USO DO MTODO DO SUBSTRATO CROMOGNICO PARA QUANTIFICAO DO NMERO MAIS PROVVEL DE BACTRIAS DO GRUPO COLIFORME EM GUAS MINERAIS ENVASADAS *

DBORA LEAL COELHO ** IDA CHAPAVAL PIMENTEL *** MRCIA REGINA BEUX ****
Avaliou-se a qualidade microbiolgica da gua mineral envasada e destinada ao mercado consumidor de Curitiba, quanto ao ndice de contaminao por coliformes totais e fecais (Escherichia coli), atravs do uso do mtodo do substrato cromognico. Seis marcas, codificadas com as letras A, B ,C, D, E e F, foram analisadas. Todas apresentaram ausncia de coliformes fecais (Escherichia coli) e duas apresentaram presena de coliformes totais. As amostras foram consideradas prprias para consumo sob o ponto de vista microbiolgico, pois no Brasil a legislao em vigor estabelece como padro de potabilidade apenas a ausncia de Escherichia coli , no fazendo referncia a presena de outras bactrias do grupo coliforme. Os padres de potabilidade especificados pelo CODEX ALIMENTARIUS e pela Comunidade Econmica Europia so mais rgidos, pois a presena de coliformes na gua mineral pode indicar ausncia de cuidados sanitrios, problemas nas operaes de captao, decantao, canalizao, elevao mecnica, proviso em reservatrios, filtrao, envasamento, carbonatao ou outros que possam alterar as propriedades caractersticas e a composio das mesmas. As amostras positivas foram submetidas a identificao bioqumica que revelou a presena de Enterobacter gergoviae e Citrobacter freundii, na amostra A e de E. gergoviae e E. aerogenes na B, microrganismos considerados coliformes totais, o que confirma o resultado obtido pelo mtodo utilizado

INTRODUO

O consumo de gua mineral envasada tornou-se popular somente na dcada de 80, em funo da crescente preocupao da populao com a sade, decorrente da poluio progressiva das guas.
* Parte da Monografia apresentada Coordenao do Curso de Cincias Biolgicas como um dos requisitos para concluso do Bacharelado em Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran (UFPR) na rea de Microbiologia - Estgio em Patologia Bsica. ** Aluna do Curso de Cincias Biolgicas, UFPR e estagiria do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos e guas, Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos (CEPPA). *** Engenheira Agrnoma, mestre, professora do Departamento de Patologia Bsica, Setor de Cincias Biolgicas, UFPR. **** Biloga, Mestre em Tecnologia de Alimentos, Coordenadora do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos e guas, CEPPA. B.CEPPA, Curitiba, v. 16, n. 1, p. 45-54, jan./jun.1998

Segundo a Resoluo n. 25/76 guas minerais so guas de origem profunda no sujeitas influncia de guas superficiais, provenientes de fontes naturais ou de fontes artificialmente captadas, que apresentam composio qumica ou propriedades fsicas ou fsico-qumicas distintas das guas comuns. Tradicionalmente, as guas minerais eram aquelas que emergiam naturalmente de fonte subterrnea sendo consumidas no lugar de origem. Atualmente so engarrafadas e vendidas em lugares distantes do seu stio de origem. Existem tambm as guas minerais artificiais ou manufaturadas que so preparadas pela adio de minerais apropriados em gua potvel. Conseqentemente tem sido necessrio introduzir o termo gua mineral natural para distinguir a gua de nascentes subterrneas de guas manufaturadas. A gua atua como substrato para bactrias, por isso importante dispor de critrios ou padres microbiolgicos numericamente estabelecidos, considerando valores mximos aceitveis de microrganismos, para no colocar em risco a sade dos consumidores e garantir a potabilidade da gua proveniente de fontes naturais ou artificialmente captadas e comercializadas envasadas. Estes critrios ou padres so determinados pela legislao e variam de acordo com a origem da gua analisada (fonte, rio, lago, rede pblica, mineral). Segundo a legislao brasileira (Resoluo n. 25/76) as guas minerais devem estar isentas apenas de Escherichia coli para que sejam consideradas potveis sob o ponto de vista bacteriolgico, apesar da potabilidade poder ser tambm verificada atravs de anlises indicadoras de contaminao, como a contagem de bactrias heterotrficas, coliformes totais ou coliformes fecais. guas minerais naturais no so estreis, apresentando microrganismos que lhe so prprios, isto , existentes antes de qualquer tratamento ou processamento. Embora, estes microrganismos conhecidos como autctones permaneam num nvel baixo em termos populacionais enquanto a gua est em seu ambiente natural, logo aps o engarrafamento comeam a crescer rapidamente. Juntamente com as bactrias autctones desenvolvem-se as indgenas e o melhor crescimento destas tem sido observado em guas com alto contedo mineral, sendo que desenvolvem-se melhor em temperaturas prximas a 20 C. Acreditase que maior nmero de microrganismos so encontrados em guas de garrafas plsticas, devido caracterstica do plstico de permitir a passagem de O2, proporcionando superfcie de crescimento adequada para as bactrias.

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Para a Sade Pblica, o significado das bactrias indgenas tem sido discutido. Alguns autores tm indicado que estas bactrias so incapazes de colonizar o trato digestivo, possivelmente devido sua inabilidade em sobreviver em potencial redox baixo e a temperatura de 37 C deste ambiente. Conseqentemente, estas bactrias so consideradas sem perigo sade pblica. Entretanto, algum interesse tem sido expressado sobre a habilidade destas bactrias em converter o nitrato das guas minerais em nitrito (VIEIRA, 1989). Outro tipo de flora bacteriana que pode surgir na gua mineral, mas no proveniente da fonte so as chamadas bactrias alctones, que aparecem durante as etapas prvias ao engarrafamento, durante o processamento ou mesmo do ambiente. O crescimento significativo destas bactrias raro, principalmente devido a seus requerimentos nutricionais. Os tipos mais persistentes de bactrias alctones apresentam caractersticas fisiolgicas semelhantes s espcies autctones. Estas incluem espcies mesfilas gram negativas, tais como: Pseudomonas cepacia, Pseudomonas multivorans, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas aeruginosa (VIEIRA, 1989). As espcies patognicas de interesse primrio em guas minerais so: Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Vibrio cholerae, Shigella sp, Pseudomonas cepacia, vrus entricos e alguns protozorios. Estes organismos chegam at a gua por contaminao fecal ou outras vias, seja diretamente na fonte ou durante o engarrafamento. As caractersticas de crescimento e sobrevivncia destes organismos nas guas minerais requerem mais estudos. Para enumerao das bactrias do grupo coliforme so preconizados trs mtodos segundo o Standard methods of the examination of water and wastewater (APHA, 1995). Destes mtodos, dois quantificam os coliformes atravs do uso de tubos mltiplos e revelam a densidade bacteriana atravs do nmero mais provvel (NMP); o padro e o substrato cromognico. O terceiro, conhecido como o da membrana filtrante, permite visualizao do nmero de colnias de microrganismos existentes, expressando o resultado em unidades formadoras de colnias (UFC). O uso do mtodo do substrato cromognico permite determinar simultaneamente os coliformes totais e Escherichia coli presentes em uma determinada amostra. O mtodo do substrato cromognico define como coliformes totais bactrias na forma de bastonetes, gram negativas, no formadoras de esporos, aerbias ou anaerbias facultativas, que hidrolizam o substrato Orto-nitrofenil--D-galactopiranosdeo (ONPG), transformando-o em Ortonitrofenol. O grupo inclui cerca de 20 espcies, dentre as quais encontramB.CEPPA, Curitiba, v. 16, n. 1, jan./jun.1998 47

se tanto bactrias originrias do trato gastrintestinal de humanos e outros animais de sangue quente, como tambm diversos gneros e espcies de bactrias no entricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por esta razo, sua enumerao em gua e alimentos menos representativa como indicao de contaminao por fezes, do que a enumerao de coliformes fecais ou Escherichia coli (SILVA & JUNQUEIRA, 1995). O mtodo reconhece como coliformes totais as cavidades com bactrias que alteram a colorao do meio, de incolor para amarelo. O resultado para Escherichia coli positivo quando as cavidades positivas apresentam alm da colorao amarela, fluorescncia azul sob luz ultravioleta (360 nm), devido ao do 4-metilumbeliferil--D-glucorondeo (MUG) utilizado como substrato para indicar a presena da enzima bglucoronidase. Esta enzima caracteristicamente produzida pela Escherichia coli e quando o MUG degradado pela b-glucoronidase o produto resultante 4-metilumbeliferona fluorescente sob luz ultravioleta. O grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos trs gneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem no fecal. Por este motivo, a presena de coliformes fecais em alimentos menos representativa, como indicao de contaminao fecal, do que a enumerao direta de Escherichia coli, porm, muito mais significativa do que a presena de coliformes totais, dada a alta incidncia de Escherichia coli dentro do grupo fecal. Utilizando-se do mtodo substrato cromognico (mais recente), o presente trabalho analisou seis marcas de gua mineral de um litro, envasadas e disponveis no mercado de Curitiba, tendo como objetivo avaliar o ndice de contaminao por coliformes totais e Escherichia coli, identificando as espcies recuperadas a partir das cavidades positivas para coliformes totais.

MATERIAL E MTODOS

Foram analisadas seis amostras de gua mineral envasadas em garrafas plsticas de um litro, compradas no mercado da cidade de Curitiba, em duplicata, utilizando-se o mtodo de contagem de coliformes totais e Escherichia coli atravs do uso de substrato cromognico, preconizado pelo Standard methods of the examination of water and wastewater, (APHA, 1995). Para quantificao dos coliformes totais e Escherichia coli foi utilizado o sistema Quanti-Tray, que composto por frascos estreis graduados com capacidade para 100 mL, flaconetes com meio de cultura, cartelas estreis com 97 cavidades e seladora Quanti-Tray, marca IDEXX.

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O processo foi desenvolvido dentro de capela de fluxo laminar, sendo cada amostra, aps assepsia do frasco com algodo embebido em lcool, transferida para um frasco estril graduado. Em seguida adicionou-se para cada frasco um flaconete contendo a quantidade exata de meio de cultura contido no flaconete. Aps dissoluo do meio de cultura transferiu-se a amostra para uma cartela plstica estril e, posteriormente, para a seladora. Esta apresenta suporte de borracha no qual as cartelas se encaixam. Aps seladas as cartelas foram incubadas em estufa bacteriolgica regulada a 3505 C por 24 horas. No sistema utilizado, o Quanti - Tray, os tubos mltiplos so substitudos por 97 cavidades contidas na cartela plstica estril. O resultado de coliformes totais e Escherichia coli obtido simultaneamente. Este mtodo amplia, em comparao ao mtodo padro de fermentao em tubos mltiplos, o nmero de combinaes positivas possveis, fornecendo resultados mais precisos. Os resultados so expressos atravs do NMP/100 mL da amostra obtido na Tabela de combinao de cavidades positivas. Aps a leitura, com o intuito de identificar os microrganismos, o meio de cultura contido nas cavidades das cartelas que apresentaram resultado positivo foi transferido, com auxlio de ala descartvel, para tubos contendo caldo verde brilhante lactose bile a 2% suplementado com MUG. Este um caldo seletivo para coliformes totais que tambm permite verificar o crescimento de Escherichia coli (10 g peptona, 10 g lactose, 20 g bile de boi desidratada, 0,0133 g verde brilhante, 1000 mL gua destilada e 0,1 g de MUG) e para placas de gar eosina azul de metileno - gar EMB, seletivo para bactrias gram negativas (10 g peptona, 10 g lactose, 2,0 g hidrogenofosfato de potssio, 0,4 g eosina amarela, 0,065 g azul de metileno, 15,0 g gar, 1000 mL gua destilada). Tanto os tubos quanto as placas foram incubados em estufa bacteriolgica regulada a 35 0,5 C por 24 horas. Nos tubos contendo verde brilhante foi observada a presena ou no de turvao e formao de gs, alm de fluorescncia sob luz ultravioleta. As colnias que cresceram nas placas de EMB foram repicadas para o gar trplice acar e ferro - TSI (15 g peptona, 5 g proteosepeptona, 3,0 g extrato de carne, 3,0 g extrato de levedura, 5,0 g cloreto de sdio, 10 g lactose, 10 g sacarose, 1,0 glicose, 0,2 g sulfato ferroso amnia 6 H2O, 0,2 g tiossulfato de sdio, 0,024 g vermelho de fenol, 13 g gar, 1000 mL gua destilada) e para o gar lisina-ferro-LIA (5,0 g peptona de carne, 3,0 g extrato de levedura, 1,0 g glicose, 10 g l-lisina monocloridrato, 0,04 g tiossulfato de sdio, 0,5 g citrato frrico amoniacal, 0,02 g prpura de bromocresol, 15 g gar, 1000 mL gua destilada), que serviram para isolamento das colnias.

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Para identificao das colnias, repicadas do EMB para os meios TSI e LIA, foi utilizado mini kit de provas bioqumicas para enterobactrias que composto pelas seguintes provas: desaminao do L triptofano, descarboxilao da lisina, descarboxilao da ornitina e indol, leitura de citrato e fermentao da rhamnose. O mini-kit no apresenta prova de fermentao da lactose, por isso deve ser complementado.

RESULTADOS E DISCUSSO

As marcas que apresentaram colorao amarelo foram a A e a B, sendo que ambas apresentaram 2 cavidades positivas, indicando a presena de coliformes totais. No entanto estas cavidades no apresentaram fluorescncia azul sob luz ultravioleta, o que indica ausncia de Escherichia coli nas amostras. Com o nmero de cavidades positivas obteve-se o nmero mais provvel de coliformes totais de acordo com a Tabela apropriada. O resultado encontrado de coliformes totais foi de 2,0 NMP/100 para as amostras A e B e ausncia de Escherichia coli em 100 mL, para todas as amostras (Tabela 1).

TABELA 1 - NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E Escherichia coli EM 100 mL DE AMOSTRA PARA AS SEIS MARCAS ANALISADAS NMP/100 mL Coliformes Coliformes Totais Fecais 2,0 Ausncia 2,0 Ausncia Ausncia Ausncia Ausncia Ausncia Ausncia Ausncia Ausncia Ausncia Limite de Confiana 0,69 8,90 0,26 7,10 -

Marca A B C D E F

Segundo a legislao vigente no Brasil (Resoluo n. 25/76) estas amostras seriam aprovadas, pois a nica especificao a ausncia de Escherichia coli em 100 mL da amostra. Contudo existem outras especificaes propostas para guas minerais naturais engarrafadas. As especificaes do CODEX ALIMENTARIUS (1995) incluem como primeiro exame coliformes fecais (Escherichia coli), Estreptococos-D (enterococos) e Pseudomonas aeruginosa (Tabela 2). O segundo exame, envolvendo as mesmas anlises, ser necessrio caso o nmero de enterococos seja maior ou igual a um ou menor ou igual a dois. O Codex no inclui critrios para contagem total em placas de aerbios, reconhecendo o fato de que

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guas minerais naturais engarrafadas apresentam microbiota indgena inofensiva, que chegam a populaes to altas quanto 106 cl/mL durante a comercializao. Entretanto, o cdigo inclui especificaes para a contagem total de aerbios da gua, na nascente, o que depende do conhecimento da ecologia microbiana de cada fonte de gua em particular.

TABELA 2 - ESPECIFICAES MICROBIOLGICAS PROPOSTAS PARA ENGARRAFAMENTO DE GUAS MINERAIS NATURAIS NO CARBONATADAS (CODEX ALIMENTARIUS, 1995) 1 EXAME Organismo/grupo Coliformes Estreptococos-D (enterococos) Pseudomonas aeruginosa 2 EXAME Organismo/grupo Coliformes Estreptococos-D (enterococos) Pseudomonas aeruginosa 4 x 250 mL 0 0 0 N 4 x 250 mL 4 x 250 mL C 1 1 m 0 0 M 2 2 1 x 250 mL aceito se ausente / rejeitado se 1 Amostra 1 x 250 mL 1 x 250 mL Deciso aceito se ausente se 1 ou 2 - fazer 2 exame

N = nmero de amostras submetidas a exame. C = nmero de unidades defeituosas tolerado entre as unidades de amostras coletadas. m = valor de contagem mnima. M = valor de contagem mxima.

Na Tabela 3 pode-se verificar as especificaes propostas pela Comunidade Econmica Europia (80/777/EEC), que inclui contagem total de colnias, ausncia de parasitas e microrganismos patognicos como: Escherichia coli, coliformes, Enterococcus faecalis, anaerbios sulfito redutores esporulados e Pseudomonas aeruginosa (VIEIRA, 1989).

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TABELA 3 - ESPECIFICAES PROPOSTAS PELA COMUNIDADE ECONMICA EUROPIA (80/777/EEC) PARA GUAS MINERAIS NATURAIS ENVASADAS
Contagem total de colnias / 12h aps envase, mantidas a temperatura 4 1 C

100/mL - 20 - 22 C - 72h 20/mL - 35 - 37 C - 24h

Ausncia de parasitas e microrganismos patognicos

Coliformes / 250 mL Escherichia coli / 250 mL Enterococcus faecalis / 250 mL Anaerbios sulfito redutores esporulados / 50 mL Pseudomonas aeruginosa / 250 mL

Na Tabela 4 esto demonstradas as propostas da Legislao Espanhola pelo real decreto 2119/81, no qual as anlises so divididas conforme o local de coleta (VIEIRA, 1989).

TABELA 4 - ESPECIFICAES PROPOSTAS PELA LEGISLAO ESPANHOLA (REAL DECRETO 2119/81) PARA AS GUAS MINERAIS NATURAIS ENVASADAS Na fonte Ausncia, em 100 mL, de parasitas e microrganismos patognicos: Enterobactrias: Escherichia coli e salmonelas Enterococcus faecalis (Grupo D) Esporos de Clostridium sulfito redutores No mercado Ausncia em 100 mL de: Todos os microrganismos anteriores Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Para reiterar o resultado obtido pelo mtodo do substrato cromognico, todos os tubos contendo verde brilhante lactose bile a 2% com MUG apresentaram turvao e formao de gs, no revelando a presena de fluorescncia, mas confirmando a presena de coliformes totais e a ausncia de Escherichia coli.

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As quatro placas de gar Eosina Azul de Metileno (EMB) apresentaram crescimento, confirmando a presena de bacilos Gram negativos. As enterobactrias identificadas nas amostras A e B esto descritas na Tabela 5.

TABELA 5 - TABELA DE IDENTIFICAO DOS MICRORGANISMOS ISOLADOS DAS QUATRO CAVIDADES POSITIVAS PARA COLIFORMES TOTAIS

Amostra n A A B B

Cav 1 2 1 2

Phe -

Lac + +

H2S + -

Glu + + + +

Gs + + + -

Lis + + +

I -

Crn + + +

Mot + + + +

KK + + +

Rha + + + +

Identificao Citrobacter freundii Enterobacter gergoviae Enterobacter gergoviae Enterobacter aerogenes

Os microrganismos isolados das cavidades contidas nas cartelas de quantificao confirmam a presena de coliformes totais nas amostras A e B analisadas.

CONCLUSO

As seis marcas de gua mineral testadas atendem aos parmetros estabelecidos pela legislao, apesar de duas marcas apresentarem presena de coliformes totais. Os microrganismos identificados a partir das amostras positivas pertencem as espcies Enterobacter gergoviae, Enterobacter aerogenes e Citrobacter freundii, comprovando que o mtodo do substrato cromognico utilizado recuperou os coliformes presentes nas amostras.

Abstract
Microbiological quality of the bottled mineral water consumed in Curitiba, Paran State, Brazil, was evaluated for total and fecal coliforms (Escherichia coli) throughout the method of chromogenic substrate. Six brands, codified with the letters A, B, C, D, E, and F, were analyzed. All brands presented no fecal coliforms while two samples showed presence of total coliforms. The samples were considered suitable for consumption under microbiological means. In Brazil, the current

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legislation only establishes as potability standard the absence of Escherichia coli, not referring to the presence of any other bacteria of the coliform group. The standards of potability specified by CODEX ALIMENTARIUS and the European Economic Community are more tight, considering the presence of coliforms in the mineral water as an indicative of inefficient sanitary cares and problems in the process operations and others that may modify the characteristic properties and their composition. The positive samples were submitted to the biochemical identification showing up the presence of Enterobacter gergoviae and Citrobacter freundi, in the sample A and of E. gergoviae and E. aerogenes in the sample B, considered total coliform microorganisms, confirming the previous result reached with the applied method.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1 BRASIL. Ministrio da Sade. Resoluo n. 25, de 1976. Estabelece padres de identidade e qualidade para guas minerais e gua natural de fonte. Dirio Oficial [da Repblica Federativa do Brasil], de 16 de maro de 1977. APHA. Standard methods for the examination of water and wastewater: part 9000: microbiological examination. 19. ed. Washington, 1995. p. 9-51. CODEX ALIMENTARIUS. Azcares, productos del cacao y el chocolate y productos varios. Roma, Itlia : FAO/OMS, [1995]. v.11. SILVA, N. da, JUNQUEIRA, V.C.A. Mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. Campinas, 1995. 229 p. (Manual Tcnico, 14). VIEIRA, M. B. C. M. gua mineral: aspectos microbiolgicos e a legislao vigente. In: ENCONTRO NACIONAL DE ANALISTAS DE ALIMENTOS, 4., Belo Horizonte, 03-07 de outubro de 1988. Anais... Belo Horizonte : Lemi, 1989. p. 125-130.

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