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UNIVERSIDAD POLITCNICA DE SINALOA

Ingeniera en Biotecnologa

Estudio de Remocin de Malatin por Microorganismos Aislados de Suelos Contaminados de Culiacn, Sinaloa.

Universidad Politcnica de Sinaloa

Daniel Guerrero Serrano

Mazatln, Sinaloa 10 de Diciembre de 2008


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INDICE

Tema

pg.

Introduccin ..............................................................................

Objetivo......................................................................................

Materiales y Mtodos ................................................................

Resiembra y Propagacin de Cepas Aisladas ................

Preparacin del Pre-inoculo .............................................

Fermentacin .....................................................................

Determinacin de pH ..........................................................

Monitoreo de Crecimiento Microbiano ..............................

Cuantificacin de Malatin.................................................

Resultados y Discusin............................................................

Conclusiones ............................................................................ 10

Bibliografa ................................................................................ 11

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INTRODUCCIN

Se denomina plaguicida a cualquier sustancia o mezcla de sustancias que se destina a controlar cualquier plaga, incluidos vectores de enfermedades humanas y de animales, as como especies no deseadas que causen perjuicio a la produccin agropecuaria (SEMARNAT), de manera que los plaguicidas forman parte integral de la produccin agrcola (Manahan, 2007). Los plaguicidas o pesticidas son utilizadas en Mxico y en Sinaloa en campos de cultivo.

La importancia de realizar estudios acerca de los plaguicidas reside en lo que sucede con los residuos en el suelo, lo que va mas all de estos, son los efectos biolgicos en los organismos de ecosistemas terrestres y acuticos, incluyendo la bioacumulacin y la transferencia a travs de la cadenas trficas, contaminacin de aguas subterrneas y efectos en la fertilidad del suelo (Manahan, 2007). Por lo tanto es relevante buscar alternativas para la solucin de problemas de suelos contaminados por este tipo de sustancias.

El pesticida 0,0-Dimetil-S-[1,2-bis(etoxicarbonil)-etil]-ditiofosfato, mejor conocido como Malatin (Figura 1), es un compuesto orgnico que contiene fosforo, por lo que se le clasifica en compuestos organofosforados (Manahan, 2007). Los plaguicidas organofosforados son considerados insecticidas selectivos, sin embargo una cantidad de aproximadamente 1200 mg de Malatin puede ser capaz de matar a un adulto y 200 mg seria suficiente para matar a un nio (Manahan, 2007). Para complementar lo anterior la FAO presenta un reporte en el cual menciona la presencia de malatin en alimentos, adems del uso agrcola, este plaguicida es usado en

Mxico para combatir los mosquitos que transmiten el dengue (Espinoza, 2002).

La seleccin del plaguicida malatin, para este proyecto de investigacin, se debe a razones de importancia debido a los usos que tiene, por los que est ms cerca de lo que se imaginan los consumidores; otro factor es que los laboratorios de la universidad no son de uso exclusivo o especializado para manejar otros contaminantes mas txicos como pudiera ser el paratin que es unas cien veces ms txico que el malatin.
H O S H C C O C 2H 5 H3 C O P S C H S O C O C 2H5 S CH3 O

Figura 1. Estructura qumica de malatin

Se han realizado investigaciones acerca de los plaguicidas obteniendo resultados importantes, los cuales tienen un enfoque hacia la

fitorremediacin y el uso de microorganismos para la degradacin de contaminantes, a este respecto Bourquin (1977) realiz pruebas con microorganismos aislados de aguas salinas, para determinar la capacidad de degradacin de malatin en medios enriquecidos, obteniendo como resultado siete especies aisladas capaces de degradar malatin entre cuarenta y noventa por ciento.

OBJETIVOS

General

Evaluar la capacidad de remocin de malatin por microorganismos aislados de suelos contaminados. Especifico

Construir las dinmicas de remocin de malatin por Pseudomona, Alcaligenes, Aeromona y Flavobacterium en cultivo lquido.

MATERIALES Y MTODOS

Resiembra y Propagacin de Cepas Aisladas

Las cepas aisladas de un suelo contaminado fueron Pseudomona, Alcaligenes, Aeromona y Flavobacterium; fueron proporcionadas por Jorge Luis Lpez Magaa de la Universidad Politcnica de Sinaloa.

Se llev a cabo la resiembra de cada una de las cepas en tubos de ensayo conteniendo agar TSA en forma de pico de flauta (Figura 2). Las cepas se mantuvieron en

refrigeracin a 4C. Para propagar los microorganismos se realiz la transferencia de cultivo de tubo a cajas de Petri que contenan agar TSA (Figura 2). Las condiciones de incubacin fueron 30C durante 24 h. Figura 2. Cultivo en caja de petri (izquierda) y
cultivo en tubo

Preparacin del Pre-inoculo

Para realizar el preinoculo se utiliz medio de cultivo lquido con las siguientes concentraciones por litro: Fosfato de potasio 0.5 g, Cloruro de amonio 1 g, Sulfato de sodio 2 g, Nitrato de potasio 2 g, Sulfato de magnesio heptahidratado 0.2 g, Extracto de levadura 1 g. Fue esterilizado a 121 C y 15 psi durante 15 minutos. Se realiz la transferencia de cultivo por duplicado, obtenido en cajas de Petri, a matraces Erlenmeyer con 50 ml de

medio, se colocaron a 28 C y 150 rpm, durante 24 horas en equipo de incubacin y agitacin continua MazQ 4000 (Figura 3).

Figura 3. Equipo de incubacin y agitacin continua

La seleccin de este medio lquido se basa en darle una fase de adaptacin al microorganismo a este entorno, proporcionndole una fuente de carbono mnima con el extracto de levadura a baja concentracin y suministrando nitrgeno orgnico e inorgnico para obtener energa. Este tipo de medios lquidos enriquecidos han sido utilizados por otros investigadores como Rivera (2005), Bourquin (1977) e Ito (1982).

Fermentacin

Una vez finalizada la incubacin de 24 horas del preinoculo se transfiri preinoculo (10 % v/v) a matraces Erlenmeyer con medio lquido, antes definido, ms malatin comercial al 88.7 % de pureza, para lograr una concentracin de 0.75 mg/ml, ya inoculados los matraces se llevaron a equipo de incubacin y agitacin continua a 30 C y 150 rpm, para una

duracin de catorce das. El tipo de cultivo que se llev a cabo fue por lote (batch). Determinacin de pH

Para la determinacin de pH se utiliz un potencimetro Hanna modelo , el tiempo definido para obtener este parmetro fueron: al momento de realizar el inoculo para iniciar la fermentacin del experimento, a las 144 horas y 192 horas. El numero de muestreos para pH estuvo determinado por el volumen mnimo recomendado que debe contener un matraz con medio liquido para este tipo de cultivos que es de dos terceras partes de su capacidad. Monitoreo de Crecimiento Microbiano

Cada muestra fue centrifugada a 1200 rpm durante 20 minutos para la separar las clulas bacterianas del malatin, retirando el sobrenadante y agregando agua destilada para volver a suspender el paquete formado al fondo del tubo y realizar una segunda centrifugacin con la finalidad de retirar lo mas posible del contaminante. Utilizando un espectrofotmetro Spectronic, se obtuvieron lecturas para tener una referencia del

comportamiento presentado por los microorganismos a travs del tiempo bajo las condiciones del experimento. Cada medicin se realiz a intervalos de 48 horas, iniciando con el tiempo cero (t0), al momento de realizar el inoculo de los matraces Erlenmeyer, hasta las 192 horas en que finaliz el cultivo.

La utilizacin de densidad ptica es considerada un mtodo indirecto para determinar el crecimiento microbiano, sin embargo al no ser necesario el nmero de clulas para este trabajo, se considera apropiado el uso de esta tcnica adems de ser utilizada en trabajos de investigacin como el reportado por Rosenberg (1979).

Cuantificacin de Malatin

Para obtener el malatin se obtuvo el sobrenadante de la centrifugacin de cada muestra, el cual se deposit en frascos de vidrio color mbar de 13 ml de capacidad para realizar una extraccin por medio de separacin liquido-liquido utilizando embudos de decantacin de 30 ml, agregando 3 ml de hexano en tres ocasiones. Cada frasco, con un contenido aproximado de 9 ml, se rotul segn la muestra y tiempo correspondiente para su anlisis por cromatografa de gases (GC).

La tcnica de cromatografa de gases fue seleccionada por considerarse adecuada para analizar compuestos orgnicos que tienen punto de ebullicin por debajo de los 250 C (Rubinson, 2000), dentro de lo cual corresponde a las caractersticas fisicoqumicas del malatin al ser un compuesto orgnico (Manahan, 2007) y presentar un punto de ebullicin entre 156 y 157 C. Por otro parte la decisin se adopt gracias a la disposicin de colaboracin entre la Universidad Politcnica de Sinaloa y el Centro de Investigacin unidad de Culiacn.

RESULTADOS Y DISCUSIN

A veinticuatro horas de sembradas en agar TSA, las cepas de Pseudomona, Alcaligenes, Aeromona y Flavobacterium, se observ

formacin de colonias, mismas que fueron resembradas en matraces Erlenmeyer con 200 ml de medio lquido y concentracin de 0.75 mg/ml de malatin. Las cuatro especies presentaron crecimiento a cuarenta y ocho horas, tiempo en que se realiz el segundo muestreo, como se puede observar en las graficas a continuacin.

El mximo crecimiento se present a las cuarenta y ocho horas, este dato concuerda con resultados obtenidos por Imran (2004) en donde obtuvo su mximo de crecimiento a las 30 horas de cultivo en presencia de malatin, lo cual, probablemente, sea la misma respuesta de los microorganismos

usados en este trabajo de investigacin debido a que el muestreo se program para cada cuarenta y ocho horas. Los valores de pH oscilaron entre 6.6 y 7.5 para las cuatro especies, mostrando con esto una tendencia a alcalinizar el medio en el que se encuentran. Al parecer los microorganismos aumentan el pH en presencia de malatin segn lo obtenido en el laboratorio y comparando con los resultados de Bourquin (1977) quien obtuvo valores de pH entre 6.3 y 6.8 al final del tiempo de cultivo.

CONCLUSINES Para esta fecha 10 de diciembre de 2008 considero que los objetivos planteados en el presente trabajo de investigacin se han cumplido de forma parcial debido a que los datos obtenidos hasta el momento representan a la parte del comportamiento de crecimiento de los microorganismos

Pseudomona, Alcaligenes, Aeromona y Flavobacterium en presencia del contamnate estudiado malatin, por obteniendo datos en dentro del

comportamiento

observado

otros investigadores

condiciones

experimentales similares. Sin embargo la parte de remocin de malatin aun no se conoce, lo cual indicar su hubo remocin del contaminante para cada cultivo. Puesto que las muestras sern analizadas despus del da 10 de diciembre en el CIAD de Culiacn, para completar el trabajo de investigacin. En cuanto a la realizacin de estadas, considero que el desarrollo de este tipo de investigaciones es importante para los alumnos y la universidad, a manera personal considero que no es tiempo perdido realizar proyectos de investigacin, aunque requiere gran parte del tiempo es satisfactorio y motivante el realizar este tipo de trabajos. Como recomendacin hacia la universidad no tengo alguna como tal, ms bien agradecimiento por las facilidades y el apoyo que se otorga a los estudiantes, en mi caso particular, sin el apoyo de la universidad no hubiese podido realizar una estada de este tipo. Lo dems son cosas que con el tiempo la universidad obtendr, me refiero a instalaciones, como laboratorios mas especializados para trabajos de investigacin.

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BIBLIOGRAFA 1. sd

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