abstracto El efecto del suero fermentado sobre la degradacin aerbica de los n-alcanos por un consorcio microbiano se investig en una

solucin acuosa sistema. La degradacin microbiana de 100 mg de n-alcanos l? 1 (C12, C14, C16 y C18) en medio mineral nutriente se evalu midiendo la disminuir en n-alcanos, la produccin de CO2 y aumento de la biomasa. La adicin de suero de leche fermentada en una concentracin de 5 mg seco l peso? 1 a un medio nutritivo recibir un inculo de tamao pequeo (103.4CFUml? 1) acortar la fase de retardo 8 a 3 das, pero el velocidad de degradacin durante la fase de degradacin no se ha mejorado. El retraso acortado fase a baja concentracin inicial de microorganismos indica que el suero fermentado estimula el crecimiento en la fase inicial, sin reducir la capacidad del consorcio para n-alcano degradacin. r 2006 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados. 1. Introduccin Suero de leche es un subproducto de la industria lctea, y causa grandes problemas de eliminacin debido a los grandes volmenes producido, y por lo tanto una gran demanda biolgica de oxgeno en plantas de tratamiento de aguas residuales. Utilizacin sostenible de los recursos convocatorias de nuevas soluciones y nuevas aplicaciones a gran escala los productos de desecho. Por fermentacin de suero de leche con Lactobacillus, la parte principal de la lactosa se metaboliza a cido lctico y

protenas se hidrolizan a aminocidos libres. Fermentado suero de leche es una fuente potencial de carbono de fcil acceso y micronutrientes, que podran ser usadas para mejorar la la degradacin microbiana de contaminantes. La adicin de materiales orgnicos o productos qumicos individuales a los ambientes naturales pueden estimular la degradacin. Cuando un qumico aadido es estructuralmente anlogo al contaminante, que puede estimular el crecimiento de microorganismos de degradacin que producen enzimas capaces de transformar las molculas anlogas, mejorando as la degradacin capacidad (Alexander, 1999). Sin embargo, cuando un estimulador enmienda orgnica no es estructuralmente anlogo a la compuesto que se metaboliza, el beneficio es no especfica, para ejemplo, en el aumento de la biomasa de los organismos que slo coincidentemente llevar a cabo una reaccin de cometablico (Alexander, 1999). Este aumento en la biomasa puede ser un efecto de la adicin de una fuente de carbono fcilmente accesible y / o de otro nutrientes. Hay poca informacin en la literatura sobre la estimulador efecto del suero sobre la degradacin microbiana de los contaminantes. Suero de leche se ha utilizado como un consumidor de oxgeno en a fin de crear una barrera reductora para la in situ remediacin de metil terc-butil ter de suelo contaminado

(Barcelona y Xie, 2001) o como un carbonsource/electrondonor en un sistema de reactor de selenio biorremediacin (Bledsoe et al., 1999). Otros subproductos industriales que contienen fcilmente accesible carbono y micronutrientes son extracto de levadura, un subproducto industrias de cervecera, y melaza, un subproducto de la industria azucarera, ambos habiendo sido utilizado como suplementos de crecimiento en una serie de biodegradacin estudios. Un suplemento de crecimiento orgnico, tal como extracto de levadura era para estimular el crecimiento de una nica cepa bacteriana en hidrocarburos aromticos en agua de mar (Derecho y Teo, 1997). Extracto de levadura tambin aument la tasa de decloracin aerbico de cidos clorobenzoico (Fava et al., 1995) y se elimina sustrato de inhibicin a partir de cidos clorobenzoico en alto concentraciones (Armenante et al., 1995). El crecimiento de bacterias y la degradacin aerbica de bromofenol en el suelo del desierto era mejorada (Ronen et al., 2000), y durante la degradacin de n-hexadecano por un cultivo mixto, la biomasa microbiana Tambin se aument mediante la adicin de extracto de levadura (Espeche et al., 1994). La melaza se ha demostrado servir como un cosustrato eficaz para la degradacin aerbica del explosivo 2,4,6 -

trinitrotolueno (TNT) en medio lquido (Boopathy et al., 1994a, b), en el suelo (Boopathy et al, 1997;.. Widrig et al, 1997) y en un reactor de suspensin de suelo (Boopathy y Manning, 1999), y para la degradacin aerobio / anxico de TNT (Boopathy et al., 1998) y el explosivo hexahidro1,3,5-trinitro-1 ,3,5-triazina (RDX) en suelos fangosos (Boopathy y Manning, 2000). Melaza tambin se ha demostrado para aumentar la velocidad de oxidacin y degradacin de los n-alcanos por una sola cepa y un cultivo mixto de bacterias en medio de agua de mar sinttica (Al-Hadhrami et al., 1996, 1997). En algunos de los estudios mencionados anteriormente, el positivo efectos de una fuente de complejo de carbono adicional se deben a co-metabolismo (vertical-Roberts, 1998; Alexander, 1999). En Por otro lado, cuando los microorganismos son capaces metabolizar el contaminante sin un co-sustrato, la Adems de una fuente de carbono fcilmente accesible tanto estimula la degradacin como se muestra arriba o inhibe la debido a la degradacin diauxie, es decir, el uso secuencial de sustrato donde la fuente de carbono es ms accesible degradado primera (Alexander, 1999). Varios estudios han demostrado que una amplia gama de los microorganismos son capaces de combustible diesel degradantes (Margesin y Schinner, 1997a, 1999; Richard y Vogel, 1999; Mrquez-Rocha et al, 2001) y n alcanos-(Al-. Hadhrami et al, 1995;. Olivera et al, 1997;. Bej et al, 2000).

sin un co-sustrato. El enfoque ms comn en la mejora de la degradacin aerbica de combustible diesel y nalkanes ha sido aadir fertilizantes con el fin de alcanzar una apropiado C: N: P (Margesin y Schinner, 1997b; Wrabel y Peckol, 2000; Rahman et al, 2003;. Walworth et al., 2003). Sin embargo, slo unos pocos estudios se han realizado sobre los efectos de suplementos de crecimiento orgnicos en la degradacin de los n-alcanos (Espeche et al, 1994;. AlHadhrami et al., 1996, 1997). El objetivo de este estudio ha sido investigar el posibilidad de utilizar suero fermentado como un suplemento orgnico para aumentar la degradacin de contaminantes orgnicos, especialmente los hidrocarburos de petrleo. Los experimentos fueron diseado para estudiar el efecto del suero fermentado sobre la degradacin aerbica de los n-alcanos en un entorno acuoso, mediante la medicin de la concentracin de n-alcano, carbono dixido de produccin y el aumento en la biomasa. 2. Materiales y mtodos 2,1. Suero de leche fermentada El suero de leche fermentada (Biogen activeTM, Invekta Verde AB) que se utiliza durante todo el estudio es un Lactobacillus sp. producto de fermentacin de dulce suero de la leche con un pH de 3,2. La masa seca del suero de leche fermentada fue 36 gl? 1 y el principal componentes de la materia seca fueron: cido lctico, 62%; protenas, 12% y

aminocidos libres, un 6,2%. El contenido de macronutrientes fue (l? 1) 17 g de carbono, 0,89 g de nitrgeno y 0,31 g de fsforo. Esto corresponde a un aproximado C: N: P relacin molar de 141:6.3:1. El suero fermentado se trat en autoclave durante 20 min a 121 1C antes de su uso. 2,2. n-alcanos El n-alcanos, C12, C14, C16 y C18 (grado Merck sntesis) representante de los constituyentes principales de combustible en el combustible diesel, se utilizaron como sustancias modelo (vertical-Roberts, 1998). Una solucin madre que contiene L 4g? 1 de cada n-alcano en n-hexano (Merck, PA) se utiliz. 2,3. Inculo Un consorcio microbiano comercial (PDM-7 HC, PHaseIII Inc., Gilbert, Arizona, EE.UU.) adecuada para la degradacin de hidrocarburos de petrleo en general se utiliz como inculo y se almacen a 4 1C segn recomendaciones de los fabricantes. El nmero total de bacterias cultivables determinado en agar de extracto de levadura (Merck) despus de la incubacin durante 2 das a 20 1C de acuerdo con procedimientos estndar (ISO 6222). La concentracin de bacterias cultivables en el inculo fue de 107,7 formadoras de colonias unidades (CFU) ml? 1, y un volumen apropiado se aadi a cada lote de medio de nutrientes minerales para dar 103,4 y 104.4CFUml? 1, respectivamente. 2,4. Medio

El medio que contiene 2,6 mg MgSO4, CaCl2 0,25 mg, 25 mg KH2PO4, K2HPO4 25 mg, 29 mg NH4NO3 y mgFeCl3 1,3 (todas las sntesis grado) l? 1 de dixido de carbono libre de agua se ajust a pH 7,5 y finalmente en autoclave a 121 1C durante 20 min 2,5. Degradacin experimento Partes alcuotas de la solucin de n-alcano se aadieron con 500-ml Erlenmeyer matraces para obtener un total de n-alcanos concentracin de 100mgl? 1. El n-hexano disolvente se dej evaporar durante 12 horas a temperatura ambiente, y 100 ml medio nutriente que contiene la cantidad apropiada de microbiana inculo, con y sin L 5mg suero fermentado? 1, se aadi entonces a los matraces Erlenmeyer. Todos los matraces se incubaron a 2272 1C en una horizontal operativo agitador a 80 rpm. Inicialmente, el C: N: P molar fue 22:2.2:1. El montaje experimental se dan en la Tabla 1. El tapn de vidrio esmerilado en cada matraz estaba equipado con un bucle de cristal diseado para contener un vial de vidrio de 2 ml que contiene 1 ml de NaOH 2 M para atrapar evolucionado CO2. Antes del anlisis, saturado BaCl2 se aadi a los viales para precipitar los carbonatos, y despus de la filtracin, el hidrxido restante iones se determinaron mediante valoracin con HCl 40 mM utilizando fenolftalena como indicador de punto final. En cada muestreo, todo el contenido de la matraces experimentales se utilizaron para la determinacin

de n-alcanos, CO2 y biomasa. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, tres frascos se utilizan en cada tiempo de muestreo para cada experimental condicin. El cambio en la concentracin de biomasa se determin por fotometra (Philips PU8650) midiendo la densidad ptica (OD) a 650 nm (A650) en un 4-cm cubeta. Para la determinacin del pH, un medidor de pH (Mettler Toledo MP225) se utiliz. 2. 2,6. Extraccin y anlisis de los n-alcanos Con el fin de evitar prdidas de n-alcanos durante la extraccin, el conjunto muestra se extrajo directamente en los matraces experimentales. Despus de acidificar con HCl a pH 2, 8 g MgSO4 (Merck, PA) se aadi para evitar formacin de emulsiones. Adems, 25 ml de n-hexano (Merck, pa) que contiene 2,5 mg de n-pentadecano (Merck, pa) como estndar interno Se aadi al matraz. Se cerr el matraz y se agit vigorosamente durante 45 min con un agitador magntico y despus se dej en reposo durante 15 min. La separacin se realiz con una construccin especial de cristal microseparator mediante la adicin de agua suficiente para el fondo del matraz para permitir la capa de fase orgnica a llenar el microseparator. La fase orgnica fue luego limpiado a travs de una pequea columna llena con 2 g de Florisil (SigmaAldrich)

cubierto con una capa de 2 g de sulfato sdico anhidro (Merck, PA). La muestra purificada se concentr usando un evaporador rotatorio y ms se concentr hasta un volumen final de 2 ml con una corriente de nitrgeno. La cantidad de n-alcano se determin por GC-FID, usando un Varian 3400CX equipado con un Alltech ECONO-CAPTM EC-1 columna capilar (30m? 0,32 mm, 0,25 mm). Las condiciones experimentales fueron las siguientes: temperatura del programa 80 1C (1 min), 80-300 1C en 201Cmin? 1 y 1C 300 (10 min); temperatura del inyector, 250 1C; temperatura del detector, 300 1C; gas portador nitrgeno; relacin de separacin, 1:50; tamao de la muestra de 0,5 ml. 2,7. El anlisis estadstico Los datos de concentracin de n-alcanos, biomasa y CO2 fueron evolucionado sometido a dos caras estudiantes varianza desigual prueba t con el fin de probar la diferencias significativas entre los tratamientos. Todos los anlisis se realizaron en Microsoft Excel. 3. Resultados y discusin La prdida abitica de n-alcanos durante el experimento fue insignificante de acuerdo con el control estril (Fig. 1a). Antes el comienzo del experimento, cuando el disolvente de hexano fue evapora tambin hubo una prdida de n-dodecano principalmente debido a la evaporacin, lo que resulta en una concentracin total

de partida de n-alcanos de 90 mg l? 1. La degradacin de los n-alcanos producido secuencialmente (Fig. 2). Los n-alcanos de ms corta longitud de la cadena, al ser ms soluble en agua, fueron degradados preferentemente. Durante el experimento, el suero de leche fermentada fue totalmente degradado, indic en un 81% de mineralizacin (Datos no mostrados). La degradacin de los n-alcanos, la produccin de CO2 y cambio en OD para las distintas condiciones experimentales son presentado en la figura. 1a-c. Las grficas muestran que la adicin l de 5 mg de suero fermentado? 1 a una concentracin de inculo de 103.4CFUml? 1 acorta la fase de retraso desde 8 a 3 das 3. en comparacin con el control sin suero. El mximo velocidades de degradacin fueron, respectivamente, 53 mg y 57 alcanos l? 1 da? 1 con y sin suero fermentado. Esta estimulacin no puede haber sido debido a la contribucin de macronutrientes en el suero fermentado, debido su relativamente bajo contenido de nitrgeno y fsforo, as como porque el medio nutriente mineral contenido de nitrgeno y fsforo en concentraciones no limitantes. La figura. 1a-c muestra tambin que el aumento del inculo inicial concentracin de 104.4CFUml? 1 (control de alta CFU) da un acortamiento de 6 das del tiempo de latencia sin la adicin de

fermentada de suero de leche. El aumento de la densidad ptica durante el la fase de degradacin corresponde a un tiempo de duplicacin de aproximadamente 9 horas a la concentracin del inculo baja y 13 h en una concentracin elevada (Fig. 1c). Con un tiempo de duplicacin en este intervalo, se tardara 1-2 das para la bacteriano poblacin a aumentar 10 veces 103,4 a 104,4 CFUml? 1. Esto demuestra que el aumento de 6 das en fase de retardo a una concentracin de inculo de baja no era ms que un resultado directo de la concentracin bacteriana ser una dcima parte de la alta concentracin, sino tambin un efecto de algn otro mecanismo control de la fase de latencia, por ejemplo aparicin de nuevos genotipos ms decisiva para el crecimiento y / o climatizacin de una pequea poblacin. Al-Hadhrami y colaboradores (1996) mostraron que la adicin de una alternativa de carbono y fuente de nutrientes, tales como melaza, aumento de la respiracin y la degradacin de los nalcanos en agua de mar sinttica. Estos autores sugirieron que la combinacin de carbono de fcil acceso y nutrientes, tales como las vitaminas, el aumento de la actividad metablica, y de ese modo estimul la produccin de enzimas eficaces en alcano degradacin. Del mismo modo, es posible que fermentada

de suero de leche acta como un sustrato de crecimiento en una fase temprana y crtica de el cultivo para aumentar la biomasa, sin reducir la capacidad del consorcio para degradar n-alcanos. Alternativamente, se podra suministrar suero fermentado crecimiento factores que son necesarios para el crecimiento rpido del consorcio, es una mezcla compleja de carbono de fcil acceso y compuestos que estimulan el crecimiento, tales como las vitaminas y los aminocidos, todos los cuales tienen el potencial de aumentar la biomasa. Sin embargo, no es posible a partir de este estudio a determinar el mecanismo por el cual suero fermentado estimula el crecimiento de cultivos iniciados por una pequea inculo. 4. Conclusin En este estudio, se ha demostrado que el suero de leche fermentada puede acortar el tiempo de retraso de la degradacin bacteriana de los n-alcanos en una solucin acuosa. Tal degradacin acelerada podra ser posible cuando se trata de hidrocarburos de petrleo u otros tipos de contaminantes en diversos ambiental situaciones, y con ello abrir nuevos usos para un a gran escala de residuos de producto, tales como suero de leche, por ejemplo en el suelo biorremediacin, los biorreactores industriales y el tratamiento de efluente.