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MARIANA KIKUTI

ACOMPANHAMENTO DA ROTINA LABORATORIAL DO

SERVIÇO DE DIAGNÓSTICO DE ZOONOSES (SDZ) DE 6 DE JULHO A 30 DE SETEMBRO DE 2009

CURITIBA

2009

MARIANA KIKUTI

ACOMPANHAMENTO DA ROTINA LABORATORIAL DO

SERVIÇO DE DIAGNÓSTICO DE ZOONOSES

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

Trabalho apresentado como um dos pré- requisitos para conclusão do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Paraná.

Supervisor: Prof. Dr. Biondo

Alexander Welker

Orientador: Prof. Dr. Hélio Langoni

CURITIBA

2009

Dedico meu trabalho às pessoas que sempre fizeram tudo por mim e pela minha felicidade, meus pais.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente aos meus pais, que sempre lutaram para me dar todas as oportunidades possíveis, sempre me apoiaram em todas as decisões e me aconselharam quando precisei e me ajudaram em cada parte da minha trajetória pessoal e profissional. São neles que eu me espelho para sempre ser uma pessoa melhor em todos os aspectos.

Ao Igor, que esteve ao meu lado por toda a minha trajetória nesta etapa importante da minha vida, me incentivando, me aconselhando e me inspirando a ser sempre melhor, assim como toda a minha família, em especial minha tia Mara.

Aos professores membros da banca, Prof. Alexander Welker Biondo, que não só me orientou durante os anos de graduação como me incentiva a sempre querer mais, Prof. Walfrido Kühl Svoboda, que me co-orientou na iniciação científica e me inspirou ainda mais a apreciar a Saúde Pública, ao Prof. Antônio Waldir Cunha da Silva, que esteve presente em muitos dos projetos desempenhados, e à Profª. Márcia de Oliveira Lopes, sempre disposta a colaborar e ajudar os alunos.

Ao meu supervisor de estágio, Prof. Dr. Hélio Langoni, pelas oportunidades que me foram cedidas durante todo o estágio, as orientações e pela inspiração para sempre fazer o melhor.

Aos demais colegas de trabalho durante o estágio, aos residentes Rozeani Olimpio Tomé, Felipe Fornazari, Fernanda Conceição Gaio e Diego Generoso, pelos ensinamentos do dia-a-dia do estágio. Ao técnico Benedito Donizeti Menozzi, com quem aprendi muito, e aos demais estagiários.

Meus sinceros agradecimentos à Leila, que gentilmente me hospedou em sua casa durante este período e fez muito além, me orientando, me supervisionando e me incentivando a melhorar cada vez mais no estágio. À Selene, que também se tornou uma pessoa muito querida por mim, assim como à Luciana.

A todos os amigos, colegas, professores e funcionários da Universidade Federal do Paraná, que sem dúvida fizeram parte desta minha conquista. A todos os meus colegas de classe, com quem tive o prazer de conviver durante estes anos de graduação, e também à Camila e Maysa que me ajudaram à distância com as documentações enquanto estive em estágio curricular.

A todos os funcionários do Hopital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, ao Prof. Luiz Felipe Caron e à Profª. Lucy Ono pela orientação e supervisão durante o estágio no Departamento de Microbiologia, ao Prof. Édson Prisco pela oportunidade de estágio na Anatomia Topográfica, ao Dr. Roberto Lange e todos os demais Médicos Veterinários e funcionários da Clínica Santa Mônica, ao Prof. Alexander Biondo e demais co-orientadores dos Projetos de Extensão, às Médicas Veterinárias Maria do Carmo Pessôa e Elzira Jorge Pierre da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado do Paraná, e ao Médico Veterinário Paulo Araújo Guerra e todos os demais funcionários da Divisão de Zoonoses da Secretaria de Estado de Saúde do Paraná. Todos vocês foram fundamentais não só pelo meu aprendizado, mas como modelo do tipo de profissional que eu quero ser.

“O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza de seus sonhos.”

Elleanor Roosevelt

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

iii

LISTA

DE

GRÁFICOS

iv

LISTA DE TABELAS

v

LISTA

DE

ABREVIATURAS

vi

LISTA

DE

SÍMBOLOS

vii

RESUMO

viii

1. INTRODUÇÃO

1

2. OBJETIVO GERAL

2

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2

4. DESCRIÇÃO DO ESTÁGIO

3

4.1 SERVIÇO DE DIAGNÓSTICO DE ZOONOSES

3

4.2 CASUÍSTICA

7

4.3 DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DE CHAGAS

12

4.3.1 INTRODUÇÃO

12

4.3.2 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

13

4.4

DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE

15

4.4.1 INTRODUÇÃO

15

4.4.2 PREPARO DE ANTÍGENOS

17

4.4.3 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

17

4.4.4 OBSERVAÇÃO DIRETA DO AGENTE

19

4.4.5 ISOLAMENTO EM MEIO DE CULTURA

20

4.4.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR

21

4.5

DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE

23

4.5.1 INTRODUÇÃO

23

4.5.2 MANUTENÇÃO DO ANTÍGENO

25

4.5.3 SOROAGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA

27

4.5.4 OBSERVAÇÃO DO AGENTE EM MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO

 

29

4.6

DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSE

30

4.6.1

INTRODUÇÃO

30

i

4.6.2

REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

31

 

4.7

DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSE

33

4.7.1 INTRODUÇÃO

33

4.7.2 MANUTENÇÃO DAS CEPAS

34

4.7.3 PREPARO DOS ANTÍGENOS

35

4.7.4 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

35

4.7.5 ISOLAMENTO DO ANTÍGENO

37

4.8

DIAGNÓSTICO DE RAIVA

38

4.8.1 INTRODUÇÃO

38

4.8.2 COLHEITA E ENVIO DO MATERIAL SUSPEITO

41

4.8.3 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

41

4.8.4 PROVA BIOLÓGICA

44

4.9

DIAGNÓSTICO DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

46

4.9.1 INTRODUÇÃO

46

4.9.2 RECEBIMENTO DE AMOSTRAS

47

4.9.3 IMUNODIFUSÃO EM GEL DE ÁGAR

48

5. DISCUSSÃO

50

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

51

7. REFERÊNCIAS

51

8. PREVENTING RABIES TRANSMITTED BY BATS IN RAIN FOREST

PRESERVED AREAS OF SOUTHERN BRAZILIAN COAST

55

9.

ANEXO

63

 

9.1

NORMAS PARA SUBMISSÃO DE ARTIGO COMPLETO DA REVISTA

ZOONOSES AND PUBLIC HEALTH

63

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Localização da cidade de Botucatu no estado de São Paulo

6

Figura 2 – Departamento de Veterinária e Saúde Pública

6

Figura 3 – Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 1

6

Figura 4 – Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 2

7

Figura 5 – Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 3

7

Figura 6 – Trypanosoma cruzi

13

Figura 7 – Disposição das diluições do soro na lâmina para diagnóstico de doença

de chagas

Figura 8 – Distribuição das diluições do soro na lâmina para diagnóstico de

Leishmaniose

Figura 9 – Reação de imunofluorescência indireta positiva para Leishmaniose

15

19

19

Figura 10 – Formas

amastigotas de Leishmania encontradas em imprint de baço

corado com Panótico rápido

20

Figura 11 – Maceração de fragmento de órgão com pistilo

21

Figura 12 – Ciclos realizados no termociclador para diagnóstico molecular de

Leishmaniose

22

Figura 13 – Imagem digital do gel capturada pelo transluminador

23

Figura 14 – Amostra reagente para Leptospirose na prova de soroaglutinação

microscópica

Figura 15 – Disposição das diluições do soro para diagnóstico de Neosporose

29

32

Figura 16 – Distribuição das diluições do soro na lâmina para diagnóstico de

Toxoplasmose

 

37

Figura

17

Amostra

positiva

para

Toxoplasmose

no

diagnóstico

por

imunofluorescência indireta

 

37

Figura 18 – Imprint de material cerebral para diagnóstico de Raiva

43

Figura 19 – Regiões para realização do imprint na lâmina de imunofluorescência

para diagnóstico de Raiva

43

Figura 20 – Remoção do excesso de material da lâmina com papel filtro

43

Figura 21 – Amostra positiva para Raiva observada em microscópio de

imunofluorescência

44

iv

Figura 22 – Maceração do material cerebral suspeito de Raiva para inoculação em

cérebro de camundongo

Figura 23 – Inoculação de material suspeito de Raiva em cérebro de camundongo

45

46

Figura

apresentando pêlos arrepiados, paralisia e morte

Figura 25 – Distribuição do gel de Agar em lâmina para diagnóstico de Anemia

Infecciosa Equina

Figura 26 – Utilização do furador para o preparo de lâmina para diagnóstico de

Anemia Infecciosa Equina

Figura 27 – Protocolo para lâmina de diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina

Raiva

24

Camundongos

inoculados

com

material

positivo

para

46

49

49

50

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Casuística de exames diagnósticos realizados pelo Serviço de Diagnóstico de Zoonoses de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

9

Tabela 2 – Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Leishmaniose no

SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

Tabela 3 – Casuistica de exames de pesquisa direta de amastigotas para

diagnóstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de

2009

Tabela 4 – Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Leptospirose no

SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

Tabela 5 – Casuistica de exames de campo escuro para diagnóstico de

Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

Tabela 6 – Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Neosporose no

SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

Tabela 7 – Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Toxoplasmose no

SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

Tabela 8 – Casuistica de exames de imunofluorescência direta para diagnóstico de

Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

Tabela 9 – Casuistica de provas biológicas para diagnóstico de Raiva no SDZ de 06

de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009

9

9

10

10

10

11

11

11

v

LISTA DE ABREVIATURAS

SDZ - Serviço de Diagnóstico de Zoonoses FMVZ – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia UNESP – Universidade Estadual Paulista AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Aquirida USP – Universidade de São Paulo Unicamp – Universidade Estadual de Campinas ICMS – Imposto sobre Circulação de Mercadorias e Serviços Enade – Exame Nacional de Desempenho dos Estudantes NUPEZO – Núcleo de Pesquisa em Zoonoses NUPEMAS – Núcleo de Pesquisa em Mastites rpm – Rotações por Minuto RIFI – Reação de Imunofluorescência Indireta ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay SST – Solução Salina Tamponada LV – Leishmaniose Visceral LIT – Liver Infusion Tryptose NNN – McNeal, Novy & Nicolle PCR – Reação em Cadeia da Polimerase DNA – Ácido Desoxirribonucleico EMJH – Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris HCl – Ácido Clorídrico RNA – Ácido Desoxirribonucleico RID – Reação de Imunofluorescência Direta UI – Unidades Internacionais CVS – Challenge Virus Standard CN – Cérebro Normal ICC – Inoculação em Cérebro de Camundongo

vi

pH – Potencial Hidrogeniônico

AIE – Anemia Infecciosa Equina

CRMV – Conselho Regional de Medicina Veterinária IDGA – Imunodifusão em Gel de Ágar pb – Pares de Base

UV

– Ultra-violeta

mL

– Mililitros

ng – Nanograma

mM - Milimol

V - Volt

% - Porcento

m 2 – Metros quadrados

ºC – Graus Celsius

µL – Microlitros

LISTA DE SÍMBOLOS

viii

RESUMO

O estágio curricular no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” consistiu no treinamento em técnicas diagnósticas utilizadas na rotina do laboratório, incluindo o diagnóstico da raiva pelas provas de imunofluorescência direta e prova biológica, da leptospirose pela técnica de visualização das espiroquetas em microscopia de campo escuro e soroaglutinação microscópica, de leishmaniose, toxoplasmose e neosporose pela técnica de imunofluorescência indireta e de anemia infecciosa eqüina pela técnica de imunodifusão em gel de ágar. Foi realizado no período de 06 de julho a 30 de setembro de 2009, totalizando 504 horas, sob orientação do Prof. Dr. Hélio Langoni. Além disso, o estágio propiciou acompanhar o preparo dos antígenos utilizados nas técnicas diagnósticas e preparo dos materiais utilizados na rotina do laboratório. Também permitiu ter uma visão geral das recomendações do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento a respeito de casos positivos de raiva, leishmaniose, entre outras e de aplicar os conhecimentos adquiridos, durante a graduação, referentes à epidemiologia, doenças infecciosas, patologia e zoonoses. Permitiu o reconhecimento da área laboratorial como uma ferramenta que pode auxiliar médicos e veterinários a responderem questões envolvendo diagnóstico, terapia ou prognóstico de um paciente.

ix

1

1. INTRODUÇÃO

O estágio curricular supervisionado no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses (SDZ), no Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) consistiu no treinamento em técnicas diagnósticas utilizadas na rotina do laboratório, incluindo o diagnóstico da raiva pelas provas de imunofluorescência direta e prova biológica, da leptospirose pela técnica de visualização das espiroquetas em microscopia de campo escuro e soroaglutinação microscópica, de leishmaniose, toxoplasmose e neosporose pela técnica de imunofluorescência indireta e de anemia infecciosa eqüina pela técnica de imunodifusão em gel de ágar. Foi realizado no período de 06 de julho a 30 de setembro de 2009, totalizando 504 horas, sob orientação do Prof. Dr. Hélio Langoni. Além disso, o estágio propiciou acompanhar o preparo dos antígenos utilizados nas técnicas diagnósticas e preparo dos materiais utilizados na rotina do laboratório. Também permitiu ter uma visão geral das recomendações do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento a respeito de casos positivos de raiva, leishmaniose, entre outras e de aplicar os conhecimentos adquiridos, durante a graduação, referentes à epidemiologia, doenças infecciosas, zoonoses, entre outras. Atualmente, mais de 200 doenças infecciosas são reconhecidas como causadas por agentes que são direta ou indiretamente transmissíveis entre diferentes espécies animais e os humanos, caracterizadas como zoonoses (Krauss et al., 2003). Aspectos ambientais, como saneamento básico, além de contribuir para a ocorrência destas doenças tornam o seu controle difícil, permitindo a disseminação do agente pela água de chuva, córregos e riachos, frequentados principalmente por crianças, o que as torna importante em países em desenvolvimento. Além disso, o advento da AIDS induziu uma intesificação de muitas zoonoses devido à imunodepressão causada pelo virus, o que leva a manifestação de muitas doenças latentes (LANGONI, 2004). O laboratório clínico pode ajudar médicos e veterinários a responderem questões envolvendo diagnóstico, terapia ou prognóstico de um paciente. Além disso, testes laboratoriais são importantes na triagem de pacientes clinicamente

2

saudáveis para evidência de doença subclínica (sem sinais ou sintomas aparentes). Quando um laboratório de saúde animal ou de saúde pública se envolve, os serviços disponíveis tornam-se mais especializados, geralmente enfatizando um grupo limitado de doenças, mudando o foco do induviduo para o rebanho ou para a comunidade. Os laboratórios locais geralmente promovem uma interface entre o setor privado e instituições públicas nos níveis estaduais e nacionais (HUGH-JONES et al., 1995). Desta maneira, torna-se clara a importância deste segmento multidisciplinar da Medicina Veterinária, que exige o entendimento de epidemiologia, imunologia, parasitologia, entre outras. O estágio curricular supervisionado realizado no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootenia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” foi baseado no seu reconhecimento pela qualidade de ensino e pelas atividades na área.

2. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral do estágio consistiu no aprendizado e aprimoramento de diversas técnicas diagnósticas de denças de caráter zoonóticas bem como da importância das mesmas e o seu profundo conhecimento de etiologia, patogenia e epidemiologia para a correta interpretação dos resultados dos exames diagnósticos.

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Os objetivos específicos consistiram do aprendizado das técnicas de imunofluorescência indireta para diagnóstico de toxoplasmose, neosporose, leishmaniose e doença de chagas; técnica de imunofluorescência direta e prova biológica para diagnóstico de raiva; soroaglutinação microscópica para diagnóstico de leptospirose; isolamento e cultura para diagnóstico de leishmaniose; e preparo de antígenos e materiais de uso rotineiro no laboratório.

3

4. DESCRIÇÃO DO ESTÁGIO

4.1 SERVIÇO DE DIAGNÓSTICO DE ZOONOSES

O Serviço de Diagnóstico de Zoonoses (SDZ) se encontra na cidade de Botucatu, estado de São Paulo, localizada a 22º53'09" de latitude sul, 48º26'42" de longitude oeste, e a 804 metros de altitude e dista 235 km da capital São Paulo (Figura 1). Sua população estimada em 2009 foi de 130.348 habitantes (IBGE,

2009).

Faz parte da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, criada em 1976, que resultou da incorporação dos Institutos Isolados de Ensino Superior do Estado de São Paulo, então unidades universitárias situadas em diferentes pontos do interior paulista. Mantida pelo Governo do Estado de São Paulo, é uma das três universidades públicas de ensino gratuito, ao lado da USP (universidade de São Paulo) e da Unicamp (Universidade Estadual de Campinas). As três instituições tem como fonte primordial de seu orçamento 9,57% do ICMS - Imposto sobre Circulação de Mercadorias e Serviços, distribuído entre USP (5%), Unicamp (2,19%) e UNESP (2,34%). Possui 168 opções de cursos de graduação e conta com uma infra- estrutura de 62.453.301,36 m 2 de área total, 732.471,04 m 2 de área construída e 1.900 laboratórios (UNESP, 2009). A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) Campus de Botucatu possui qualidade de ensino e ampla infra-estrutura, que asseguram à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP, câmpus de Botucatu, lugar de destaque entre as principais instituições de ensino superior do País, tendo obtido nota "A" nas últimas quatro avaliações do Enade (Exame Nacional de Desempenho dos Estudantes) e o selo 5 estrelas nas edições do Guia do Estudante 2006 e 2007. Mantém um importante Hospital Escola Veterinário, o primeiro do gênero no Brasil, que atende perto de 15 mil casos por ano e realiza suas atividades de ensino e pesquisa em três fazendas que, juntas, somam 1.143 hectares (UNESP, 2009).

4

O SDZ pertence ao Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública

(Figura 2). Uma das premissas do Departamento é seu espírito empreendedor nas atividades em saúde animal, com forte viés para a saúde pública. A saúde de populações de animais de produção é vista como um dos pré-requisitos para a produtividade, diminuição das barreiras sanitárias, comercialização e, para a

indústria, melhor viabilização dos processos industriais. Os atendimentos clínicos, individuais ou populacionais, diagnósticos de doenças, oficiais ou não, e seus controles ocorrem, conforme o caso, integralizados, principalmente, com prefeituras municipais, órgãos oficiais, cooperativas, associações de criadores e, ainda, com os mais diferentes profissionais. O Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública foi instituído em 07 de abril de 1977. Antes, as atividades inerentes ao Departamento estavam distribuídas no âmbito da ex-Faculdade de Ciências Médicas e Biológicas de Botucatu, onde foi criado o curso de Medicina Veterinária, em 22 de abril de 1963. Já a partir de 1973, o Departamento começou a oferecer residência em Enfermidades Infecciosas. Atualmente, oferece aprimoramento profissional em quatro áreas: Enfermidades Infecciosas dos Animais, Planejamento de Saúde Animal e Saúde Pública, Inspeção Sanitária de Alimentos e Zoonoses e Saúde Pública. Hoje, o Departamento conta com nove docentes, que atuam nas mais diferentes especialidades e prestação de serviços intra e extramuros e ministram aula na graduação e pós-graduação (UNESP, 2009).

O Serviço de Diagnóstico de Zoonoses é um laboratório que oferece os

serviços de diagnóstico de toxoplasmose, neosporose, leishmaniose, doença de chagas, leptospirose, raiva e anemia infecciosa eqüina, esta última não sendo uma zoonose, porém o docente responsável pelo laboratório é credenciado para diagnóstico da mesma. Além do diagnóstico destas enfermidades nos animais, o Serviço de Diagnóstico de Zoonoses colabora com o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, para o diagnóstico laboratorial de leptospirose de amostras de soro de seus pacientes e ainda no diagnóstico da tuberculose e brucelose daqueles atendidos e internados pela área de Doenças Tropicais. Desenvolve atividades inerentes ao controle de mastites com diagnósticos a partir de exame citológico e microbiológico do leite, visando à melhor qualidade do leite (UNESP, 2009).

5

O laboratório oferece serviços de segundas às sextas-feiras, das 8h00 às

12h00 e das 14h00 às 18h00, com plantões entre os residentes para finais de semanas e feriados. É comandado pelo Prof. Dr. Hélio Langoni, que orienta quatro residentes, os quais são responsáveis pelas atividades de rotina do laboratório, como os exames diagnósticos e preparo antígenos. Conta também com a

colaboração de um técnico de laboratório, habilitado tanto para preparo de materiais como para preparos de meios e diagnósticos. Estão inclusas ainda as subdivisões do laboratório com relação aos exames de pesquisa, o Núcleo de Pesquisa em Zoonoses (NUPEZO) e Núcleo de Pesquisa em Mastites (NUPEMAS). Sua infra-estrutura consiste de laboratório, sala dos aprimorandos, infectório e sala de lavagem. O laboratório é subdividido em três áreas, a primeira que conta com uma autoclave, três estufas, uma geladeira, um freezer, um equipamento de água de osmose reversa, pia, armários para armazenamento dos materiais e bancada para a realização dos exames (Figura 3). A segunda área conta com um microscópio óptico comum, um microscópio de campo escuro, uma capela de fluxo laminar, armários e bancada para a realização dos exames de leptospirose, repique dos antígenos e preparação de material para cultura e isolamento (Figura 4). A terceira área conta com uma estufa, bancada e equipamento para contagem de células somáticas de leite (Figura 5).

A sala dos aprimorandos contém computadores e impressora, onde é

realizada a parte burocrática do laboratório como emissão de laudos. Nela se situa

também uma sala com microscópio de imunofluorescência, para leitura dos testes de reação de imunofluorescência direta e indireta.

O infectório é o local onde são mantidos os animais inoculados, tanto para as

bioprovas de raiva quanto para manutenção de cepas e isolamento de antígeno. Contém uma centrífuga, uma geladeira, uma bancada, pia e um fluxo de ar controlado. A sala de lavagens conta com uma autoclave e pias, onde são lavados e preparados os materiais utilizados na rotina do laboratório. As amostras de animais suspeitos para diagnóstico são recebidas juntamente com uma requisição onde deverão constar os dados de identificação, estado de saúde e procedência do animal.

6

Figura 1. Localização da cidade de Botucatu no estado de São Paulo (FONTE:

http://pt.wikipedia.org)

no estado de São Paulo (FONTE: http://pt.wikipedia.org) Figura 2. Departamento de Higiene Veterinária e Saúde

Figura 2. Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (FONTE:

SDZ/FMVZ/UNESP).

Veterinária e Saúde Pública (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 3. Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 1

Figura 3. Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 1 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

e Saúde Pública (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 3. Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 1 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

7

Figura 4. Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 2 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

de Diagnóstico de Zoonoses, sala 2 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 5. Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala

Figura 5. Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, sala 3 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

de Diagnóstico de Zoonoses, sala 3 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.2 CASUÍSTICA Durante o período de estágio foram

4.2 CASUÍSTICA

Durante o período de estágio foram realizados no SDZ 623 exames de rotina, os quais incluem 207 exames de sorologia para Leishmaniose, 6 pesquisas diretas de amastigotas de Leishmania, 75 sorologias para Leptospirose, 39 provas de

campo escuro para Leptospirose, 30 sorologias para Neosporose, 70 sorologias para Toxoplasmose, 134 provas de imunofluorescência direta para Raiva, 31 provas biológicas de Raiva e 31 sorologias para Anemia Infecciosa Equina (Tabela 1). Além disso, foram realizados no laboratório 300 exames de sorologia para Doença de Chagas para fins de pesquisa.

8

Com relação aos exames sorológicos de Leishmaniose, todas as 207 amostras consistiram de amostras caninas, sendo que destas 37 foram reagentes (Tabela 2). Já dos 6 exames de pesquisa direta de amastigotas para diagnóstico de Leishmaniose, todos consistiam de amostras caninas e 5 foram reagentes (Tabela

3).

As 75 sorologias para leptospirose consistiram de amostras caninas (36), bovinas (8), equinas (21), caprinas e ovinas (10) com um total de 13 amostras que apresentaram reatividade para determinado sorovar de importância para cada espécie (Tabela 4). Dos 39 exames de campo escuro, 15 consistiram de amostra de urina canina (2 positivas), 1 de sangue ovino (0 positivas), 18 de sangue canino (1 positiva), 1 de líquido abdominal ovino, 1 de líquido torácico ovino, 1 de líquido abomasal ovino, 1 de líquido torácico caprino e 1 de líquido abomasal caprino, estas 5 últimas sendo negativas (Tabela 5). Do total de 30 exames de imunofluorescência indireta realizados para diagnóstico de Neosporose, 2 amostras eram de felinos, 27 de caninos e 1 de bovino e 3 amostras apresentaram-se positivas (Tabela 6). As 70 amostras que chegaram ao SDZ para exame de rotina de Toxoplasmose consistiam de 4 amostras de felinos, 16 de caprinos, 8 de ovinos, 1 de equino e 41 de caninos e obteve um total de 31 amostras positivas (Tabela 7). Com relação aos exames diagnósticos de Raiva, foram realizadas 134 provas de imunofluorescência direta de espécies caninas (70), bovinas (8), equinas (3), ovinas (1), caprinas (4), felinas (22), quirópteros (22) e outras (4), com um total de 1 amostra positiva (Tabela 8). Foi realizado também um total de 31 provas biológicas, todas negativas, das espécies caninas, bovinas, equinas, felinas, quirópteros e outras (Tabela 9).

9

Tabela 1. Casuística de exames diagnósticos realizados pelo Serviço de Diagnóstico de Zoonoses de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Tipo de exame

Quantidade

Reagente

Leishmaniose (RIFI) Leishmaniose (Pesquisa de amastigotas) Leptospirose (SAM) Leprospirose (Campo escuro) Neosporose (RIFI) Toxoplasmose (RIFI) Raiva (RID) Raiva (PB) Anemia Infecciosa Equina (IDGA)

207

37

6

5

75

13

39

3

30

3

70

31

134

1

31

0

31

0

Total

584

90

Tabela 2. Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Positivo

Caninas

207

37

Humanas

0

0

Silvestres

0

0

Outras

0

0

Total

207

37

Tabela 3. Casuistica de exames de pesquisa direta de amastigotas para diagnóstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Positivo

Caninas

6

5

Humanas

0

0

Silvestres

0

0

Outras

0

0

Total

6

5

10

Tabela 4. Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Reagente

Espécie

Total

Reagente

Caninos

36

0

Felinos

0

0

Bovinos

8

2

Silvestres

0

0

Equinos

21

11

Humanos

0

0

Suinos

0

0

Outras espécies

0

0

Caprinos e ovinos

10

0

Total

75

13

Tabela 5. Casuistica de exames de campo escuro para diagnóstico de Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Amosta

Total Positivo

Amostra

Total Positivo

Amostra

Total Positivo

Urina

   

canina

15

2

Rim canino

0

0

Líq abd ovino Líq torácico ovino Líq abomasal ovino Líq torácico caprino Líq abomasal caprino

1

0

Urina

   

bovina

0

0

Rim bovino

0

0

1

0

Urina

   

equina

0

0

Rim equino

0

0

1

0

Urina

   

ovina

0

0

Rim ovino

0

0

1

0

Sangue

Sangue

 

ovino

1

0

canino

18

1

1

0

 

Total

39

3

Tabela 6. Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Neosporose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Positivo

Espécie

Total

Positivo

Felinos

2

1

Humanos

0

0

Caprinos

0

0

Bovinos

1

1

Ovinos

0

0

Outros

0

0

Equinos

0

0

 

Caninos

27

1

Total

30

3

11

Tabela 7. Casuistica de exames sorológicos para diagnóstico de Toxoplasmose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Positivo

Espécie

Total

Positivo

Felinos

4

1

Humanos

0

0

Caprinos

16

16

Bovinos

0

0

Ovinos

8

7

Outros

0

0

Equinos

1

0

 

Caninos

41

7

Total

70

31

Tabela 8. Casuistica de exames de imunofluorescência direta para diagnóstico de Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Positivo

Espécie

Total

Positivo

Caninas

70

0

Caprinas

4

0

Bovinas

8

0

Felinas

22

0

Equinas

3

0

Quirópteros

22

1

Suínas

0

0

Outras

4

0

Ovinas

1

0

Total

134

1

Tabela 9. Casuistica de provas biológicas para diagnóstico de Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.

Espécie

Total

Positivo

Espécie

Total

Positivo

Caninas

6

0

Caprinas

0

0

Bovinas

6

0

Felinas

1

0

Equinas

1

0

Quirópteros

15

0

Suínas

0

0

Outras

2

0

Ovinas

0

0

Total

31

0

12

4.3 DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DE CHAGAS

4.3.1 INTRODUÇÃO

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (Figura 6),

permanece um importante problema de saúde (MCKERROW et al., 2009). Este protozoário pertence à classe Mastigophora, subfilo Sarcomastigophora, filo Protozoa. Dentro do gênero dos tripanossomos, as espécies podem ser divididas em dois grupos: Salivaria e Stercoraria. O T. cruzi pertence ao grupo Stercoraria por

apresentar multiplicação e transformação no intestino e as formas infectantes migram para o reto do artrópode vetor, sendo eliminadas nas fezes. No caso da doença de Chagas, os vetores são insetos hematófagos da ordem Hemíptera, frequentemente deniminados “barbeiros” (URQUHART et al., 1998).

A doença de Chagas é uma das patologias de mais larga distribuição no continente americano. É conhecida a existência de vetores da doença desde o sul dos Estados Unidos à Argentina. São mais de cem espécies responsáveis pela transmissão natural da infecção pelo Trypanosoma cruzi. Estima-se que sejam de 16

a 18 milhões os indivíduos infectados e de aproximadamente oitenta milhões a

população em risco de contaminação na América Latina (VINHAES & DIAS, 2000).

É a enfermidade humana mais relacionada com o subdesenvolvimento, o que torna

mais crítica ainda a situação de milhões de pacientes chagásicos (HUEB, 2006). O protozoário Trypanosoma cruzi vivia restrito à situação silvestre. Os

triatomíneos, hematófagos estritos, encontraram nas habitações e modificações do habitat feitas pelo homem uma condição ideal de abrigo e oferta alimentar abundante, tornando a transmissão vetorial no mecanismo primário de difusão da doença (VINHAES & DIAS, 2000). A doença possui duas rotas principais de transmissão aos homens: pela espoliação sanguínea através do triatomíneo vetor e por transfusão sangínea (CASTILLO-RIQUELME et al., 2008).

A fase aguda da doença de chagas se estabelece após a contaminação por

trasmissão vetorial, transfusão de sangue, congênita ou transplante de órgãos e na

13

maioria das vezes passa despercebida. Quando os sintomas existem, aparecem de 4 a 12 dias após a infecção. Verifica-se dentre eles o chagoma de inoculação, o sinal de Romaña, que é caracterizado por edema bipalpebral unilateral e indolor. Também é possível observar febre superior a 39ºC, mialgias, astenia, anorexia, cefaléia e síndromes digestiva, cardíaca e respiratória. Depois de 2 a 4 meses da doença nesta fase, as manifestações clínicas desaparecem e raramente se detecta parasitas no sangue periférico. A doença entra então na fase crônica, apresentando muitas vezes um longo período de ausência de sinais e sintomas. Depois desse período, muitos pacientes podem apresentar manifestações envolvendo outros órgãos como o coração, esôfago e cólon e sistema nervoso (HUEB, 2006). O principal impacto em saúde na infecção por Trypanosoma cruzi é a doença crônica, que se manifesta em 10 a 30% dos pacientes. Para alguns pacientes a dença é fatal, enquanto para outros, procedimentos médicos onerosos são necessários (CASTILLO-RIQUELME et al., 2008).

Figura 6. Trypanosoma cruzi (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 6. Trypanosoma cruzi (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.3.2 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Para o

4.3.2 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Para o diagnóstico sorológico de doença de chagas o material a ser recebido do animal suspeito é amostra de soro ou sangue total, que neste caso deverá ser devidamente dessorado em centrífuga a 3.000 rpm por 10 minutos. Caso não seja possível a realização imediata do exame, o material deverá ser estocado em freezer

14

a -20ºC. A técnica utilizada é reação de imunofluorescência indireta (RIFI) que consiste da detecção de anticorpos específicos contra T. cruzi. Primeiramente o soro a ser testado deverá ser diluído em uma placa de ELISA de fundo reto a 1:20, ou seja, deverá ser pipetado 10 µL do soro e 190 µL de solução salina tamponada com pH 7,2 (SST 7,2) em um primeiro poço da placa. Em

seguida, nos próximos 4 poços da placa de ELISA deve-se pipetar 100 µL de SST 7,2. Retira-se então 100 µL do primeiro poço, onde a diluição é 1:20, e adiciona-se ao segundo poço que já contém 100 µL de SST 7,2, obtendo-se a diluição 1:40. Repete-se a operação até o quinto e último poço, sempre homogeneizando entre um e outro, e desprezando os 100 µL finais no último poço. Obtem-se assim as diluições 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320.

É necessário também proceder a primeira diluição de 1:20 para controles

positivos e negativos referentes à doença de chagas da mesma espécie animal. Em uma placa de imunofluorescência previamente sensibilizadas com promastigotas de T. cruzi, pipetar 10 µL do soro controle positivo no primeiro poço,

10 µL de cada diluição do soro teste do mais diluído para o mais concentrado nos poços 6 a 2 respectivamente, e 10 µL do soro controle negativo no poço 7 (Figura 7). Colocar a lâmina em câmara úmida e incubar em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação dos anticorpos dos soros aos antígenos da lâmina. Em seguida, lavar a lâminacom SST 7,2 e posicioná-la no coplin para que fique mergulhada em SST 7,2 por 10 minutos (procedimento chamado de “banho”). Após, desprezar a SST 7,2 do coplin e preencher com novo SST 7,2 para mais um

banho de 10 minutos. Este procedimento é realizado para que se eliminem excessos de anticorpos livres e demais substâncias que possam vir a interferir no resultado do exame causando ligações inespecíficas. A lâmina deve então ser seca em estuda a 37ºC por cerca de 10 minutos.

A seguir, deverá ser adicionado o conjudado à lâmina, que consiste de um

anti-anticorpo espécie-específico ligado a isocianato de fluoresceína. Este deve ser previamente diluído segundo seu título em solução de Azul de Evans com proporção 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 µL do conjugado em cada poço da lâmina e incubá-la em câmara úmida em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação do conjugado ao anticorpo aderido à lâmina. Em seguida lavar a lâmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10

15

minutos cada. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamínula para proceder a leitura em microscópio de imunofluorescência.

Após a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como título final a mais alta diluição do soro em que há fluorescência completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas.

Figura 7. Disposição das diluições do soro na lâmina para diagnóstico de doença de chagas.

do soro na lâmina para diagnóstico de doença de chagas. 4.4 DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE 4.4.1 INTRODUÇÃO

4.4 DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE

4.4.1 INTRODUÇÃO

A Leishmaniose é uma doença provocada por protozoários intracelular do gênero Leishmania, sendo bastante frequente em cães (SAITO et al., 2008). Cerca de trinta espécies diferentes de Leishmania podem ser encontradas em diversas partes do Velho e do Novo Mundo. Destas, aproximadamente vinte são responsáveis por uma ampla variedade de doenças clínicas em pessoas. O gênero Leishmania é dividido nos subgêneros Leishmania e Viannia com base nas diferenças no desenvolvimento do mosquito vetor. Várias espécies são reconhecidas dentro dos subgêneros e a classificação é baseada em comparações genéticas e reatividade a anticorpos monoclonais (GREENE, 2006). As doenças causadas pela Leishmania spp. em pessoas podem ser divididas em três formas de acordo com suas manifestações clínicas: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral (GREENE, 2006). No Brasil, a

16

Leishmania (Leishmania) chagasi é a espécie envolvida na transmissão da Leishmaniose Visceral. O período de incubação da Leishmaniose Visceral (LV) varia de 10 dias a 24 meses (BRASIL, 2006).

O ciclo natural de infecção por Leishmania envolve um mosquito vetor e um hospedeiro vertebrado e diferentes formas do parasita podem ser encontradas. Fêmeas de mosquitos hematófagos infectadas com Leishmania contém no seu interior as formas promastigotas e transmitem durante seu repasto sanguíneo o parasita para animais domésticos, silvestres e humanos, onde a forma amastigota se desenvolve. Mosquitos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo são os vetores naturais de leishmaniose (GREENE, 2006). No Brasil, duas espécies, até o momento, estão relacionadas com a transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi. A primeira é considerada a principal espécie transmissora da L. (L.) chagasi, mas a L. cruzi também foi incriminada como vetora no estado do Mato Grosso do Sul. Em nosso país, a distribuição geográfica de L. longipalpis é ampla e parece estar em expansão. Esta espécie é encontrada em quatro das cinco regiões geográficas: Nordeste, Norte, Sudeste e Centro-Oeste (BRASIL, 2005).

Após a picada do mosquito, as promastigotas são transferidas da sua saliva para a pele do hospedeiro vertebrado. As promastigotas são então fagocitadas por macrófagos e multiplicam-se como amastigotas. Quando há a ruptura do macrófago, as amastigotas livres penetram em outras células do hospedeiro e se disseminam principalmente aos órgãos do sistema linfático e áreas dérmicas remotas generalizando a infecção. Inicialmente a infecção não apresenta sintomas aparentes mas pode progredir para doença sintomática a não ser que a replicação das amastigotas seja impedida por mecanismos imunes (GREENE, 2006). Há relativamente poucos efeitos diretos da Leishmania no hospedeiro. Na leishmaniose visceral a doença é causada principalmente pela resposta imune ao parasita, como

a

anemia, que resulta da destruição direta da medula óssea ou da função esplênica,

e

a febre que resulta de toxinas liberadas pelas células (PALMER et al., 1998).

17

4.4.2 PREPARO DE ANTÍGENOS

O SDZ emprega como antígeno a forma promastigota da L. major, mantida em tubos rosqueados contendo cerca de 10 mL de meio líquido LIT (Liver Infusion Tryptose) e 5 mL de meio sólido NNN (McNeall, Novy & Nicolle). Os repiques são realizados semanalmente dentro da câmara asséptica com avaliação do crescimento das proastigotas em microscópio, repicando-se os que possuem melhor motilidade e maior quantidade. Os tubos são mantidos em estufa a 28-30ºC.

Para a obtenção de uma quantidade viável de promastigotas para a preparação de lâminas é necessário repicar 0,5 ml de uma cultura em LIT e NNN para um tubo de rosca contendo somente 10 ml de LIT. Deve-se proceder dois repiques em LIT, com intervalo de 7 dias para obtenção de maior concentração do agente.

Em seguida, após a verificação do crescimento das promastigotas em microscópio óptico, realizar uma série de três centrifugações a 3.000 rpm por 10 minutos, sempre desprezando o sobrenadante e acrescentando SST 7,2 para purificação do antígeno.

Quantificar os parasitas em microscópio óptico e, caso a quantidade de promastigotas seja inferior a 20 a 30 parasitas por campo, recentrifugar e ressuspender a suspensão até se obter a concentração desejada. Para fixar o antígeno nas lâminas deve-se colocar 10L da suspensão de promastigotas em

cada poço da lâmina de imunofluorescência, que logo em seguida é retirada, por aspiração, restando somente uma fina película sobre cada poço. Deixar as lâminas secarem a temperatura ambiente e guardá-Ias em laminário à -20°C.

4.4.3 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

A técnica sorológica utilizada no SDZ para diagnóstico de Leishmaniose é a de imunofluorescência indireta (RIFI), que se baseia na detecção de anticorpos. O material enviado deverá ser soro do animal suspeito ou então sangue total que

18

deverá ser devidamente dessorado em centrífuga a 3.000 rpm por 10 minutos, o soro aliquotado em tubo tipo eppendorf devidamente identificado e a fração celular desprezada. Em uma placa de ELISA de fundo reto, pipetar no primeiro poço 190 µL de SST 7,2 e 100 µL de SST 7,2 nos 5 poços seguintes. Diluir 10 µL do soro a ser testado no primeiro poço, obtendo-se a diluição 1:20. A partir da primeira diluição, transferir 100 µL para o poço seguinte, homogeneizar e tranferir para o próximo, repetindo a operação até o último poço, desprezando-se os 100 µL finais. Obtem-se assim as diluições 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640. Proceder da mesma maneira com os soros controles positivo e negativa da mesma espécie animal até a diluição 1:40. Em uma placa de imunofluorescência previamente sensibilizadas com promastigotas de Leishmania major, pipetar 10 µL do soro controle positivo na diluição 1:40 no primeiro poço, 10 µL de cada diluição do soro teste do mais diluído para o mais concentrado nos poços 6 a 2 respectivamente, utilizando-se as diluições 1:40 a 1:640, e 10 µL do soro controle negativo na diluição 1:40 no poço 7 (Figura 8). Colocar a lâmina em câmara úmida e incubar em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação dos anticorpos dos soros aos antígenos da lâmina. Lavar com SST 7,2 e deixar a lâmina em banho no coplin por 10 minutos. Descartar a SST do coplin e repreencher com SST 7,2 para novo banho por 10 minutos. Retirar a lâmina do banho e secar na estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos. Preparar a solução do conjugado, que deve ser previamente diluído segundo seu título em solução de Azul de Evans com proporção 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 µL do conjugado em cada poço da lâmina e incubá-la em câmara úmida em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação do conjugado ao anticorpo aderido à lâmina. Em seguida lavar a lâmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10 minutos cada. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamínula para proceder a leitura em microscópio de imunofluorescência.

Após a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como título final a mais alta diluição do soro em que há fluorescência completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas (Figura 9).

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Figura 8. Distribuição das diluições do soro na lâmina para diagnóstico de Leishmaniose.

do soro na lâmina para diagnóstico de Leishmaniose. Figura 9. Reação de imunofluorescência indireta positiva

Figura 9. Reação de imunofluorescência indireta positiva para Leishmaniose (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

indireta positiva para Leishmaniose (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.4.4 OBSERVAÇÃO DIRETA DO AGENTE O diagnóstico direto de

4.4.4 OBSERVAÇÃO DIRETA DO AGENTE

O diagnóstico direto de Leishmaniose é realizado através da observação dos parasitas em amostras que podem ser obtidas através de escarificações, punção aspirativa ou biópsia quando o exame é realizado antemortem, ou através de imprint de órgãos quando o exame é realizado postmortem. Os locais para obtenção de amostra podem ser lesões cutâneas ou órgãos linfóides como medula óssea, baço, fígado, linfonodos, entre outros. O imprint em lâminas pode ser corado por métodos citológicos como o de Giemsa ou por métodos

20

histopatológicos como a hematoxilina-eosina. A obsevação direta do agente também pode ser realizada a partir da cultura do materia em meio específico para isolamento do agente. Em casos positivos poderão ser encontradas as formas amastigotas intracelular (Figura 10).

Figura 10. Formas amastigotas de Leishmania encontradas em imprint de baço corado com Panótico rápido (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

baço corado com Panótico rápido (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.4.5 ISOLAMENTO EM MEIO DE CULTURA O cultivo para

4.4.5 ISOLAMENTO EM MEIO DE CULTURA

O cultivo para isolamento do agente pode ser realizado com o meio NNN, podendo-se encontrar as formas promastigotas do parasita em torno de 5 dias após a inoculação do material no meio, acondicionado em estufa a 24-26ºC. Este é um diagnóstico utilizado principalmente postmortem, onde se obtém amostras de órgãos linfóides, que precisam ser mascerados com solução tampão para que sejam inoculadas em meio de cultura (Figura 11). Para evitar contaminação, pode ser recomendado em casos de materiais de biópsia o tratamento do mesmo com solução salina contendo antibióticos, como penicilina ou estreptomicina. A inoculação do material é realizada inoculando-se cerca de 0,1 mL do material no líquido de condensação do meio NNN, e incubando por 7 dias a 24ºC. Após este período, utiliza-se alça de platina estéril para obtenção de amostra deste material para observação de promastigotas em microscópio, utilizando-se a objetiva de 40x. Se o resultado for negativo, o tubo deve ser reincubado e examinado

21

semanalmente por 4 a 6 semanas e então descartado. A sensibilidade deste método diagnóstico é de 50% para Leishmania Viannia brasiliensis.

Figura 11. Maceração de fragmento de órgão com pistilo (FONTE:

SDZ/FMVZ/UNESP).

de fragmento de órgão com pistilo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.4.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR Um método diagnóstico que tem

4.4.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Um método diagnóstico que tem sido cada vez mais utilizado, pela elevada sensibilidade e especificidade é a reação em cadeia pela polimerase (PCR), que identifica de maneira direta o parasito, pela detecção de fragmentos de DNA específicos provenientes do seu cinetoplasto. O SDZ utiliza métodos moleculares para diagnóstico de Leishmaniose para fins de pesquisa. São utilizados fragmentos de órgãos como pulmão, fígado, baço e linfonodos de animais sorologicamente positivos e que precisaram ser eutanasiados. Podem ser utilizados também material proveniente do isolamento do agente em meio de cultura. Este material é armazenado a -80ºC. A extração do DNA das amostras de tecido e cultura é realizada utilizando-se Kit Illustra Tissue & Cells genomic Prep Mini Spin (GE Healthcare), conforme instruções do fabricante. A quantificação foi avaliada em espectrofotômetro (NanoVue-GE Healthcare).

A amplificação do DNA para Leishmania spp. é realizada utilizando-se os primers LINR4 (5'-GGGGTTGGTGTAAAATAGGG-3') e LIN19 (5'- CAGAACGCCCCTACC CG-3') que amplificam 720pb. O perfil de ciclagem consiste

22

de: 95ºC por 3 minutos, 32 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 58ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto. A extensão final é de 72ºC por 7 minutos. Para Leishmania chagasi os primers utilizados são RV1 (5’-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3’) e RV2 (5’-CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3’) com o seguinte perfil de ciclagem:

94ºC por 4 minutos, 40 ciclos de 94ºC por 30 seundos, 59ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos. A extensão final é de 70ºC por 10 minutos (Figura 12).

As reações de PCR são realizadas em microtubo de 0,2 mL com volumes totais de 25 µL contendo tampão de reação 10 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM KCl, 1,5

mM MgCl 2 , 0,2 mM dNTP, 20 M de cada primer, 0,2 unidades de Taq Platinum

DNA polimerase (Invitrogen) e 10 ng de DNA genômico. A incubação foi realizada em termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf).

A visualização do material amplificado é avaliada pela corrida eletroforética em gel de agarose a 1,5% adicionado de 1,0 µL/mL de SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen). A corrida eletroforética é realizada em cuba horizontal contendo TBE 1X (89 nM Tris-HCl, 89 mM ácido bórico e 20 mM EDTA) com voltagem de 65V. O gel é visualizado em transluminador de luz UV e a imagem capturada pelo sistema de documentação digital (Figura 13).

São utilizados 8 µL do material amplificado e como marcador de peso

molecular 4 µL de 100pb ladder ou 50pb ladder (Invitrogen). Para todas as amostras

são acrescidos 2 µL do tampão de corrida (0,25% azul de bromophenol, 0,25%

xileno cianol, 30% glicerol, 70% água Milli-Q).

23

Figura 12. Ciclos realizados no termociclador para diagnóstico molecular de Leishmaniose (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

molecular de Leishmaniose (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 13. Imagem digital do gel capturada pelo

Figura 13. Imagem digital do gel capturada pelo transluminador (FONTE:

SDZFMVZ/UNESP).

do gel capturada pelo transluminador (FONTE: SDZFMVZ/UNESP). 4.5 DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE 4.5.1 INTRODUÇÃO A

4.5 DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE

4.5.1 INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial (GIUDUGLI et al., 2000). é causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que foram classificadas em sorovares baseado em suas características antigênicas e

24

recentemente em espécies baseado em estudos genômicos (AHMAD et al., 2005). O gênero Leptospira é dividido em duas espécies: Leptospira interrogans, que compreende todas as cepas patogênicas, e Leptospira biflexa, contendo cepas sapróficas (não-patogênicas) isoladas do meio ambiente. As espécies de Leptospira interrogans compreendem pelo menos 250 variantes antigenicamente diferentes, conhecidas como sorovares, que pertencem a 23 sorogrupos (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). Em muitos países a leptospirose é considerada uma doença ocupacional. É endêmica no Brasil, onde a incidência aumenta durante o verão (GIUDUGLI et al., 2000). A maior parte das infecções humanas ocorem em homens adultos jovens e crianças, associada a exposição ocupacional ou ambiental. Estudos epidemiológicos indicam que as infecções são comumente associadas com atividades ocupacionais como fazendeiros, lixeiros e veterinários. A leptospirose também pode ser transmitida durante atividades recreacionais como pique-niques, natação e canoagem (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). Roedores e outros animais domésticos ou silvestres infectados podem transmitir a bactéria através da urina (AHMAD et al., 2005). Nas espécies animais reservatórias, a bactéria pode persistir indefinidamente nos túbulos contornados do rim sem causar doença aparente e sendo disseminada através da urina. Alguns sorovares são particularmente associados a um animal hospedeiro, por exemplo, a L. icterohemorrhagiae/copenhageni é classificada como parasita clássico de ratos, L. canicola de cães, L. hardjo de gado e L. pomona de suínos (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). A bactéria pode sobreviver longos períodos em água fresca, solos e vegetações úmidos e lama. A leptospirose humana é causada pelo contato da pele não íntegra ou membranas mucosas com água, solos úmidos ou lama contaminados com urina de animais infectados (AHMAD et al., 2005). Em seguida, ocorre um período de incubação um período de bacteremia pode se desenvolver. A bactéria disseminada pode se replicar em vários tecidos, mas são eventualmente neutralizadas pelo desenvolvimento de anticorpos. Em alguns casos a infecção pdoe persistir em longos períodos nos rins, olhos e útero e as leptospiras podem ser eliminadas intermitentemente por meses (O’KEEFE, 2002).

25

A patogenia da leptospirose não está completamente esclarecida. Na fase imune da doença a resposta imune do hospedeiro, incluindo deposição de imunocomplexos, pode ter papel importante nos danos endoteliais. Durante a fase septicêmica, as leptospiras são amplamente distribuídas no organismo, a disseminação e proliferação das espiroquetas em vários tecidos podem resultar em doença sistêmica, que leva a uma série de manifestações clínicas (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). As manifestações clínicas após infecções agudas variam sua severidade desde doença hemolítica aguda a episódios febris transitórios. A infecção também pode ser associada com aborto, mortalidade neonatal, infertilidade, uveíte, mastite e falência renal (O’KEEFE, 2002).

4.5.2 MANUTENÇÃO DO ANTÍGENO

Os antígenos utilizados pelo SDZ são cultivos de cepas-padrão de Leptospira, mantidas por repiques semanais em meio Ellinghausen-MacCullough-Johnson- Harris (EMJH) e Fletcher, sendo o primeiro utilizado para a prova diagnóstica. O meio semi-sólido de Fletcher é utilizado para o armazenamento das cepas chamadas “mães”, que são como matrizes que serão repicadas para um meio EMJH para utilização de rotina. Este meio garante a sobrevivência das bactérias por tempo mais prolongado, fazendo-se necessário o repique para novos meios a cada 3 meses. Neste meio o crescimento dos espiroquetídeos é de forma lenta e pode ser observado através do contorno que se forma na parede do tubo, denominado de “anel de Dinger”. Para o crescimento ótimo das bactérias o meio é mantido em uma estufa sob temperatura entre 25 à 28 o C.

Já com ao meio EMJH, é um meio líquido, que faz com que as leptospiras apresentem crescimento acelerado, gerando um alto consumo do meio, o que torna necessário o repique semanal para novos meios. O uso constante das amostras para provas de rotina propiciam um alto índice de contaminação pelo ambiente.

As culturas são examinadas no mínimo uma vez por semana macroscopicamente para verificação de contaminantes. No dia da prova, as culturas

26

que vão ser utilizadas como antígenos devem ser avaliadas microscopicamente. Só devem ser utilizados como antígenos culturas de 4 a 14 dias, que não apresentem contaminantes nem auto-algutinações. No momento da prova, as culturas que vão ser usadas como antígeno, devem ser diluídas em SST de pH 7,6 na proporção de 1:2, calculando o volume de cada antígeno de acordo com a quantidade necessária para a prova. A bateria de antígenos a ser empregada a prova de aglutinação microscópica deve incluir respresentantes de sorogrupos de todos os sorovares existentes no país ou na região para a espécie em questão (Tabela 9). Quaisquer outras cepas podem ser acrescentadas, desde que representem a situação epidemiológica local (Tabela

10).

Tabela 9. Sorovares utilizados no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses conforme a espécie (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

HERBÍVOROS

CANINOS

 

HUMANOS

 

1B

BRA

1A

AUS

1A

AUS

10

HEB

3

CAS

1B

BRA

1B

BRA

11A

COP

5

CAN

2A

AUT

2A

AUT

11B

ICT

8A

DJA

5

CAN

2B

BUT

12

JAV

9

GRY

7

CYN

3

CAS

13

PAN

11A

COP

8A

DJA

4A

BAT

14A

POM

11B

ICT

9

GRY

5

CAN

15

PYR

14A

POM

11A

COP

6B

WHI

16A

HAR

15

PYR

11B

ICT

7

CYN

16B

WOL

16A

HAR

14A

POM

8A

DJA

17

SHE

16B

WOL

15

PYR

8B

SEN

18

TAR

18

TAR

16A

HAR

9

GRY

19

AND

21

PAT

27

Tabela 10. Sorovares utilizados na rotina de diagnóstico de Leptospirose no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

1

A

AUS

australis

11 A

COP

copenhageni

1

B

BRA

bratislava

11 B

ICT

icterohaemorrhagiae

2

A

AUT

autumnalis

12

JAV

javanica

2

B

BUT

butembo

13

PAN

panamá

3

CAS

castellonis

14 A

POM

pomona

4

A

BAT

bataviae

15

PYR

pyrogenes

5

CAN

canicola

16 A

HAR

hardjo

6

B

WHI

whitcombi

16 B

WOL

wolffi

7

CYN

cynopteri

17

SHE

shermani

8

A

DJA

djasiman

18

TAR

tarssovi

8

B

SEN

sentot

19

AND

andamana

9

GRY

gryppotyphosa

21

PAT

patoc

10

HEB

hebdomadis

28

4.5.3 SOROAGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA

A técnica diagnóstica sorológica padrão-ouro para Leptospirose é a soroaglutinação microscópica, e é a utilizada pelo SDZ. Esta técnica é indireta, e se baseia na detecção de anticorpos referentes a cada sorovar.

O material a ser recebido é o soro do animal suspeito ou sangue total que

deverá ser devidamente dessorado em centrífuga a 3.000 rpm por 10 minutos, despresando-se a parte celular e aliquotando o soro em tubos tipo eppendorf devidamente identificado e armazenado a -20ºC até a realização da prova. Para a prova diagnóstica de Leptosiporse, primeiramente é necessário a diluição inicial do soro a 1:50 em solução salina tamponada com pH 7,6 (SST 7,6), para isto, em um tubo de ensaio, coloca-se 100 µL do soro a ser testado e 4.900 µL de SST 7,6. Primeiramente é realizada a prova de triagem. Para isto utiliza-se uma placa de ELISA de fundo reto e pipeta-se 50 µL do soro diluído nos poços formando uma fileira, o número de poços é de acordo com o número de sorovares a ser testado. O mesmo é realizado para obter-se uma fileira controle, porém, ao invés de pipetar 50 µL do soro, utiliza-se 50 µL de SST 7,6. Acrescenta-se então nos respectivos poços, 50 µL da solução de cada sorovar na linha controle e na linha do soro teste,

passando a ser a diluição final de cada poço 1:100. Homogeneizar suavemente a placa e incubar em estufa a 37ºC por 1 hora para que ocorra a ligação antígeno- anticorpo, que se traduzirá em aglutinação. Com alça de Henly, colocar uma gota do conteúdo de cada poço em fileiras sobre uma lâmina e examinar sem lamínula em microscópio de campo escuro, com óleo de imersão colocado entre a lâmina e o condensador. A observação de ser feita na objetiva de 10X e ocular de 10X. Deve- se observar o grau de aglutinação para cada sorovar, considerando positivos aqueles que possuírem 50% ou mais de aglutinação, ou seja, 50% de leptospiras aglutinadas e 50% livres, tendo como referência os respectivos controles.

O soro que na prova de triagem, mostrou 50% de aglutinação, ou mais,

deverá ser submetido à prova de titulação, realizando-se a mesma somente para os

29

sorovares reagentes. Para esta prova, utiliza-se 100 µL do soro diluído a 1:50 (100 µL do soro em 4.900 µL de SST 7,6) no primeiro poço da linha e 50 µL de SST 7,6 nos próximos 5 poços. Pipeta-se 50 µL da diluição inicial (1:50) no segundo poço, homogeneizando, e pipetar 50 µL deste para o próximo, assim sucessivamente até o último poço, desprezando os 50 µL finais. Assim se obtem as diluições 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600. Adicionar 50 µL do sorovar a ser titulado em cada poço, obtendo então as titulações 100, 200, 400, 800, 1600 e 3200. Homogeneizar suavemente a placa e incubar em estufa a 37ºC por 1 hora para que ocorra a ligação antígeno-anticorpo e realizar a leitura conforme descrito na prova de triagem. Considerar como título a maior diluição do soro capaz de aglutinar 50% ou mais das leptospiras, em relação ao controle (Figura 14).

Figura 14. Amostra reagente para Leptospirose na prova de soroaglutinação microscópica (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

de soroaglutinação microscópica (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.5.4 OBSERVAÇÃO DO AGENTE EM MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO

4.5.4 OBSERVAÇÃO DO AGENTE EM MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO

A prova de observação direta do agente em microscopia de campo escuro pode ser realizada com amostras de urina (quando se suspeita que o animal esteja em fase de leptospirúria), sangue (quando a suspeita é que esteja em fase de

30

leptospiremia) ou ainda líquidos cavitários quando se trata de fetos abortados. O material enviado deverá ser protegido da luz para evitar a inapropriação do mesmo para a prova. Esta prova diagnóstica precisa ser realizada o mais breve possível quando da chegada do material, uma vez que depende da observação direta do agente, e sua motilidade é uma característica importante na identificação que se perde com o passar do tempo. Pode ser realizada a observação direta do material, aplicando-se uma gota do material enviado em lâmina coberta com lamínula e observada em microscópio de campo escuro. Pode-se também diluir o material em SST 7,6 para que se torne menos concentrado, especialmente quando o material enviado for sangue, a fim de evitar que a fração celular dificulte a visualização. Quando a amostra for positiva, é possível observar espiroquetídeos com movimentos longitudinais e ao redor do próprio eixo. A amostra negativa não exclui a doença, porém a positiva confirma se o animal apresenta infecção.

4.6 DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSE

4.6.1 INTRODUÇÃO

Neospora caninum é um protozoário recentemente descoberto, parasita de animais de produção e de companhia, amplamente distribuído pelo mundo (DUBAY, 2003). No geral é muito similar ao T. gondii com relação à sua estrutura e ciclo, com duas importantes diferenças: neosporose é primariamente uma doença de rebanho bovino e os cães e canídeos são hospedeiros definitivos, enquanto que a toxoplasmose é primariamente uma doença de humanos, ovelhas e cabras e os felídeos são os hospedeiros definitivos (DUBEY et al., 2007). O ciclo deste parasita consiste de 3 estágios: taquizoítos, cistos tissulares e oocistos (DUBEY et al., 2007). Os taquizoítos penetram as células hospedeiras e podem se tornar intracelular em 5 minutos de contato com as mesmas. Nos animais infectados, os taquizoítos podem ser encontrados em muitas células, incluindo

31

células neurais, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais vasculares, hepatócitos, entre outras (DUBEY & LINDSAY, 1996). Esta forma do parasita é encontrada nos hospedeiros intermediários. O cisto pode ser encontrado nas formas redonda ou oval, principalmente no sistema nervoso central. A fase do parasista resistente no meio ambiente, o oocisto, é excretada nas fezes de cnídeos no estágio não esporulado, e esporula em 24 horas (DUBEY et al., 2007). O Neospora caninum apresenta uma ampla gama de hospedeiros. Evidências de infecções naturais foram encontradas em cães, gado, ovinos, caprinos, eqüinos e veados. Infecções experimentais foram induzidas em camundongos, ratos, cães, raposas, caprinos, felinos, ovinos, coiotes, suínos, gerbils, coelhos e bovinos (DUBEY & LINDSAY, 1996). Cães podem ser os hospedeiros intermediários e definitivos de Neospora caninum. A transmissão vertical é a principal via de infecção de bovinos, porém carnívoros podem se infectar através da ingestão de tecidos infectados (DUBEY et al., 2007). O Neospora caninum pode causar aborto tanto em gado de corte como em gado de leite. Vacas de qualquer idade podem abortar a partir do terceiro mês de gestação. A maioria dos abortos causados por neosporose ocorrem entre 5 e 6 meses de gestação. Os fetos podem vir a óbito dentro do útero, serem reabsorvidos, mumificados, autolizados, nascerem vivos com sinais clínicos ou nascerem clinicamente normais com infecção crônica (DUBEY et al., 2007).

4.6.2 REAÇÃO DE IMUNOFLUORECÊNCIA INDIRETA

Para o diagnóstico sorológico de neosporose o material a ser recebido do animal suspeito é amostra de soro ou sangue total, que neste caso deverá ser devidamente dessorado em centrífuga a 3.000 rpm por 10 minutos. Caso não seja possível a realização imediata do exame, o material deverá ser estocado em freezer a -20ºC. A técnica utilizada é reação de imunofluorescência indireta (RIFI) que consiste da detecção de anticorpos específicos contra Neospora. Primeiramente o soro a ser testado deverá ser diluído em uma placa de ELISA de fundo reto a 1:25, ou seja, deverá ser pipetado 5 µL do soro e 120 µL de solução salina tamponada com pH 7,2 (SST 7,2) em um primeiro poço da placa. Em seguida, nos próximos 4 poços da placa de ELISA deve-se pipetar 50 µL de SST

32

7,2. Retira-se então 50 µL do primeiro poço, onde a diluição é 1:25, e adiciona-se ao segundo poço que já contém 50 µL de SST 7,2, obtendo-se a diluição 1:50. Repete- se a operação até o quinto e último poço, sempre homogeneizando entre um e outro, e desprezando os 50 µL finais no último poço. Obtem-se assim as diluições 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400.

É necessário também proceder a primeira diluição de 1:25 para controles

positivos e negativos referentes à doença de chagas da mesma espécie animal. Em uma placa de imunofluorescência previamente sensibilizadas com taquizoítos de Neospora, pipetar 10 µL do soro controle positivo no primeiro poço, 10

µL de cada diluição do soro teste do mais diluído para o mais concentrado nos poços 6 a 2 respectivamente, e 10 µL do soro controle negativo no poço 7 (Figura 15). Colocar a lâmina em câmara úmida e incubar em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação dos anticorpos dos soros aos antígenos da lâmina. Em seguida, lavar a lâminacom SST 7,2 e posicioná-la no coplin para que fique mergulhada em SST 7,2 por 10 minutos (procedimento chamado de “banho”). Após, desprezar a SST 7,2 do coplin e preencher com novo SST 7,2 para mais um banho de 10 minutos. Este procedimento é realizado para que se elimine excessos

de anticorpos livres e demais substâncias que possam vir a interferir no resultado do exame causando ligações inespecíficas. A lâmina deve então ser seca em estuda a 37ºC por cerca de 10 minutos.

A seguir, deverá ser adicionado o conjudado à lâmina, que consiste de um

anti-anticorpo espécie-específico ligado a isocianato de fluoresceína. Este deve ser

previamente diluído segundo seu título em solução de Azul de Evans com proporção 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 µL do conjugado em cada poço da lâmina e incubá-la em câmara úmida em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação do conjugado ao anticorpo aderido à lâmina. Em seguida lavar a lâmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10 minutos cada. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamínula para proceder a leitura em microscópio de imunofluorescência.

Após a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como título final a mais alta diluição do soro em que há fluorescência completa na borda de pelo menos 50% dos taquizoítos.

33

Figura 15. Disposição das diluições do soro para diagnóstico de Neosporose.

das diluições do soro para diagnóstico de Neosporose. 4.7 DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSE 4.7.1 INTRODUÇÃO O

4.7 DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSE

4.7.1 INTRODUÇÃO

O gênero Toxoplasma tem uma única espécie, Toxoplasma gondii, pertence à família Sarcocystidae, classe Coccidia (URQUHART et al., 1998). É um parasita intracelular obrigatório, pertencendo ao filo Apicomplexa. Apresenta o ciclo intestinal de ocorrência exclusiva nos felídeos e um ciclo extra-intestinal comum aos felídeos e às demais espécies (LANGONI, 2005). Possui como hospedeiro definitivo, portanto, todos os felídeos, porém o gato doméstico é o mais importante. Como hospedeiros intermediários estão inclusos todos os mamíferos, incluindo o homem, ou aves (URQUHART et al., 1998). A enfermidade é uma das mais comuns parasitoses que afetam animais homeotérmicos em todo o mundo, constituindo importante zoonose de distribuição mundial (LANGONI et al., 2001). Estima-se que um terço da população humana mundial tenha sido infectada por T. gondii. Este parasita tem sido considerado um patógeno oportunista, associado à enfefalites ou infecções sistêmicas em imunocomprometidos, particularmente em indivíduos com AIDS (KIM & WEISS,

2008).

O Toxoplasma gondii apresenta três formas evolutivas: os taquizoítos, característicos da infecção aguda, com multiplicação rápida, podendo atravessar a

34

placenta e atingir o feto; os bradizoítos, característicos da infecção crônica, forma de multiplicação lenta, organizados sob a forma de cistos teciduais que podem resistir por toda a vida do hospedeiro nos tecidos muscular e nervoso; e os esporozoítos, produzidos no epitélio intestinal de felídeos, eliminados em oocistos não esporulados nas fezes destes animais, que tornam-se infectantes sob as condições ambientais (GONÇALVEZ NETTO et al., 2003). O ciclo evolutivo inclui uma fase sistêmica facultativa, que é uma causa importante de aborto em ovinos e também pode causar uma zoonose. As infeccções humanas são particularmente graves se ocorrerem durante a gravidez e podem resultar em aborto ou em distúrbios adquiridos congênitos que acometem principalmente o sistema nervoso central (URQUHART et al., 1998). A principal forma de infecção ocorre através de ingestão acidental de alimentos contaminados com oocistos esporulados ou com cistos teciduais, sendo a higiene a melhor forma de prevenção da doença (SOUZA, 2003).

4.7.2 MANUTENÇÃO DAS CEPAS

O SDZ faz a manutenção das cepas de T. gondii: RH, AS-28, BTU 2, BTU 3,

BTU 4, BTU 6, BTU 8, BTU 9 e BTU 12. As cepas RH e AS-28 são cepas-padrão isoladas de seres humanos. As cepas BTU foram isoladas de animais e receberam esta nomenclatura devido ao isolamento na cidade de Botucatu (BTU) e a numeração esta relacionada com a ordem cronológica de isolamento de cada cepa. A manutenção as cepas é realizada semanalmente visando também a produção de taquizoítos utilizados para sensibilização de lâminas para o teste de imunoflourescência indireta.

A manutenção é feita em camundongos de 30 dias inoculados com 1 mL por

animal por via intraperitoneal. Para cada cepa são inoculados 5 camundongos, que são mantidos por uma semana, tempo para que haja produção suficiente de taquizoítos. Ao final deste período, os animais são eutanasiados com éter para a realização do lavado intraperitoneal. O lavado tem como função a recuperação dos taquizoítos presentes no líquido peritoneal.

35

Para o lavado, posiciona-se o corpo do animal em decúbito dorsal e prepara a

região abdominal com álcool iodado. Incisa-se a pele desta região e, com seringa contendo 5 mL de solução fisiológia com antibiótico (500 mL de soro fisiológico, 0,5

mL de penicilina e 0,5 mL de estreptomicina), perfura-se a cavidade na região lateral

para injetar a solução, atentando-se para evitar a perfuração de vísceras. Recupera-

se a solução injetada na cavidade com a seringa devidamente identificada com a

cepa que o animal continha.

Todas as 5 amsotras de lavado de cada cepa são analisadas microscopicamente quanto à quantidade e motilidade dos taquizoítos e quanto à presença de contaminantes. São então separadas 2 das melhores amostras de cada cepa para reinoculação em camundongos, 2 amostras que serão guardadas em geladeira por cerca de 2 semanas e a que apresentar pior qualidade é descartada.

4.7.3 PREPARO DOS ANTÍGENOS

O preparo dos antígenos para a confecção de lâminas de imunofluorescência é realizada com o exsudato peritoneal de camundongos de 30 dias previamente inoculados com taquizoítos. Realiza-se a inativação deste antígeno incubando cerca de 50 mL da solução antigênica em tubo de centrífuga juntamente com a mesma quantidade de formol 2% em estufa a 37ºC por 30 minutos, homogeneizando por inversão a cada 10 minutos. Após a incubação, centrifugar-se a 3.000 rpm por 10 minutos e então descarta-se o sobrenadante. Acrescenta-se ao pellet de antígeno 2 - 3 mL de SST 7,2. Homogeneiza-se em vórtex e centrifuga-se novamente, a 3.000 rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante, ressuspender em solução fisiológica até obter 20 a 30 parasitos por campo, utilizando o aumento de 40x para a leitura. Deve-se recentrifugar e ressuspender a suspensão até obter a concentração adequada.

Para a preparação das lâminas, adiciona-se a cada um dos poços 10 µL da solução antigênica, espera-se de 2 a 3 minutos e, logo em seguida, retira-se o excesso, deixando-se uma fina película sobre cada poço. Depois de secas e temperatura ambiente, as lâminas são colocadas dentro de um laminário, que é guardada em freezer a -20ºC.

36

4.7.4 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

A técnica sorológica utilizada no SDZ para diagnóstico de Toxoplasmose é a de imunofluorescência indireta (RIFI), que se baseia na detecção de anticorpos. O material enviado deverá ser soro do animal suspeito ou então sangue total que deverá ser devidamente dessorado em centrífuga a 3.000 rpm por 10 minutos, o soro aliquotado em tubo tipo eppendorf devidamente identificado e a fração celular desprezada. Em uma placa de ELISA de fundo reto, pipetar no primeiro poço 150 µL de SST 7,2 e 50 µL de SST 7,2 nos 4 poços seguintes. Diluir 10 µL do soro a ser testado no primeiro poço, obtendo-se a diluição 1:16. A partir da primeira diluição, transferir 50 µL para o poço seguinte, homogeneizar e tranferir para o próximo, repetindo a operação até o último poço, desprezando-se os 50 µL finais. Obtem-se assim as diluições 1:16, 1:64, 1:256, 1:1024 e 1:4096. Proceder da mesma maneira com os soros controles positivo e negativa da mesma espécie animal utilizando-se somente a primeira diluição de 1:16. Em uma placa de imunofluorescência previamente sensibilizadas com taquizoítos de Toxoplasma, pipetar 10 µL do soro controle positivo diluído a 1:16 no primeiro poço, 10 µL de cada diluição do soro teste do mais diluído para o mais concentrado nos poços 6 a 2 respectivamente, e 10 µL do soro controle negativo na diluição 1:16 no poço 7 (Figura 16). Colocar a lâmina em câmara úmida e incubar em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação dos anticorpos dos soros aos antígenos da lâmina. Lavar com SST 7,2 e deixar a lâmina em banho no coplin por 10 minutos. Descartar a SST do coplin e repreencher com SST 7,2 para novo banho por 10 minutos. Retirar a lâmina do banho e secar na estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos. Preparar a solução do conjugado, que deve ser previamente diluído segundo seu título em solução de Azul de Evans com proporção 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 µL do conjugado em cada poço da lâmina e incubá-la em câmara úmida em estufa a 37ºC por 30 minutos para que

37

ocorra a ligação do conjugado ao anticorpo aderido à lâmina. Em seguida lavar a lâmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10 minutos cada. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamínula para proceder a leitura em microscópio de imunofluorescência.

Após a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como título final a mais alta diluição do soro em que há fluorescência completa na borda de pelo menos 50% dos taquizoítos (Figura 17).

Figura 16. Distribuição das diluições do soro na lâmina para diagnóstico de Toxoplasmose.

do soro na lâmina para diagnóstico de Toxoplasmose. Figura 17. Amostra positiva para Toxoplasmose no

Figura 17. Amostra positiva para Toxoplasmose no diagnóstico por imunofluorescência indireta (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

38

38 4.7.5 ISOLAMENTO DO ANTÍGENO O isolamento de antígeno de T. gondii pode ser realizado através

4.7.5 ISOLAMENTO DO ANTÍGENO

O isolamento de antígeno de T. gondii pode ser realizado através de amostras de órgãos como baço, fígado e pulmão. Para isto, primeiramente é necessária a digestão de tecidos, com o objetivo de romper cistos e liberar o agente. Esta digestão pode ser realizada tanto com tripsina quanto com pepsina. A digestão é feita incubando-se cerca de 20 gramas de tecido em 20 mL de solução salina 0,18% com antibióticos (SSA) por 20 minutos à temperatura

ambiente. Em seguida, mascera-se o tecido em gral com pistilo e adiciona-se 200

mL de tripsina 0,5% em solução salina 0,18% ou 100 mL de solução HCl-pepsina,

digerir por 60 minutos a 30ºC sb agitação constante. Filtra-se em gase estéril e centrifuga a 3.000 rpm por 10 minutos. Descarta-se o sobrenadante e ressuspende

em 10 mL de SST. Centrifuga novamente a 3.000 rpm por 10 minutos descarta o

sobrenadante e ressuspende em 10 mL de SST. Esta operação é repetida por 5

vezes. Ao final, ressuspender em 10 mL de SST e inocular 1 mL, via subcutânea,

em camundongos.

4.8 DIAGNÓSTICO DE RAIVA

39

4.8.1 INTRODUÇÃO

O vírus da raiva está classificado na familia Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus. Têm forma de bastonete com uma extremidade achatada e outra arredondada, resultando num aspecto de projétil. Possui um invólucro lipídico e uma genoma de RNA. Todas as espécies de animais de sangue quente são suscetíveis à infecção com o vírus da raiva, embora existam diferenças de suscetibilidade, sendo que as aves encontram-se entre as espécies mais resistentes (ETTINGER, 1996).

Os vírus rábico são classificados sorológica e genotipocamente com base em, respectivamente, reatividade sorológica cruzada em testes de vírus neutralização e perfil genético (CUBAS et al., 2007). Com a utilização de anticorpos monoclonais muitos estudos confirmaram que amostras de vírus rábicos originárias de diferentes hospedeiros naturais apresentavam variantes com características antigênicas

particulares. Foram identificadas no Brasil até o presente as variantes denominadas

2 (encontrada principalmente em cães), 3 (usualmente identificada em morcegos

Desmodus rotundus), variante 4 (identificada em morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis), variante 5 (relacionada a morcegos hematófagos na Venezuela, porém no Brasil isolada de uma “raposa” ou “cachorro-do-mato” - Cerdocyon thous) e variante 6, isolada de um morcego insetívoro Lasiurus cinereus (BATISTA et al., 2007). Outras variantes desconhecidas foram detectadas, sendo uma em sagüis (Callithrix jacchus) e duas em morcegos insetívoros (Histiotus velatus e Nyctinomops

laticudatus) (CUBAS et al., 2007). Com relação aos genótipos, o gênero Lyssavirus

foi subdividido em sete genótipos denominados genótipo 1 (vírus rábico), genótipo 2 (Lagos bat), genótipo 3 (Mokola), genótipo 4 (Duvenhage), genótipo 5 (European bat Lyssavirus 1), genótipo 6 (European bat Lyssavirus 2) e mais recentemente genótipo

7 (Australian bat Lyssavirus). O conhecimento das variantes permite definir a

distribuição geográfica e o hospedeiro de origem das várias amostras virais, úteis em estudos epidemiológicos e de controle (CUBAS et al., 2007). Na natureza, o vírus rábico é mantido por ciclos ocasionalmente inter- relacionados, denominados ciclos urbano e silvestre, aéreo e rural. Ciclo “urbano” refere-se à raiva em cães e gatos domésticos, seu caráter zoonótico é mais evidente

40

neste ciclo em função da natureza da relação entre cães e humanos. O ciclo aéreo refere-se à raiva em morcegos (sendo os demais ciclos denominados ciclos “terrestres”), a presença de morcegos potencialmente contaminados com o vírus em áreas sinantrópicas representa um problema sério, especialmente para animais de estimação e seres humanos, constituindo-se em uma fonte de contaminação perigosa, particularmente pela possibilidade de passar insuspeita. Em toda a América Latina, os morcegos hematófagos Desmodus rotundus são os principais hospedeiros do vírus no ciclo aéreo. Ciclo “rural” refere-se à raiva dos herbívoros, que envolve, principalmente bovinos e eqüinos e na qual o principal vetor é o morcego hematófago. O termo “silvestre” refere-se à raiva associada a espécies silvestres, sendo por vezes utilizada englobando o ciclo aéreo (BATISTA et al.,

2007).

A maioria das infecções pelo vírus rábico se dá por transmissão percutânea,

através da mordedura ou arranhadura de animais infectados. A transmissão por via aérea pode ocorrer raramente, mas não tem significância epidemiológica no ciclo da infecção (BATISTA et al., 2007). Após a ocorrência da infecção, o vírus da raiva

migra centripetamente nas fibras nervosas periféricas até o sistema nervoso central,

e termina por afetar os neurônios, levando a comportamento anormal e à paralisia.

Depois que o vírus da raiva atinge o cérebro e multiplica-se nos neurônios, o organismo migra centrifugamente nas fibras nervosas, desde o sistema nervoso central até as glândulas salivares, permitindo que o vírus seja eliminado na saliva, com a continuação da transmissão. O vírus da raiva pode ser encontrado em outros

tecidos e órgãos periféricos, mas que não são importantes na sua transmissão (ETTINGER, 1996).

A mortalidade da raiva em humanos, após mordeduras não tratadas de cães

raivosos, varia de 38% a 57%, dependendo da severidade e localização da lesão e da concentração viral na saliva. A exposição à animais raivosos de outras espécies, como lobos, pode resultar em 80% de mortalidade. Mordeduras na cabeça, face, pescoço e mãos, particularmente quando há sangramento representam maior risco e são geralmente associadas com um período de incubação menor. Todavia, todas as mordeduras devem ser tratadas com a mesma urgência. Em casos de morcegos raivosos, o risco está presente mesmo em uma agressão superficial, em parte

41

devido à habilidade única destes agentes para replicar na epiderme e derme (HEMACHUDHA et al., 2002).

A raiva é uma zoonose de grande relevância devido à sua alta taxa de mortalidade (GREENE, 2006). Uma pessoa morre de raiva a cada 15 minutos e mais de 300 são expostas. Mundialmente, estima-se que entre 45.000 a 60.000 pessoas morrem pela enfermidade a cada ano. Por outro lado, 50 milhões de doses de vacinas são utilizadas em 10 milhões de tratamentos pós-expositivos no mundo (CUBAS et al., 2007). A raiva humana foi inserida na lista nacional de doenças e agravos de notificação compulsória e imediata na Portaria Interministerial 5, de 21 de fevereiro de 2006 (BRASIL, 2009). No Brasil, a raiva é endêmica, em grau diferenciado de acordo com a região geopolítica. A região Nordeste responde por 54,2% dos casos humanos registrados de 1980 a 2003; seguida da região Norte, com 17,5%; Sudeste, com 10,8%; Centro-Oeste, com 10,4% e Sul, com 0,4%. Desde 1987 não há registro de casos nos estados do Sul, sendo o último no Paraná, cuja fonte de infecção foi um morcego hematófago. No período de 1991 a 2003, cães e gatos foram responsáveis por transmitir 80% dos casos humanos de raiva; os morcegos, por 10,6% e outros animais (raposas, sagüis, gato selvagem, bovinos, eqüinos, caititus, gambás, suínos e caprinos), 4,8%. Casos cuja fonte de infecção foi desconhecida representaram 4,6% (BRASÍL, 2005). Além da saúde pública, a importância econômica da raiva está relacionada a sua ocorrência em animais de produção. Considera-se que as perdas anuais diretas e indiretas causadas à pecuária pelos ataques de morcegos hematófagos superam 50 milhões de dólares (CUBAS et al., 2007).

4.8.2 COLHEITA E ENVIO DO MATERIAL SUSPEITO

Quando há a suspeita de raiva e deseja-se realizar o diagnóstico postmortem, deve-se enviar a cabeça do animal suspeito, o encéfalo inteiro ou fragmentos do tecido cerebral de ambos os hemisférios, como córtex, cerebelo e o hipocampo. Quando tratar-se de eqüídeos, é necessário encaminhar também a medula espinhal. Para a realização deste procedimento recomenda-se a utilização de luvas, óculos

42

protetor e máscara. Os instrumentos para retirada do cérebro devem ser preferencialmente estéreis e, na impossibilidade, devem ser bem limpos após imersão em solução desinfetante. Pequenos animais silvestres como morcegos, gambás, sagüis, entre outros, devem ser encaminhados inteiros para possibilitar a identificação da espécie.

Depois de coletado o material deve-se tomar a medidas necessárias para o acondicionamento mais proprício do material durante o seu envio. Deve-se acondicionar o material cerebral em saco plástico duplo, bem amarrado, e colocar em caixa de isopor com gelo também em saco plástico duplo bem amarrado, ou ainda com elemento gelado reciclável. Identificar e encaminhar anexo com ficha epidemiológica contendo dados sobre o animal e endereço com dados completos para notificação são de suma importância. Caso o transporte exceda 24 horas poderá ser conservado em solução salina com glicerina a 50%.Em última hipótese proceder ao congelamento do material, pois desta mateira o material pode se tornar impróprio para a realização das provas diagnósticas.

4.8.3 REAÇÃO DE IMUNOFLUORECÊNCIA DIRETA

Para o diagnóstico de raiva, uma das técnicas utilizadas pelo SDZ é a reação de imunofluorescência direta (RID), que se baseia na detecção de antígeno. Para isto, utiliza-se fragmentos cerebrais de cerca de 1 grama da região do hipocampo, da região do córtex e do cerebelo. Em equinos é importante também a utilização de fragmento de medula. Posiciona-se em uma espátula de madeira descartável o fragmento que será utilizado para o imprint com a superfície de corte voltada para cima (Figura 18). Com a ajuda da espátula realiza-se o imprint em lâmina de imunofluorescência direta devidamente identificada nos campos laterais direito e esquerdo (Figura 19). Retira- se o excesso de material com papel filtro fazendo leve pressão contra a lâmina (Figura 20). Os imprints são feitos em duplicada do material do hipocampo e

cerebelo. Além disto, fragmentos das regiões utilizadas também são estocados em freezer a -20ºC como contra-prova. No caso de quirópteros realiza-se duas lâminas de imprint sem diferenciação das regiões. É importante ressaltar que o manipulador

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sempre deverá usar como equipamentos de proteção individual máscara, óculos e luvas de procedimento, e que para que esteja apto a realizar esta técnica é necessário que obtenha titulação sorológica antirrábia igual ou superior a 0,5 UI/mL. As lâminas ficam então mergulhadas em acetona por 1 a 4 horas estocadas a -20ºC para a fixação e inativação viral. As lâminas são em estufa a 37ºC para que seja possível corar. Pipetar 25 µL da suspensão de CVS na região esquerda da lâmina e 25 µL da suspensão de CN do lado direito da lâmina. A solução de CVS (Challenge Virus Standard) consiste de uma suspensão de cérebro de camundongos infectados com a cepa padrão (CVS) que contém diluído o conjugado, ou seja, o anticorpo contra o vírus da raiva marcado com fluoresceína. A solução de CN (cérebro normal) consiste de suspensão de cérebros de camundongos sadios que contém diluído o conjugado. A cada bateria de lâminas a serem coradas utiliza-se também duas lâminas com imprint de material sabidamente positivos para atuarem como controles positivos da técnica.

Em seguida, incuba-se as lâminas em estufa a 37ºC por 30 minutos para que ocorra a ligação antígeno-anticorpo. Após este procedimento, as lâminas são lavadas com solução salina tamponada com pH 8,5 (SST 8,5) e mergulhadas no coplin para banho de 10 minutos. A SST 8,5 é então descartada e o coplin é repreenchido com SST 8,5 para novo banho de 10 minutos. Após os banhos as lâminas são postas para secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 10 minutos e então estão prontas para colocação de glicerina tamponada e lamínula para leitura em microscópio de imunofluorescência (Figura 21).

Figura 18. Imprint de material cerebral para diagnóstico de Raiva (FONTE:

SDZ/FMVZ/UNESP).

(Figura 21). Figura 18. Imprint de material cerebral para diagnóstico de Raiva (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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Figura 19. Regiões para realização do imprint na lâmina de imunofluorescência para diagnóstico de Raiva.

lâmina de imunofluorescência para diagnóstico de Raiva. Figura 20. Remoção do excesso de material da lâmina

Figura 20. Remoção do excesso de material da lâmina com papel filtro (FONTE:

SDZ/FMVZ/UNESP).

da lâmina com papel filtro (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 21. Amostra positiva para Raiva observada em

Figura 21. Amostra positiva para Raiva observada em microscópio de imunofluorescência (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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45 4.8.4 PROVA BIOLÓGICA A prova biológica para diagnóstico de raiva pode também ser chamada de

4.8.4 PROVA BIOLÓGICA

A prova biológica para diagnóstico de raiva pode também ser chamada de inoculação em cérebro de camundongo (ICC). Para isto são utilizados camundongos lactentes de 21 dias de idade. São utilizados cerca de 1 grama de material contendo fragmentos de cada segmento cerebral do material suspeito (hipocampo, cerebelo e córtex) que serão mascerados juntos com a utilização de cadinho e pistilo (Figura 22). Este material é então diluído na concentração 1:5 (peso-volume) em um diluente contendo água deionizada ou solução fisiológica, soro equino e antibiótico (lincomicina). Após a obtenção de uma papa, este material deve ser centrifugado em um tubo de falcon a 3.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante é acondicionado em tubo tipo eppendorf em geladeira por no mínimo 1 hora para ação do antibiótico. Em seguida, são inoculados 0,03mL via intracerebral em 10 camundongos de 21 dias (Figura 23). Os animais devem ser observados diariamente durante 30 dias no caso material proveniente de herbívoros, quirópteros e equinos, e observação de 21 dias no caso de caninos e felinos. Para materiais oriundos de equinos, a

46

incoulação é feita separadamente conforme o segmento cerebral, ou seja, são inoculados 10 camundongos para cada segmento.

No caso de positividade os animais apresentarão pêlos arrepiados, dificuldade de locomoção, paralisia e morte (Figura 24). Para confirmação do resultado é necessário realizar a prova de imunofluorescência direta do material cerebral dos camundongos que morrerem a partir do quarto dia após inoculação. Anteriormente a esse período a morte pode ser devido à trauma craniano ou a infecção bacteriana. Normalmente a morte dos camundongos ocorre entre o 7º e 9º dia pós inoculação, podendo levar mais tempo, o que é comum com as amostras de eqüinos, onde muitas vezes os camundongos começam a apresentar sintomas no 18º dia e as vezes até mais tarde, havendo a necessidade de se observar os animais até 30 dias após a inoculação.

Figura 22. Maceração do material cerebral suspeito de Raiva para inoculação em cérebro de camundongo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

em cérebro de camundongo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 23. Inoculação de material suspeito de Raiva em

Figura 23. Inoculação de material suspeito de Raiva em cérebro de camundongo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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47 Figura 24. Camundongos inoculados com material positivo para Raiva apresentando pêlos arrepiados, paralisia e morte

Figura 24. Camundongos inoculados com material positivo para Raiva apresentando pêlos arrepiados, paralisia e morte (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

arrepiados, paralisia e morte (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 4.9 DIAGNÓSTICO DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA 4.9.1

4.9 DIAGNÓSTICO DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

4.9.1 INTRODUÇÃO

A anemia infecciosa equina (AIE) é uma doença infecciosa viral potencialmente fatal aos eqüídeos (UNITED STATES, 2003). É causada por um lentivírus, o vírus da anemia infecciosa equina, da família Retroviridae (QUINN et al., 2005). A AIE pode comprometer irreversivelmente o desempenho dos animais suscetíveis que são os equinos, mulas e burros de qualquer raça, idade e sexo. A doença é conhecida mundialmente como febre do pântano. A AIE é, até o momento,

48

uma doença incurável e a legislação pertinente preconiza o sacrifício dos animais soropositivos (GONÇALVES & RIBEIRO, 2005).

A transmissão do vírus é feita mecanicamente por insetos hematófagos,

sobretudo espécies Tabanus e de Stomoxys, que podem transferir o vírus para outro

hospedeiro ao se alimentar (QUINN et al., 2005). A transmissão pode ocorrer

também de forma vertical (intra-uterina) ou horizontal, por meio de utensílios contaminados (agulhas, freios, esporas e outros), leite materno e sêmen (GONÇALVES & RIBEIRO, 2005). Ocorre com mais freqüência no verão, durante períodos de alta atividade de insetos (QUINN et al., 2005). O risco de transmissão entre animais positivos para AIE e animais sadios aumenta com a prevalência da doença na propriedade, a diversidade e abundância dos vetores e a proximidade entre animais (GONÇALVES & RIBEIRO, 2005).

O vírus replica-se em macrófagos, em monócitos e em células de Kupffer.

Uma viremia associada a células desenvolve-se, com disseminação pelo organismo. Os equinos infectados tornam-se persistentemente infectados após a inserção do provírus no genoma das células hospedeiras (QUINN et al., 2005). A infecção resuta em episódios periódicos de anemia, hemorragias, trombocitopenia, leucopenia, supressão transitória da resposta imunológica e aumento significativo nos níveis de cobre e enzimas hepáticas. Sinais neurológicos e lesões no Sistema Nervoso Central tem sido associados à doença. Podem apresentar ainda sinais clínicos como perda de peso, depressão, desorientação, andar em círculos e hipotermia, porém, nem todos os animais infectados apresentam sinais (GONÇALVES & RIBEIRO,

2005). O controle da disseminação da doença envolve minimizar ou eliminar o contato de eqüídeos com secreções, excreções e sangue de animais soropositivos (UNITED STATES, 2003).

4.9.2 RECEBIMENTO DE AMOSTRAS

O material utilizado para o diagnóstico da anemia infecciosa equina é o soro

sanguíneo. Se for enviado o sangue total, sendo imediatamente dessorado por centrifugação a 3.000 rpm por 10 minutos. O soro deve estar devidamente acondicionado e enviado refrigerado ou congelado, não devendo estar hemolisado.

49

Todo material recebido deverá estar acompanhado pela ficha de requisição (ficha própria, de cor branca), assinada pelo Médico Veterinário requisitante, e seu número junto ao CRMV (de preferência, também o carimbo), constando também à resenha do animal e todos os dados completos (proprietário, animal e Médico Veterinário requisitante).

Após o recebimento do material, o mesmo é registrado em pasta de arquivo própria e acondicionar o soro em microtubos de plástico tipo eppendorf e manter congelado a –20ºC até o momento do exame.

4.9.3 IMUNODIFUSÃO EM GEL DE ÁGAR

O diagnóstico de anemia infecciosa equina, apesar de não ser uma zoonose, é realizado no SDZ. Para isto, utiliza-se a técnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) ou prova de Coggins. Esta prova se baseia na detecção de anticorpos. Para a prova de IDGA é necessário secar lâminas lisas novas e colocá-las sobre uma placa de petri. Enquanto isto, deve-se preparar cerca de 25 mL de gel de ágar, que será composto de 0,25g de agarose, 1,25 mL de tampão borato, 23,25 mL de cloreto de sódio 5% e 0,25 mL de azida sódica 1%. Aquecer em banho maria tubos de ágar Noble, tampão borato e ágar base até a compela fusão do ágar, que deve ficar translúcido e homogêneo. Em seguida, distribui-se 5 mL de gel por lâmina (Figura 25), formando uma camada fina de ágar sobre a mesma. Após a solidificação em temperatura ambiente e com a placa de petri destampada, deixar de 1 a 2 horas em câmara úmida dentro da geladeira. Fazer as cavidades com o furador (Figura 26), obedecendo a linha de marcação e aspirar o ágar de cada cavidade com a bomba de vácuo. Em cada lâmina podem ser realizadas 3 rosetas e cada cavidade deve estar bem seca e sem defeitos na borda do ágar. O soro teste, soro controle e antígeno devem ser pipetados de acordo com o protocolo (Figura 27). São pipetados 25 µL do antígeno na cavidade central, 25 µL do controle em cada uma das cavidades da borda, intercaladas pelos soros testes, que também são pipetados 25 µL em cada cavidade. Incubar em câmara úmida em estufa a 25ºC, durante 48 horas. A leitura inicial é realizada em 24 horas e final depois de 48 horas.

50

Figura 25. Distribuição do gel de Agar em lâmina para diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

de Anemia Infecciosa Equina (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). Figura 26. Utilização do furador para o preparo de lâmina

Figura 26. Utilização do furador para o preparo de lâmina para diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Utilização do furador para o preparo de lâmina para diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

51

Figura 27. Protocolo para lâmina de diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina.

para lâmina de diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina. 5. DISCUSSÃO Conforme discutido na introdução, as

5. DISCUSSÃO

Conforme discutido na introdução, as atividades laboratoriais podem ajudar médicos e veterinários a responderem questões envolvendo diagnóstico, terapia e prognóstico de um paciente (HUGH-JONES et al., 1995), fato que pode ser notado durante o estágio curricular no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses, uma vez que é imprescindível noções do histórico do animal e sua situação clínica para uma correta interpretação dos laudos, que usualmente é realizada em conjunto com os funcionários do laboratório. Os laboratórios locais geralmente promovem uma interface entre o setor privado e instituições públicas nos níveis estaduais e nacionais (HUGH-JONES et al., 1995), que também pôde ser observado durante o estágio, sendo que o SDZ

recebia amostras de Prefeituras locais para o programa de monitoramento da raiva urbana e também amostras de animais suspeitos de leishmaniose, sendo responsável pela notificação de resultados positivos às Vigilâncias Epidemiológicas das Prefeituras envolvidas. O estágio permitiu a satisfação plena de todas as minhas expectativas, através do aprendizado de técnicas diagnósticas, epidemiologia, patogenia das diversas doenças bem como da sua importância em saúde pública.

52

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estágio no Serviço de Diagnóstico de Zoonoses na UNESP Botucatu permitiu a realização plena dos objetivos gerais e específicos, abrangendo não somente as técnicas diagnósticas como também o reconhecimento da importância de conhecimentos multidisciplinares para uma correta interpretação dos resultados, bem como noções gerais de gerenciamento de um laboratório de diagnóstico como este.

7. REFERÊNCIAS

AHMAD, S.N.; SHAH, S.; AHMAD, F.M.H. Laboratory Diagnosis of Leptospirosis. J. Postgrad Med. Vol. 51. Issue 3. Setember 2005.

BATISTA, H.B.C.R.; FRANCO, A.C.; ROEHE, P.M. Raiva: uma breve revisão. Acta Scientiae Veterinariae. 35 (2): 125-144, 2007.

BRASIL. Secretaria de Vigilância em Saúde. Ministério da Saúde. Programa Nacional de Vigilância, Controle e Profilaxia da Raiva. Brasília, 2009. Disponível em:

<http://portalsaude.gov.br/portal/arquivos/pdf/raiva_apresentacao05062009.pdf>.

Acesso em: 19 ago. 2009.

BRASIL. Secretaria de Vigilância em Saúde. Ministério da Saúde. Doenças Infecciosas e Parasitárias Guia de Bolso. 6ª ed. Brasília, 2006. (Série B. Textos

Básicos de Saúde)

BRASIL. Secretaria de Vigilância em Saúde. Ministério da Saúde. Guia de Vigilância Epidemiológica. 6ª ed. Brasília, 2005. (Série A. Normas e Manuais Técnicos)

53

CASTILLO-RIQUELME, M.; GUHL, F.; TURRIAGO, B.; PINTO, N.; ROSAS, F.; MARTINEZ, M.F.; FOX-RUSHBY, J.; DAVIES, C.; CAMPBELL-LENDRUM, D. The Costs of Preventing and Treating Chagas Disease in Colombia. Neglected

Tropical Diseases. Volume 2, Issue 11, e336. November. 2008.

CUBAS, Z.S.; SILVA, J.C.R.; CATÃO-DIAS, J.L. Tratado de Animais Selvagens. 1ª

ed. Editora Roca Ltda. São Paulo, 2007.

DUBEY, J.P.; SCHARES, G.; ORTEGA-MORA, L.M. Epidemiology and Controlo f Neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology Reviews. Volume 20,

No. 2, p. 323-367. April, 2007.

DUBEY, J.P. Review of Neospora caninum and neosporosis in animals. The Korean Journal od Parasitology. Vol. 41, No. 1, p. 1-16. March, 2003.

DUBEY. J.P.; LINDSAY, D.S. A review of Neospora caninum and neosporosis.

Veterinary Parasitology. Volume 67, p. 1-59. 1996.

DUTTA, T.K.; CHRISTOPHER, M. Leptospirosis – An Overview. JAPI. Volume 53, p. 545-551. June, 2005.

ETTINGER, S.J. Manual de Medicina Interna Veterinária. Ed. Manole. 1ª ed. São

Paulo, 1996.

GONÇALVES, C.M.; RIBEIRO, R.M.G. Anemia Infecciosa Equina: Revisão de Literatura. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária. Edição número 4.

Janeiro, 2005.

GONÇALVES NETTO, E.; MUNHOZ, A.D.; ALBUQUERQUE, G.R.; LOPES, C.W.G.; FERREIRA, A.M.R. Ocorrência de gatos soropositivos para Toxoplasma gondii Nicolle e Manceaux, 1909 (Apicomplexa: Toxoplasmatinae) na cidade de Niterói, Rio de Janeiro. Ver. Bras. Parasitl. Vet. Volume 12, n°4, p. 145-149. 2003.

54

GREENE, C.E. Infectious Diseases of the Dog and Cat. 3 rd ed. Sounders Elsevier,

St. Louis, Missouri, U.S.A., 2006.

GUIDUGLI, F.; CASTRO, A.A.; ATALIAH, A.A. Sistematic Reviews on Leptospirosis. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. Volume 42 (1), p. 47-49. 2000.

HEMACHUDA, T.; LAOTHAMATAS, J.; RUPPEREHCT, C. Human ravies: a disease of complex xeuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. The Lancet Neurology, Vol. 1, June, 2002.

HUEB, M.F.D. Doença de Chagas: indicadores cognitivos, de transtorno orgânico cerebral, de uso de álcool e qualidade de vida. [Tese Doutorado em

Saúde Mental – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo] Ribeirão Preto, 2006.

HUGH-JONES, M.E.; HUBBERT, W.T.; HAGSTAD, H.V. Zoonoses: Recognition, Control, and Prevention. Iowa State University Press. 1995.

IBGE. Estimativas das populações residentes, em 1° de julho de 2009, Segundo

os

<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/populacao/estimativa2009/POP2009_DOU.

em:

Municípios.

Disponível

pdf>. Acesso em: 02/11/2009.

KIM, K.; WEISS, L.M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes Infect. 10(9): p. 978-984. July, 2008.

KRAUSS, H.; WEBER, A., APPEL, M.; ENDERS, B.; ISENBERG, H.D.; SCHIEFER, H.G.; SLENCZKA, W.; VON GRAEVENITZ, A.; ZAHNER, H. Zoonoses: Infectious Diseases Transmissible from Animals to Humans. 3 rd edition. ASM Press. 2003.

LANGONI, H. Súmula de Aula Teórica sobre Toxoplasmose. Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP – Botucatu, 2005.

55

LANGONI, H. Zoonoses and Human Beings. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop.

Dis. Volume 10, n. 2, p. 111. 2004.

LANGONI, H.; SILVA, A.V.; CABRAL, K.G.; CUNHA, E.L.P.; CUTOLO, A.A. Prevalência de Toxoplasmose em gatos dos estados de São Paulo e Paraná. J.

Vet. Res. Anim. Sci. Volume 38, n°5, p. 243-244. 2001.

MCKERROW, J.H.; DOYLE, P.S.; ENGEL, J.C.; PODUST, L.M.; ROBERTSON, S.A.; FERREIRA, F.; SAXTON, T.; ARKIN, M.; KERR, I.D.; BRINEN, L.S.; CRAIK, C.S. Two approaches to discovering new drugs for Chagas disease. Mem Inst

Oswaldo Cruz. Volume 104 (Suppl. I), p. 263-269. Rio de Janeiro. 2009.

O’KEEFE, J.S. A brief review on the laboratory diagnosis of leptospirosis. New Zealand Veterinary Journal 50(1), p. 9-13. 2002.

PALMER, S.R.; SOULSBY, L.; SIMPSON, D.H.I. Zoonoses: Biology, Clinical Practice, and Public Health Control. Ed. Oxford University Press. 1ª edição.

Oxford, 1998.

QUINN, P.J.; MARKEY, B.K.; CARTER, M.E.; DONNELLY, W.J.; LEONARD, F.C. Microbiologia Veterinária e Doenças Infecciosas. Editora Artmed. Porto Alegre,

RS. 2005.

SAITO, A.S.; NAKASATO, F.H.; SARGASSO, F.; PINHEIRO JUNIOR, O.S. Leishmaniose em cães: Revisão de Literatura. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária. Ano VI. Número 10. Janeiro, 2008.

SOUZA, H.J.M. Coletâneas em Medicina e Cirurgia Felina. 1ª edição. P. 454-459,

2003.

UNESP, 2009. Disponível em: <http://www.unesp.br/apresentacao/perfil_2009.php>. Acessado em: 25/09/2009.

56

Animal and Plant Health Inspection Service. Department of

Agriculture. Equine Infectious Anemia. Veterinary Services. APHIS Factsheet.

April, 2003.

UNITES STATES.

URQUHART, G.M.; ARMOUR, J.; DUNCAN, J.L.; DUNN, A.M.; JENNINGS, F.W.

Parasitologia Veterinária. 2ª edição. Editora Guanabara Koogan. Rio de Janeiro,

RJ. 1998.

VINHAES, M.C.; DIAS, J.C.P. Doença de Chagas no Brasil. Caderno de Saúde

Pública. Volume 16 (Sup. 2), p.7-12. Rio de Janeiro. 2000.

8. PREVENTING RABIES TRANSMITTED BY BATS IN RAIN FOREST

PRESERVED AREAS OF SOUTHERN BRAZILIAN COAST

1

2

Corresponding author: Alexander Welker Biondo

3

Name of the Institution: Universidade Federal do Paraná, Brazil

4

Place where the work was carried out: City of Guaraqueçaba, Curitiba surroundings,

5

Paraná State, Southern Brazil

6

Title: Preventing rabies transmitted by bats in rain forest preserved areas of Southern

7

Brazilian coast.

8

Running title: preventing rabies by bats

9

Authors:

10

Kikuti, Mariana; Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do

11

Paraná, Curitiba, 80035, Brazil

12

Pierre, Elzira Jorge; Secretaria Estadual da Agricultura e do Abastecimento do

13

Estado do Paraná, Curitiba, 80035, Brazil

14

Silva, Maria do Carmo Pessôa; Secretaria Estadual da Agricultura e do

15

Abastecimento do Estado do Paraná, Curitiba, 80035, Brazil

16

Paploski, Igor Adolfo Dexheimer; Departamento de Medicina Veterinária,

57

1

Oliveira, Eduardo Alexandre de; Departamento de Medicina Veterinária,

2

Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 80035, Brazil

3

Souza, Pauline Sperka de; Secretaria Estadual da Agricultura e do Abastecimento

4

do Estado do Paraná, Curitiba, 80035, Brazil

5

da Silva, Antônio Waldir Cunha; Departamento de Medicina Veterinária,

6

Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 80035, Brazil

7

Biondo, Alexander Welker; dual affiliation: Universidade Federal do Paraná,

8

Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Paraná, Curitiba,

9

80035, Brazil and University of Illinois, Urbana, IL 61802, USA.

10

Corresponding author: Dr. Alexander W. Biondo. Departamento de Medicina

11

Veterinária, Setor de Ciências Agrárias, Campus Agrárias, Universidade Federal do

12

Paraná. Rua dos Funcionários 1540, Juvevê, Curitiba, Paraná State, 80035, Brazil.

13

+55 41 3350-5723. E-mail address: abiondo@illinois.edu

14

15

Summary

16

Guaraqueçaba city is a rain forest environmental protected area located at the

17

Southern coast of Brazil. The local Health Service has noticed in past years bats

18

feeding from humans and domestic animals, and bat colonies located in local houses

19

and schools. In 2007, two non hematophagous bats were tested positive on direct

20

immunofluorescence for rabies in a nearby city. Native fauna and environmental laws

21

protect non hematophagous bats in Brazilian protected areas such as

22

Guaraqueçaba, making non hematophagous bat population control almost

23

impossible. Accordingly, the aim of this study was to evaluate a prevention protocol

24

on rabies transmitted by bats based on lectures and post-evaluation in local

25

elementary schools, which were also geo-referenced for further monitoring.

26

Interdisciplinary task force included health, agricultural sectors and areas of

27

environment, education and community participation. Several students referred

28

handling and playing with bats at day time, exposing themselves to what may

29

actually represent a higher risk of rabies transmission then hematophagous bat

30

feeding directly from humans. Training of teachers and students may effectively

31

spread rabies prevention information in their communities. Insertion of this subject

32

into science contents of the local elementary school educational program was

33

proposed in order to establish a continuing education program on public health.

34

35

Keywords

36

Rabies, prevention, education, bats, schools

37

58

1

1. Rabies transmitted by non-hematophagus bats has been a growing concern on

2

tropical countries, particularly because they are protected by environmental and

3

native fauna laws.

4

2. Non-hematophagus bats may daily share common spaces with people in

5

preserved areas when living in human-made facilities such as schools, houses and

6

churches.

7

3. Education in schools of preserved areas about non-hematophagus bat role on the

8

ecosystem balance of rain forests along with the potential diseases they may

9

transmit may be crucial to rabies prevention associated to environmental

10

preservation.

11

12

Introduction

13

Rabies is characterized as one of the most important zoonoses due to its large

14

number of human deaths per year (Hemachudha et al., 2002). All mammals can

15

became ill with rabies and its transmittion can occur through contaminated animals'

16

saliva (Greene, 2006). Since bats are the only mamals capable of flying and some of

17

them feeding from blood (hematophagous or vampires), they are considered as

18

potencial responsibles for the rabic virus' spread. Infection of wild animals, domestic

19

animals and human beings occur by inoculating contaminated saliva when feeding

20

(Greene, 2006). Not surprisingly, both hematophagous and non-hematophagous bats

21

are the most common wildlife animal involved in human rabies (Belloto et al., 2005).

22

Vampire attacks on humans are common in several areas of Latin America (Belotto

23

et al., 2005), and rabies transmition from bats to humans has been reported in the

24

last 70 years in Brazil, Mexico, Guianas, Bolivia, Argentina, Suriname and Peru

25

(Lopez et al., 1992). Cases of human rabies transmitted by bats were increasing in

26

Brazil between 1980 and 1990 (Mayen, 2003, Cunha et al., 2006, Scheffer et al.,

27

2007), requiring special atention due to its adaptation to human made structures as

28

schools and churches. Outbreaks of bat-transmitted rabies are usually related to

29

recurring factors such as small, remote populations, environmental changes by

30

human activity (deforestation, domestic animals), poor living conditions, difficult

31

access to health services, lack of community awareness on bat-transmitted rabies

32

(Schneider, 2009). Guaraqueçaba city, Paraná State shore, Southern Brazil, is a rain

33

forest environmental protected area formed by small communities which fit into most

34

of these risk factors. The city of Guaraqueçaba is formed by the continental part and

35

several islands, the entire municipality is inside an Ambiental Protection Area (APA)

36

and is kept as one of the few natural reserves of the former Atlantic Forest in Brazil.

37

According to brazilian legislation, an APA has the main objective of protect the

38

biological biodiversity, being the activities desenvolved in the area under a several

39

restrictions. Bats play an important role in seed dispersion, plant pollination and

40

natural insect control; their interaction with natural enviroment may be a complex and

41

delicate balance on natural ecossystem dinamics (Kunz and Pierson, 1994, Mayen,

42

2003). This regulation of animal populations occurs through the predation of

43

arthropodes and small vertebrates such as night-flying insects like mosquitoes and

44

moths (Medellín, 1998). Due to the fact that bats have an important role in the

59

1 impossible to take drastic measures in controling the hematophagous bats

2 population, such as the sistematic use of warfarin gel, which would eliminate a high

3 number of bats and could bring an environmental unbalance. Local Health Service

4 has noticed in past years bats feeding from humans and domestic animals such as

5 dogs, cats, horses and poultry. Also, bat colonies were reportedly found in houses

6 and schools. The island of Sibuí was the place where the aggressions complaining

7 mostly occured. In Pontal do Paraná, city located approximately 20 km of

8 Guaraqueçaba, two non hematophagous bats tested positive on direct immuno-

9 fluorescence for rabies by the Agriculture Secretariat of Paraná State (Secretaria de

10 Agricultura e do Abastecimento do Estado do Paraná). This fact increases the risk of

11 circulation of the virus among bat colonies in Guaraqueçaba. For these reasons, a

12 bat-transmitted rabies prevention protocol based on lectures on public health directed

13 to teachers and students and post-evaluation in local elementary schools was

14 prepared by students and professors of Universidade Federal do Paraná Veterinary

15 School (UFPR), SEAB employees and the City Hall of Guaraqueçaba. The schools

16 were also geo-referenced for further monitoring.

17

18 Materials and Methods

19 The protocol for bat-transmitted rabies prevention in Guaraqueçaba city consisted of

20 an interdisciplinary task involving health and agricultural sectors and also areas of

21 environment, education and community participation. It counted with the participation

22 of 6 Veterinary graduation students, 2 professors from UFPR and 7 Animal Health

23 Service employees from SEAB. The participants were divided in 5 groups of 3 people

to

, 2008. Each group was equipped with one GPS, one laptop, the schedule of

26 schools to be visited, questionnaires to be applied to students and teachers,

27 additional teaching material about rabies to be distributed to the teachers and a

28 comic book about how to prevent rabies to be distributed to the students. The

29 transportation of the groups from the base to each school occurred by car to the

30 groups that were visiting schools on the continent parts of Guaraqueçaba or by

31 motorboat to the groups that were visiting schools on the islands. All of the schools

32 were previously aware of this event through the Municipal Secretary of Education of

33 Guaraqueçaba and, in addition, each group brought with themselves an official letter

34 allowing the activity to be presented to the schools’ responsible. After that, the group

35 filled out a note paper with the geo-reference of the school and additional comments,

36 such as presence of bats or bats’ traces. A questionnaire of 14 questions was

37 applied to each teacher about their previous acknowledgment of rabies. A 50 minutes

38 lecture addressed mainly to the students began with the use of a leptop. On those

39 schools which electricity was not provided, the laptop worked on battery. The lectures

40 focused on general information on rabies, urban and sylvatic cycle of the disease,

41 clinical signs in animals and symptoms in humans attacked by rabid bats, how to

42 prevent rabies, general information on the types of bats and their importance to the

43 environment, and mainly the procedures to be taken in cases of bat attacks directly

44 to humans or animals. To strengthen the information, a cartoon video was shown to

45 the students on how to prevent animal rabies, produced by Pasteur Institute of São

46 Paulo. In order to evaluate the knowledge acquired from the lecture, a questionnaire

24

25

each. All 31 elementary schools of the municipality were visited from April 13

18

th

th

60

1

participation on each school, all students received a comic book named “Abaixo a

2

Raiva” (Stop Rabies) and a booklet with recommendations on how to prevent rabies.

3

4

Results

5

As a result of this protocol, 31 elementary schools were geo-referenced, 684

6

students attended to an educational lecture on rabies transmitted by bats and

7

learned the procedures to be taken in cases of bat aggression to people. In addition

8

to that, through the questionnaires applied to 50 teachers before the lectures it was

9

possible to realize that 46% (23/50) of them have a university degree, while 20%

10

(10/50) have not finished the graduation, 30% (15/50) have finished high school and

11

4% (2/50) have not finished high school. 90% (45/50) of the teachers claimed

12

teaching health subjects and 98% (48/49) claimed discussing zoonosis with their

13

students. When questioned about the information on rabies previously received, 51%

14

(25/49) have not recieved any. 27% (13/47) of the teachers did not know or

15

answered mistakenly the question about what kind of microorganism causes rabies.

16

88% (43/49) of them recognize the bats as animals susceptible to rabies, 0% (0/49)

17

fishes, 51% (25/49) swine, 12% (6/49) poultry, 96% (47/49) cats and dogs and 71%

18

(35/49) recognize equine and bovine as susceptible, while 2% (1/49) of the teachers

19

did not know the answer to this question. About the transmission of rabies, 92%

20

(42/50) recognize dog bites as a source of transmission, 26% (13/50) cat scratches,

21

38% (19/50) bovine’s saliva, 90% (45/50) bat bites and 2% (1/50) mistakenly

22

recognize insect bites as a source of transmission. When questioned about rabies

23

signs in bats, 63% (26/41) identify changes of natural behavior such as flying during

24

the day and 32% (13/41) as walking on the floor as a sign of the disease. About the

25

signs of rabies in livestock animals, 88% (37/42) recognize salivation as a sign, 74%

26

(31/42) hostility, 26% (11/42) paralysis of members and 5% (2/42) do not recognize

27

that rabies affects these animals. Regarding the vaccination as a prevention of

28

rabies, 76% (29/38) of the teachers recognize the vaccination of people and 96%

29

(46/48) the vaccination of animals as effective ways of prevention. 4% (2/50) of the

30

teachers claimed already have been asked for advice by people of the community

31

bitten by bats and all instructed correctly the prophylactic measures to be taken such

32

as wash the injury and seek for medical assistance. Regarding the questionnaire

33

applied to the students, 94% (307/325) recognize dogs as susceptible to rabies, 82%

34

(267/325) ovine, 83% (271/325) swine, 91% (295/325) equine, 94% (306/325) bovine

35

and 10% (33/325) fishes. When questioned about rabies transmission sources to

36

humans, 75% (243/325) recognize handling bats, 75% (243/325) contact with

37

bovine’s saliva, 88% (286/325) bat bites and 82% (267/325) dog bites. 86%

38

(214/250) of the students claim bats are able to enter residences and can bite the

39

inhabitants. Regarding the procedures to be taken in cases of bat bites, 94%

40

(225/240) of the students answered correctly that the injury should be washed with

41

soap and water and the person should seek medical assistance. When questioned

42

about ways to prevent bats entering the residences, 87% (255/293) of them

43

answered keeping doors and windows closed and blocking all holes in the house.

44

Also, through additional comments noted by the groups about the schools, it was

45

possible to realize that in every school at least one person related the cohabitation of

61

1

Discussion

2

In small populations like these in Guaraqueçaba city, that constantly cohabit with wild

3

animals, specially bats, monitoring the populations at risk is very important, as well as

4

health education. Some of the recommendation of rabies experts on prevention of

5

bat-transmitted rabies such as greater rabies awareness in at-risk populations and

6

epidemiological surveillance were stimulated with this project. Also, it was able to

7

form an intersectoral approach on rabies prevention involving health, agricultural

8

sectors and areas of environment, education and community participation as

9

recommended by specialists (Schneider, 2009, Schneider et al., 2009), being this

10

project a well succeeded experience regarding the concept of “one world, one

11

health”. The questionnaire applied to teachers shows that many investments in their

12

education still need to be done, specially regarding health issues. Health education is

13

considered to be an important tool on the prevention of several diseases (Dandoy

14

and Scanlon, 1999), yet most educational systems are not ready to insert this content

15

in schools. In Asian countries, from patients seeking post-exposure only 15% of

16

them reported learning about rabies in school. Public Health education in schools as

17

part of the educational system could make a difference mainly instructing how to first

18

aid care to the wound properly and to seek the nearest rabies prevention centre as

19

soon as possible (Dodet et al., 2008). Evaluating the questionnaires answered by

20

the students, it was possible to conclude that at a first moment, this protocol is

21

effective on health education. The protocol is also effective regarding the diagnosis of

22

the community real situation. The educational program should be continuing, forming

23

teachers and students as a reference in prevention in their communities. For this to

24

be possible, additional teaching material was distributed to the teachers and there

25

was a proposition of inserting this subject in the science classes of the county’s

26

Public Educational System. Analyzing the additional comments made by the groups

27

about the schools it was possible to realize that before the lectures, most of the

28

students and the teachers didn’t realize the risk of cohabiting with bats or even the

29

risk of bats’ spoliation to people, since some of the students claimed knowing

30

someone that have been already bitten by chiropters. Also, many of them related

31