FAQ SOBRE PCR Y LEISHMANIOSIS CANINA Llus Ferrer, med vet, PhD, Dipl ECVD (1).

Xavier Roura, med vet, PhD, Dipl ECVIM-CA. (2) (1) Miembro del grupo LeishVet. Facultad de Veterinaria, Universitat Autnoma de Barcelona. (2) Miembro del Grupo de Estudio de la Leishmaniosis Canina (GSLC). Hospital Clnic Veterinari, Universitat Autnoma de Barcelona. El sptimo artculo de la serie sobre leishmaniosis de los especialistas Llus Ferrer y Xavier Roura es una recopilacin de respuestas a las preguntas ms frecuentes que se hacen los clnicos acerca de la utilidad de la PCR en el diagnstico de esta enfermedad en el perro. Entre las tcnicas moleculares de anlisis de cidos nucleicos, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), permite un diagnstico de alta sensibilidad y especificidad, ya que amplifica fragmentos especficos de ADN. Se han identificado numerosos fragmentos amplificables de ADN de Leishmania y algunos de ellos han sido utilizados en tcnicas de PCR para el diagnstico de la leishmaniosis del hombre y del perro. Este captulo intenta aclarar la utilidad para el clnico veterinario de la PCR en la leishmaniosis canina. Son importantes las tcnicas de diagnstico molecular? No hay ninguna duda en afirmar que el diagnstico mediante tcnicas moleculares ha cambiado el trabajo en la clnica veterinaria con las enfermedades infecciosas. La polymerase chain reaction (PCR) es la tcnica molecular ms desarrollada actualmente y tiene un amplio abanico de posibilidades, entre las que se incluyen la deteccin de diversos patgenos, la individualizacin de nuevos agentes infecciosos o el seguimiento de la prevalencia de diversas enfermedades infecciosas en la poblacin. Probablemente, con la mejora progresiva de estas tcnicas, la PCR llegue a sustituir a los diagnsticos ms tradicionales como el cultivo en la evaluacin de la leishmaniosis canina. En los ltimos 10 aos se han desarrollado innumerables aplicaciones de la PCR en leishmaniosis canina. No obstante, desde el punto de vista clnico, la PCR se ha consolidado como un procedimiento realmente til en la deteccin de la Leishmania que es difcil de visualizar.

FIGURA 1. EN LOS LTIMOS 10 AOS SE HAN DESARROLLADO INNUMERABLES APLICACIONES DE LA PCR EN LEISHMANIOSIS CANINA, QUE SE HA CONSOLIDADO COMO UN PROCEDIMIENTO REALMENTE TIL EN LA DETECCIN DEL PARSITO.

En qu facetas de la clnica podemos aplicar la PCR? La PCR se est aplicando en tres grandes campos:

En el diagnstico etiolgico, donde la PCR es sobre todo til en ausencia de mtodos de diagnstico alternativos o cuando stos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnstica complementando mtodos convencionales o si se requiere un diagnstico rpido y precoz del agente etiolgico que permita iniciar el tratamiento especfico lo antes posible. En el control del tratamiento, donde la PCR se utiliza tanto para la seleccin de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, para lo cual es importante disponer de mtodos cuantitativos. En la caracterizacin gentica del parsito (genotipificacin) e identificacin de mutaciones determinantes de resistencias a frmacos o de virulencia.

La serologa pierde su valor en el diagnstico de la leishmaniosis canina con la llegada de la PCR? La serologa es una de las tcnicas ms utilizadas en el diagnstico de la leishmaniosis canina. Esta tcnica nos informa del ttulo de anticuerpos que ha producido el paciente frente a la presencia de la Leishmania. Suero, plasma, lquido cefalorraqudeo, exudados o humor acuoso son las muestras clnicas ms utilizadas. Aunque su uso est muy extendido, puede ser difcil la interpretacin de sus resultados. Los ttulos normalmente son expresados en diluciones (1:80, etc.) o en porcentajes (150%, etc.). El problema principal es que la presencia de anticuerpos en un paciente es slo circunstancial (puede significar que ha tenido contacto con el parsito anteriormente) y, por tanto, no podemos afirmar categricamente que en ese momento el paciente est infectado. Un aumento de cuatro veces en el ttulo basal se puede considerar diagnstico para la leishmaniosis canina. A pesar de todo esto, el uso conjunto de la serologa con la PCR aporta mucha ms informacin que cada una por separado. Qu es una PCR convencional? Es la amplificacin de un fragmento especfico de ADN de la Leishmania en un tubo de ensayo donde se encuentra la muestra clnica. Es decir, permite detectar al agente infeccioso mediante la amplificacin de su ADN. Sin embargo su resultado es slo negativo (no se detect el ADN del parsito) o positivo (se detect el ADN del parsito).

Cmo se realiza una PCR convencional? El proceso de deteccin de la Leishmania por amplificacin gentica se desarrolla de manera habitual en tres etapas:

La primera consiste en la extraccin y purificacin de los cidos nucleicos del microorganismo de la muestra biolgica, seguida de la amplificacin de un segmento seleccionado del genoma del agente infeccioso mediante reaccin en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha. La PCR utiliza fragmentos cortos de ADN (oligonucletidos) de cadena simple, llamados cebadores (primers), que corresponden a secuencias especficas de los extremos del ADN que se quiere amplificar. Despus de la hibridacin de los cebadores con el ADN molde, una polimerasa termoresistente cataliza el proceso de sntesis de la secuencia complementaria de nucletidos. Este proceso se repite de forma exponencial durante 25-35 ciclos hasta obtener millones de copias de la secuencia de ADN original. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la deteccin de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tincin con bromuro de etidio, o mediante hibridacin con sondas especficas. En general todo este proceso puede durar aproximadamente 24 h.

Cules son las ventajas y desventajas de la PCR? Las ventajas y desventajas de la PCR frente a otras tcnicas diagnsticas se detallan en la siguiente tabla.

Por qu en la clnica se utiliza cada vez ms la PCR cuantitativa? Las ventajas de la PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR) son que permite una cuantificacin de la carga de parsitos de la muestra (nmero de leishmanias), tiene una mayor sensibilidad que los otros tipos de PCR, permite el seguimiento y monitorizacin del tratamiento de los perros (incluso en aquellos con una baja cantidad de parsitos) y, adems, existe mucho menor riesgo de contaminacin durante la realizacin de la tcnica (por tanto, evita los falsos positivos). Es decir, no nos dice slo si es positivo o negativo el resultado al final del proceso (a tiempo final), sino que nos da informacin durante el proceso de amplificacin (cuantitativa) y si es positivo, nos da la cantidad de parsitos que presenta la muestra clnica (carga de parsitos baja, media o alta). En el seguimiento, la PCR cuantitativa nos permite tomar decisiones sobre la efectividad o no del tratamiento sin tener que esperar a obtener un resultado negativo en la muestra clnica, como sucede cuando se utiliza la PCR convencional. Cmo debo interpretar los resultados de una PCR convencional? Si la PCR es positiva, es muy probable que el perro tenga esa infeccin concreta (si la tcnica se ha realizado con los controles adecuados). En la mayora de los casos, la nica manera de tener ADN de la Leishmania en la muestra es que el perro tenga una infeccin activa. Si la PCR es negativa, slo significa que el ADN del parsito no est presente en la muestra que se ha analizado, pero eso no significa que la Leishmania no est en el perro del cual se ha tomado la muestra. Se debe recordar que muchas PCR slo evalan de uno a 10 microlitos de sangre o muestra clnica equivalente. Adems, el valor predictivo negativo de una PCR slo se puede saber si la prueba se ha realizado en una poblacin de perros en los que se conoce la prevalencia real de esta enfermedad. Desafortunadamente esto no es posible en la mayora de las PCR comercializadas o realizadas por los laboratorios.

Cmo debo interpretar los resultados de una PCR cuantitativa? La interpretacin de una PCR cuantitativa para el diagnstico de la leishmaniosis es esencialmente la misma que para la PCR convencional. Sin embargo, hay diferentes datos publicados que demuestran que tiene una mayor sensibilidad comparada con la PCR convencional. La mayor utilidad de la PCR cuantitativa es la cuantificacin de los parsitos ya que no nos dice nicamente si la Leishmania est presente o no, sino que nos dice si est presente en mucha o poca cantidad. Adems, saber la cantidad de parsitos de la muestra nos permitir evaluar de una forma ms clara la respuesta al tratamiento y, posiblemente en el futuro, dar un pronstico sobre la evolucin de la enfermedad. En la leishmaniosis canina, cmo puede ayudar ms al clnico la PCR cuantitativa frente a la PCR convencional? Las manifestaciones clnicas de la leishmaniosis canina varan enormemente debido a los numerosos mecanismos patognicos que engloba la enfermedad, as como a la gran diversidad de respuestas inmunes que muestran los distintos huspedes frente al parsito. En la clnica diaria, los veterinarios se enfrentan a casos compatibles con leishmaniosis y a menudo con resultados contradictorios en las diversas pruebas diagnsticas. El resultado de una PCR convencional es una variable discreta con dos posibles valores (positivo o negativo) e incluso muestras con diferencias en la carga parasitaria de hasta cinco rdenes de magnitud dan el mismo resultado positivo en la PCR convencional. Conviene considerar: 1) Que todas las muestras sometidas a un anlisis de Leishmania por PCR provienen de perros con signos clnicos o alteraciones en la analtica compatibles con la enfermedad. 2) Que los signos clnicos o las alteraciones en la analtica de la leishmaniosis canina son diversos, inespecficos y compatibles, en muchos casos, con otras patologas. 3) Que en una zona endmica se pueden encontrar perros con serologas dudosas que pueden estar infectados por el parsito pero sin tener la enfermedad activa. 4) Que la PCR cuantitativa qPCR es capaz de discriminar de 0.01 a 10.000 parsitos en una reaccin. El valor continuo de los datos que se obtienen con la qPCR puede ayudar al veterinario clnico a dilucidar el estatus de perros positivos por PCR convencional, especialmente en zonas endmicas, diferenciando entre infeccin o enfermedad activa y tomando la decisin final de tratar o no al perro. A su vez, la qPCR es muy til en la monitorizacin de la enfermedad. Los perros que son positivos por PCR convencional en todos los puntos del anlisis, pueden mostrar drsticas diferencias en la carga parasitaria, por tanto, no hay que esperar a ser negativo por PCR convencional para validar la efectividad del tratamiento. En conclusin, dado que la qPCR permite cuantificar de forma precisa la carga parasitaria, resulta una ayuda eficaz para poder confirmar un diagnstico de leishmaniosis en casos de serologa dudosa o incluso cuando el perro an no ha seroconvertido. En casos de qPCR positivas se recomienda repetir la prueba al mes postratamiento para evaluar la respuesta al mismo, a los seis meses si ha negativizado y anualmente de forma preventiva. Si no responde al tratamiento se puede repetir la qPCR a criterio del clnico para monitorizar la evolucin del parsito y/o evaluar la presencia

de otras coinfeccin o enfermedades. Para perros sin signos clnicos y control rutinario se pueden hacer qPCR de sangre/frotis conjuntival una vez al ao.

FIGURA 2. LA QPCR RESULTA UNA AYUDA EFICAZ PARA CONFIRMAR UN DIAGNSTICO DE LEISHMANIOSIS EN CASOS DE SEROLOGA DUDOSA O INCLUSO CUANDO EL PERRO AN NO HA SEROCONVERTIDO.

Existen falsos positivos en la PCR? Los falsos positivos (la prueba es positiva pero la Leishmania no est presente en el perro) pueden ocurrir por varios motivos. En el diagnstico clnico, la causa ms frecuente es la contaminacin, cuya fuente ms comn son las amplificaciones resultantes de las PCR realizadas previamente en el laboratorio. Los controles meticulosos sobre la separacin fsica entre las muestras anteriores y posteriores a la amplificacin son los que caracterizan la buena prctica de un laboratorio. Estos controles reducen la posibilidad de contaminacin en un grado importante. Tambin pueden darse falsos positivos cuando los cebadores ( primers) que se utilizan no se han seleccionado meticulosamente y, por tanto, detectan y amplifican otra secuencia de ADN distinta a la deseada. Existen falsos negativos en la PCR? Los falsos negativos (la prueba es negativa pero la Leishmania est presente en el perro) pueden ocurrir con la PCR en los casos en que el volumen de la muestra es demasiado pequeo o cuando existen problemas en su procesado. Si se sospecha que la concentracin del parsito es muy baja, el laboratorio debe usar mtodos para concentrar o purificar la muestra antes de iniciar la PCR. Las causas ms frecuentes de problemas en el procesado de la muestra son la inadecuada eliminacin de inhibidores de la PCR (como hemoglobina, medicamentos o formol, entre otros) y la baja cantidad y calidad de la extraccin de ADN de las muestras. Qu muestras podemos enviar para realizar una PCR? La amplificacin del ADN se puede realizar sobre casi cualquier muestra o material clnico obtenido, como sangre o mdula sea (conservadas en EDTA o citrato), ganglio linftico, saliva, orina, LCR, humor acuoso, exudados, raspados cutneos o conjuntivales y biopsias de diferentes tejidos u rganos (frescas o parafinadas). Las muestras no se deben conservar o enviar en heparina o en formol porque inhiben la PCR y, por tanto, los resultados pueden ser negativos. Lo ms importante es preservar el

ADN y por tanto las clulas. Por eso, no hace falta enviar las muestras refrigeradas pero si lo antes posible, especialmente si es sangre o mdula sea. La hemlisis es un factor importante de interferencia con la PCR. Si se ha de retrasar el envo de las muestras, stas se pueden mantener refrigeradas o congeladas. No hace falta que las muestras sean estriles, siempre y cuando no existan otros microorganismos que se amplifiquen con la misma tcnica. Esta ltima circunstancia supondra un falso positivo como resultado final. Tanto en Medicina como en Veterinaria se ha podido detectar ADN de Leishmania en raspados y biopsias de piel en casos en los que las tcnicas convencionales no haban sido capaces de identificar el parsito, incluso en muestras conservadas en parafina durante aos. Lo ms importante es seleccionar la muestra a analizar de donde sea ms probable encontrar al agente infeccioso. Por ejemplo, numerosos estudios realizados en el hombre y en el perro demuestran una sensibilidad y especificidad muy altas de la PCR (alrededor del 100%) en la deteccin de Leishmania en la mdula sea. Sin embargo, en las muestras de sangre la sensibilidad baja y vara segn los autores entre 60 y 80%. Finalmente, no hay que olvidar que la PCR cuantitativa permite cuantificar cargas de patgenos muy bajas y, por tanto, utilizar la sangre perifrica como muestra vlida para el diagnstico de la leishmaniosis canina. En la leishmaniosis, cul es la mejor muestra clnica para el diagnstico o el seguimiento mediante PCR? La eleccin de la muestra para el diagnstico o seguimiento de un perro con leishmaniosis es una decisin clnica. El veterinario debe decidir en cada caso cul es la muestra clnica ms eficaz, ya que debido al tropismo variado que exhibe el parsito frente a los distintos tejidos, la cantidad de parsito es diferente y oscila. Por ejemplo, la carga parasitaria puede ser de 4.000 a 5.000 veces ms en un aspirado de mdula sea que en sangre perifrica. Debido a esto, el veterinario debe variar el tipo de muestra en funcin de cada caso y de lo que quiera valorar en esa PCR. Si lo que se quiere es hacer un diagnstico, hay que seleccionar la muestra clnica donde creamos que vamos a encontrar ms leishmanias:

Si el cuadro clnico es marcadamente cutneo o muco-cutneo (ndulos, ppulas, ulceras, fstulas, alopecias con descamacin, hipopigmentacin, etc.) las mejores muestras seran las biopsias de estas lesiones o el aspirado de mdula sea por este orden. Si el cuadro clnico es ms heterogneo, probablemente el aspirado de mdula sea, la sangre perifrica o el aspirado de ganglio, por este orden, podran ser las muestras clnicas de eleccin.

Algunos veterinarios realizan una mezcla de sangre y aspirado de mdula sea (muchas veces se obtiene poca cantidad) como muestra para realizar la PCR ya que de esta manera aumentan las posibilidades de deteccin del parsito. Como los cuadros clnicos asociados a la leishmaniosis son tan variados, en los casos en los que las lesiones estn circunscritas slo a mucosas, ojos, articulaciones, hueso,

intestino, msculo, tejido subcutneo, uas, etc., las biopsias de cada una de estas lesiones sern las mejores muestras clnicas para realizar la PCR. Sin embargo, la capacidad de la qPCR para cuantificar cargas parasitarias muy bajas permite a su vez utilizar la sangre perifrica (debido a su fcil obtencin) como muestra vlida tanto para el diagnstico de la leishmaniosis en muchos de los casos como para el seguimiento durante el tratamiento. Si se ha enviado una muestra de sangre perifrica para el diagnstico de la leishmaniosis mediante PCR y el resultado ha sido negativo, y seguimos pensando que el cuadro clnico es muy sugestivo de leishmaniosis, se debe enviar otra muestra de aspirado de mdula sea slo o mezclado con sangre perifrica para aumentar las posibilidades de deteccin del parsito.

Es la PCR la solucin definitiva a todas las dificultades en el diagnstico de la leishmaniosis canina? La respuesta es NO. No existe una estandarizacin de las PCR entre los diferentes laboratorios, lo que significa que no se pueden comparar directamente los resultados de unos con otros. Cuando hay discrepancias entre los resultados es imposible decir quin es el que tiene razn. Por tanto, es muy importante la seleccin de un laboratorio en el que confiemos y siempre realizar las PCR all. Sin embargo, no debemos olvidar que no hay una tcnica de diagnstico 100% sensible y especifica. Los resultados de todas las pruebas se deben interpretar junto con toda la informacin que dispongamos del paciente; el diagnstico de una enfermedad infecciosa es una decisin clnica, no slo un positivo en una determinada prueba de laboratorio.

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