos a los cuales no se les puede pedir una muestra adecuada. Broncoscopa: puede ser usada para obtener las muestras directamente del sitio infectado. Se obtienen muy buenas muestras.

b)

c)

2.

Lavado gstrico: Frecuentemente se solicita lavado gstrico para anlisis de micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estmago, sirve para demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha tragado. Este procedimiento est indicado en los siguientes pacientes: a) Con evidencia radiolgica de tuberculosis pulmonar y en quienes los exmenes de esputo son negativos. En pacientes que no cooperan, diciendo que no producen esputo o se lo tragan. Los que no pueden expectorar porque padecen de otros trastornos: estados de coma, enfermedad neurolgica, etc. En los nios en los que normalmente se hace difcil obtener la muestra de esputo.

b)

c)

d)

La investigacin microscpica de BAAR en lavado gstrico no es recomendable como un procedimiento diagnstico nico y definitivo, pues BAAR como M. gastri forman parte de la microbiota gstrica y no se pueden diferenciar de M. tuberculosis. Sin embargo, mltiples BAAR en contenido gstrico generalmente se correlacionan con cultivos positivos de M. tuberculosis y constituye informacin valiosa inmediata con utilidad clnica. 205

El lavado gstrico debe ser efectuado en la maana, cuando el estmago est vaco (por lo menos 8 horas despus que el paciente ha comido o tomado medicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que la muestra se obtenga 30 minutos despus de inducir esputo por nebulizacin. Deben usarse sondas de Levin, jeringas estriles de 50 ml y 20 a 30 ml de agua destilada estril. Introducir la sonda al estmago por la nariz, inyectar el agua, succionar e inyectar de nuevo varias veces. La muestra obtenida debe colocarse en recipiente estril de boca ancha. Debido a que las micobacterias pueden destruirse rpidamente en los lavados gstricos por la accin del cido clorhdrico del estmago, la muestra debe ser procesada en un perodo de tiempo que no exceda de 20 minutos. Si por cualquier circunstancia no es posible procesarla rpidamente, es necesario neutralizarla, agregando carbonato de sodio al 10%, solucin de fosfato trisdico anhidro al 10%, solucin de fosfato trisdico con 12 molculas de agua al 23% o bien cristales de fosfato disdico. En todos los casos es aconsejable usar rojo fenol como indicador para saber si el pH est entre 7 y 8. No neutralizar las muestras que son procesadas antes de 4 horas despus de obtenidas y mantenidas en refrigeracin. 3. Orina: Se debe examinar un mnimo de tres muestras de la primera orina de la maana colectada al vuelo en recipiente estril de boca ancha (ver captulo 7), o muestras obtenidas por catter. Se debe colectar toda la orina posible cada vez, algunas veces se utiliza orina colectada durante 12 a 24 horas, la cual es menos adecuada porque generalmente est muy contaminada y contiene menos micobacterias viables que la primera orina de la maana. Las muestras deben mantenerse refrigeradas mientras se procesan lo antes posible; no utilizar recipientes con preservativos. Otro tipo de muestras: La tuberculosis es una infeccin que puede localizarse en casi cualquier parte del cuerpo, por esta razn pueden analizarse las siguientes muestras de lquidos, exudados o tejidos: Lavado bronquial Fragmentos de pulmn Hisopo farngeo Lquido cefalorraqudeo Lquido pleural Lquido articular Pus 206

4.

Raspado endometrial/sangre menstrual Mdula sea Lquido pericrdico Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia Heces (en ocasiones muy especiales)

Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el mdico en recipientes estriles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adicionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservativos o fijadores. Es conveniente obtener un volumen grande de muestra; si la cantidad es pequea adicionar solucin salina para evitar desecacin. Si la muestra no se examina inmediatamente debe refrigerarse. PROCEDIMIENTO: Baciloscopa: El diagnstico de micobacteriosis se basa en la observacin de los bacilos alcohol-cido resistente en la muestra y su cultivo in vitro. Los bacilos alcohol-cido resistentes deben teirse con las coloraciones de Ziehl-Neelsen o Kinyoun; ambas tinciones dan buenos resultados. La diferencia fundamental consiste en lo siguiente: Ziehl-Neelsen s utiliza calentamiento de la lmina y Kinyoun no, adems la fuchsina de Kinyoun es ms concentrada. Coloracin de Ziehl-Neelsen: Preparar frotes delgados de la muestra a examinar. Si se trata de esputo trasladar la muestra a una caja de Petri estril y examinarla con buena luz sobre fondo oscuro. Con aplicadores de madera quebrados, seleccionar los fragmentos anormales (con pus verdoso, blanquesino o amarillento; sangre rojiza o herrumbrosa). Colocar un pequeo fragmento entre dos portaobjetos de vidrio, aplastar varias veces el esputo y luego deslizar una lmina sobre otra para obtener dos frotes parejos y delgados. Escoger el mejor, dejar secar y luego fijar moderadamente con calor sobre la llama del mechero (igual que para la coloracin de Gram). Puede colorearse sedimento del esputo digerido/ descontaminado, u otras muestras clnicas. Procedimiento de la coloracin de Ziehl-Neelsen: 1Poner el frote ya fijado y fro en el soporte de coloracin cerca del lavatrastos, colocarle encima un trozo de papel filtro para que mantenga el colorante sobre el frote. 207

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Cubrir el papel filtro con fuchsina carbnica de Ziehl-Neelsen; debe quedar bien empapado. Calentar cuidadosamente la lmina por debajo, ya sea con un mechero de alcohol o con un hisopo grande empapado en alcohol. Calentar suavemente hasta el aparecimiento de humos blancos. No debe hervir. Dejar colorear el frote por 5 minutos sin calentar ms. Si la lmina se seca agregar ms fuchsina sin volver a calentar. Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presin). Decolorar el frote con alcohol-cido hasta que ya no salga ms colorante rojo (aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloracin ya que es el paso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloracin, pero tampoco se debe decolorar excesivamente. Lavar brevemente con agua corriente. Cubrir el frote con azul de metileno por 1 2 minutos. Lavar con agua corriente. Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absorbente. Examinar el frote con el lente de inmersin, con cuidado de limpiar el aceite del lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra a otra. No efectuar coloraciones simultneas de varias muestras en recipientes de Coplin, porque tambin puede haber transferencia de micobacterias entre las muestras.

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REACTIVOS PARA ZIEHL-NEELSEN 1Fuchsina carblica de Ziehl-Neelsen (colorante principal) Solucin saturada de fuchsina bsica .............................. 10 ml Preparar solucin saturada de fuchsina bsica as: Disolver 3 gramos de fuchsina bsica en 100 ml de alcohol etlico al 95%.

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Solucin acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 ml Preparar solucin de fenol al 5%, as: (Fundir los cristales de fenol en bao de Mara, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de 100 ml con agua destilada estril. 2Alcohol-cido (decolorante): Acido clorhdrico concentrado ......................................... 93 ml Alcohol etlico al 95% ........................................................ 95 ml Azul de metileno (colorante de contraste): Cloruro de azul de metileno ........................................... 0.3 gramos Agua destilada .................................................................. 100 ml Segn F. Ziehl (1882), y Neelsen (1885), Alemania. COLORACIN DE KINYOUN: Esta coloracin da buenos resultados, comparables al Ziehl-Neelsen, si se efecta segn la tcnica exacta. Tiene la ventaja que no necesita calentamiento. Proceder as: 12Preparar el frote igual que para Ziehl-Neelsen y fijarlo con calor. Colocar la lmina en la gradilla de coloracin y dejar que enfre. Cubrir el frote con fuchsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es necesario calentar. Lavar con agua corriente. Decolorar el frote con alcohol-cido hasta que ya no salga ms colorante rojo. Insistir en este paso pues es el que diferencia a las bacterias. Lavar con agua corriente. Cubrir el frote con azul de metileno por 1 2 minutos. Lavar con agua corriente. Dejar secar y examinar con el lente de inmersin. En general tomar las mnimas precauciones que para la coloracin de Ziehl-Neelsen. 209

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REACTIVOS PARA KINYOUN 1Fuchsina carblica de Kinyoun: Fuchsina bsica .................................................................... 4 gramos Fenol fundido ................................................................... 128 ml Alcohol etlico al 95% ...................................................... 120 ml Agua destilada .................................................................. 100 ml Disolver la fuchsina en el alcohol y luego adicionar el agua lentamente con agitacin. Fundir cristales de fenol en bao de agua caliente a 56 C, medir con pipeta 8 ml y adicionar a la fuchsina. 2Alcohol cido: igual al de Ziehl-Neelsen (cido clorhrico concentrado: 3 ml, ms alcohol etlico al 95%: 97 ml) Azul de metileno: igual al de Ziehl-Neelsen (0.3 gramos de cloruro de azul de metileno, disolver en 100 ml de agua destilada). Segn Kinyoun: Am. J. Pub. Health, 5: 867, 1915.

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INTERPRETACIN E INFORME DE BACILOSCOPIAS: La caracterstica de alcohol-cido resistencia tpica de las micobacterias hace que la baciloscopa tenga una importancia fundamental. Se usa para seguir el curso del tratamiento y para dar de alta al paciente en el hospital, para continuar su tratamiento ambulatorio. Tomar muy en cuenta las siguientes consideraciones: 1Sin excepcin alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los frotes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la Asociacin Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Estados Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos laboratorios y orientar adecuadamente al mdico.

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REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS NMERO DE BACILOS ALCOHOL-CIDO RESISTENTE 0 1 a 2 en todo el frote 3 a 9 en todo el frote 10 ms en todo el frote 1 ms por campo REPORTE No se observan bacilos alcohol-cido resistentes Informar el nmero de BAAR encontrados y pedir nueva muestra + o escasos ++ o regular cantidad +++ o abundantes

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Un frote para diagnstico de tuberculosis o cualquiera otra micobacteriosis debe examinarse de 10 a 15 minutos antes de darse por negativo. Si se trata de L.C.R. debe observarse an por ms tiempo. La especie del microorganismo alcohol-cido resistente no puede determinarse slo por la morfologa microscpica, debe hacerce por cultivo. Sin embargo, algunas caractersticas pueden orientar, por ejemplo: Nocardia spp. frecuentemente produce ramificaciones y Mycobacterium kansasii puede formar clulas largas y anchas, con coloracin en bandas.

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La caracterstica alcohol-cido resistente de un microorganismo puede variar con la edad del cultivo o exposicin a drogas. Con el lente de inmersin, Mycobacterium tuberculosis aparece tpicamente como bacilos bien definidos, ligeramente curvos, de color rojo brillante (se aprecia mejor con luz intensa). Pueden aparecer con coloracin discontinua en forma de varios grnulos de color rojo ms intenso, observar con atencin grnulos rojos en la preparacin ya que pueden ser parte de un BAAR. En el frote pueden aparecer artefactos alcohol-cido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. Slo bacilos bien definidos deben considerarse BAAR. En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote 211

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es muy grueso es probable que se desprenda de la lmina durante la coloracin, por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparacin a otra por medio de aceite de inmersin, lentes sucios o colorantes. 18Ocasionalmente, la buena seleccin de las partes anormales de la muestra para preparar el frote puede dar resultados mucho mejores que el uso de concentraciones. Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por cultivo, ya que la baciloscopa es menos sensible para detectar micobacterias que el cultivo. Nunca dejar el azul de metileno por ms tiempo del indicado: 1 2 minutos. A veces es difcil distinguir los artefactos acidfilos (rojos) de verdaderos bacilos alcohol-cido resistentes. La observacin de cuerpos esfricos alcoholcido resistentes debe mencionarse como sospechosa. Los grnulos de Much son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positivo y no alcohol-cido resistentes. La liberacin irregular de micobacterias de los focos endotraquiales puede dar frotes positivos y negativos en el mismo paciente. Los BAAR observados no presentes originalmente en la muestra, pueden provenir del agua del chorro, colorantes contaminados, recipientes o de portaobjetos sucios.

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CULTIVO PARA MICOBACTERIAS Los procedimientos para obtener el crecimiento in vitro de las microbacterias son especializados; deben seguirse estrictamente las instrucciones para tener xito en su recuperacin. Por lo general, las muestras para cultivo de micobacterias contienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el esputo que siempre se contamina con microbiota de la boca. Adems el esputo es una muestra difcil de manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo lquido y descontaminarse; es decir, darle algn tratamiento qumico para destruir las bacterias contaminantes que crecen rpido, pero sin destruir a las micobacterias.

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DIGESTIN Y DESCONTAMINACIN DE ESPUTOS Para efectuar la digestin/descontaminacin de esputos pueden usarse dos mtodos: aMtodo convencional de hidrxido de sodio bMtodo de N-acetil-levo-cistena (NALC) El mtodo de hidrxido de sodio es muy fuerte y destruye un porcentaje considerable de micobacterias. Por esa razn, debe hacerse todo lo posible para implementar la tcnica de NALC. El mtodo de la acetil-cistena proporciona mayor porcentaje de aislamiento de micobacterias pero su desventaja consiste en la dificultad de conseguir esta sustancia qumica en nuestro medio. La N-acetil levocistena (NALC), puede obtenerse de las siguientes compaas: aBBL, Cockeysville, Maryland, USA. bMead Johnson Research Center, Evansville, Indiana, USA. cSigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA. La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro de la mucina y adems destruye las bacterias comunes sin daar a las micobacterias. Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumo cuidado y dentro de una campana bacteriolgica. Descartar todo el material contaminado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se producen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente con alcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena). Mtodo de digestin/descontaminacin con N-acetil-levo-cistena (NALC). (Segn Kubica et al. Am. Rev. Respir. Dis. 89:284, 1964) 1El reactivo para digerir/descontaminar es inestable pues es inactivado por oxgeno, iones de metales pesados y hemoglobina. Por esta razn, el reactivo debe prepararse diariamente y slo dura un da. Si sobra solucin NALC, puede guardarse en frasco bien cerrado y usarse al da siguiente, pero nunca al tercer da despus de preparada. El polvo de NALC debe mantenerse refrigerado. Debe prepararse slo la cantidad de solucin que se usar en un da mezclando los tres componentes as:

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Cantidad a preparar 125 ml 150 ml 100 ml

NaOH al 4% estril 12.4 ml 25 ml 50 ml

Citrato de sodio al 2.9% estril 12.5 ml 25 ml 50 ml

Polvo de NALC (refrigerado) 0.125 g 0.25 g 0.5 g

Las soluciones individuales deben prepararse as: Hidrxido de sodio Na0H al 4% (1N): Disolver 40 g de hidrxido de sodio para anlisis en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a temperatura ambiente. Si precipita descartar. Citrato de sodio al 2.9% (0.1M): Disolver 29.4 g de citrato de sodio anhidro en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a temperatura ambiente. Si precipita descartar.

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Colectar la muestra de esputo segn lo indicado. Transferir aproximadamente 10 ml a un tubo plstico, descartable de 50 ml. Esto debe hacerse bajo una campana bacteriolgica. Limpiar la superficie de trabajo peridicamente, con desinfectante. Agregar un volumen igual del reactivo de acetil-cistena, pero no ms que el volumen de esputo. Si el esputo es muy escaso o mucoso agregar el NALC directamente al recipiente de coleccin y luego pasar al tubo. Tapar bien el tubo, y agitar bien en agitador vortex de 5 a 20 segundos o hasta que el esputo se digiera. La agitacin demasiado violenta puede desnaturalizar el reactivo NALC. Dejar en reposo exactamente 15 minutos a temperatura ambiente, para que la muestra se descontamine. Llenar el tubo con agua destilada estril, hasta que el nivel del lquido quede 12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinacin para mezclar bien. Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos. 214

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Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente con desinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar contaminacin. Con una pipeta serolgica estril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albmina bovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuar aspticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear con Ziehl-Neelsen o Kinyoun. Con pipeta capilar estril, inocular dos gotas del sedimento con albmina en la superficie de un tubo (dos de preferencia segn disponibilidad), de medio de cultivo Lowenstein-Jensen. Colocar los tubos dentro de la incubadora a 36 C, inclinados de manera que la superficie del medio quede totalmente horizontal por 1 a 2 das para distribuir bien el inculo; luego incubar verticalmente en gradilla. De preferencia colocar a cada tubo un capuchn de cartulina negra para evitar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapn de rosca ligeramente flojo.

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DIGESTIN/DESCONTAMINACIN DE ESPUTOS POR EL MTODO CONVENCIONAL DE HIDRXIDO DE SODIO Este procedimiento es muy utilizado, pero el porcentaje de recuperacin de micobacterias es menor que el que se obtiene con el mtodo de la acetil-cistena. Utilizar este mtodo slo si no se consigue el polvo de NALC. 1Trasladar aspticamente el esputo a una caja de Petri, sobre fondo oscuro. Con dos aplicadores con las puntas quebradas, seleccionar las porciones anormales del esputo (pus, sangre, etc.). En un tubo de centrfuga grande, colocar una fraccin anormal del esputo. Adicionar igual volumen de hidrxido de sodio al 3.5% con 0.004% de rojo fenol. Agitar vigorosamente por 10 minutos, de preferencia en mquina homogenizadora. Centrifugar el tubo a 3,000 rpm por 20 minutos. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sobre un recipiente con desinfectante. 215

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Con pipeta Pasteur estril, adicionar lentamente cido clorhdrico 2N, hasta obtener un color amarillo definitivo. Neutralizar el sedimento con unas pocas gotas de hidrxido de sodio al 3.5% hasta un punto final con un color rosado dbil. Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedimento. Incubar a 36 C segn lo indicado.

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Reactivos para la tcnica de digestin/descontaminacin con Na0H: 1Hidrxido de sodio al 3.5% con 0.004% rojo fenol: Pesar 35 gramos de hidrxido de sodio para anlisis, colocar las lentejas ya pesadas dentro de un baln aforado de 1 litro. Poner el baln en bao de agua fra, y adicionar lentamente agua destilada con agitacin constante hasta casi llegar a la marca. Dejar enfriar y luego aforar exactamente a la marca de un litro. Pesar 0.04 g (40 mg) de rojo fenol en polvo. Adicionarlo al hidrxido y mezclar bien hasta obtener una solucin rosado fuerte. 2Acido clorhdrico 2N: Medir 16 ml de cido clorhdrico concentrado en el fondo de un baln aforado de 1 litro. Adicionar lentamente agua destilada hasta aforar a la marca de 1 litro. Procedimiento de digestin/descontaminacin para esputos de pacientes cuyas muestras estn constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp: 1Agregar al esputo un volumen igual de cido oxlico al 5% (si no se cuenta con este reactivo usar cido sulfrico al 4%). Mezclar en agitador vortex y dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente, con agitacin ocasional. Agregar solucin salina estril para bajar el peso especfico y diluir el cido. Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos. 216

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Decantar el lquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al 3.5% con 0.004% de rojo fenol. Inocular dos asadas del sedimento en Lowenstein-Jensen.

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Procedimiento para lavados gstricos Si el material es mucoide: 1234Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gstrico. Mezclar manualmente en agitador vortex. Centrifugar a 3,000 rpm por 30 minutos. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de agua destilada estril. Agregar un volumen igual de la solucin NALC-NaOH y proceder igual que esputo.

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Si el material es fluido: 12Centrifugar toda la muestra por 30 minutos a 3,000 rpm. Decantar el lquido sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de agua destilada estril. Unir todos los sedimentos si se centrifugan varios tubos. Agregar igual volumen de la solucin NALC-NaOH y proceder igual que esputo.

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Procedimiento para orina: 1Centrifugar toda la muestra de la primera orina de la maana por 30 minutos a 3,000 rpm. Puede ser necesario utilizar varios tubos estriles. Decantar los sobrenadantes, y unir los sedimentos. Agregar al sedimento igual volumen de cido sulfrico al 4%. 217

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Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos. Llenar el tubo con agua destilada estril. Centrifugar a 3,000 rpm por 15 minutos. Decantar el sobrenadante y agregar al sedimento unas gotas de albmina bovina al 0.2%.

Procedimiento para hisopo farngeo: 1Trasladar el hisopo con pinzas flameadas a un tubo de centrfuga estril (slo la punta). Agregar 2 ml de agua destilada estril o solucin salina estril. Agregar 2 ml de la solucin digestora NALC-NaOH. Agitar en agitador vortex. Dejar en reposo 15 minutos. Remover el hisopo del tubo con pinzas flameadas. Llenar el tubo con agua destilada estril hasta 12 mm del borde. Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm y continuar el procedimiento como esputo.

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Procedimiento para tejido o piel: 1Utilizar macerador de tejidos o mortero estril para triturar la muestra aspticamente en solucin salina estril. Si el tejido es mucoso (por ejemplo pulmn), adicionar una pizca de polvo NALC. Si se desea investigar hongos patgenos es mejor no triturar, mejor cortar en pedazos finos con tijeras estriles. Si la muestra fue colectada aspticamente, inocular directamente un pequeo trozo en Lowenstein-Jensen. Si el tejido no ha sido colectado aspticamente, colocar el macerado en un tubo estril y procesar como esputo. 218

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Procedimiento para otros fluidos corporales: Si el material es muco-purulento: 12Procesar igual que esputo si el volumen es de 10 ml o menos. Si el volumen es mayor de 10 ml, proceder como lavado gstrico mucoso.

Si el material es fluido: 1Si el material se obtuvo aspticamente, centrifugar o inocular el sedimento directamente en Lowenstein-Jensen. Si el material no se obtuvo aspticamente, proceder como esputo si el volumen es menor de 10 ml, si es mayor procesar como lavado gstrico fluido. Efectuar procedimientos especiales para aislamiento de micobacterias de sangre o heces fecales, debe justificarse plenamente y por lo general no se efecta. Mdula sea: sembrar directamente en Lowenstein-Jensen.

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INTERPRETACIN DEL CULTIVO Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscpico y buena luz, a los 5 das despus de inoculados, y luego una vez por semana, los das lunes, para observar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a 36 C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo a las 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte. Las micobacterias pueden producir en el medio de Lowenstein-Jensen dos tipos de colonias: Eugnicas: Colonias secas, superficie rugosa, bordes irregulares color crema amarillento. Son tpicas de la mayora de micobacterias especialmente M. tuberculosis. M. kansasii es menos rugoso. Disgnicas: Colonias brillantes de superficie lisa y bordes enteros tpicas de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium-intracelulare. Al observarse estos tipos de crecimiento en el tubo de Lowenstein-Jensen de preferencia observados con microscopio estereoscpico, hacer frote en una gota de solucin salina o colorear con Ziehl-Neelsen. 219

Si se observan colonias eugnicas de color crema formadas por bacilos alcohol-cido resistentes (las cepas ms virulentas con factor cordn: forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y no produce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tuberculosis. Reportar el crecimiento observado cuantitativamente segn esta tabla:
Nmero de colonias No se observan colonias Menos de 50 colonias 50-100 colonias 100-200 colonias Casi confluente (200-500) Confluente (ms de 500) Reporte de cantidad Negativo para Mycobacterium tuberculosis Mencionar el nmero de colonias +(1+) ++ ( 2 + ) +++ ( 3 + ) ++++ ( 4 + )

Por ejemplo si el tubo de Lowenstein-Jensen presenta el crecimiento de 70 colonias eugnicas de BAAR, identificadas como M. tuberculosis por niacina, e informar: Se aisl Mycobacterium tuberculosis +. Identificar M. tuberculosis por las siguientes caractersticas: 1Crecimiento lento de colonias eugnicas no pigmentadas en LowensteinJensen que crecen entre 4 y 7 semanas. El Ziehl-Neelsen de estas colonias revela BAAR cortos, ligeramente curvos de coloracin slida, a veces agrupados en cordones. Confirmar con la reaccin de produccin de niacina positiva.

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Prueba de niacina: La produccin de la vitamina niacina (cido nicotnico) en el medio Lowenstein-Jensen es tpica de M. tuberculosis. Las otras micobacterias son niacina negativo, por lo que con esta nica prueba se logra una diferenciacin adecuada. Esta diferenciacin se conoce desde 1955 segn Konno et al. (Science, 124: 985, 1956 y Am. Rev. Resp. Dis. 75: 529, 1957). 220

Las colonias eugnicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina la cual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que se desarrollan las colonias. Por esta razn, la prueba slo puede hacerse en cultivos puros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubacin. Se utiliza un procedimiento sencillo de extraccin de la niacina que se encuentra en el medio (no en las colonias), la cual luego se identifica por la produccin de un color amarillo en las tiras que contienen los reactivos qumicos adecuados. Proceder as si el cultivo llena los requisitos mencionados: 1Al tubo de Lowenstein-Jensen, con un cultivo puro de colonias eugnicas (50 a 100) no pigmentadas y 3 a 4 semanas de incubacin, agregar 1.5 ml de agua destilada estril o solucin salina estril. No usar cultivos contaminados que presentan coloracin azul en el Lowenstein-Jensen. Con el asa espatulada o pipeta capilar, cortar profundamente varias veces el medio de cultivo dentro del tubo, para que el agua o solucin salina penetre y extraiga la niacina. Inclinar el tubo sobre algn soporte, de manera que la superficie del medio quede horizontal y cubierta de lquido. Dejar el tubo en reposo en esta posicin por 30 minutos. Colocar el tubo verticalmente en una gradilla con mucho cuidado, succionar aproximadamente 0.6 ml de extracto con pipeta Pasteur y bulbo. Pasarlo al fondo de un tubo 13 X 75 mm con tapn de rosca. Marcar el tubo con el nmero de muestra. Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solucin salina utilizada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo control negativo. Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeracin. Agitar los tubos suavemente; repetir esta agitacin suave de 5 a 10 minutos. 221

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Despus de 12 a 15 minutos, pero no despus de 30 minutos, comparar el color de los extractos. Interpretacin: la prueba de niacina es positiva si aparece color amarillo en el extracto de la muestra, y el control negativo no presenta color. Autoclavear los tubos con extractos de muestras.

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Si el cultivo en Lowenstein-Jensen presenta crecimiento de colonias pigmentadas (amarillo-anaranjado), o de crecimiento rpido (antes de 5 das), o niacina negativo, se debe sospechar de otras especies atpicas del gnero Mycobacterium o ms correctamente de los grupos de Runyon. En Guatemala son mucho menos frecuentes que Mycobacterium tuberculosis. En este caso el personal tcnico deber entregar el cultivo al microbilogo a cargo del laboratorio, quien clasificar el BAAR aislado en alguno de los cuatro grupos de Runyon por medio de pruebas especiales. Grupos de Runyon (micobacterias atpicas): Grupo I: Fotocromgenos: producen pigmento slo cuando el cultivo se expone a la luz. En la obscuridad producen colonias sin pigmentacin, son de crecimiento lento. Ejemplos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30C). Grupo II: Escotocromgenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y son de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopata cervical en nios. Grupo III: No fotocromgenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium avium-intracelulare. Grupo IV: Crecedores rpidos: se caracterizan por crecer antes de 7 das de incubacin. Ejemplo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.

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Esta publicacin fue impresa en los talleres grficos de Editorial Serviprensa C.A. de Guatemala, C.A. en el mes de septiembre de 1996. Esta edicin consta de 1,000 ejemplares en papel bond 80 gramos.