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F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

Efecto de la dexametasona sobre la actividad de fenoloxidasa


en la respuesta inmune de Aedes aegypti
Ana Beatriz Celma,1 Carlos G. García,1 Lilia A. González,1
Fernando García,1 y 2 Humberto Lanz3 y Fidel Hernández1 y 2
1
Universidad Simón Bolívar, 2Cinvestav-Instituto Politécnico Nacional,3CISEI-Instituto Nacional de Salud Pública

Resumen

Aedes aegypti es un díptero (Culicidae) vector de enfermedades como el dengue y la fiebre


amarilla. El conocimiento de los mecanismos de la respuesta inmune de estos mosquitos
resulta fundamental para, en un futuro, diseñar estrategias en el control biológico de estas
enfermedades. El sistema de la profenoloxidasa (proFO) es un mecanismo inmune enzimático
en cascada activado por moléculas de la superficie de microorganismos. El objetivo fue eva-
luar la actividad de la proFO en presencia de dexametasona (inhibidor de síntesis de
prostaglandinas) a diferentes concentraciones.

Abstract

Aedes aegypti is a dipterous (Culicidae) vector of diseases such as dengue and yellow fever.
The knowledge of the mechanisms of the immune response of these mosquitoes is relevant
and can be helpful in the design of strategies for biological control. The system
prophenoloxidase (proFO) is an enzimatic mechanism in cascades wich is activated by molecules
found in the surface of microorganisms. The objective was to evaluate the proFO activity in
presence of dexametasone (prostaglandin synthesis inhibitor) at different concentrations.

Introducción La melanización consiste en una serie de reacciones


que comienzan con la hidroxilación de tirosina para
Los invertebrados no tienen inmunoglobulinas ni formar L-DOPA (L-hidroxifenilalanina), la cual sufre
linfocitos. Algunos de sus mecanismos de defensa oxidación y da lugar a los dopacromos que producen
para evitar el establecimiento de patógenos son: el inolquinonas que se polimerizan y forman la mela-
endurecimiento de la exocutícula, proceso donde nina (Söderhall e Iwanaga, 1996).
se añaden moléculas de quitina y melanina al pa-
tógeno (Ashida y Brey, 1995); encapsulación (Pech y Las prostaglandinas (PGs) son eicosanoides cíclicos y
Strand, 2000); melanización del agente extraño para derivan de ácidos grasos monocarboxílicos insatu-
inmovilizarlo; fagocitosis; formación de nódulos rados de 20 carbonos, los cuales están formados por
(Stanley, 1998), y producción de quinonas citotóxi- dos cadenas y un anillo de cinco carbonos, y están
cas. Estas funciones son llevadas a cabo por los he- relacionadas con la estimulación de la adenil ciclasa.
mocitos (Gillespie, Kanost y Trenczek, 1997), en res-
puesta a la presencia de componentes micóticos y La dexametasona es un glucocorticoide que induce
bacterianos en ausencia de especificidad y de me- la síntesis de lipocortina, la cual bloquea las primeras
moria inmunológica (Nation, 2002). reacciones enzimáticas involucradas en la síntesis de
protaglandinas (PGs) (Funk, 2001), inhibiendo la fos-
Algunos componentes de la respuesta inmune se folipasa A2, por lo tanto, se frena la síntesis de ácido
encuentran integrados en cascadas de reacciones co- araquidónico y de los derivados de éste, como son
mo la coagulación y la activación de la proFO (Her- las PGs (García, Lanz, Rojas y Hernández, 2002).
nández, Gollas y Vargas, 2000).

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La activación del sistema de la proFO se presenta Objetivo


gracias a la transformación de esta proteína a
Fenoloxidasa (FO), dicho proceso se da por hidrólisis, El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la
mediada por una proteasa de tipo serina que recibe dexametasona sobre la actividad de la proFO en la
el nombre de enzima activadora de la proFO hemolinfa de mosquitos de la especie Aedes aegypti,
(EAproFO). Esta reacción se inicia gracias a la unión con el propósito de, en un futuro, proponer estra-
de los componentes estructurales de la membrana tegias en el control de estos vectores dentro de sus
de agentes micóticos y bacterianos, como los lipopoli- poblaciones naturales.
sacáridos (LPS) y ß-1-3 glucanos (Laminarina), a un
receptor de membrana. Una vez activada la FO,
comienzan las reacciones de reducción de óxido que
permiten que los difenoles se transformen en qui- Metodología
nonas, moléculas precursoras de la melanización.
Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo
El conocimiento actual del sistema inmune de los fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las
hexápodos deriva en su mayoría de los estudios compañías Sigma Chem (St. Louis Missouri),
genéticos y moleculares en Drosophila (Zdobnov et al., Invitrogen y PE Applied Biosystems.
2002). Sin embargo, al comparar otros organismos,
como el mosquito Anopheles, que responde a las Para la realización de este proyecto, se obtuvieron
infecciones por Plasmodium, encontraron que los mosquitos A. aegypti cultivados en el insectario del
genes en A. gambiae están asociados con la inmunidad Centro de Investigación sobre Enfermedades Infec-
del insecto, y se demostró que ellos divergen amplia- ciosas (CISEI) de Cuernavaca, Morelos, bajo condi-
mente de los de Drosophila (Christophides et al., 2002). ciones estándar (Chan et al., 1994) (Castex, Fachado
Buenos ejemplos son las enzimas proFO (nueve en y Fonte, 1997).
el mosquito, tres en la mosca de la fruta); ya que
estas enzimas catalizan la síntesis de melanina, la Obtención de la hemolinfa. Para la manipulación
cual está asociada con varias reacciones de defensa de A. aegypti, los ejemplares se sometieron a bajas
entre los insectos. temperaturas para inducir un estado de letargo. Se
separaron en grupos experimentales de 15 hembras
García Gil et al. (2002) realizaron un estudio sobre el cada uno, la extracción de la hemolinfa se hizo me-
efecto de los inhibidores de la síntesis de prosta- diante una incisión en el abdomen y un centrifugado
glandinas sobre la coagulación en el homóptero de 15 min, dejando caer la hemolinfa en 50 µl de
Dactylopius coccus (cochinilla del nopal). NaCl (cloruro de sodio) al 0.8% para el grupo con-
trol. Para los grupos experimentales, se agregaron
Aedes aegypti es un díptero de la familia Culicidae, concentraciones de 12.5, 25 y 50 µg/µl de dexame-
y la importancia de su estudio radica en que es un tasona y se incubaron durante 30 min.
vector de enfermedades como el dengue, la fiebre
amarilla y varios virus, entre ellos, el transmisor de Electroforesis de proteínas. Para su análisis, se ex-
la encefalitis. Por tal motivo, el conocimiento del trajeron proteínas, las cuales fueron obtenidas en pre-
sistema inmunológico de esta especie permitiría sencia de inhibidores de proteasas (minicomplete TM
crear estrategias para el control biológico, por protease inhibitor Amersham Inc.), preparados en
ejemplo, mediante una inmunodepresión específica amortiguador PBS (19 mM NaH2 PO4, 8.1 mM Na2
para dicho organismo (Söderhäll e Iwanaga, 1996). HPO4, 154mM NaCl, pH 7.4). Esto se corrió en un gel
de acrilamida (PAGE-SDS) al 10%, 100-110 Volts/2 h,
Las hembras representan el factor de riesgo dentro colocando 17 µg de proteína. Se realizó la cuantifica-
de este género, por ser hematófagas, hábito que ción proteica por medio del método de Bradford.
las hace susceptibles a adquirir el arbovirus (den-
gue o fiebre amarilla) (Söderhäll e Iwanaga, 1996). La actividad enzimática se analizó mediante un
El estudio de los hexápodos vectores cobra mayor método espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En
relevancia debido a que tienen una distribución los pozos de esta placa se agregó 30 µl de un sustrato,
mundial, que abarca desde regiones tropicales, hasta L-dopa (4 mg/ml) más el inhibidor, 12.5, 25 y 50 µl de
templadas. hemolinfa y 30 µl del agente microbiano (LPS o
Laminarina). Los cambios de tonalidad se analizaron

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mediante espectrofotometría a 420 nm. Para determinar de manera cuantitativa si existen diferencias significativas
entre los grupos (p<0.05), se realizó la prueba estadística de Tukey (Sigma Stat 2.03).

Resultados
Análisis espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En todos los pozos se añadió L-dopa como sustrato,
un componente de membrana de microorganismo (LPS o Laminarina) y hemolinfa. En los pozos experimen-
tales se agregó un inhibidor de prostaglandinas (dexametasona) a diferentes concentraciones.

En el grupo 1, que contenía LPS como activador de la reacción inmune, se observó una melanización que se
consideró como testigo para comparar la concentración de melanina obtenida.

El grupo 2 fungió como un segundo grupo control (sin dexametasona), en el cual se utilizó laminarina co-
mo activador.

Al grupo 3 se le añadió dexametasona 12.5 µg/µl y LPS como activador. La melanización obtenida fue intensa,
análoga a los grupos control.

Al grupo 4 se le añadió dexametasona 25 µg/µl y LPS. Se observó una reducción en la melanización respecto al
grupo 3, pero no en relación con los grupos control.

El grupo 5 se trabajó con dexametasona 50 µg/µl y laminarina. La concentración de melanina disminuyó


respecto a los grupos control y a los dos grupos experimentales anteriores.

Tabla 1. Cuantificación de la producción de melanina en multiplaca ELISA por espectrofotometría (ABS 420 nm)

Grupo HL Dexametasona Laminarina LPS L-dopa Absorbancia (420nm)

1 (Control) + - - + + 0.000

2 + - + - + 0.036

3 + + - + + 0.290

4 + + - + + 0.055

5 + + + - + 0.001

Cuantificación de melanina (420 nm) en los diversos tratamientos de los pozos de la multiplaca ELISA.

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Figura 1. Efecto de la dosis de dexametasona sobre la producción En el análisis espectrofotométrico de la melanización,


de melanina
se observa que la dexametasona, a una concentración
de 25 µg/µl, tuvo el efecto más significativo. Esto se
puede comprobar mediante el análisis a detalle del
gel de proteínas, a través del cual se puede observar
que el ancho de las bandas de los carriles tres y cuatro
son distintas en cuanto a intensidad.

Para el análisis cuantitativo de estos resultados, se


aplicó la prueba estadística de Tukey, en donde la
probabilidad es < 0.05. Se demostró que existe una
1 2 3 4
HLc+Lam+ HL+dexa HL+dexa HL+dexa diferencia significativa entre los tratamientos dexa-
L-dopa 50µg+LPS+ 25µg+LPS+ 12.5µg+Lam+
L-dopa L-dopa L-dopa metasona 12.5 µg/µl vs. 50 µg/µl. Los tratamientos
Tratamientos (n=2) Tukey: P< 0.05 dexametasona 12.5 µg/µl vs. 25 µg/µl, dexa. 25 µg/µl
vs. control y control vs. dexa. 50 µg/µl, no mostraron
diferencia significativa.
Actividad protéica por electroforesis (PAGE-SDS).
En el carril 1, se corrió el marcador de peso molecu-
El gel de acrilamida mostró un aumento de la activi-
lar; carril 2, la muestra del grupo control; carril 3,
dad proteica en las bandas correspondientes a 25 kDa,
tratamiento con dexametasona 25 µg/µl; carril 4, tra-
lo que podría significar la presencia de péptidos
tamiento con dexametasona 50 µg/µl. No se apreció
antimicrobianos caracterizados por un peso molecu-
ningún cambio aparente en el patrón de bandas de
lar similar (Müller, Dimopoulos, Blass y Kafatos, 1999).
proteínas en los diferentes tratamientos. En el grupo
control, se observaron los patrones proteicos nor-
males que posee el mosquito como respuesta ante
un agente extraño. El tamaño y grosor de las bandas
Conclusiones
varió respecto a los otros dos carriles.
Las prostaglandinas tienen efecto sobre la respuesta
de melanización en Aedes aegypti y ésta puede ser
Figura 2. Análisis de proteínas de HL de A. aegypti por PAGE-SDS
inhibida por acción de la dexametasona a concen-
traciones de 12.5, 25 y 50 µg/µl.*
KDa

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inmune en invertebrados puede deberse a la presen-
cia de los agentes patógenos. El análisis de nuestros Christophides, G. K., Zdobnov, E., Barillas Mury, C., Birney, E.,
resultados mostró que en todos los ensayos realiza- Blandin, S., Blass, C., Brey, P. T., Collins, F. H., Danielli, A.,
Dimopoulos, G., Hetru, C., Hoa, N. T., Hoffmann, J. A.,
dos existe un efecto del inhibidor de prostaglandina
Kanzok, S. M., Letunic, I., Levashina, E. A., Loukeris, T. G.,
(dexametasona) sobre el inductor LPS y laminarina.

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* Agradecemos el apoyo brindado por la Coordinación de Investi-


gación de la Universidad Simón Bolívar y del laboratorio de
Entomología Molecular del Cinvestav-IPN, así como al insectario
del CISEI-INSP.

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