EVALUACIN POR ENSAYO COMETA DE DAO CELULAR INDUCIDO CON PERXIDO DE HIDRGENO A LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA IN VITRO Camacho

Banda G. S. (1); Morn Martnez J. (2); Betancourt Martnez N. D. (2); Monreal de Luna K. D. (2); Bentez Muos M. A. (3) (1) Facultad de Qumica, Universidad Autnoma de Quertaro; (2) Departamento de Biologa Celular y Ultraestructura, Centro de Investigacin Biomdica, Facultad de Medicina, Universidad Autnoma de Coahuila, Unidad Torren; (3)Departamento de Ingeniera Bioqumica, Centro de Ciencias Bsicas, Universidad Autnoma de Aguascalientes.

RESUMEN Se realiz la evaluacin del dao genmico inducido a clulas de sangre perifrica, linfocitos, utilizando como agente genotxico el perxido de hidrgeno, el cual ha demostrado ser capaz de inducir un dao celular general, y especfico al genoma de la clula. Se analizaron diferentes muestras de sangre perifrica por duplicado, analizando el dao segn el tiempo de exposicin y concentracin al agente genotxico, haciendo uso del Ensayo Cometa para la comparacin de los niveles de dao; cada categora de cada cometa, fue asignada segn el mtodo por Collins (2002). Al final se realiz una comparacin entre los controles y las clulas daadas segn su exposicin a diferentes concentraciones del agente, as como a los diferentes tiempos de exposicin a este. Se comprob la relacin entre la variacin de concentraciones de H2O2 con un tiempo constante y diferentes tiempos de exposicin a una concentracin constante, y su relacin con el dao celular que se present. Se lleg a la conclusin de que el nivel de concentracin influye de manera directa en el dao celular que se presente, siendo el tiempo de exposicin un determinante final del dao progresivo a observarse en las clulas al ser expuestas a un agente genotxico. INTRODUCCIN La mayor parte del material hereditario, DNA, se localiza en el ncleo celular como bases qumicas, Adenina, Guanina, Citosina y Timina; el orden y secuencia de estas determina la informacin para construir y mantener un organismo. Existen diferentes tipos de daos al DNA que inducen ciertas lesiones introduciendo desviaciones a su conformacin normal de doble hlice. Un agente genotxico, es capaz de producir modificaciones de las caractersticas particulares del DNA; el H2O2 es un agente capaz de dar lugar a mltiples reacciones, llegando a producir un dao celular. El dao celular producido por estos agentes al encontrarse en elevadas cantidades, ocurre sobre diferentes macromolculas, tal es el caso de lpidos, protenas y DNA, conocindose a este dao como estrs oxidativo. En el DNA, el estrs oxidativo puede dar lugar a fenmenos como mutaciones y carcinognesis. Los linfocitos humanos perifricos representan una poblacin celular donde el DNA est predominantemente en la etapa pre-sinttica del ciclo celular, fase Go. Los linfocitos humanos poseen un ncleo denso y citoplasma escaso. Se distinguen dos tipos principales de linfocitos, clulas T y B. El nmero total de linfocitos en un
1

adulto saludable puede ser aproximadamente 500x 109, y alrededor del 2% (10 x 109) estn presentes en la sangre perifrica y el resto se ubican en otros tejidos, como en timo, nodos linfticos, tejido linftico del intestino, bazo y mdula sea. Para interpretar aberraciones cromosmicas, es de gran importancia conocer si el grupo de linfocitos perifricos pertenece al grupo de redistribucin; cerca del 80% de los linfocitos (400 x109), pertenecen a este y el tiempo total de recirculacin es de cerca de 12 horas. Empleando los linfocitos de sangre perifrica como modelo experimental no solo puede detectarse el dao cromosmico que ha sido inducido en los linfocitos en la sangre perifrica, sino tambin aquellos que han sido inducidos en cualquiera de los rganos donde estas clulas se distribuyen en el cuerpo. Singh y colaboradores (1988) introdujeron una tcnica en microgeles que involucra la electroforesis alcalina (pH 13) para detectar el dao al DNA en clulas individuales; se refiere a la migracin del DNA en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis, que al ser observada la clula al microscopio, por fluorescencia o tincin con plata, presenta la apariencia de un cometa, con una cabeza, regin nuclear, y cola, formada por fragmentos nucleares que han migrado en direccin del nodo, por lo que es conocido como Ensayo Cometa, debido al patrn de migracin del DNA que se produce. Comparado con otros ensayos de genotoxicidad, el Ensayo Cometa se distingue por: 1) Una demostrada sensibilidad para detectar bajos niveles de dao al DNA, 2) Rpida realizacin, 3) Un anlisis de los datos a nivel de clulas individuales, 4) Requerir un pequeo tamao de muestra, 5) Flexibilidad y bajo costo, 6) y es aplicable a cualquier poblacin de clulas eucariotas; Todo esto justifica su amplio uso en la evaluacin genotxica in vitro, de qumicos industriales, agroqumicos, frmacos, as como, en el biomonitoreo ambiental y humano. OBJETIVO Evaluar el dao celular inducido por agente genotxico (perxido de hidrgeno), en linfocitos de sangre perifrica para anlisis de las rupturas de simple cadena y sitios absicos producidos en el DNA por el agente como criterio de genotoxicidad mediante la electroforesis alcalina de clulas individuales mediante el Ensayo Cometa. EXPERIMENTAL Se utiliz solucin de agarosa de punto de fusin normal (APFN) al 0.5 %, solucin de agarosa de bajo punto de fusin (ABPF) al 0.5 %, solucin de lisis celular (45mL Stock de lisis, 4mL DMSO, 400L TitonX100), solucin tampn de electroforesis (EDTA (Na2) + NaOH + HCL, pH13), solucin tampn de neutralizacin (Tris + NaOH + HCL pH7), 1mL de H2O2 30%, v/v, Bromuro de Etidio. Se recolectaron muestras de tres sujetos sanos para los tres ensayos realizados. Cada categora de cada cometa, fue asignada segn el mtodo por Collins (2002). DISCUSIN DE RESULTADOS Las muestras utilizadas para el ensayo fueron tomadas el da de su realizacin. En total se realizaron tres ensayos, el primero para obtener controles negativos, el segundo para evaluacin de dao celular por exposicin a 10L de H2O2 con variacin en los tiempos de exposicin (1, 5, 10 minutos), y tercero para evaluacin de dao celular por exposicin a diferentes concentraciones de H2O2 (5, 10, 15L) durante 5 minutos, realizndose todo por duplicado.
2

Durante los ensayos fue visible el dao ejercido por el agente genotxico al visualizarse una reaccin de efervescencia inmediatamente despus de agregar el agente. Se analizaron las laminillas con un microscopio de fluorescencia (LABOMED, Lx 400), contndose cincuenta clulas por laminilla y se le asign una categora a cada clula segn el tamao de la cabeza y cola, y fluorescencia del cometa formado (Figura 1).

Figura 1. Cometas encontrados en tratamiento con 10L de H2O2 durante 5 minutos presentando un nivel de dao celular 3. Por otro lado se realiz una comparacin grafica entre el control negativo y las clulas tratadas con 10L de H2O2 con del tiempo de exposicin (Figura 2).
4 3 2 1 0 0 20 40 60

Nivel de Dao Celular

Control Negativo 10min 5min 1min

Numero de Clulas Daadas

Figura 2. Evaluacin de dao celular por exposicin a 10L de H2O2 con variacin en los tiempos de exposicin (1, 5, 10 minutos) Se observ una tendencia de dao creciente conforme aumentaba el tiempo de exposicin al agente genotxico, observndose cometas de nivel 3 desde el primer tiempo de exposicin, esto se atribuye a la relacin del agente con la concentracin celular, siendo la relacin utilizada una relacin 1:1 (10L sangre perifrica y 10L H2O2). Se realiz una segunda comparacin grafica entre el control negativo y las clulas tratadas con el perxido de hidrgeno a diferentes concentraciones con un tiempo constante de exposicin (Figura 3).

Nivel de Dao Celular

4 3 2 1 0 0 20 40 60

Control Negativo 15L 10L 5L

Numero de Clulas Daadas

Figura 3. Evaluacin de dao celular por exposicin a diferentes concentraciones de H2O2 (5, 10, 15L) durante 5 minutos Se observ una tendencia creciente de dao celular segn el aumento de la concentracin, aumentando el dao de manera progresiva en las diferentes concentraciones evaluadas. CONCLUSIN El dao celular presentado segn las variaciones de concentracin de H2O2 con un tiempo constante y el dao a diferentes tiempos de exposicin a una concentracin constante de H2O2, ayudaron a concluir que conforme la concentracin aumentaba se observaba un dao superior con crecimiento gradual segn la exposicin que la clula tenia al agente genotxico. Por otro lado, al variar los tiempos de exposicin se observ un dao celular importante desde el primer tiempo, pero su aumento no fue gradual pero si constante. Se lleg a la conclusin de que el nivel de concentracin influye de manera directa en el dao celular que se presente, siendo el tiempo de exposicin un determinante final del dao progresivo a observarse en las clulas al ser expuestas a un agente genotxico. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Norea Atehorta J. C.; Lloreda C. E.; Bogot D.C., Entendiendo el envejecimiento facial, Cirugia Plstica y Reconstructiva. 11, 23-27, 2008. Arencibia Arrebola D.F., Rosario Fernndez L.A., Actualizacin sobre el ensayo cometa y de microncleos in vitro, Toxicologa, 20, 24-41, 2003. M. Madigan. J. Martinko. J. Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, Pearson, Espaa, 2003. Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser C. A., Krieger M., Scott M. P., Zipursky S. L., Darnell J. Molecular Biology of the Cell, WH Freeman, New York, 2004. Ziga Venegas, L.A. Optimizaciones metodolgicas del ensayo del cometa y su aplicacin en biomonitorizacin humana. Tesis Doctoral en Gentica, Universidad Autnoma de BarcelonaBarcelona, Espaa, 2009.