Inmunologa mdica

UNIVERSITAT de BARCELONA
CAMPUS de BELLVITGE

APUNTES DEL SEMESTRE - 2 de MEDICINA

Cristbal Muoz Prez

TEMARIO

1. La respuesta inmunitaria 2. Clulas del sistema inmunitario 3. Receptores/actv. inmunidad innata 4. Antgenos de la inm. adaptativa 5. Inmunoglobulinas (I) 6. Inmunoglobulina (II) 7. Inmunoglobulinas (III) 8. Ontogenia de los linfocitos B 9. C. mayor de histocompatibilidad

(1) (7) (18) (25) (30) (38) (46) (49) (54)

10. Expresin y regulacin del MHC 11. Procesamiento/presentacin del Ag. 12. Linfocito T: receptor y ontogenia 13. Molculas de adhesin 14. Activacin de los linfocitos T 15. Activacin de los linfocitos B 16. Citocinas 17. Citotoxicidad 18. Sistema del complemento

(59) (62) (66) (72) (75) (80) (86) (96) (100)

INMUNOLOGA MDICA

1. LA RESPUESTA INMUNITARIA Introduccin

La inmunologa es la ciencia que estudia la inmunidad o, lo que es lo mismo: la capacidad de responder a sustancias extraas, incluyendo microorganismos y molculas no infecciosas, adems de las reacciones siolgicas y patolgicas que se generan. A diferencia de otros sistemas, el sistema inmunitario no queda adscrito a una estructura concreta, si no que est formado por el conjunto de molculas, clulas, tejidos y rganos que proporcionan inmunidad. El sistema inmunolgico se caracteriza por su elevada especicidad (ya que puede discernir entre lo propio y lo ajeno), una gran capacidad de respuesta (neutraliza y/o elimina un nmero ilimitado de elementos extraos), y su memoria1.
Perspectiva histrica

La inmunologa es una ciencia con bastante historia. Nace a partir de la observacin de ciertos individuos que, al padecer unas determinadas infecciones, ya no las volvan a sufrir ms (quedaban inmunizados). El trmino inmunidad viene del latn inmunis, que era un privilegio que tenan los senadores gracias al cual quedaban exentos de obligaciones civiles y procesamientos legales. En 1796 Edward Jenner efectu la primera vacunacin a partir de pstulas de vaca infectada con viruela (viruela vacuna). Gracias a que esta clase de viruela es mucho menos virulenta que la humana, el individuo al que se le inoculaba el preparado quedaba inmunizado. No sera hasta un siglo ms adelante (1885) cuando Louis Pasteur crea la primera vacuna (vaccina; vacca = vaca) a partir de la forma atenuada de un patgeno. Actualmente, la vacunacin es uno de los tratamientos ms efectivos que hay, con un coste muy bajo. A nales del siglo XIX, von Behring descubre que el suero2 conere inmunidad, y ms concretamente las gamma-globulinas (de ah el trmino inmunoglobulina). Con estos resultados se habla de una inmunidad humoral (humor = uido corporal). Paralelamente, Metchnikoff descubre que las clulas de la lnea blanca (macrfagos y neutrlos) proporcionan tambin inmunidad. La transferencia de inmunidad a la tuberculosis a travs de clulas de la lnea blanca en 1940 hace que se acue un nuevo trmino: la inmunidad celular. En un inicio se consider que la inmunidad humoral y la celular no podan coexistir. No fue hasta 1950 que se asumi que las dos estaban interrelacionadas: los linfocitos T son los responsables de la inmunidad celular y los linfocitos B de la humoral. Finalmente, se empez hablar sobre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa o adquirida. Ambas actan ante un antgeno y emplean sistemas humorales y celulares.

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La memoria es una caracterstica nica de los sistemas inmunitarios ms avanzados (mamferos). Parte de la sangre que permanece lquida tras haberse producido la coagulacin. 1

Inmunidad innata y adaptativa

Antes de describir qu es cada una, veamos qu componentes forman cada una de las dos inmunidades (tanto celulares como humorales):
Componentes Celulares Humorales Inmunidad innata Inmunidad adaptativa Macrfagos, neutrlos, NK, cls. dendrticas, ... Linfocitos T y B Sistema del complemento, citocinas, molculas microbicidas, ... Anticuerpos, citocinas

En referencia a la especicidad de estas dos clases de inmunidad, la inmunidad innata se caracteriza porque se reconocen molculas o patrones comunes de los patgenos o de clulas daadas (p. ej., RNA en los virus o lipopolisacridos en las bacterias Gram negativas). Por el otro lado, la inmunidad adaptativa es mucho ms especca: hay una reaccin especca para antgenos concretos (sean de patgenos o no). Si nos jamos en la diversidad (capacidad para reconocer toda una serie de agentes), la inmunidad innata presenta una diversidad limitada (presente en la lnea germinal), mientras que en la inmunidad adaptativa la diversidad es muy elevada por el mecanismo de recombinacin somtica. Finalmente, comentar que la memoria es una caracterstica de algunos sistemas inmunolgicos. nicamente la inmunidad adaptativa tiene memoria.
Inmunidad innata

La inmunidad innata (tambin llamada natural o espontnea) aporta la primera lnea de defensa frente a los elementos extraos. Es preexistente, bastante rpida, tiene una diversidad limitada, reconoce patrones comunes y no tiene memoria. A pesar de que a primera vista podamos pensar que la inmunidad innata es ms sencilla que la adaptativa por su menor especicidad, es ms grave una deciencia en la inmunidad innata que en la adaptativa. Existen varios elementos que conforman la inmunidad innata (cuadro inferior).
Componentes de la inmunidad innata Barreras anatmicas Piel La piel es una barrera mecnica que impide el paso de microorganismos hacia el interior del organismo (siempre que no est daada y con algunas excepciones). Tiene un pH cido (3-5) y unas glndulas asociadas (p. ej., sebceas) que la protegen con sus secreciones. La propia descamacin de la piel (y su continua renovacin) es tambin un mecanismo de defensa. Mucosas En las mucosas podemos encontrar una ora endgena que impida la proliferacin de bacterias patgenas (p. ej., intestino grueso). Destacar el papel del moco y de los cilios. Barreras siolgicas Temperatura Fiebre pH bajo Acidez Mediadores Lisozima, interferones, sistema del complemento, defensinas... Clulas Macrfagos, neutrlos Se encargan de fagocitar microorganismos. Otras Cls. dendrticas, cls. NK, mastocitos, baslos, eosinlos (importantes para luchar contra los parsitos). 2

Si el patgeno atraviesa esta primera lnea de defensa, debe entrar en juego la inmunidad adaptativa (que est muy bien relacionada con la innata). En clase se destac el papel de las cls. dendrticas en la interrelacin entre las dos clases de inmunidades, y tambin se habl de un subtipo de stas, los plasmocitoides, que son importantes en el enfrentamiento con virus. Las cls. de la inmunidad innata se caracterizan por tener numerosos inputs (tienen varias clases de receptores) y puede provocar toda una serie de respuestas. Entre los receptores que tienen en su membrana encontramos los receptores de citocinas y quimiocinas3 (importantes para la comunicacin intercelular), los receptores para la Fc 4 de las Ig (relacin entre las dos inmunidades), los receptores para el sistema del complemento, y los receptores de reconocimiento de patrones (y aqu hay diferentes subfamilias).
Inamacin. Una infeccin generalmente es acompaada por una inamacin. Supongamos que un astilla atraviesa nuestra piel (se rompe la barrera anatmica) y entran algunas bacterias a travs de la pequea sura. El dao tisular es detectado, por lo que habr una vasodilatacin y aumentar la permeabilidad capilar. Las bacterias sern captadas por las clulas del epitelio, los macrfagos y las clulas dendrticas y producirn la extravasacin de monocitos (que es transformarn en macrfagos), y neutrlos, as como pasar un exudado desde la sangre hasta el tejido. El exudado est formado por el sistema del complemento, anticuerpos y protena C reactiva.

Inmunidad adaptativa

La inmunidad adaptativa, como ya hemos dicho antes, se caracteriza principalmente por su elevada especicidad antignica (gracias a su gran diversidad). Adems, dispone de memoria. La inmunidad adaptativa ejerce su funcin de reconocimiento y eliminacin selectiva de microorganismo y molculas extraas gracias a un sistema celular y otro humoral. El linfocito B (LB) es el responsable de la inmunidad adaptativa humoral, ya que forma anticuerpos. El receptor del linfocito B es el BCR (Eng: B-cell receptor), y es especco para un antgeno. Por el otro lado, el linfocito T (LT) es el responsable de la inmunidad adaptativa celular (forma citocinas), y su receptor es el TCR (Eng: T-cell receptor). Tanto el TCR como el BCR tienen una parte constante y otra variable. Los LB y los LT reconocen el antgeno de forma distinta: (a) Linfocito B. El BCR se une directamente al antgeno. Por interaccin directa entre el BCR y el antgeno, el LB se activa y empieza la produccin de Ig. (b) Linfocito T. Existen dos poblaciones de linfocitos T, los helpers (TH) y los citotxicos (TC). Los primeros se caracterizan por tener la protena CD4 en su membrana, y los segundos por tener la CD8. Los TCD4+ reconocen el antgeno cuando est unido al MHC II, mientras que los TCD8+ lo reconocen cuando est unido al MHC I. Los TH produce citocinas que activan a otras cls. para as eliminar a los microorganismos. Se les podra considerar como los directores y reguladores de la respuesta inmunitaria. Los TH activan a los LB, las CPA y los TC.

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Las quimiocinas atraen a diferentes tipos celulares al lugar donde se produce la infeccin. Fc: fraccin constante. 3

Interaccin entre MHC y antgeno El proceso por el cual se produce el complejo MHC-Ag depende de la clase del complejo principal de histocompatibilidad (MHC; Eng: major histocompatibility complex). - MHC de clase I-Ag. Como sabemos, las protenas intracelulares se van degradando en una estructura denominada proteosoma, transformndolas en pptidos. Estos pptidos interaccionan con el MHC de clase I en el interior del retculo endoplasmtico rugoso. A continuacin se formarn unas vesculas que irn a parar a la membrana y as la clula puede exponer un MHC de clase I con un pptido que, normalmente, ser de una protena propia. Aqu lo interesante viene cuando un virus infecta a una clula y empieza a producir protenas (p. ej., combina su material gentico con el nuclear): esa clula expondr MHC de clase I con pptidos de protenas extraas. - MHC de clase II-Ag. Las clulas presentadoras de antgeno (CPA; macrfagos, cls. dendrticas) son las nicas que disponen de MHC de clase II. Cuando una CPA fagocita un elemento extrao, ste se encuentra en un endosoma y ser degradado por la accin de los lisosomas. Los productos de la digestin del elemento extrao sern expuestos en la membrana de la CPA por medio del MHC de clase II. El MHC de clase I se encuentra en casi todas las clulas mientras que el MHC II nicamente en algunas. Antgeno exgeno MHC II Antgeno endgeno MHC I

Ejemplo. Supongamos que una CPA ha sido infectada mientras va fagocitando elementos extraos. Muestra un antgeno a travs del MHC II y otro a travs del MHC I. El reconocimiento de antgenos por parte de los LT y de los LH se puede dar simultneamente. La activacin del TC, no obstante, depende del TH (que tambin activar al LB).

Etapas de la respuesta inmunitaria adaptativa La respuesta inmunitaria adaptativa se divide en cinco grandes etapas sucesivas, siendo la primera el reconocimiento del antgeno y la ltima el mantenimiento de algunos linfocitos especcos para ese antgeno a modo de memoria. (1) Reconocimiento de antgenos. Ya sea directa o indirectamente, los linfocitos reconocen los antgenos. (2) Activacin de los linfocitos. Aquellos linfocitos que reconozcan especcamente al antgeno en cuestin, irn proliferando de manera exponencial (expansin/seleccin clonal). (3) Fase efectora. Se destruyen los antgenos por medio de una respuesta humoral y celular. (4) Homeostasis (contraccin). El exceso de linfocitos que se han formado entra en apoptosis (volvemos a los valores originales). (5) Memoria. Algunos de los linfocitos (B, TH, TC) cambian algunas de sus caractersticas internas para convertirse en linfocitos de memoria, los cuales sobreviven de meses a aos. Gracias a la memoria, la exposicin de nuevo al mismo antgeno hace que la respuesta inmunitaria sea ms rpida y fulminante (respuesta secundaria).
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Entendemos por respuesta primaria sta que acabamos de explicar, es la primera vez que el organismo se enfrenta a un determinado antgeno. La respuesta secundaria es aquella que se da gracias a la memoria y ocurre cuando el organismo se vuelve a enfrentar a un antgeno con el que ya se ha encontrado previamente. La respuesta secundaria es muchsimo ms rpida y efectiva (tanto a nivel humoral como celular).

Etapas de la respuesta inmunitaria adaptativa.

Podemos enfrentarnos simultneamente a varios antgenos gracias a la existencia de clones de linfocitos con diferentes especicidades. Tenemos un repertorio de linfocitos de entre 109 a 1011 (o lo que es lo mismo, esa misma cantidad de especicidades antignicas). Este repertorio o diversidad de linfocitos se realiza gracias a la recombinacin somtica de los genes TCR y BCR (reordenamiento al azar de fragmentos gnicos).
Postulados de la teora de la seleccin clonal

Como ya se ha dejado entrever antes, la seleccin clonal es la activacin de los linfocitos con especicidad para el antgeno. Adems, nos permite generar memoria. Existen cuatro postulados que explican la seleccin clonal. - Cada linfocito tiene una sla clase de receptor con especicidad nica. - La interaccin entre una molcula de antgeno extraa y el receptor especco provoca la activacin del linfocito. - Las cls. efectoras diferenciadas derivadas del linfocito activado tienen receptores con una especicidad idntica a la cl. parental. - Los linfocitos que tienen receptores especcos para molculas propias son eliminados a lo largo del desarrollo y por ende no forman parte del repetorio de linfocitos.

Inmunidad activa y pasiva

Hemos estado hablando de inmunidad celulas y humoral, de innata o adquirida... A continuacin introducimos una nueva clasicacin: activa o pasiva. La inmunidad activa es aquella que se da cuando un individuo se enfrenta a un patgeno, lo reconoce, genera linfocitos y despus se recupera y tiene una memoria. La inmunidad pasiva es aquella en que al individuo infectado le damos suero con anticuerpos especcos5 que hacen que la persona se recupere y quede inmunizada durante un cierto tiempo (no se genera memoria).
Alteracin del sistema inmunitario

El sistema inmunitario no siempre funciona correctamente, hay situaciones en las que no es lo sucientemente efectivo o que ataca a un elemento que es inocuo y nos genera un proceso que conocemos como reaccin alrgica. Veamos algunas de las situaciones: - Antgeno infeccioso. Ante un antgeno infeccioso, el sistema inmunolgico debe protegernos y atacarlo. Una respuesta alterada sera aquella en la que la destruccin del antgeno no es completa y por tanto se dan episodios recurrentes de infeccin. - Tumor. En condiciones normales podemos eliminar las cls. tumorales (inmunidad antitumoral). Cuando el sistema inmulgico fracasa es cuando aparece el cncer. - Sustancia inocua. El sistema inmunitario no debe actuar ante sustancias inocuas. Si lo hace entonces nos encontramos con una alergia. - rgano propio. Ante los rganos propios, el sistema inmunitario no hace absolutamente nada (los tolera). La respuesta alterada sera la autoinmunidad. - rgano transplantado. Como un rgano transplantado es ajeno, lo normal es que se de un rechazo. La respuesta alterada del sistema inmunitario (y que nosotros producimos y preferimos) es la aceptacin.
Resumen nal

Por tanto, por sistema inmunitario entendemos un sistema de defensa verstil y complejo formado por una red dinmica de molculas, clulas y tejidos. Para cumplir su funcin, consta de una inmunidad innata (preexistente y rpida) y otra adaptativa (lenta y ms especca). La respuesta inmunitaria discierne entre aquello ajeno de lo propio, dispone de una diversidad6 celular que le permite responder especcamente a un antgeno (p. ej., LT y LB que aumentan su nmero por seleccin clonal) y nalmente da una respuesta efectora y de memoria.
Datos. En los animales vertebrados se ha demostrado que tienen una inmunidad innata y otra adaptativa. En los invertebrados se conoce la innata pero se sabe que no tienen adaptativa (no se han encontrado LT o LB ni anticuerpos).

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Suero de alguien que haya pasado ya la enfermedad.

Es difcil que dos personas tengan el mismo repertorio de linfocitos (principalmente porque sus receptores se generan por recombinacin al azar de fragmentos gnicos). 6

2. CLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO Hematopoyesis

Todas las clulas del sistema inmunitario se originan a partir de una clula madre hematopoytica o HSC (Eng: hematopoietic stem cell). La HSC da lugar al progenitor mieloide y al progenitor linfoide. Las HSC se caracterizan por dos rasgos principales: (a) Capacidad de autorrenovacin. Existen unas pocas cls. madre hematopoyticas en la mdula sea, aproximadamente 5104. Adems, son clulas con una gran capacidad proliferativa. (b) Pluripotencia. Las HSC dan lugar a todas las cls. sanguneas y del sist. inmunitario. Presenta una elevada capacidad de diferenciacin. Las dos clulas que proceden directamente de la HSC (los progenitores mieloides y linfoides) pierden la capacidad de autorrenovacin y adems, al estar determinadas hacia la formacin de unos tipos celulares concretos, pierden (parte de) la capacidad de diferenciacin (commitment). El progenitor linfoide da lugar a los linfocitos B y T (inm. adaptativa), a las cls. dendrticas linfoides (inm. innata) y a las clulas NK (inm. innata). Por el otro lado, el progenitor mieloide da lugar a muchos tipos celulares: cls. dendrticas, monocitos (y stos a macrfagos), neutrlos, eosinlos, baslos, eritrocitos y plaquetas. Es decir, que el progenitor mieloide da lugar a todas las cls. de la lnea blanca. Existen toda una serie de factores que regulan la proliferacin y diferenciacin de las HSC y de los precursores. A menudo se habla de un microambiente en la mdula sea (HIM; Eng: hematopoietic inducing microenvirontment) formado por factores de crecimiento, citocinas7 y clulas estromales (adipocitos, broblastos, cls. endoteliales, macrfagos, LT). Hay toda una serie de factores de transcripcin (TF) esenciales para el desarrollo de los diferentes linajes hematopoyticos. Es interesante conocerlos para comprender algunas patologas o manipularlos desde el punto de vista teraputico. Homeostasis hematopoytica Por homeostasis hematopoytica (o stady-state) entendemos el conjunto de mecanismos que logran que la produccin de nuevas clulas iguale a la prdida. Esto es complicado porque cada clula tiene tiempos vitales distintos (p. ej., eritrocito = 120 das; neutrlos = pocosdas; LT de memoria = 20-30 aos). Para lograr este equilibrio deben haber una serie de mecanismos que regulen la proliferacin, la diferenciacin y la muerte de las cls. hematopoyticas: - Tipos y niveles de citocinas producidas por las cls. estromales. - Produccin de citocinas por macrfagos y LT (inamacin). - Regulacin de la expresin de receptores para citocinas y TF. - Eliminacin celular (apoptosis) de las cls. diferenciadas y progenitores.
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Por ejemplo, cuando se da una inamacin aumenta el nmero de neutrlos (se incrementa su formacin). 7

La apoptosis es un mecanismo clave para regular la homeostasis hematopoytica. Como ya sabemos, la muerte celular programada no produce una inamacin ya que los cuerpos apoptticos son fagocitados por los macrfagos sin que su contenido se exponga (todo lo contrario que con la necrosis). Los genes reguladores de la apoptosis (p. ej., bcl-2, bax, fas8) sern importantes para que sta se produzca y para entender aquellas enfermedades en que se produce una acumulacin celular por falta de apoptosis (cncer).
Clulas dendrticas

Las clulas dendrticas reciben este nombre porque tienen unas prolongaciones membranarias largas que recuerdan a las dendritas de las neuronas. Encontramos tres grandes familias de clulas dendrticas: (a) dendrtica plasmacitoide, (b) dendrtica convencional y (c) dendrtica linfoide. Las dos primeras provienen del progenitor mieloide mientras que la ltima procede del linfoide. La familia de las cls. dendrticas linfoides est formada por un nico miembro: la cl. dendrtica folicular. En cambio, la familia de las cls. dendrticas convencionales consta de tres componentes: cl. de Langerhans + cl. intersticial + cl. mieloide 9. Las clulas dendrticas se caracterizan principalmente porque se consideran clulas presentadoras de antgeno (CPA); es decir, que pueden incorporar un antgeno y mostrarlo. Clula dendrtica mieloides Como acabamos de decir, forma parte de la familia de las cls. dendrticas convencionales (por tanto, proviene del progenitor mieloide). Est presente en epitelios, tejido conectivo y linfoide. Puede capturar antgenos y madurar y migrar hacia los ganglios. Presenta niveles elevados (sobre todo cuando han madurado) de MHC I, MHC II (presentacin de antgeno a los LT), y de CD80 y CD86 (coestimuladores de los LT). Expresan receptores de la inmunidad innata (PRR). En cuanto a sus funciones, presentan el antgeno a los LT y activa a los LT vrgenes (naive), que son aquellos que nunca han entrado en contacto con un antgeno y que estn tanto en los rganos linfoides primarios (mdula sea y timo) as como en los ganglios linfticos. Como estas clulas pueden migrar hacia los ganglios, sern esenciales para la interaccin entre la inmunidad innata y la adaptativa. Son las CPA por antonomasia 10. Clula dendrtica plasmacitoide Las caractersticas que se han comentado antes son rasgos comunes de todas las cls. dendrticas convencionales. Las plasmacitoides se caracterizan porque intervienen en la respuesta
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Fas es el encargado de inducir la apoptosis por parte de los LT.

La cl. mioide procede de un monocito (que viene del progenitor mieloide) y ste puede dar lugar a un macrfago o a la susodicha cl. mieloide.
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Los macrfagos tambin son CPA pero no pueden migrar hacia los ganglios linfticos, por lo que no pueden activar a los linfocitos naive (a los otros s). 8

inicial a virus. Expresan una gran canidad de receptores de inmunidad innata (PRR) para cidos nucleicos de virus intracelulares (RNA). Atencin, los RNAs vricos presentan rasgos que

los diferencian de los RNA endgenos. Las cls. dendrticas plasmacitoides tambin producen una gran cantidad de interfern de tipo I (IFN/), que es una citocina antiviral (la clula la secreta para avisar a las cls. cercanas que ha sido infectada por un virus y as se promueva la expresin de genes antivirales). Clula dendrtica linfoide La clula dendrtica folicular (linfoide) se encuentra en los centros germinales de los folculos linfoides de los ganglios linfticos y del bazo, y en el tejido linfoide asociado a muscosas (MALT). A diferencia de las clulas dendrticas que proceden del progenitor mieloide, las que provienen del progenitor linfoide no expresan MHC II y por tanto no presentan antgenos a los LT. En su lugar, lo que hacen es expresar una gran candidad de receptores de anticuerpos y receptores del complemento. Por tanto, podrn captar anticuerpos o fracciones del complemento que a su vez capten al antgeno. En otras palabras, son clulas que presentan el antgeno a linfocitos B y seleccionan a aquellos LB con mayor anidad por el antgeno.
Ciclo de vida delas cls. dendrticas. (Fainboim pg. 16) El ciclo de vida de las cls. dendrticas transcurre a travs de diferentes etapas. (a) Las cls. dendrticas se originan a partir de precursores hematopoyticos pluripotenciales presentes en la mdula sea que darn lugar, en ltima instancia, a precursores inmediatos de las cls. dendrticas que alcanzan la circulacin. Entre estos precursores inmediatos se destacan los monocitos. (b) Precursores de las cls. dendrticas y cls. dendrticas provenientes de la circulacin extravasan en la piel y las mucosas, donde conforman una extensa e intrincada red celular. (c) Al activarse, en respuesta a un proceso infeccioso, las cls. dendrticasm igran a los ganglios linfticos drenantes del sitio de infeccin y completan su proceso madurativo. (d) Ya en el ganglio linftico, las cls. dendrticas maduras activan a los LT vrgenes (naive) e inducen su expansin clonal y su diferenciacin en distintos perles efectores.

Macrfago

El macrfago es una clula que procede del monocito. En funcin del tejido al que se extravase este monocito, pasar a diferenciarse a una clase de macrfago u otro (cls. de Kuppfer, microgla, cls. mesangiales, histocitos, macrfagos alveolares u osteoclastos). Esta diferenciacin se da por el cctel de sustancias con las que se encuentra el monocito al migrar a un tejido determinado (que no tiene por qu darse nicamente cuando hay una infeccin). Los macrfagos pueden estar en una forma inactiva o activa, y para llegar a este estado activo pueden activarse de dos maneras distintas, la M1 (activacin clsica) y la M2 (activacin alternativa). Comentar tambin que un macrfago puede proliferar y tambin entrar en apoptosis.
Diferencias principales entre monocito y macrfago Tipo celular Monocito Tamao 10-15 m Orgnulos Lisosomas, fagosomas... Capacidad fagoctica + Produccin enzimas hidrolticos + Secrecin de factores solubles + 9 Macrfago 50-150 m Aumento en n y complejidad de lisosomas, fagosomas... +++ +++ +++

De las caractersticas que aparecen en el cuadro anterior, comentar que en el caso de un macrfago activado, su capacidad fagoctica, de produccin de enzimas hidrolticas (bactericidas) y su secrecin de factores solubles (p. ej., citocinas) aumentra drsticamente. Como todas las cls. del sistema inmune, los macrfagos disponen de toda una serie de marcadores de supercie. Para identicar a cada una de las poblaciones del sistema inmune se escogieron marcadores de membrana especcos para cada tipo celular. A pesar de que estos marcadores puedan no ser exclusivos de un tipo celular, su combinatoria es completamente nica para cada poblacin celular. Estos marcadores son los CD, del ingls cluster of differentiation. Ejemplos: CD4 = LT helper (colaborador); CD8 = LT citotxico. Los marcadores de supercie que tienen los macrfagos son los siguientes: - Receptores de la inmunidad innata. Estos receptores reconocen patrones comunes a varios patgenos, como por ejemplo los mucopolisacridos de la pared bacteriana. Dentro de esta categora estn los TLRs (toll-like receptor), el receptor de manosa (CD68) y los receptores carroeros (scavenger receptors). - Receptores de componentes del sistema del complemento. Esto permite la fagocitosis de elementos opsonizados. Encontramos el CD35 (receptor para C3b; CR1), el CD11b/ CD18 (CR3) y el CD11c/CD18 (CR4). - Receptores para las inmunoglobulinas. Favorecen la fagocitosis. En la diapositiva se comentan el CD64 (FcRI), el CD32 (FcRII) y el CD16 (FcRIII). - Molculas del MHC I y II. - Molculas coestimuladores. Como el CD80 y el CD86, que son necesarias para la activacin de los LT naive. Todas estas protenas de membrana adems de la arquitectura interna de la clula permiten que el macrfago pueda: (a) reconocer microorganismos y activarse; (b) fagocitar; (c) ejercer una actividad antimicrobiana y citotxica; (d) ingerir cls. apoptticas y muertas; (e) presentar antgenos; (f) producir citocinas y otros factores; (g) participar en la reparacin tisular. Son clulas con un papel importante en la relacin entre la inmunidad innata y adaptativa. Atencin, en clase se dijo que el macrfago puede activar a LT. No obstante, como no puede migrar a los ganglios, su capacidad de activacin es bastante reducida. nicamente podr activar aquellos LT naive que se encuentren en el mismo tejido y que tengan especicidad por el antgeno que presenta el macrfago.
Granulocitos

Los granulocitos son un tipo de leucocitos. Dentro de los granulocitos encontramos tres tipos celulares: los neutrlos, que son los ms importantes cuantitativamente, los eosinlos y los baslos. Neutrlos Los neutrlos forman gran parte de la frmula leucocitaria; entre el 50 y el 70% de los leucocitos son neutrlos. Experimentan adems un pico durante la respuesta inamatoria. Son ge10

neralmente los primeros en llegar al lugar donde se ha originado la infeccin (extravasacin, quimiotaxis), en gran nmero para hacer frente a los microorganismos que estn proliferando exponencialmente. En su membrana presentan receptores para la IgG (CD64) y receptores del complemento (CR1, CR2, CR3 y CR4) que sirven para que la fagocitosis que realizan estas clulas sea eciente. NEUTRFILS

Col.lagenasa, lisozima lactoferrina Peroxidasa, lisozima enzims hidroltics

neutrlos 50 70 % leuccits a la sang. Augment durant la resposta inflamatria. Neutrlo. Los tienen mecanismos microbicidas dependientes o no de oxgeno. Presentan ms de Generalment els primers darribar al lloc de la infecci (quimiotxis, extravasaci) fensinas y una mayor actividad de explosin respiratoria que los macrfagos (se ver ms adelante). Se dijo en Receptors per IgG (CD64) i receptors del complement (CR1,CR2,CR3, CR4) clase que mientras que un macrfago tena que formar de novo todos los enzimas y agentes microbicidas, el Activitat fagoctica neutrlo ya los tiene desde un principio. Enzims ltics i agents bactericides dins grnuls primaris i secundaris Mecanismes microbidides dependent i independents doxgen. Activitat de Tambin en su membrana hay receptores de quimioquinas que respiratory burst i nivells de defensines ms elevades que hacen els M que el neutrlo pueda Paper clau en la fasedonde inicial Immunitat extravasarse a aquellos tejidos hay unaInnata infeccin. Una vez en el tejido, los neutrlos

forman agentes quimioatractantes. En su citoplasma encontramos enzimas lticos y agentes microbicidas que reposan en los grnulos primarios y secundarios. El fracaso de los neutrlos es sinnimo de que tiene que actuar la segunda lnea de defensa (inmunidad adaptativa). Eosinlos

EOSINFILS

Los eosinlos representan un pequeo porcentaje de los leucocitos en sangre (del 1 al 3%). Son clulas que migrarn a los tejidos en respuesta a infecciones y que estn especializados en fagocitar parsitos. En su interior hallamos grnulos con factores txicos para parsitos. En su membrana hay receptores de baja anidad para las IgE (FcRII: CD23); en otras palabras, que se unir a las IgE cuando stas estn muy concentradas (p. ej., cuando se Eosinlo . Se indica presencia un 1 3 % dels leuccits a sang. Migraci de la la sang als teixitsde en resposta a opsoniza con IgE un parsito). El nmero de eosinlos grnulo con cristaloide. infeccions Activitat aumentar en parasitosis y en reacciones alrgicas . fagoctica versus parsits Baslos

Grnuls amb factors txics per parsits Receptors de baixa afinitat per IgE (Fc RII: CD23). Destrucci de partcules recobertes dIgE Participen en reaccions al.lrgiques: inflamaci i lesi de teixits Augmenta el seu nombre en al.lrgies i parasitosi

Los baslos son los leucocitos ms minoritarios (< 1%). Son equivalentes a los mastocitos tisulares. En su membrana expresan receptores de alta anidad para las IgE, por lo que pueden reconocer IgE que estn libres (a concentraciones muy bajas). Precisamente por esta baja
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BASFILS

anidad de sus receptores de IgE, los baslos participan en las reacciones alrgicas, que adems cursan con una gran inamacin por culpa de los grnulos de histamina que tienen estas clulas (y que liberan cuando se activan). A diferencia de los neutrlos y eosinlos, Histamin los baslos no tienen actividad fagoctica. Los mastocitos son clulas muy parecidas a los baslos. Su precursor es liberado a la sangre y se dife- Baslo. Los grnulos que se indican Menys de l1 % dels leuccitshistamina. a la sang. Equivalents als mastcits tissulars rencian en los tejidos (piel, tejido conectivo y epitelio contienen Expressi receptors dalta afinitat per la IgE (Fc RI) que reconeixen IgE lliure de las mucosas). Expresan receptores de la Contenen IgE, IgG y dhistamina grnuls NO tenen activitat fagoctica del complemento. Presentan grnulos citoplasmticos con histamina y son importantes en Participaci en reaccions al.lrgiques (Hipersensibilitat inmediata mediada per Ig las alergias y en las defensas contra helmintos (gusanos que parasitan). En una de las diapositivas aparece una tabla donde se resumen las principales caractersticas funcionales de las clulas que acabamos de explicar en este captulo. Se coment que los neutrlos tienen una mayor capacidad antignica que los macrfagos, que los macrfagos son CPA y que las cls. dendrticas son CPA y adems tienen la clara ventaja de poder migrar hacia los ganglios y activar a los LT naive.
Clulas linfoides

Las clulas linfoides proceden del progenitor linfoide que su vez es descendiente directo de la clula madre pluripotencial (HSC). Las diferentes poblaciones de linfocitos se identican gracias al reconocimiento de unos marcadores de supercie (CD), que no son ms que unas molculas que el linfocito expresa en su membrana y que pueden cumplir diferentes funciones biolgicas en la clula (su cometido no es identicar a la clula, nosotros nos aprovechamos de esas molculas para nuestro inters). La identicacin de estos marcadores se realiz por medio de anticuerpos monoclonales. Los CD no son exclusivos de una poblacin celular, pero su combinatoria suele serlo. El CD4 se encuentra en los linfocitos T helpers, aunque tambin lo podemos encontrar en algunos linfocitos NK. De igual manera, el CD8 est en los LT citotxicos y tambin puede ser hallado en linfocitos NK. Un marcador especco de LT es el CD3, y un marcador especco de los linfocitos T y B es el CD5. El CD28 es necesario para el funcionamiento de los LT.
Linfocito T

Los linfocitos T maduran en el timo. En su membrana expresan el receptor para el antgeno (TCR) y toda una serie de marcadores de supercie: CD3 y CD28 en todos, y despues CD4 en los colaboradores y CD8 en los citotxicos. La expresin de CD4 limita al LT a que pueda reconocer un antgeno nicamente acoplado a una molcula de MHC II, mientras que la expresin de CD8 limita al LT a que pueda reconocer un antgeno unido a un MHC I. A pesar de que la interaccin entre el antgeno y el LT se d a travs del TCR (complejo TCR-Ag), el CD4 (o el CD8) actuaran a modo de correceptores que estabilizan la interaccin. Para que el
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TCR pueda reconocer el Ag necesitar, a parte del CD4 (o CD8), al CD3 y al CD28. Existen dos grandes poblaciones de linfocitos T: (a) TCR, y (b) TCR; las dos tienen dos subunidades que son necesarias para el reconocimiento del antgeno. - TCR. CD3+, CD4+ (variable), CD8+. Se encuentran en una baja proporcin en la sangre (5-10% de los LT sanguneos). Se suelen encontrar en las mucosas. Cuando reconocen al antgeno realizan una actividad microbicida y forman citocinas. - TCR. Son el 90-95% de los LT sanguneos y se dividen en tres subpoblaciones. - T colaborador. CD3+, CD4+. Tambin pueden ser denominados helpers (Th). Participan el control de la activacin de los macrfagos, la diferenciacin de LB y en la inamacin. - T citotxico. CD3+, CD8+. Tambin pueden ser de- Tejido Th Tc nominados CTL (Eng: cytotoxic T limphocyte) o Tc. Sangre 50-60% 20-25% Se encargan de hacer la lisis de cls. infectadas, G. linftico 50-60% 15-20% 50-60% 10-15% tumorales y de los aloinjertos. Hay aproximada- Bazo mente el doble de TH que de TC (tanto en sangre Distribucin de TH y TC. como fuera de ella). - T reguladores. CD3+, CD4+, CD25+, FoxP3+. Hay bastante pocos. Se encargan de regular la respuesta inmunitaria, de promover la auto-tolerancia (impedir que ser reconozcan antgenos propios) y suprimen a los LT. Activacin de los linfocitos Los linfocitos naive se encuentra en un estado de quiescencia (Go) porque no interesa que prolifere hasta que entre en contacto con un antgeno. El contacto del antgeno con el linfocito hace que este ltimo entre en el ciclo celular y se divida. En ltimo trmino, el linfocito puede diferenciarse a clula de memoria o a clula efectora (p. ej., cl. plasmtica). Migracin y circulacin de los linfocitos Los LT naive deben ir desde el timo a los ganglios linfticos empleando la circulacin sangunea. Estos LT volvern a la circulacin a travs del conducto torcico (no se deben quedar permanentemente en el ganglio para as aumentar las posibilidades de contactar con un el Ag). Las cls. dendrticas migrarn hacia los ganglios cercanos para presentar el Ag a los LT naive. Una vez el antgeno ha sido presentado al LT naive, madurar y migrar hacia el tejido infectado, donde realizar una respuesta u otra en funcin de la clase de T que sea. Los T efectores (activados) tendrn en su membrana molculas que interaccionarn con molculas de adhesin en el endotelio. Se destac que los LT naive presentaban en su membrana una gran cantidad de L-selectina (molcula de adhesin). Como veremos en el cuadro de la pgina siguiente, hay toda una serie de caractersticas que diferencian a los LT naive de los efectores y de los de memoria.
Nota. Con el tiempo el timo va degenerando, aunque esto no supondr un problema porque tenemos linfocitos de memoria. Con lo que resta de timo ya es suciente para la formacin de T naive. 13

Caractersticas Freq. respuesta Ag Funciones efectoras Ciclo celular R. alta anidad IL-2 Homing receptors L-selectina Ligando E- y P-selectina Integrinas CD45 Morfologa

Linfocitos naive Muy baja Ninguna No Baja Baja Alta Baja Baja CD45RA Pequeo

Linfocitos activados/efectores Alta Secrecin de citocinas, actividad citoltica S Alta Alta Baja Alta Alta CD45RO Grande

Linfocitos de memoria Baja Ninguna +/Baja Baja Baja o variable Alta Alta CD45RO; variable Pequeo

Los ganglios linfticos expresan el receptor para las L-selectinas, lo que permite que los LT naive puedan acceder a su interior. Los linfocitos efectores expresan una menor cantidad de Lselectinas pero expresan una mayor cantidad de ligandos para las selectinas E y P, que son expresadas por el endotelio del tejido inamado. Las citocinas secretadas mejoran la extravasacin hacia el tejido infectado (receptores para stas en las membranas de los LT).
Linfocitos B

Los linfocitos B (LB) se forman en la mdula sea y en la bolsa de Fabricio. Disponen de los siguientes marcadores fenotpicos: - Receptor para el antgeno (BCR). Se trata de una inmunoglobulina de membrana que puede unirse directamente a un antgeno. Hay unas 1,5 105 molculas/clula. - Marcadores especcos. Tales como el CD19 y el B220. - Receptores del complemento. Como el CR2 y el CR1. - MHC de clase II. - Receptores para la Fc de IgG. FcRII. - Molculas coestimuladoras. Tales como CD80, CD86 y CD40. Dentro de los linfocitos B podemos distinguir dos poblaciones: B1 y B2. El principal elemento diferencial de estas dos poblaciones es la expresin (o no) del CD5. nicamente el 5% de los linfocitos B sanguneos son del tipo B1 (CD5+) mientras que el 95% restante de los LB sanguneos son del tipo B2 (CD5-). - B1. Su BCR es capaz de reconocer estructuras comunes de patgenos (antgenos comunes), lo cual es una caracterstica tpica de los receptores de patrones comunes que encontramos en las clulas de la inmunidad innata. No es un PRR de la innata porque se genera por recombinacin. Atencin, esta poblacin est implicada en la formacin de anti-anticuerpos, por lo que estn muy implicados en los procesos de autoinmunidad. Son abundantes en el peritoneo. - B2. Es la poblacin mayoritaria de LB. La principal funcin de los LB (B1 y B2) es la produccin de anticuerpos (inmunidad humoral).

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LIMFCITS B: ACTIVACI, DIFERENCIACI I APOPTOSI

Los LB no se encuentran distribuidos uniformemente por todos los tejidos: en la sangre estn entre el 10 y el 15%; en los ganglios entre el 20 y el 25% y en el bazo entre el 40 y el 45%.

Linfocitos B. nicamente aquellos LB que entren en contacto con el antgeno se activarn, abandonar la fase Go (aunque no nicamente por la interaccin con el Ag, se precisarn ms seales). A partir de ese momento, proliferar y podr diferenciarse a: (a) clula efectora (plasmtica), (b) cl. B de memoria. No obstante, la gran mayora de las clulas que han proliferado en el marco de una reaccin inmunitaria, entrarn en apoptosis.

Los diferentes linfocitos (naive, activados y de memoria) pueden identicarse en el laboratorio jndonos en toda una serie de caractersticas diferenciales.
Caracterstica Inmunoglobulina (Ig) Linfocito naive IgM e IgD Linfocito activado/efector Linfocito de memoria Adems de los dos isotipos Adems de los dos isotipos existentes en el naive, IgG, IgA existentes en el naive, IgG, e IgE IgA e IgE Aumenta Formacin de anticuerpos Grandes (cl. plasmtica) Poca Alta Ninguna Pequeos ?

Anidad de la Ig Funcin efectora Morfologa Receptor quimiocinas (CXR5)

Baja Ninguna Pequeos Elevada

La anidad de la Ig aumenta en los linfocitos efectores y de memoria por un proceso denominado hipermutacin somtica (se explicar ms adelante). sta consiste en el proceso por el cual aumenta el nmero de mutaciones (no se sabe cmo) que tienen lugar en la regin gnica que codica para la fraccin variable de las Ig, de manera que acabamos teniendo un receptor del LB distinto al de la clula parental (con anidad distinta). Como el antgeno es el limitante, se realizara una seleccin sesgada en factor de los LB que tengan un receptor con mayor anidad. En cuanto a los receptores de quimiocinas, se expresarn ms o menos en un tipo de linfocito en funcin de la clase de receptor que sea. Por ejemplo, si es un receptor que retiene al linfocito al ganglio, estar ms expresado en los naive.
Clulas NK

Las clulas NK (o asesinas naturales) pertenecen a la inmunidad innata. Se denen como linfocitos grandes con grnulos con enzimas y elementos con gran capacidad citotxica. Se enfren15

tan sobre todo a clulas tumorales y a clulas infectadas por determinados virus. Representan entre el 5 y el 10% de los linfocitos sanguneos y del bazo. En su membrana tienen los siguientes marcadores fenotpicos: - No expresan receptores especcos para el antgeno. Como los que encontramos en los linfocitos T y B. - CD16. Se trata de un receptor para la fraccin constante de las Ig (FcRIII). Estos receptores tienen una clara funcin: facilitar la interaccin entre la respuesta innata y en la adaptativa. - Otros receptores. Similares a lectina tipo C, KIR, LILR, LAIR, NKp, etc. Hay ms de una poblacin de linfocitos NK. En clase se destac una particular, la poblacin NK1-T. Esta poblacin se caracteriza por presentar caractersticas de la clula T y de la NK: expresan un TCR que interacta preferentemente con el CD1. El CD1 (MHC-like) es una molcula que suele mostrar lpidos. Al igual que el TCR presente en el linaje T, el TCR de las NK1-T se forma por recombinacin somtica, aunque mucho ms limitada en cuanto a su diversidad. Esta poblacin tambin presenta el CD16 y los otros receptores observados antes. Las clulas NK tienen una funcin citotxica y de secrecin de citocinas.

Activacin, diferenciacin y migracin de los linfocitos. Para aquellos antgenos presentes en la sangre, la interaccin entre el linfocito naive y el antgeno se dar en el bazo. Una vez producida dicha interaccin, habr una expansin clonal. Las clulas efectoras debern migrar hacia el sitio de infeccin). Nota 1. En la penltima diapositiva del tema 2 aparece una pequea tabla del Abbas en el que se resumen las principales funciones de los diferentes tipos de linfocitos: - LB: reconoce el antgeno directamente. Forma anticuerpos y activa al complemento. - TH: reconoce el antgeno a travs de una CPA (MHC II). Su principal mecanismo efector son las citocinas. Controla la inamacin, activa a los macrfagos y activa (proliferacin y diferenciacin) de los LT y LB. 16

- TC (CTL: reconoce el antgeno expresado por un MHC I. Destruye a la clula infectada. - T regulador: es una subpoblacin cuantitativamente pequea pero cualtitavamente importante. Son importantes en la supresin de la respuesta inmunitaria (clave para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inamaciones crnicas). - NK: destruir clulas tumorales o infectadas. Nota 2. Se volvieron a comentar (repetido hasta la saciedad) las caractersticas funcionales de los linfocitos: (a) reconocer propio/no propio; (b) especicidad; (c) diversidad; (d) memoria; (e) secrecin de citocinas. Tambin se habl de unas clulas accesorias que secretan citocinas, que capturan y destruyen microorganismos, y que presentan el antgeno.

Apunte sobre las dos clases de macrfagos activados

Como se dijo previamente, los macrfagos pueden activarse de dos maneras distintas: M1 (activacin clsica) y M2 (activacin alternativa). Que un macrfago inactivo pase a activarse de un modo u otro depende de las citocinas con las que contacte. - Macrfago M1. Se parece mucho al macrfago clsico. Presenta una gran cantidad de MHC II, capacidad microbicida, presenta PRRs y forma TNF (una citocina proinamatoria). - Macrfago M2. Son antiinamatorios y estn relacionados con la reparacin de tejidos. Forman IL-10 y TGF (citocinas antiinamatorias). Cuando los macrfagos reconocen clulas apoptticas, el tipo de diferenciacin es el M2 (que no genera tanta inamacin como el M1). Los tumores a veces estimulan la formacin de macrfagos en su forma M2 para eludir al sistema inmunitario.

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3. RECEPTORES Y ACTIVACIN DE LA INMUNIDAD INNATA Seales y receptores de la inmunidad innata

En las clulas de la inmunidad innata encontramos los receptores de patrones comunes (PRR). Estrictamente, estos receptores puede reconocer dos grandes agrupaciones de molculas: (a) PAMPs, y (b) DAMPs. La primera agrupacin (Eng: pathogen associated molecular patterns) son las molculas que podan ser halladas en varios patgenos a la vez, como por ejemplo los lipopolisacridos, la agelina, los peptidoglucanos y material gentico. Dentro del material gentico se le puso especial nfasis al CpG DNA, que son regiones del DNA ricas en citosinas y guaninas no metiladas (en el ser humano estas regiones estn metiladas). La segunda agrupacin (Eng: damage associated molecular pattens) incluye molculas que aparecen cuando hay necrosis, como por ejemplo el cido rico, las HBPs (high shock proteins), el ATP, la adenosina y la HMGB111. Existen numerosas clases de receptores dentro de la familia de los PRR. Unos se encontrarn en la membrana y otros sern intracelulares. Sea de la clase que sea y estn donde estn, la interaccin entre el PRR y su ligando provocar una respuesta intracelular (activacin) que provocar una reaccin: p. ej., la formacin de citocinas, la fagocitosis, la quimiotaxis, la liberacin de enzimas, etc.

Receptores de patrones comunes (PRR). A continuacin aparecen algunos de los PRR que se explicarn a continuacin. Los TLR ubicados en la membrana reconocen elementos lipoproteicos comunes a distintos patgenos. Los TLR endosomales reconocen material gentico viral (e incluso DNA bacteriano). Los RLR citoslicos tambin pueden reconocer RNA viral y los NLR citoslicos haran lo mismo que los TLR de la membrana pero a nivel del citosol. Finalmente, en la imagen se observa un receptor de lecitina.

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Esta protena se encuentra unida al material gentico por lo que si est en el medio extracelular es un claro indicio de necrosis. 18

TLR (toll-like receptors)

Existe una gran cantidad de TLR, cada uno de ellos con una anidad determinada para un patrn. A continuacin se exponen algunos de los ms importantes ( end: endosomal; membr: membrana; entre parntesis aquello que reconocen) 12: TLR3end (bc-RNA); TLR7end (mc-RNA); TLR9end (DNA rico en CpG); TLR4membr (lipopolisacridos); TLR5membr (agelina); TLR1,2,6membr (diferentes estructuras bacterianas). En cuanto a la estructura del receptor, comentar que tiene un dominio TIR con el que interaccionar directamente con diferentes protenas (inicia la sealizacin). Los receptores TLR estn especialmente presentes en clulas dendrticas, y concretamente en los plasmacitoides. Se coment que los plasmacitoides participan en la respuesta anti-viral, por lo que le interesa tener TLRs endosomales que puedan detectar la presencia de material gentico vrico. Una vez reconocido, formar citocinas (como el interfern /) 13. Adems de encontrarse en las cls. dendrticas, los TLRs estn en otros elementos de la inmunidad innata (macrfagos, neutrlos), de la adaptativa (LB) y clulas que estrictamente no Mecanismo de accin intracelular de los TLRs. La forman parte del sistema inmunitario pero produccin de toda una serie de sustancias de la madel factor de transcripcin NF-B genera una inque colaboran con l (queratinocitos, cls. no amacin y la estimulacin de la inmunidad adaptaepiteliales). tiva. De igual manera, los IRFs favorecen un estado El mecanismo de funcionamiento del antiviral. TLR es el que se expone a continuacin. Una vez se produce la interaccin receptor-ligando, el dominio TIR, que no tiene actividad enzimtica) contactar con un adaptador, que en este caso puede ser la protena MyD88 o la TRIF. Acto seguido, se activar un factor de transcripcin (NF-B o IRFs) que promover la expresin de toda una serie de genes. La activacin del NF-B induce la expresin de citocinas proinamtorias (TNF, IL-1 e IL-6), mientras que la activacin del IRF induce la expresin de IFN. La cantidad y la duracin de la respuesta depender del tipo celular y de ligando.

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No es la nomenclatura ocial, es un aadido que les pongo yo para aclararme.

Recordemos que otra gran familia de interferones es la gamma (). Este IFN es formado por clulas de la inmunidad adaptativa (Th1 y NK). 19

NLR (NOD-like receptors)

Los NLR reconocen estructuras lipoproteicas que se encuentran en el citosol. El rol de estos receptores es clave para que algunas citocinas sean activas. Por ejemplo, supongamos que la interaccin entre un TLR y un ligando produce la activacin del factor de transcripcin NF-B y se expresa una citocina en una forma inactiva (Pro-IL-1). La activacin de esta citocina se realizar por medio de una caspasa (caspasa-1) que a su vez precisar que se active por medio del denominado inamasoma. El inamasoma est formado por el NLRP3, la protena ASC y la caspasa-1 inactiva. El inamasoma se activar por toda una serie de DAMPs (colesterol, ATP, especies reactivas de oxgeno) y de PAMPs (como el DNA viral). Una vez el inamasoma est activo, hace que la caspasa-1 pase a su forma activa (no induce la apoptosis) y da lugar a la citocina en Mecanismo de accin intracelular del NLR. La activasu forma activa (que ser liberada). Los in- cin de la citocina se realiza por medio de una proteliamasomas se encuentran en el citoplasma sis catalizada por la caspasa-1. de fagocitos, de clulas epiteliales, etc.
RLR (Rig-1 like receptors)

Los RLR estn en el citoplasma y pueden detectar RNAs virales con diferentes caractersticas. Los dos receptores de esta familia que se citaron en clase fueron el RIG-1 (que le da el nombre a la familia) y el Mda5. La interaccin receptor-ligando producir, en ltimo trmino, la formacin de citocinas proinamatorias (TNF, IL-1 e IL-6) e interferones (IFN/). Estn presentes en fagocitos.
CLR (C-type lectin receptors)

Estos receptores son protenas transmembrana que reconocen motivos ricos en manosa, fucosa y -glucano (se pueden encontrar en microorganismos) Se encuentra en macrfagos y clulas dendrticas. Hasta ahora, los receptores que hemos visto producan cascadas de sealizacin intracelular que culminaban con la liberacin de sustancias. Los CLRs participan en procesos de internalizacin de microorganismos no opsonizados (fagocitosis).
Papel de DC-SIGN (CLR) en el sida. El virus del sida es endocitado por la clula dendrtica una vez que ste ha interaccionado con el DC-SIGN, y en lugar de ser degradado permanece en un compartimento intracelular no degradativo. La clula dendrtica migrar hacia los ganglios linfticos y ah entrar en 20

contacto con un linfocito T CD4+. Cuando se da el contacto, las vesculas que contienen al virus se fusionan con la membrana de la cl. dendrtica en el sitio de contacto entre ambas clulas, y transeren la infeccin a los linfocitos T CD4+.

Receptores scavenger

Los receptores scavenger (carroeros) se encuentran en la membrana de macrfagos, neutrlos, clulas dendrticas, cls. endoteliales y epitelios. Reconocen LDL modicada (acetilada u oxidada), ligandos polianinicos, componentes microbianos y restos de clulas apoptticas (como la fosfatidilserina oxidada).
Nota. Todos estos receptores que estamos viendo nos demuestran la gran cantidad de familias de receptores que existen, las cuales pueden coexistir en una misma clula. La respuesta de una clula con diferentes receptores ser el resultado de la suma de las diferentes vas intracelulares.

Receptores para pptidos formilados (RFP)

Los RFP se encuentran en la membrana plasmtica de los fagocitos y reconocen: (a) pptidos N-formilados en el aa Met, que son producidos por las bacterias y que resultan en una actividad quimiotctica sobre neutrlos y macrfagos; (b) pptidos de algunos virus, como el VIH1, el VIH-2 y el bola.
Receptores de patrones solubles

A continuacin se exponen toda una serie de receptores que pueden interaccionar con patrones solubles. - Colectinas. Son las formas solubles de la familia CLR. Reconocen motivos ricos en manosa, fucosa y -glucano. Se cit la MBL, que consta de una lectina que se une a manosa. Son importantes para la activacin del complemento. Estimulan la fagocitosis. - Ficolinas. Su principal caracteristica es que reconocen grupos acetilados (GlcNAc) que se encuentran principalmente en microorganismos y en cls. apoptticas. Participan en la activacin del complemento. - Pentraxinas. Aqu pertenece una de las protenas de la fase aguda: la protena C reactiva (PCR). Principalmente reconocen la fosfocolina, que la podemos encontrar en hidratos de carbono de microorganismos y en la membrana celular de cls. necrticas y apoptticas. Promueven la fagocitosis (al reconocer los patrones, la PCR podr unirse -con menor anidad- al receptor de la Fc de Ig)14. Acaba activando al sistema del complemento. - Sistema del complemento. Ya se explicar, pero comentar que pueden reconocer patrones solubles.

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La PCR junto con la fosfocolina del microorganismo (o de donde venga) podr ser reconocida por el receptor de la Fc de la Ig presente en clulas como los fagocitos. 21

Como suceda con los PRRs, la interaccin entre el receptor de patrn soluble y su ligando puede producir: (a) fagocitosis; (b) activacin del complemento (uno de los principales mecanismos efectores de la inmunidad innata y en parte de la adaptativa); y (c) formacin de citocinas proinamatorias (que son la IL-1, IL-6 y el TNF). Los PRRs tienen un cierto solapamiento por lo que respecta a los PAMPs que reconocen (es decir, un ligando puede ser captado por ms de un receptor). Diferentes grupos de patgenos son reconocidos por grupos de receptores diferentes que inducirn una respuesta concreta con caractersticas particulares (depende del tipo celular y de receptor).
Nota. Se observa una diapositiva en la que se ilustran la cantidad inmensa de receptores de la inmunidad innata (PRRs) que sirven para detectar partes del hongo Candida albicans. La cl. dendrtica es la que despliega un mayor repertorio de PRRs.

Reconocimiento y fagocitosis

A continuacin se describen los diferentes pasos por los cuales una clula con actividad fagoctica puede incorporar un elemento ajeno. En primer lugar viene la quimiotaxis, que consiste en la atraccin y el movimiento hacia una partcula (p. ej., cls. muertas, partculas opsonizadas). En el marco de la quimiotaxis, el fagocito sufrir unos cambios en la membrana y en el citoesqueleto que permiten el movimiento hacia la partcula en cuestin. En segundo lugar se produce el reconocimiento y la fagocitosis. El reconocimiento se da por los diferentes receptores presentes en la membrana, a su vez la interaccin receptor-ligando favorecer la internalizacin del elemento extrao. La fagocitosis ser ms efectiva si la partcula que debe ser interiorizada est opsonizada. Si est opsonizada quiere decir que est completamente rodeada por opsoninas (que pueden ser anticuerpos, receptores de patrones solubles, componentes del complemento, etc). En tercer lugar, el microorganismo interiorizado da lugar a un fagosoma, al que se le fusionarn diferentes lisosomas para as formar un fagolisosoma15. En cuarto lugar, en estos fagolisosomas se van a dar toda una serie de mecanismos microbicidas gracias a los cuales se destruirn los microorganismos. Parte de los pptidos fruto de la digestin que se produce pasarn al RE para interaccionar con molculas de MHC II (que despus pasarn al Golgi y se mostrarn en la membrana). En sexto y ltimo lugar, los productos de la digestin que no han pasado al RE sern liberados al exterior. Mecanismos microbicidas Los mecanismos microbicidas se pueden dividir en dos grandes categoras, los (a) dependientes del oxgeno, y los (b) independientes del oxgeno. En los fagolisosomas de los neutrlos (numricamente ms importantes) y de los macrfagos se va a dar la formacin de ROS (Eng: reactive oxygen species), lo que tambin recibe el nombre de explosin respiratoria (Eng: respiratory burst). Para formar las ROS (o ROI) 16 se precisa de la NADPH oxidasa de membrana. Adems de los ROI encontramos los intermediarios reactivos del nitrgeno, entre los cuales ha15 16

Atencin, existen microorganismos que evitan esta fusin y por tanto se pueden perpetuar intracelularmente. Intermediarios reactivos del oxgeno. 22

llamos el xido ntrico (NO), que se forma gracias al iNOS (xido ntrico sintasa inducible). El enzima iNOS se activa por el interfern gamma (entre otros elementos) y cataliza la siguiente reaccin:

L-arginina + O2 + NADPH iNOS NO + L-citrulina + NADP

Mecanismos dependientes del oxgeno Intermediarios reactivos del O2 (ROI): O*2- (anin superxido); OH* (radicales hidroxilo); H2O2 (perxido de hidrgeno); ClO- (anin hipoclorito). Intermediarios reactivos del nitrgeno: NO (xido ntrico); NO2 (dixido de nitrgeno); HNO2 (cido nitroso). Otros: NH2Cl (monocloramida). Mecanismos independientes del oxgeno Defensinas: forman canales permeables a iones que producen la lisis del microorganismo por desequilibrios inicos o por ujos osmticos. Enzimas hidrolticos: como la lisozima.

Citocinas proinamatorias. IL-1, IL-6, TNF

Nota. El anin superxido es bastante inestable, por lo que pasa a ser rpidamente perxido de hidrgeno.

La NADPH oxidasa de membrana est formada por diversas subunidades. Es la que se va encargar de reducir el oxgeno al anin superxido, el cual es bastante inestable y enseguida da lugar al perxido de hidrgeno. La mieloperoxidasa transforma el perxido de hidrgeno en el hipoclorito (empleando cloro). Atencin, la clula que forma estas especies reactivas del oxgeno no queda exenta de un dao colateral, pero es notablemente menor al que sufre el microorganismo interiorizado. Factores secretados por macrfagos activados Una vez que el macrfago queda activado, por ejemplo, por la interaccin entre un PAMP y su receptor, el macrfago libera/expresa toda una serie de elementos: - Citocinas. El macrfago liberar tanto citocinas como quimiocinas. Las quimiocinas median el reclutamiento de diferentes poblaciones leucocitarias en el foco infeccioso. La liberacin ser mayor en funcin de la intensidad y duracin de la infeccin (n de macrfagos activados durante ms tiempo). - Citocinas proinamatorias: IL-1, IL-6, TNF. - Citocinas antiinamatorias: IL-10, TGF. Son las tpicas de los macrfagos M2. Participan en la reparacin de los tejidos. Recordemos que esta clase de macrfagos aparecan en la fase nal de la infeccin, cuando stos detectan que hay dao tisular. - IL-12: ya ser estudiada con ms detalle ms adelante, pero comentar que promueve la diferenciacin de los T CD4+ en un perl TH1 e induce la produccin de IFN por parte de las NK. - Factores de crecimiento. Como el M-CSF (macrfagos) y el G-CSF (granulocitos) que modulan la hematopoyesis. - Receptores para la Fc de las Ig.

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Las citocinas proinamatorias a nivel local pueden actuar sobre distintos tipos celulares: macrfagos, cls. endoteliales, neutrlos, mastocitos, cls. dendrticas, etc. Adems, estas mismas citocinas pueden actuar a nivel perifrico. En clase se detall que la IL-617 puede estimular directamente al hgado para ste forme protenas de la fase aguda, como por ejemplo lo son la protena C reactiva o los receptores de patrones solubles. Si nos centramos en la C reactiva, sta se une a la fosfocolina de la bacteria y acta a modo de opsonina, por lo que el ACCIONS SISTMIQUES CITOQUINES PRO-INFLAMMATRIES macrfago/neutrlo de turno podr fagocitar la bacteria con una mayor efectividad.

Efectos sistmicos de las citocinas proinamatorias. En este caso se habla de la IL-6 a nivel heptico. El hgado formar diferentes protenas de la fase aguda, como la protena C reactiva o la MBL (manose binding lectin), que al igual que ocurra con la C-reactiva, se podr unir a elementos bacterianos a modo de opsonina.

Otros efectos de las citocinas proinamatorias a nivel perifrico son los siguientes: - Endotelio de la mdula sea: movilizacin de neutrlos (fagocitosis). - Hipotlamo: aumento de la temperatura corporal. Este aumento tiene como n evitar el crecimiento de aquellos microorganismos sensibles a la temperatura. - Grasa y msculo: produce toda una serie de cambios metablicos (movilizacin de protenas y de energa para permitir el incremento de la temperatura corporal que ordena el hipotlamo). - Cls. dendrticas: el TNF estimula su migracin hacia los ganglios linfticos y as iniciar la respuesta adaptativa. Un exceso de TNF provoca un edema sistmico (volemia, neutropenia, hipoproteinonemia) que puede llevar a un fallo multiorgnico y a la muerte.

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Puede ser formada por otros tipos celulares a parte de los macrfagos, pero en menor cantidad. 24

4. ANTGENOS DE LA INMUNIDAD ADAPTATIVA Antigenicidad e inmunogenicidad

Por antgeno entendemos aquella sustancia que puede ser reconocida directamente por un BCR (B-cell receptor/Ab de membrana) o por el TCR cuando forma un complejo con las molculas de MHC. La antigenicidad es la capacidad que tiene un compuesto para unirse a productos de la respuesta inmunitaria especca (anticuerpo y TCR). Un inmungeno es una sustancia-antgeno que es capaz de inducir una respuesta celular y/o humoral; es decir, generar esta transformacin:
Cl. B + antgeno cl. B efectora (cl. plasmtica) + cl. B de memoria Cl. T + antgeno cl. T efectora (TC, TH) + cl. T de memoria

La inmunogenicidad es la capacidad para generar una respuesta inmunitaria adaptativa. Finalmente, un hapteno es una sustancia pequea (<4 kDa) y de estructura sencilla que puede actuar a modo de antgeno pero que no genera una respuesta inmunitaria. En otras palabras, un hapteno es una sustancia antignica que no tiene inmunogenicidad. Un hapteno que se conjugue con un elemento ms grande puede llegar a ser inmunognico. Un ejemplo de hapteno sera la penicilina.
Factores que inuyen en la inmunogenicidad

Existen toda una serie de factores que inuyen en la inmunogenicidad. A continuacin se detallan en funcin de si son del propio antgeno o del sistema biolgico en el que es introducido. Empezaremos hablando de las caractersticas que hacen que el antgeno sea inmunognico. - Parecido con protenas propias. Conforme ms grande sea la distancia logentica entre las dos especies, mayores sern las diferentes estructurales entre la molcula propia (del huesped) y la molcula ajena, y por tanto aumentan las posibilidades de que la molcula ajena sea reconocida como ajena.
Excepciones: protenas conservadas (colgeno, citocromo c) o no accesibles al sistema inmunitario (esperma, tejido corneal).

- Tamao molecular. Existe una correlacin positiva entre tamao e inmunogenicidad.

No obstante, algunas molculas pequeas (<1 kDa) son inmunognicas. - Composicin qumica y estructura molecular. Conforme ms compleja y heterognea sea la sustancia, ms inmunognica ser (mayor cantidad de eptopos susceptibles a ser reconocidos por elementos del sistema inmunitario). La estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria contribuyen a la inmunogenicidad. Generalmente una protena o un polisacrido es ms antignico que un lpido. No obstante, un lpido es antignico si es empleado como hapteno y se combina con una protena transportadora. - Susceptibilidad de procesamiento y presentacin. Los procesos de procesamiento y de presentacin presentan diferencias entre individuos.
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- Forma. Hay una mayor inmunogenicidad en las formas desnaturalizadas o particuladas

que en las nativas o solubles. Por lo que respecta a caractersticas del sistema biolgico, a continuacin se describen algunas caractersticas que pueden determinar la inmunogenicidad del antgeno: - Genotipo del animal receptor. Los receptores MHC18 son muy importantes para que los linfocitos T sean activados. Si el antgeno no puede acoplarse al MHC, ni los T, ni los B indirectamente (recordemos que los T activan a os B), podrn actuar. - Dosis. Cada inmungeno tiene una curva dosis-respuesta particular. Por booster entendemos la aplicacin reiterada de un inmungeno. Una segunda aplicacin generar una respuesta mayor respecto a una primera, pero no superior a una tercera (as hasta un lmite). - Via de administracin. Existen diferentes vas de administracin de antgenos. La ms efectiva (en trminos de generar una respuesta inmunitaria) es la subcutnea (mayor cantidad de cls. de Langerhans y dendrticas).
Subcutnea > intraperitoneal > intravenosa > intragstrica

- Adyuvantes (adjuvare = ayuda). Son sustancias que se mezclan y se inyectan junto al

antgeno para as aumentar la inmunogenicidad del mismo. Algunos de estos adyuvantes pueden ser restos bacterianos, aluminio, aceite mineral, etc. Se desconoce el mecanismo de accin pero se sabe que el adyuvante: (a) aumenta la persistencia del antgeno; (b) incrementan las seales coestimuladoras; (c) aumenta la inamacin local; y (d) se estimula la proliferacin no especca de linfocitos.
Eptopo

Por eptopo o determinante antignico describimos una regin inmunolgicamente activa de un inmungeno que interacciona con receptores de membrana especcos para el antgeno o con un anticuerpo libre. En un antgeno puede haber ms de un eptopo. Existen diferentes clases de eptopos. - Eptopo secuencial o lineal. Formado por residuos de aminocidos continuos en la estructura primaria. - Eptopo no-secuencial o conformacional. Est formado por segmentos de aas discontinuos en la secuencia primaria pero cercanos en la estructura tridimensional de la protena. Huelga decir que esta clase de eptopo nicamente est presente en la estructura nativa (y no en la desnaturalizada). La mayora de Igs reconocen esta clase de eptopos. - Neoeptopo. Aquel generado por modicaciones a partir del eptopo original. Entre estas modicaciones encontramos la fosforilacin (de un residuo de serina, por decir algo) o la protelisis. Por lo general, los neoeptopos se generan tras modicaciones postraduccionales.

18

Los MHC pueden determinar la compatibilidad al realizar un transplante. Los genes que codican para estas protenas se caracterizan por tener diferentes polimorsmos, por lo que en la poblacin hay distintos alelos. 26

A pesar de que una protena compleja pueda disponer de ms de un eptopo (se pueden llegar a solapar), el sistema inmunolgico nicamente reconoce a algunos de ellos, los inmunodominantes19 . La determinacin de qu eptopo es inmunodominante tiene que ver con caracterstica topogrcas intrnsecas del antgeno y con los propios mecanismos reguladores del huesped.

Naturaleza de los determinantes antignicos. Los determinantes antignicos (que se muestran en amarillo, azul y rojo) pueden depender del plegamiento de las protenas (estructura tridimensional), as como de la estructura primaria. Algunos determinantes son accesibles en las protenas originales y se pierden con la desnaturalizacin (A), mientras que otros quedan expuestos slo al desplegarse la protena (B). De las modicaciones postsintticas, como la rotura de un enlace peptdico, surgen nuevos determinantes (C).

Haptenos

Como se ha comentado al inicio del tema, un hapteno es una molcula que por su reducido tamao y escasa complejidad, no genera una respuesta inmunitaria. Si queremos que estos haptenos ganen inmunogenicidad, se les suele acoplar una macromolcula a la que denominamos transportador. Cuando se generen anticuerpos contra el complejo hapteno-transportador, se podrn generar anticuerpos contra: (a) hapteno (que ya es un determinante antignico); (b) transportador; y (c) complejo-hapteno-transportador. Algunos ejemplos de haptenos son la penicilina, la aspirina, algunas drogas e incluso hormonas peptdicas como la hCG. En el caso de la penicilina, sta puede acoplarse a una protena y entonces generar una reaccin inmunitaria.
Complejo ternario

Para reconocer el antgeno, las cls. T deben formar un complejo ternario formado por los componentes que ahora se describirn. En primer lugar debe participar el TCR del LT, que
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Estrictamente, y segn las diapositivas, los eptopos inmunodominantes son aquellos que generan una respuesta ms fuerte en comparacin con el resto. 27

interaccionar con un MHC que ser de clase I o II en funcin de si el LT es citotxico o colaborador. Supongamos que es colaborador, por lo que se formar un dmero MHCII-TCR, y en el MHC est el antgeno de unos 20 a 30 aas. Este dmero presenta un anidad muy baja, por lo que necesitamos que un correceptor estabilice la unin. En este caso concreto, el correceptor es el CD4, que parte de la membrana del TH para interaccionar con una parte de la estructura terciaria del MHC II y as estabilizar la unin. El antgeno incorporado pasar por un procesado por el cual se generar el pptido que interaccionar especcamente con la molcula de MHC. Atencin, una molcula de MHC puede unir selectivamente pptidos diferentes con caractersticas estructurales comunes (la unin no es tan especca como la que se observa entre antgeno y anticuerpo. Los eptopos reconocidos por el TCR son generalmente motivos internos del antgeno. El eptopo para la clula B es un pptido que reacciona con el anticuerpo mientras que el eptopo para la clula T es un pptido que interacciona con el TCR y las molculas de MHC.
Caracterstica Interaccin con el Ag Unin de antgeno soluble MHC Naturaleza qumica del Ag Clula B Complejo binario: Ig de membrana - Ag S No se precisan Proteico, polisacrido, lipdico Clula T Complejo ternario: TCR - Ag - MHC No Se precisan Mayormente proteico, pero hay algunos lpidos y glicolpidos presentados por molculas MHC-like (CD1). Pptidos lineales internos producidos por el procesamiento del antgeno y posterior unin al MHC.

Propiedades del eptopo

Accesible, hidroflico. Secuencial o no secuencial.

Antgenos timo-dependientes y timo-independientes

Los antgenos timo-dependientes son aquellos que para activar a la clula B precisan de un contacto directo con el T colaborador (TH). Por el otro lado, los antgenos timo-independientes (TI) son aquellos que pueden activar a una clula B sin que haya contacto directo con una clula TH, aunque con la desventaja de que no se generan clulas de memoria. Encontramos dos grandes tipos de antgenos TI: - TI de tipo 1 (TI-1). Mitgenos/activadores policlonales de cls. B. Un ejemplo dentro de esta categora son los lipopolisacridos. A bajas concentraciones los LPS inducen una produccin de anticuerpos anti-LPS20, mientras que a altas concentraciones activan la divisin policlonal de LB. La alta concentracin provoca la proliferacin debido a que el exceso de LPS activa a los TLR4 presentes en la membrana de los LB. - TI de tipo 2 (TI-2). Activacin de LB por crosslinking de receptores mlg. Hay compuestos bacterianos, como la agelina (protena polimrica) que se puede unir a varios BCR a la vez (crosslinking). Los TI-2 no son mitgenos de las cls. B, activan a aquellas maduras e inactivan a las inmaduras. Sern necesarias las citocinas del TH para que haya una proliferacin eciente de la cl. B y para un cambio de isotipo diferente del IgM.
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Estimulan a aquellas cls. que tienen un BCR que reconoce a los LPS. 28

Granulomatosis inamatoria crnica. A causa de una alteracin en el gen que da lugar a la NADPH oxidasa, no se puede producir la explosin respiratoria que se de en neutrlos y macrfagos. Se forman abcesos y granulomas. Un granuloma es un ndulo de tejido inamado formado por macrfagos activos y LT, y se asocia a necrosis y brosis. Sndrome de Chediak-Higashi. Se observa que los lisosomas no pueden fusionarse con los fagosomas por un defecto en el gen LYST (gen regulador del trco lisosomal).

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5. INMUNOGLOBULINAS (I) Introduccin

Las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos (Ab) son el principal elemento de la inmunidad adaptativa y humoral. stos pueden aparecer en dos formas: (a) unidos a la membrana sobre la supercie de los linfocitos B (BCR); (b) en forma soluble en diferentes localizaciones (circulacin sangunea, mucosas, lquidos corporales en general). La interaccin entre la Ig y el antgeno es especca y directa.
Nota. No s exactamente por qu pero en la primera diapositiva del tema se vuelven a hablar de las caractersticas que identican a la respuesta adaptativa: (a) reconocer lo propio de lo ajeno; (b) especicidad antignica (gracias a la gran diversidad de linfocitos que tenemos); (c) diversidad (generada por recombinacin somtica); (d) memoria (la seleccin clonal genera tanto linfocito efectores como de memoria).

Las Ig son formadas por los LB y si se encuentran jadas a su membrana pasan a denominarse BCR. Cada cl. B forma un nico BCR con una determinada especicidad, aunque su membrana est repleta de stos (son copias). Aproximadamente disponemos de 109 tipos de LB, por lo que tambin tenemos 109 tipos de BCR y por tanto una gran diversidad (reconoceremos a prcticamente todos los antgenos). Comentar que cuando se produce la unin entre el Ag y el BCR, nos encontramos en la fase de reconocimiento de la inmunidad humoral. Si, por el otro lado, los encontramos ya en su forma soluble e interaccionan ya con el Ag, es que estamos en la fase efectora de la inmunidad humoral. Las glucoprotenas del plasma o el suero se clasican tradicionalmente por sus caractersticas de solubilidad en albmina y globulinas, aunque tambin se pueden clasicar por su migracin en un campo elctrico (electroforesis). La mayor parte de los anticuerpos se encuentra en el tercer grupo que migra ms rpido de globulinas, denominado gammaglobulinas (inmunoglobulinas).
Estructura de la inmunoglobulina

Todas las molculas de anticuerpo comparten las mismas caractersticas bsicas, pero muestran una variabilidad importante en las regiones que se unen a los antgenos. La estructura en comn es la siguiente: - Cadenas pesadas. Cada anticuerpo dispone de dos cadenas pesadas o H (heavy) idnticas, cada una de unos 50 kDa. Las cadenas pesadas pueden ser (M), (G), (A), (D) o (E). - Cadenas ligeras. Cada anticuerpo dispone de dos cadenas ligeras o L (light) idnticas, cada una de unos 25 kDa. Las cadenas ligeras pueden ser o . Como vemos, el peso total del anticuerpo es de aproximadamente unos 150 kDa. Las cadenas pesadas y ligeras estn unidas por puentes disulfuro y enlaces no covalentes formndose un
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heterodmero (H-L)2. Dentro del anticuerpo podemos hablar

de un fragmento cristalino (Fc) y de dos fragmentos de unin al antgeno (Fab). Esta divisin se realiz al tratar la Ig con papana, haciendo que sta se dividiera en una Fc y un Fab. Paralelamente, si se ataca a la Ig con mercaptoetanol (un reductor), el heterodmero se reduca (se perdan los enlaces disulfuro) y por tanto dividamos la Ig en sus cadenas pesadas y ligeras que la conforman.
Fragmentos proteolticos de una molcula de IgG. La digestin con papana produce la separacin de dos lugares de jacin al antgeno (fragmentos Fab) de la porcin de la molcula de IgG que se une al complemento y a los receptores Fc (fragmento Fc). La pepsina, en cambio, generara un nico fragmento de unin al antgeno bivalente, F(ab)2.

Tanto la parte N-terminal de las cadenas ligeras como la de las cadenas pesadas son regiones variables, son las que se unen al antgeno. El resto de la Ig es constante, y se encarga de interactuar con los receptores de la Fc de las Ig o con el sistema del complemento. Como en toda protena, en las Ig podemos distinguir diferentes niveles de estructura. La estructura primaria consiste en la suma de la secuencia peptdica de la regin variable y de la regin constante. La estructura secundaria es el plegamiento (principalmente) en hoja antiparalela. La estructura terciaria es cuando aparecen unos dominios globulares compactos (dominio Ig) que estn conectados con dominios vecinos por la cadena polipeptdica situada fuera de las hojas con plegamiento . Finalmente, la estructura cuaternaria es la interaccin entre los dominios globulares de las cadenas pesadas y ligeras adyacentes, formando dos dominios funcionales: (a) dominio de unin al antgeno, y (b) dominio de actividad biolgica/funcin efectora.
Dominio Ig

El dominio inmnuglobulina (Ig) est presente en una gran cantidad de protenas del sistema inmunitario (y otras que no pertenecen al mismo) adems de en las inmunoglobulinas. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas contienen estas unidadas homlogas que se repiten (dominios Ig), cada una de unos 110 aas de longitud y que se repliegan en una estructura globular. Un dominio Ig contiene dos capas de lminas , compuestas cada una de ellas por tres a cinco hebras de cadenas polipeptdicas antiparalelas. Las dos capas de hebras se mantienen unidas por un puente disulfuro21 y las hebras adyacentes estn conectadas por bucles cortos. Se cree que el dominio Ig facilita interacciones entre dominios no homlogos. Est presente en muchas molculas: receptores Fc, TCR, MHC, molculas de adhesin, etc. En las cadenas pesadas los dominios Ig estn repetidos 4-5 veces, mientras que en las cadenas ligeras es21

Dos cistenas separadas por unos 60 aas. 31

tn repetidos dos veces. Dentro de estos dominios Ig, dis-

tinguimos unos dominios variables (V) de otros que son constantes (C). - Dominios variables (V). Es el dominio de unin al antgeno, ahora veremos en qu se diferencian respecto a los dominios Ig constantes. Se localizan en el extremo N-terminal de las cadenas pesadas (VH) y de las ligeras (VL). - Dominios constantes (C). Determinan la actividad biolgica de la Ig. - IgA, IgD, IgG. CH1, regin bisagra (hinge), CH2, CH3. La regin bisagra hace que estas Ig tengan una mayor exibilidad. - IgE, IgM. CH1, CH2, CH3, CH4.
IgG secretada. Podemos ver los diferentes dominios Ig constantes y variables. Entre el CH1 y el CH2 est la regin bisagra que aumenta la exibilidad de la Ig. Vemos tambin como los puentes disulfuro estn tanto entre las dos cadenas como en el propio dominio Ig.

La mayora de las diferencias en la secuencia entre diferentes anticuerpos se limitan a tres breves segmentos de la regin V de la cadena pesada y a tres segmentos de la regin V de la cadena ligera. Estos segmentos se conocen como segmentos hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y que corresponden a tres bucles que sobresalen y que conectan las hebras adyacentes de las lminas que forman los dominios V de las protenas de las cadenas pesadas y ligeras de la Ig. Estos tres segmentos (CDR) estn juntos en el espacio tridimensional para formar una supercie de unin al antgeno (son complementarias al mismo, de ah que se hable de CDR). Las variaciones en la longitud y en la secuencia de las CDR son las responsables del amplio rango de especicidades que presentan los anticuerpos.

Regiones hipervariables en IgA. Como vemos, los aas ms variables se agrupan en tres regiones hipervariables: CDR1, CDR2 y CDR3. Los dominios Ig variables presentan 9 cadenas beta mientras que los dominios Ig constantes presentan 7 cadenas.

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Si lo pensamos, cada Ig dispone de cuatro dominios Ig variables: dos de la cadena pesada y dos de la cadena ligera. El resto de zonas del dominio Ig variable que presentan una menor variabilidad se conocen como regiones estructurales o frameworks (FR). Actan a modo de esqueleto donde se apoyan las CDR y hay cuatro por cada regin variable. Las regiones FR de diferentes anticuerpos se pueden superponer, cosa que no hacen las CDR.
Dominios constantes de las Ig

Hasta ahora hemos hablado de los dominios variables (V) tanto de la cadena ligera como de la pesada (VL + VH), que sern los que interaccionarn con el eptopo del antgeno. A continuacin hablaremos de las diferentes regiones constantes (C): - Dominios CH1 y CL. Son los que estn unidos a los dominios variables. Permiten extender los brazos Fab facilitando la interaccin con el Ag y aumentando al mximo la capacidad de rotacin. Mantienen unidos VH y VL por los puentes disulfuro entre las cadenas H-L. Contribuyen en la generacin de diversidad de los anticuerpos aumentando el nmero de interacciones estables posibles en VH y VL. - Regin bisagra (hinge). Es una regin rica en prolinas que une las regiones Fab y Fc de las cadenas pesadas (G), (D), y (A). Proporcionan exibilidad a la molcula, de tal manera que una Ig puede hacer que cada uno de sus dos brazos interaccione con un nico eptopo (que sern iguales entre s).
Flexibilidad de las molculas de anticuerpo. Los dos puntos de unin al antgeno de un monmero de Ig pueden jarse simultneamente a dos determinados separados por distancias variables. (A) Se representa una molcula de Ig unindose a dos determinantes muy separados sobre una supercie celular. (B) El mismo Ab est unido a dos determinantes prximos.

- Dominios CH2, CH3 y CH4. Son los que conforman la Fc. Son los dominios que interac-

cionarn con el sistema del complemento o con un receptor para Fc. - Dominios CH2 ( y ). Seran la bisagra. Funcin desconocida. - Dominios CH2-CH2 (IgA, IgD, IgG) y CH3-CH3 (IgE, IgM). Estn separados por cadenas de oligosacridos, lo que los hace ms accesibles. A su vez, estos oligosacridos otorgan especicidad en la interaccin con los receptores Fc o el complemento. - Dominios carboxi-terminal [CH3-CH3 (IgA, IgD, IgG) y CH4-CH4 (IgE, IgM)]. Es el dominio que determina si la Ig es soluble (se secreta) o si se ja a la membrana. Inmunoglobulina soluble = slg; inmunoglobulina de membrana = mlg.

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Isotipos de Ig

Un isotipo es una clase de anticuerpo determinada por la regin constante de la cadena pesada. Existen cinco isotipos, dos de ellos con diferentes subclases. Las diferentes clases o isotipos tienen propiedades sico-qumicas y biolgicas diferentes. Hay diferentes receptores Fc para las IgG, las IgA y las IgE: nicamente estas tres Ig podrn funcionar a modo de opsoninas y facilitar la fagocitosis.
Clase Cadena pesada Sublcases Cadena ligera IgG 1, 2, 3, 4 o IgM Ninguna o Frmula molecular 22 22 (22)n (22)n n=1o5 IgA 1, 2 o (22)n (22)n n = 1, 2, 3 o 4 IgE IgD Ninguna Ninguna o o 22 22 22 22 Isotipos de Ig. Vemos como las IgG tienen cuatro tipos de cadenas pesadas. stas, combinadas con las dos ligeras (, ) dan lugar a un total de ocho combinaciones. Las IgM y las IgA pueden formar polmeros: las IgM suelen formar pentmeros (aunque tambin pueden estar en su forma monomrica) y las IgA suelen estar en forma de dmeros (aunque tambin hay trmeros, tetrmeros...).

IgG Las cuatro diferentes subclases de IgG se distinguen por sus diferencias de tamao, de la regin bisagra y de la posicin de los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. Las diferentes ESTRUCTURA DE LES SUBCLASSES DIgGs subclases son codicadas por diferentes CHDIFERENTS con un 90-95% de homologa.

Subclases IgG. Cada una diferente funcin biolgica. Codificats per de diferents CH subclase amb un tiene 90-95% dhomologia Diferncia a nivell de tamany i de la regi bisagra i la posici dels ponts disulfur entre cadenes pesades 34

Difer Diferncies Activitat Biolgica

Las IgG son las inmunoglobulinas ms abundantes en el suero (10 mg/mL), representan el 80% del total de Igs. Predominan en la respuesta secundaria (en la primaria predominan las IgM). Entre las diferentes subclases de IgG hay, como es lgico, alguna diferencia por lo que respecta a la capacidad para realizar determinadas funciones: - Unin a receptores Fc. Las IgG con mayor capacidad de opsonizacin son las IgG1, les siguen las IgG3 y las IgG4. Las IgG2 no tienen una gran capacidad. - Activacin del complemento22. Aqu el orden cambia: las IgG3 tienen una mayor capacidad para activar el complemento, les siguen las IgG1 y despus las IgG2. Las IgG4 no tienen esta capacidad. - Barrera placentaria. Las IgG1, las IgG3 y las IgG4 pueden atravesar la barrera placentaria. Las IgG adems pueden unirse al receptor Fc neonatal (FcRn), incrementando su vida media hasta unos 23 das (la ms elevada de entre todas las inmunoglobulinas). Este receptor permite el paso de las IgG a travs de la placenta y del epitelio intestinal y, adems, es el resposable del incremento de la vida media de las IgG en el adulto. Por qu? El adulto expresa FcRn en el endotelio y en muchos tejido epiteliales. Este receptor permitir que las IgG interaccionen con l y sean endocitadas. Tras la endocitosis, parte del contenido endocitado ser degradado en lisosomas y otra parte (las IgG) volvern de nuevo al espacio extracelular. Esto protege a las IgG del posible efecto de las pro- Endocitosis de IgG. En clase se coment que en realidad el mecanismo era una pinocitosis: se capturan proteasas. tenas (entre ellas IgG) que estn a un pH siolgico En un inicio, el feto precisa de los (7,4) y al pH del endosoma (2,0 aprox.) se producir la anticuerpos de la madre para combatir a los interaccin entre las IgG y el FcRn, haciendo que cuando se envie de nuevo el endosoma hacia la memmicroorganismos, de ah que se transfundan brana para reciclar la bicapa lipdica, las IgG permaIgG por medio de este FcRn. Cuando el ni- nezcan intactas y se libren de la FcRn al subir el pH. o ya ha nacido, continuar recibiendo anticuerpos de la madre a travs de la leche, que captar gracias a los FcRn que hay en su epitelio intestinal. Progresivamente el nio podr ir formando sus propias inmunoglobulinas. IgD Las IgD tienen una concentracin bastante baja en suero (30 g/mL), representando el 0,2% de las Igs totales. Esta Ig junto a las IgM son las dos principales Igs que coexisten en la memA pesar de que ya lo daremos ms adelante en profundidad, comentar que el sistema del complemento es un mecanismo efector soluble que permite destruir los patgenos. 35
22

brana de los LB naive. Cuando stos son activados pasarn a seleccionar un nico isotipo. Las IgD tienen una vida bastante corta: aproximadamente de tres das. IgE Las IgE tienen una concentracin mucho ms baja (cien veces menor) que las IgD (0,3 g/ mL), aunque est aumentada en los individuos que padecen alergia. Las IgE pueden unirse a los receptores Fc de eosinlos, baslos y mastocitos. Recordemos que los mastocitos (y los baslos) tienen unos receptores Fc de muy alta anidad que les permite unir IgE a concentraciones muy bajas. Se las relaciona con mecanismos de hipersensibilidad y de defensa contra parsitos. A pesar de tener una vida corta (2,5 das), esta vida puede aumentarse si se ja al receptor Fc de los tipos celulares comentados. Cuando una IgE unida al receptor Fc de un mastocito (p. ej.) interacciona con un antgeno, se produce una va de sealizacin intracelular que culmina con la liberacin del contenido de los grnulos (histamina principalmente) del mastocito, dando lugar la reaccin de hipersensibilidad23. IgA

Las IgA, en su forma monomrica, representan entre el 10 y el 15% de las Igs del suero (3,5 mg/mL). Adems, la IgA es la principal inmunoglobulina de las secreciones de las mucosas, la leche, saliva, lgrimas, etc. La IgA es la que ms se produce a lo largo del da (5-15 g/da) SECRECI DIMMUNOGLOBULINES A LES MUCOS y tiene una vida media de unos 6 das. Las IgA se producen en los linfocitos B de la lmina propia y se secreta en forma de un dmero que se mantiene unido mediante una cadena J que se elabora de manera coordinada. En contraste, la IgA srica es normalmente un monmero que carece de cadena J. La cadena J facilita el transporte del dmero de IgA e impide su degradacin. Desde la lmina propia, la IgA debe transportarse a travs del epitelio hasta alcanzar la luz y esta funcin est mediada por el receptor de poli-Ig. Este receptor se sintetiza en las cls. epiteliales de las mucosas y se expresa en sus supercies basal y lateral. Transcitosi: Transport dIg a travs de lepiteli (gastrointestinal, Es una glucoprotena con cinco dominios Secrecin de IgG en las mucosas Transport depenent de (transcitosis). les propietats de la regi co extracelulares homlogos a los dominios Interacci Ig - Receptor Fc (Receptor Poly-Ig) Ig. La IgA dimrica secretada que contiene la cadena J se une al receptor de poli-Ig asociado
23

Las segundas exposiciones a alrgenos son siempre peores y ms peligrosas que las primeras. 36

a la membrana de las cls. epiteliales de las mucosas. Este complejo se endocita al interior de la cl. epitelial y se transporta activamente en vesculas a la supercie luminal. Aqu, el receptor de poli-Ig se escinde proteolticamente, sus dominios transmembranario y citoplasmtico se quedan unidos a la cl. epitelial y el dominio extracelular del receptor que transporta la molcula de IgA se libera a la luz intestinal. El componente del receptor asociado a la IgA se llama componente secretorio. IgM Las IgM representan un 5-10% de las Igs totales (1,5 mg/mL suero). Son las principales Ig que estn en la respuesta primaria y las primeras en aparecer en una respuesta humoral. Generalmente encontraremos las IgM en forma de pentmero (forma secretada). El pentmero se forma por medio de puentes disulfuro que unen C4/C4 y C3/C3. Las Fc quedan en el centro y las Fabs quedan en la periferia (interacciona hasta con 10 determinantes antignicos). Cada pentmero tiene un pptido adicional denominado cadena J que tambin se unir por puentes disulfuro. Las IgM activan al complemento de una manera mucho ms eciente que las IgG (respuesta de 100 a 1.000 veces superior). En su forma monomrica estn en forma de receptor de LB. Su vida media es de unos cinco das.
Determinantes antignicos de las Ig (pg. 88 Abbas)

Las molculas de anticuerpos son protenas y, por consiguiente, pueden ser inmungenas. Existen tres grandes clases de determinantes antignicos en las Ig: - Determinante isotpico. Son los determinantes presentes en las regiones constantes de las diferentes clases de cadenas pesadas y ligeras de las Ig. Los determinantes isotpicos nos dicen a qu isotipo pertenece una Ig. - Determinante alotpico. Son los determinantes presentes en las regiones constantes de cada uno de los alelos de las cadenas pesadas pesadas y ligeras de las Ig. - Determinante idiotpico. Son los determinantes exclusivos de molculas de anticuerpos individuales. En otras palabras: son los determinantes presentes en las regiones variables de las Ig. Un idiotopo es cada uno de los determinante antignicos de la regin variable, y un idiotipo es la suma de los idiotopos de un anticuerpo.

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6. INMUNOGLOBULINAS II Repertorio de anticuerpos

Cuando hablamos de un repertorio de anticuerpos nos referimos al sumatorio de especicidades antignicas, que puede superar las 108 en un individuo. Este repertorio tambin puede ser denido como el sumatorio de BCRs o el sumatorio de clones de los linfocitos B. Si disponemos de unos 25.000 genes, cmo es posible que tengamos semejante diversidad? Durante mucho tiempo esta pregunta se mantuvo sin responder. El modelo gentico que pretendiera explicar esta diversidad deba tener presente la estructura de las Igs, y concretamente dos puntos sobre la misma: (a) que tienen una cadena pesada y otra ligera, con una regin variable (V) y otra constante (C); (b) y que existen diferentes isotipos de Ig con la misma especicidad antignica (es decir, puede haber una IgM y una IgG con la misma especicidad antignica). Se bajaron algunas hiptesis: la teora de la lnea germinal, la de la diversidad somtica y el modelo (postulado) de los dos genes, que ya se acercaba bastante. La teora de la diversidad somtica propona que la recombinacin genmica que explicaba la gran especicidad de Igs se daba en el LB diferenciado, sin explicar por qu los cambios genmicos se reducan a una zona en concreto. El modelo de los dos genes propona que haba un gen para la regin variable y otro para la constante (pero no lo pudieron demostrar). No fue hasta 1976 en que Tonegawa y Hozumi propusieron el modelo de la reordenacin de los genes de las Igs.
Modelo de Tonegawa y Hozumi

El modelo de la reordenacin de los genes de las Igs se demuestra comparando el genoma de una clula embrionaria con el de una clula de mieloma (cl. plasmtica inmortal). Este genoma fue digerido con enzimas de restriccin y los productos de la digestin se hicieron pasar por un gel de agarosa para hacer una separacin diferencial por tamao. A continuacin se aadi una sonda que reconoca una parte del gen que codica para la regin V de la Ig (Southern Blot). Se observ como el fragmento con la sonda tena un tamao distinto en funcin de si se trataba del genoma digerido de la cl. embrionaria o de la cl. de mieloma. En la cl. del mieloma, por la recombinacin, se haba omitido un punto de restriccin, por lo que la digestin de los dos genomas es distinta. Se llegaron a dos conclusiones: - Genes separados. Los genes que codican para las regiones V y C de las inmunoglobulinas son distintos. - Recombinacin somtica. El DNA genmico de los genes de las Ig se reordena a lo largo de los diferentes estadios de maduracin de la cl. B a partir de cl. madre. Como no se da en la lnea germinal, este proceso se denomina recombinacin somtica.
Organizacin de los genes de las Igs

La regin variable se codica a partir de mltiples segmentos gnicos V, D y J. La VH se construye a partir de segmentos V, D y J y la VL se construye a partir de segmentos V y J. Por el
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otro lado, la regin constante se codica a partir de un nmero limitado de segmentos gnicos C. El locus que codica para la cadena pesada est en el cromosoma 14, el locus que codica para la cadena ligera () est en el cromosoma 2, y el locus que codica para la cadena ligera () est en el cromosoma 22. En cada locus habrn diferentes genes, separados entre s, algunos de los cuales se juntarn para dar lugar a un gen que codicar una parte de la inmunoglobulina; esto es lo que se conoce como la organizacin multignica de los genes de las inmunoglobulinas. En el extremo 5 de cada uno de los locus de las Ig hay un grupo de segmentos gnicos V. Los nmeros de segmentos de los genes V varan mucho entre los diferentes locus de las Ig y de unas especies a otras. P. ej., hay aproximadamente 35 genes V en el locus de la cadena ligera humana y aproximadamente 100 genes funcionales en el locus de la cadena pesada humana. Upstream respecto a los segmentos V encontramos un segmento gua (L, de leader) que codica los 20-30 aas N-terminales de la protena traducida. Estos aas son moderadamente hidrfobos y constituyen el pptido seal. Downstream respecto a los segmentos V estn los segmentos J. nicamente en el locus que codica para la cadena pesada encontramos unos segmentos D entre los segmentos V y J.

Organizacin de los locus de las Ig. Se muestran los locus de la cadena pesada, la cadena ligera y la cadena ligera . nicamente se han dibujado los genes funcionales, los pseudogenes se han omitido. Los exones y los intrones no estn dibujados a escala. Cada gen CH se ilustra en una sola caja, pero est formado por diferentes exones (tal y como se muestra para C). L = leader; V = variable; D = diversity; J = joining; C = constant, y enh = enhancer.

Hasta ahora hemos visto la ubicacin de los segmentos gnicos que dan lugar a zonas variables. Ahora bien, qu ocurre con las zonas constantes? Pues que se codican a partir de diferentes segmentos C que estn hacia el extremo 3 de los locus de las Ig. En los seres humanos, el locus de la cadena ligera tiene un nico gen C (C), y el locus de la cadena ligera tiene cuatro genes C funcionales (C). El locus de la cadena pesada de las Ig tiene nueve genes C (CH), dispuestos en una organizacin en tndem, que codican las regiones C de los nueve isotipos y subtipos diferentes de las Ig (C, C1, C2, C3, C4, C1, C2, C y C). El orden de los genes CH est relacionado con la expresin secuencial de los diferentes isotipos a
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lo largo de la maduracin de los linfocitos B. Si nos jamos, los dos primeros genes C en expre-

sarse son el C y el C, y precisamente el LB naive expresa en su membrana los isotipos IgM e IgD.
Recombinacin de los genes de las Igs

Una vez hemos descrito la anatoma de los locus de las Igs veremos cmo se produce la recombinacin (la unin de los diferentes fragmentos gnicos). Estrictamente lo que suceder es una serie de rupturas bicaternarias en los extremos de ADN de los fragmentos gnicos y la posterior unin para producir genes funcionales. - Cadena pesada. En la cadena pesada se producir una primera rotura y una posterior unin que dar lugar a la formacin de un complejo D-J. Este primer reordenamiento se da en el DNA germinal (precursor del linfocito). El siguiente paso ser la unin V-DJ. Esta reordenacin de segmentos gnicos separados funcionalmente da lugar al gen funcional que perseguamos formar. Lo que hemos hecho ha sido unir un fragmento V con uno D y otro J, y toda una ristra de genes C downstream respecto a J. Estos genes C que tenemos nos van a permitir generar una Ig con la misma regin variable pero con diferentes regiones constantes (V + D + J = VH). Este gen ser transcrito y nos dar un trnscrito primario que pasar por un proceso de splicing posterior. - Cadena ligera. En la cadena ligera suceder exactamente lo mismo que en la cadena pesada, slo que como el locus que da lugar a las cadenas ligeras no tiene fragmentos gnicos D, nicamente se da la unin entre el V y el J: unin VJ (V + J = VL).

Formacin de la unin VJ (cadena ligera). A mi parecer, el DNA recombinado dar lugar a un gen funcional con una zona V(D)J (en la ilustracin parece ser que esta recombinacin se ha dado en el locus de la Ig de la cadena ligera ) y varios (o uno solo) exones C, pudiendo generar Igs con la misma zona variable y diferente zona constante (isotipos de Igs distintos con la misma especicidad antignica.

Para que las rupturas bicatenarias se produzcan en unos puntos concretos y no en zonas aleatorias del genoma existen unas seales: las secuencias de reconocimiento de recombinacin (RSS; recombination signal sequences). Estas secuencias estn localizadas en direccin 3 a cada uno de los segmentos de los genes V, en direccin 5 a cada uno de los segmentos J y ranqueando a cada uno de los segmentos D a ambos lados. Las RSS estn formadas por una
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secuencia muy conservada de 7 nucletidos, denominada heptmero, localizada adyacente a la

secuencia codicadora, seguida por un espaciador de exactamente 12 o 23 nucletidos no conservados, seguido por una secuencia de 9 nucletidos muy conservada y rica en AT denominada ELEMENTS nonmero. Los I espaciadores 12 y de 23 nucletidosSOMTICA corresponden a aproximaGENS DE de LA RECOMBINACI damente una o dos vueltas de hlice de DNA, respectivamente, y probablemente sitan dos heptmeros distintos en posiciones que son accesibles simultneamente a las enzimas que Seqncies de reconeixement de recombinaci (RSS, recombination signal sequences) catalizan el proceso de recombinacin. Flanquegen cada fragment V, D i J germinal i sn senyals pel reordenarment gnic

Expressi especfica a limfcits (cl.lula pro-B i pre-B) 1 activador la recombinaci (RAG-1 , recombination-activating 1) debiLosGen enzimas que se de encargan de efectuar los cortes en determinadas partesgene del DNA Gen 2sealadas activadorpor de la (RAG-2 , recombination-activating gene 2) damente lasrecombinaci secuencias RSS son las recombinasas V(D)J. Tenemos dos recombi Terminal deoxinucleotidil transferasa ( TdT , terminal deoxynucleotidy tranferase ) nasas (RAG-1 y RAG-2; Eng: recombination-activating gene), ambas necesarias, que se expreExpressi especfica a limfcits (cl.lula pro-B) san en un estadio concreto de la maduracin del linfocito B (clulas pro-B y pre-B). La re Diferents gens del mecanisme de reparaci del DNA combinacin est regulada por la presencia o no de estos enzimas, por lo que la recombinaExpressi ubqua cin se dar,nicamente en esos dos la cl. IV B. DNA-PK Artemis, Ku70/Ku86 , estadios XRCC4,de Lligasa Ademas de estas dos recombinasas, hay otros enzimas que son importantes para que se d la recombinacin: - Terminal deoxinucleotidil transferasa (TdT). Tras el corte del DNA introduce nucletidos en el extremo recin cortado, por lo que se genera variabilidad. Atencin, este enzima nicamente est presente en la cl. pro-B. Podramos llegar a prescindir de este enzima, pero del resto no. - Genes del mecanismo de reparacin del DNA. Son genes que se expresan de manera constitutiva y que sern importantes para reenganchar los extremos cortados del DNA. Estos genes codican para las siguientes protenas: DNA-PK, Artemis, Ku70/Ku86, XRCC4 y la ligasa IV.
Proceso de la recombinacin de los genes de las Igs

RSS de vuelta nica o de doble vuelta. La presencia de un espaciador con ms o menos nucletidos permite el Recombinases que RSS sea de vueltaV(D)J nica o de doble vuelta.

En primer lugar se da la sinapsis, que consiste en la aproximacin de los dos segmentos gnicos que se quieren acoplar. Para que se produzca esta sinapsis tiene que haber un reconocimiento de las seales RSS por parte de RAG-1/2. Este reconocimiento llevar a la formacin de un bucle cromosmico que se va haciendo mayor a medida que las dos secuencias gnicas, en un principio separadas, se van acercando. Atencin, la recombinacin entre dos segmentos nicamente ser posible si se da la regla 12/23. Esta regla dictamina que la recombinacin se da entre un segmento con un RSS de una vuelta y otro segmento con un RSS
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de doble vuelta. Con esto aseguramos que: (a) no se unan dos fragmentos del mismo tipo (p. ej., D-D), (b) y que se produzca una unin ordenada (V-D-J).

Regla 12/23. Observamos como los diferentes fragmentos V, D y J presentan RSS de tipos alternos (con espaciador de 12 y de 23). Por ejemplo, un segmento gnico V del locus que da para la cadena pesada (H) presenta un RSS de doble vuelta en el extremo 3. Este RSS tendr que interactuar obligatoriamente con uno de vuelta nica, que precisamente lo encontramos en 3 y 5 del segmento D.

Una vez el bucle se ha formado, se da la escisin, que consiste en la rotura de las dos cadenas de DNA. El corte lo realizarn las RAG-1/2 en el punto entre las secuencias codicadoras y su secuencia RSS. Sobre estos extremos habr un procesado que consistir, por ejemplo, en la adicin de nucletidos por parte de la TdT y as generar una mayor diversidad. Finalmente se dar una unin por los mecanismos de reparacin de DNA que tiene la propia clula. Como hemos dicho, para que se d la recombinacin nos tendremos que librar de una parte del DNA en el que encontramos tambin las secuencias RSS. Si los dos fragmentos gnicos que deben ser unidos se encuentran en la misma direccin, se realiza una unin por delecin en la que se forma un anillo residual de DNA que contiene las dos secuencias RSS. En cambio, si los dos fragmentos a unir estn orientados en direcciones opuestas, se realizar una unin por inversin (sin formacin de anillo de DNA).

Unin por delecin (izquierda) y unin por inversin (derecha). 42

Cuando se produce la escisin entre la RSS y la secuencia codicante, RAG-1/2 corta una de las dos hebras del DNA. Esto deja un extremo OH 3 que realizar un ataque nucleoflico sobre la otra cadena, para despus formar una horquilla covalente (un bucle). Este bucle se formar en los dos extremos de DNA que deben ser enganchados (osase, entre los dos extremos de las dos regiones codicantes que se enfrentan entre s). Estos dos bucles sufrirn un corte aleatorio por medio de una endonucleasa, generando lugares de adicin para las polimerasas. Estas polimerasas irn aadiendo nucletidos complementarios dando lugar a secuencias palindrmicas (los nucletidos aadidos se denominan nucletidos-P). Paralelamente, en los extremos de las cadenas, podemos aadir nucletidos nuevos, hasta 15, gracias a la accin de ADDICI DE NUCLETIDS-P i -N EN LA UNI V(D)J: DIVERSITAT la TdT (nucletidos-N). Estos dos mecanismos generan variabilidad ya que se forman aleatoriamente secuencias ausentes en la lnea germinal. Addici de Nucletids-P Addici de Nucletids-N

La ruptura del bucle genera llocs per laddici de nucletids (ruptura aleatria)

La ruptura del bucle genera llocs per laddici de nucletids (ruptura aleatria)

Polimerases afegeixen nucletids complementaris generant seqncies palindrmiques (Nucletids-P)

TdT afegeix nucletids-N (fins 15)

i enzims de reparaci afegeixen nucletids complementaris

Adicin de nucletidos-P (izquierda) y de nucletidos-N (derecha). La horquilla o bucle (hairpin) se form por la rotura inicial de una de las hebras de DNA y el posterior ataque nucleoflico realizado por sta hacia la otro hebra. La ruptura al azar despliega el bucle, permitiendo la accin de las polimerasas y de la TdT.

Generaci aletoria de seqncies absents en la lnia germinal

La adicin de nuevas secuencias queDiversitat no estaban presentes en la lnea germinal pueden generar, efectivamente, una utilsima diversidad. No obstante, tambin es probable que la incorporacin de nuevos nucletidos modique los codones de tal manera que, al transcribir el gen y traducir el mRNA, nos encontremos con un codon de STOP en medio de la secuencia. Esto es lo que se conoce como reordenamiento no productivo. Si esto no sucede, es decir, si se genera una secuencia de aas alternativa a la secuencia original, hablamos de un reordenamiento productivo. Existe una exibilidad de unin entre los diferentes fragmentos gnicos: sta no debe darse por unos nucletidos especcos. Toda esta variabilidad explica, por ejemplo, la presencia de las zonas CDR en los dominios Ig de las zonas variables de las cadenas pesadas y ligeras de las Ig. A modo de resumen, recordemos que los reordenamientos V-J, D-J y V-DJ se dan completamente al azar y que eso tambin hace que la generacin de las especicidades de los anticuerpos sea al azar. Durante la ontogenia de la cl. B se observa un proceso de recombinacin secuencial. En primer lugar se reordena la regin variable de la cadena pesada: primero se da la unin DJ y despus la interaccin V-DJ. As generamos una nica secuencia gnica VDJ. Por el otro
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lado se da el reordenamiento de la regin variable de la cadena ligera, que si recordamos nicamente dispone de segmentos V-J (por lo que se genera una nica secuencia gnica VJ). Reiteramos, ya que es importante tenerlo presente, que estos sucesos ordenados tienen lugar, cada uno de ellos, al azar.
Cl. madre hematopoytica Cl. linfoide (reordenamiento cadena pesada) Cl. pro-B (n reordenamiento cadena pesada) Cl. pre-B (reordenamiento cadena ligera) Cl. B inmadura

Atencin, las TdT se expresan en el estadio de pro-B y ya est, por lo que en la cadena ligera no se podrn aadir nucletidos-N.
Exclusin allica

La exclusin allica explica que nicamente se exprese el gen reordenado de uno de los dos alelos. Es por eso que cada cl. B posee una especicidad antignica nica (expresa un solo tipo de receptor). En primer lugar se empieza con el reordenamiento de la cadena pesada. Si ste es productivo, se inhibe el otro alelo. Si, por el otro lado, el reordenamiento no es productivo, se inicia el reordenamiento con el otro alelo. Si sigue sin darse un reordenamiento productivo, la clula entrar en muerte celular. Recordemos que la cadena pesada ser en un inicio del tipo y que despes se producir el cambio de isotipo. Supongamos que se obtiene una cadena productiva. Ahora pasaremos a formar una cadena ligera productiva. Para esta ocasin tendremos cuatro oportunidades (2 alelos y otro ; generalmente se empieza con el ). En el momento en que se produzca una reordeBASE PER A LESPECIFICITAT ANTIGNICA NICA DE LAquedaban CL.LULA namiento productivo de la cadena ligera, se inhibirn el resto de alelos que por B EXCLUSI AL.LLICA recombinar (de cadena ligera).
Cadena inhibeix el reordenament del segon al.lel i indueix el reordenament de la cadena i inhibeixen el reordenament del segon al.lel k i indueixen el reordenament de la cadena i inhibeixen el reordenament del la cadena i inhibeix el reordenament del segon al.lel

Exclusi Noms sexpressa el gen reordenat dun dels al.lels.nica. Exclusin allica. al.llica: Este mecanismo asegura que el linfocito B exprese una especicidad antignica 44 Mecanisme pel qual la cl.lula B posseeix una especificitat antignica nica

Un linfocito B no saldr de la mdula sea si reconoce a un antgeno propio. Si eso se produce, se podr dar lo que se conoce como edicin del receptor, que consiste en que se volver a producir una recombinacin del gen que codica para la cadena ligera (se vuelve a formar un segmento VJ). Si ste procedimiento da lugar a una unin no productiva o a una productiva que sigue reconociendo a un antgeno propio, la clula entrar en apoptosis.
Mecanismos generadores de diversidad.

Hasta ahora hemos visto varios mecanismos que generan diversidad: (a) los mltiples segmentos V, D y J en la lnea germinal; (b) la diversidad de combinacin V-J y V-D-J; (c) la exibilidad de unin V-J y V-D-J; (d) la adicin de nucletidos P y N; (e) la combinacin de las asociaciones de cadenas pesadas y ligeras; y, nalmente, (f) la hipermutacin somtica. Hipermutacin somtica Como su nombre indica, la hipermutacin somtica consistir en un incremento de las mutaciones en la regin variable ordenada. Para hacernos una idea, cuando replicamos el DNA aparecen mutaciones cada 108 pb; en la hipermutacin somtica esta frecuencia aumenta hasta 103 pb. Esto quiere decir que cada dos divisiones aparece una mutacin. Este incremento de mutaciones (hipermutacin) es somtica porque se da una vez el gen que codica para la cadena, ligera o pesada, se ha recombinado. Concretamente, el momento de produccin de estas mutaciones se da cuando la clula B es activada (al interaccionar con un antgeno) y empieza a proliferar. Adems de comentar que las mutaciones afectan a la zona variable, se seleccionan aquellas que afectan a las regiones CDR. Se ir haciendo una seleccin positiva que consistir en que nicamente aquellas cls. B que presenten una mayor capacidad de interaccin con el antgeno (mayor anidad), sobrevivirn. La respuesta secundaria (o terciaria y sucesivas) ser ms efectiva y fulminante precisamente por eso: se han seleccionado previamente a las cls. B que interaccionan mejor con el antgeno. La variabilidad de CDR1, CDR2 y CDR3 est determinada por el segmento variable y por la hipermutacin somtica (V en CDR1-2; VDJ o VJ en CDR3). Adems, la variabilidad en CDR3 est determinada por otros factores adicionales: la exibilidad de unin y la adicin de nucletidos-P y nucletidos-N.
Clculo terico de la diversidad de anticuerpos

Si tenemos en cuenta la cantidad la cantidad de segmentos V, D y J en los locus para la cadena pesada y las dos ligeras, nos sale (por combinatoria) una diversidad del orden de 106. Para llegar a valores de 109-1011 precisamos de la exibilidad de unin, la adicin de nucletidos P y N, y de la hipermutacin somtica.

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7. INMUNOGLOBULINAS III Expresin de las inmunoglobulinas

Como sabemos, las clulas B proceden, en primera instancia, Cl. madre hematopoytica (HSC) de la clula precursora hematopoytica pluripotencial (HSC; Eng: hematopoietic stem cell). sta da lugar al precursor linfoide y ya en esta clula se va a dar un primer reordenamiento del gen de Clula linfoide la cadena pesada. Se llegar al estadio de pro-B en el que se Reordenamiento parcial H proseguir con dicho reordenamiento y, cuando se nalice, ya hablaremos de una clula pre-B que expresa en su membrana Cl. pro-B la cadena pesada . En el paso de pre-B a la clula B inmadura se Reordenamiento completo H da el reordenamiento del gen de la cadena ligera y la clula B inmadura expresar una IgM en su membrana. Finalmente, la cCl. pre-B
lula B madura expresa en su membrana tanto IgM como IgD
Reordenamiento completo L (mIgM + mIgD). Por tanto, como podemos observar, podemos llegar a B inmadura mIgM discernir entre los diferentes estadios de cls. B nicamente Cambio procesado RNA observando las Igs que expresan en su membrana. Una vez se llega al estadio de B madura, y si no reconoce a un Ag propio, B madura mIgM mIgD saldr en forma de B naive de la mdula sea en direccin a los ganglios linfticos, donde podrn interactuar con un Ag, Maduracin de las cls. B. activarse y diferenciarse. Las cls. B naive pueden activase (al interaccionar con el Ag) y dar lugar: (a) cl. plasmtica sin cambio de isotipo (expresa IgM); (b) cl. plasmtica con cambio de isotipo (expresar IgG, IgA o IgE); (c) cl. B de memoria de varios isotipos (no a la vez). La B naive pasar a ser un tipo de plasmtica generadora de Igs en funcin de la citocina con la que haya contactado.

Cambio de isotipo de la cadena pesada

Una vez tenemos el gen funcional para la cadena pesada, ste ser transcrito y obtendremos un mRNA con varios exones. Uno de estos exones ser producto de la unin VDJ y dar lugar al dominio variable de la cadena pesada (VH). A continuacin se observan exones que dan lugar a los diferentes dominios constantes, primero los C y despus los C. La formacin de IgM o de IgD depender del splicing diferencial y de la poliadenilacin (poli(A)). La cadena de poliadeninas nos indica el nal del trnscrito, por lo que todo lo que quede downstream respecto a sta no ser traducido. Existen cuatro puntos de poli(A): - Poli(A) 1. Est tras el segmento que codica la C4. Si se efecta aqu la poliadenliacin formaremos IgM soluble (al menos su cadena pesada; as en todos los casos). Estrictamente lo correcto es decir que formamos H secretada. - Poli(A) 2. Est tras el segmento que codica para la parte transmembrana de la mIgM. Si se efecta aqu la poliadenlizacin formaremos H de membrana. - Poli(A) 3. Est tras el segmento que codica la C3. Obtendremos H secretada.
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Mecanisme: : processament diferencial del RNA poliadenilaci i splicing diferencial

- Poli(A) 4. Est tras el segmento que codica para la parte transmembrana de la mIg.

Si se efecta aqu la poliadenilacin fomaremos H de membrana

Transcrit primari RNA de la cadena H

Poli-A Lloc 1

Poli-A Lloc 2

Poli-A Lloc 3

Poli-A Lloc 4

H secretada

H membrana

H H secretada membrana

Trnscrito primario de la cadena H. En funcin del lugar donde se produzca la poliadenilacin, obtendremos DIgM I IgD un isotipo u otro (M o D) y su formaCOEXPRESSI soluble o de membrana.

Apenas hay IgD soluble, por lo que apenas se usa el tercer punto de poli(A). Si, por ejemplo, se efecta la poliadenilacin en el cuatro punto, se evitarn los segmentos que codican para elementos de H gracias al splicing diferencial. Con esto hemos podido explicar cmo se forma IgM o IgD. Qu ocurre con el resto de isotipos? Pues tendr que haber una especie de recombinacin. Recordemos que el cambio de isotipo de la cadena pesada se da una vez la cl. B ha entrado en contacto con un antgeno y que en virtud a este cambio, un mismo segmento VHDHJH se combinar con cualquier CH. Para que esta recombinacin pueda darse tendrn que haber unas secuencias de cambio que anqueen las CH (excepto las C) y que puedan ser reconocidas por las recombinasas de cambio. Las secuencias de cambio son regiones de entre 2 y 10 kb en las que aparecen secuencias repetidas (p. ej., TGGGG). Las citocinas sern las responsables de dirigir el cambio de isotipo hacia uno en concreto. Un ejemplo sera el TGF, muy presente en las mucosas, que induce la formacin de IgA. Atencin, la recombinacin que se produce Recombinacin para un cambio de isotipo. con el n de generar un isotipo en concreto hace que se pierda DNA en el que hay informacin para codicar otros isotipos. Eso quiere decir que, por ejemplo, cuando formamos IgE no podemos formar IgG ya que la informacin que codica para H ha sido omitida.
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Sntesis, ensamblaje y secrecin de Igs

La traduccin de los mRNAs de las cadenas H y L se da en el RER (translocacin proteica). Se romper el pptido seal y el ensamblaje por puentes disulfuro se dar en el propio RER. En el caso de las IgM, en primer lugar se forma el heterodmero H-L y despus se forma (HL)2. En cambio, en el caso de las IgG, primer se forma un monmero H-H, despus formamos H2L y nalmente H2L2. El RER emitir vesculas que irn hacia el Golgi, donde las Igs sufrirn un procesado (glicosilacin) y nalmente la vescula emitida por el trans Golgi se fusionar con la membrana y secretar la Ig. En el caso de mIgs, la Ig ya estar insertada en la vescula emitida por el Golgi.
Regulacin de la transcripcin de los genes de las Igs

Lo que suceder cuando se produzca la recombinacin es que aproximaremos al promotor con un enhancer, potenciando la expresin del gen. Se coment que los promotores los podemos encontrar upstream (5) respecto a la secuencia L de cada VH y VL, antes del cluster de genes Jk y en cada uno de los genes DH. Tambin se habl de cajas TATA, el octmero-1 y el octmero-2 (especco de la cl. B). En cuanto a elementos moduladores (enhancers o silenciadores), se destac el E2A, ubicado entre la regin V y C del gen. Este incremento de la expresin de los genes de las Igs puede ser contraproducente en el caso de que se produzcan translocaciones cromosmicas. Por ejemplo, en el linfoma de Burkitt24 hay una translocacin del gen c-myc (relacionado con la proliferacin celular) al locus del gen de la cadena pesada de las Igs. Esto hace que la clula sea inmortal: linfoma de cls. B. Por lo general, la translocacin de genes reguladores de la proliferacin o apoptosis (protooncogenes) en los locus de las Igs causa un aumento de su expresin y pueden ser la causa de cncer. Otro mtodo de regulacin de la expresin de Igs es ya a nivel postranscripcional: vida media del RNA, traduccin, mecanismos post-traduccionales y el ensamblaje de las cadenas H y L. Inhibicin de la expresin en cls. T Los linfocitos T reordenan los genes del TCR por medio de los mismos mecanismos por los que se reordenan los genes de las Igs en los linfocitos B (RAG-1/2, RSSs), pero cada proceso da un nico tipo celular. Por tanto, deben haber mecanismos reguladores de esta especicidad. Esto an no est del todo respondido, pero se baraja la posibilidad de la existencia de una protena inhibidora de la unin V-J que se expresara nicamente en LT.

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Las personas con este linfoma suelen estar infectadas con el virus de Epstein-Barr. 48

8. ONTOGENIA DE LOS LINFOCITOS B Introduccin

Los linfocitos B se forman, antes del nacimiento, en el saco embrionario, el hgado y en la mdula sea. Tras nacer nicamente se formarn en la mdula sea. El desarrollo de una clula B pasa por tres etapas bien diferenciadas, que tambin suceden en diferentes regiones del organismo: (a) maduracin, que se da en la mdula sea; y (b) activacin y (c) diferenciacin, que se dan en la periferia (ganglios linfticos).
Maduracin de las cls. B

Como ya hemos dicho, la maduracin de la clula B es un proceso que se da en la mdula sea. Como ocurre con todas las clulas sanguneas, partiremos del precursor hematopoytico pluripotencial (HSC). Al principio de la maduracin, la interaccin entre protenas de membrana de los linfocitos que estn madurando y las que estn en las clulas troncales de la mdula sea ser fundamental. Concretamente, la interaccin ser importante en las etapas de precursor linfoide y clula pro-B (y aqu distinguimos entre un estadio inicial y otro nal). Se destac el papel de IL-7 en esta maduracin.25
Genes de la c. pesada Clula madre Pro-B temprana Pro-B tarda Pre-B grande Pre-B pequea B inmadura B madura Lnea germinal Reordenamiento D-J Reordenamiento V-DJ VDJ reordenado VDJ reordenado VDJ reordenado VDJ reordenado Genes de la c. ligera Lnea germinal Lnea germinal Lnea germinal Lnea germinal Reordenamiento V-J VJ reordenado VJ reordenado Ausente Ausente Ausente Cadena en la supercie como parte del receptor pre-B Cadena en el citoplasma y en la supercie IgM expresada en la supercie celular IgD e IgM a partir de un procesamiento alternativo de trnscritos de cadena H Ig de supercie

Estadios de desarrollo de la cl. B. En verde se muestran aquellas clulas en que hay expresin de RAG-1/2 (hay recombinacin) y adems se expresa la TdT (adicin de nucletidos-N). Por contra, en naranja se muestra aquella etapa del desarrollo en que si bien se expresan RAG-1/2 que permiten la recombinacin, no hay expresin de TdT.

Como se observa en la tabla superior, cada etapa de maduracin se caracteriza por el reordenamiento o no de la cadena pesada o ligera. Este reordenamiento controla la maduracin de los LB. La expresin de las protenas que regulan el reordenamiento est programada a lo larEn las diapositivas adems se habla del SDF-1/PBSF (cell-derived factor/pre-B growth factor stimulating factor) que es secretado por las clulas estromales y que se trata de una quimiocina. Creo que es la propia IL-7. 49
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go del desarrollo (TdT nicamente en pro-B). Debemos tener presente que, por ejemplo, la clula al llegar al estadio de pro-B detendr su proliferacin y se producir el reordenamiento de la cadena pesada, despus seguir proliferando hasta pre-B26 y ah se detendr para expresar los enzimas que le permitan recombinar el gen de la cadena ligera. En cuanto al receptor de la cl. B, ste se ir formando por partes, ya que desde un inicio no disponemos de todos sus componentes (el gen de la cadena ligera y de la pesada recombinados). Por lgica, nada ms llegar al estadio de pre-B, la clula nicamente dispondr de la cadena pesada en su membrana (VHDHJHC). A modo de sucedneo de cadena ligera, se le une la surrogate light chain, formada por dos protenas: Vpre-B y 5. sta ltima (5) ser esencial para que el desarrollo de la cl. B prosiga y que por tanto haya la expresin de RAG-1/2 que recombinen el gen de la cadena ligera. Una vez llegamos al estadio de cl. B inmadura, que ya tiene IgM en la membrana, podr interaccionar con un antgeno. Fruto de esta interaccin se darn tres respuestas: (a) activacin; (b) anergia (insensibilizacin; se interacta con un Ag pero la cl. no responde); (c) apoptosis. Este linfocito inmaduro nicamente sobrevivir si no contacta con ligandos que estn en la mdula sea, puesto que son Ag propios. Recordemos que si an le quedan alelos, se podr realizar una edicin del receptor.

Puntos de vericacin de la maduracin de los linfocitos. Los procesos de seleccin negativa y positiva hacen que nalmente nos quedemos con aquellos linfocitos que nos son tiles.

En la maduracin de los LB se da una seleccin negativa y una seleccin positiva. Por seleccin negativa entendemos que se eliminarn aquellos linfocitos B especcos para antgenos propios (90% de los casos). La eliminacin se producir por apoptosis (delecin clonal por apop26

Gracias a esto, podremos generar diferentes clones de linfocitos con la misma cadena pesada () pero diferente cadena ligera, puesto que es difcil que la recombinacin que se dar en el estadio de pre-B sea exactamente la misma para todos los clones formados. 50

tosis). Por seleccin positiva entendemos la preservacin de los linfocitos que son capaces de

responder a antgenos no propios (10% de los casos). Existen cuatro posibles tipos de interacciones con ligandos en la mdula sea: - Sin interaccin. Si no se produce interaccin con ningn ligando el linfocito B inmaduro migrar hacia la periferia y ah se transformar en un linfocito B maduro. - Unin multivalente con una molcula propia. El LB inmaduro entrar en apoptosis o, si puede, realizar la edicin del receptor (y si no es fructfera entrar en apoptosis). - Unin con molculas propias solubles. En este caso el linfocito B inmaduro migrar a la periferia y se transformar en un linfocito B anrgico. - Unin de baja anidad con molculas propias solubles. Es similar al caso anterior, el LB migra a la periferia y se transformar en un LB maduro en los que la interaccin con el antgeno propio que reconoce no producir ningn efecto (similar a la anergia).
Dinmica de la poblacin de cls. B

En la mdula sea acabaremos nalmente con un repertorio de clulas B que han pasado por un proceso de seleccin en funcin de si reconocen o no antgenos propios (induccin de tolerancia). Las cls. B que han pasado por el proceso migrarn hacia la sangre y de ah podrn entrar o no en los folculos linfoides. - Clulas B que no pueden entrar en los folculos linfoides. Tendrn una vida media bastante reducida, de aproximadamente tres das. Parece ser que no pueden entrar porque no expresan las molculas de membrana necesarias (no han sido correctamente sealizadas para que las expresen). - Clulas B que pueden entrar en los folculos linfoides. Entrarn en los folculos y circularn por el sistema linftico-sanguneo. Son las formas naive y pueden vivir entre 3 y 8 semanas. Si en este tiempo de vida no entran en contacto con un antgeno, entrarn en apoptosis. Si, por contrario, entran en contacto con un antgeno, quedarn activadas y darn lugar a clulas de memoria y clulas efectoras que migrarn al lugar de infeccin.
Activacin del linfocito B

La activacin de los linfocitos B o, en otras palabras, la induccin de la respuesta humoral, puede darse en el bazo y en los ndulos linfticos, ya que en estos dos lugares se genera el microambiente adecuado para restringir un tipo concreto de interacciones celulares. Como ya se ha ido comentando en otros temas, la activacin de un linfocito B precisa de (a) la interaccin con un antgeno, y (b) la interaccin con un TH. Una vez producida dicha activacin, se da la famosa expansin clonal que da lugar a clulas plasmticas (secretoras de IgM; para excretar los otros tipos precisamos de un cambio de isotipo) 27 y la formacin de clulas de memoria. Todo este proceso se da en el folculo germinal. Ahora discutiremos un poco por encima como se produce la activacin del LB.

27

Recordemos que tambin habr una maduracin de anidad, que no es ms que la hipermutacin. 51

- Antgeno y TH. Los antgenos presentes en la zona de la infeccin sern captados por

una clula dendrtica local, sta migrar al ganglio y lo presentar al TH (va MHC) Se producir una interaccin entre TCR-MHC II (y CD4; complejo ternario) y el linfocito TH
quedar activado. - Antgeno y LB. El antgeno no se quedar en una zona del cuerpo, si no que proba-

blemente alcanzar la sangre y la linfa y nalmente podr llegar al ganglio, en el que interaccionar con la cl. B (se discutir ms adelante con mayor detalle) y la activar. El linfocito B activado migrar a la periferia del folculo primario.

ESDEVENIMENTS DE LA RESPOSTA HUMORAL A LANTGEN

Linfocitos TH activados y linfocitos B se irn acercando unos a otros. El linfocito B en este caso actuar como una molcula presentadora de antgeno, incorporar el antgeno y mostrar una parte del mismo por medio de una molcula de MHC II. Se dar una activacin bidireccional B-T. Esto se da as para incrementar las probabilidades de contacto entre clula B y clula T; logramos que el T prolifere en la periferia y despus migre hacia el ganglio para contactar con el LB.

Interaccin entre linfocitos B y T en el ganglio linftico. En el momento de la activacin denitiva del linfocito B, cuando ste prolifere, hablaremos de folculo germinal en lugar de primario. Como vemos tambin en el esquema, la interaccin B-T se da en el paracrtex.

En un plazo de 7 a 10 das tras la exposicin al antgeno, algunos linfocitos B activados migran a zonas profundas del folculo y comienzan a proliferar rpidamente, haciendo que la regin central del folculo pase a denominarse centro germinal. En el centro germinal podemos distinguir una zona clara y una zona oscura. La zona oscura es ms externa y contiene linfocitos B en proliferacin rpida (centroblastos). La zona clara es ms interna y es donde se experimentan los procesos de diferenciacin y seleccin (centrocitos quiescentes). Para la formacin de un centro germinal es esencial la presencia de linfocitos T colaboradores. En los folculos linfticos encontramos las clulas dendrticas foliculares (CDF), que se caracterizan por expresar receptores del complemento (CR1, CR2 y CR3) y receptores de Fc (no tienen MHC de clase II). Las largas prolongaciones que tienen forman una red alrededor de la cual se forman los centros germinales. En la zona oscura, las cls. B activadas harn la hipermutacin somtica y darn lugar a linfocitos B con la misma especicidad antignica pero con diferente anidad. En sus prolongaciones, las CDF presentan una cantidad limitada de antgeno, por lo que nicamente los LB activados con una mayor anidad por el antgeno
52

MADURACI DE LAFINITAT SELECCI DE CL.LULES B AMB ALTA AFINITAT AL CENTRE GERMINAL

podrn interaccionar conB l. Todos aquellos LB Cl.lules amb hipermutaci somtica als segments V que no se unan al antgeno ser fagocitados. i Igs amb diferents afinitats per La CDF no presenta MHC de clase II en la lantgen membrana, en su lugar, para presentar el antgeno utiliza el receptor del complemento (CR1/ CR2, que se une a una porcin del antgeno Noms les cl.lules B amb Ig amb elevada poden unida a un fragmento del afinitat complemento) o competir per interaccionar amb bien por medio del receptor de Fc (une la Ig que lAg de les cl.lules dendrtiques foliculars a su vez est unida al antgeno). Adems de tener que interactuar con el Supervivncia/ Supervivncia/Selecci antgeno presentado por la CDF, la clula B de les cl.lules B que interaccionen sobrevivir si reciben seales amb de lAg los de TH. Sin les cl.lules dentrtiques fol.liculars estas seales no se a producir cambio de ai que, ms a ms,el reben senyals de les T (CD40/CD40L i MHCII/Ag-TCR). H de isotipo. En las diapositinidad ni el cambio El reste de cl.lules B moren per apoptosi vas se menciona las interacciones que se dan Interaccin entre CDR y linfocitos por medio del X-linked hyper-IgM syndrome No expressi de CD40L receptor del complemento y del receptor Fc. con los TH: CD40/CD40L y MHCII/Ag-TCR.
No generaci de cl.lules B de memria, ni centres germinals ni hipermutaci somtica

Sndrome de hiper-IgM. Debido a la falta de expresin de CD40L, no se pueden generar ni cls. B de memoria, ni se da el cambio de isotipo ni la hipermutacin somtica. Es una enfermedad gentica ligada a X y se maniesta con unos niveles altos de IgM.

Poblaciones de linfocitos B

Tenemos dos grandes clases de poblaciones de linfocitos B, los B1 y los B2: - Linfocitos B1. Son minoritarios (5%), se forman en el hgado fetal y se localizan en las cavidades peritoneal y pleural adems de en las mucosas. Se pueden autorrenovar y disponemos de un repertorio reducido (limitado tipo V y no hay expresin de TdT en precursores). Tienen una baja anidad y reconocen lpidos, polisacridos microbianos o virales. Los anticuerpos naturales que forman se secretan rpidamente (72-92h). - Linfocitos B2. Se forman en la mdula sea. Dentro de las B2 podemos encontrar otras dos clases: - B2 zona marginal. Estn en el seno marginal del bazo. Son similares a las B1, tienen una diversidad limitada, una baja anidad, forman IgM, reconocen polisacridos y lpidos microbianos/virales, y pueden formar anticuerpos naturales rpidamente (72-92h). - B2 folicular. Es el B2 convencional. Se localizan en los folculos y van recirculando. Hay tumores para cada uno de los estadios del desarrollo de los LB (p. ej., macroglobulinea de Walndestrm: en la cl. B secretora de IgM).

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9. COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC) Introduccin

Un antgeno puede unirse tanto a un BCR, a un TCR a travs de una molcula del MHC o incluso tambin a un receptor de la inmunidad innata (PRR). El MHC ser de una clase u otra en funcin del tipo de linfocito T. Tambin se habl de unas molculas MHC-like, como CD1, que son capaces de mostrar molculas lipdicas o glicolipdicas a algunos tipos de clulas NK (NK1-T). Por lo que respecta a su descubrimiento, entre 1930 y 1950 se realizaron toda una serie de experimentos con ratones. Se cruzaron ratones emparentados (uniones consanguneas) en hasta veinte ocasiones par as lograr cepas de ratones singnicas, es decir: genticamente idnticos en los alelos de los genes polimrcos28 (homocigotos en todos los locus polimrcos). Por el otro lado, se cruzaron ratones para dar lugar a cepas de ratones alognicas, es decir: con diferencias en los alelos de los genes polimrcos (se expresan alelos diferentes en los locus genticos polimrcos). A continuacin se realiz un injerto de piel en ratones de la misma cepa singnica, aceptndose el injerto en el receptor. Por contra, si el injerto se realiDESCOBRIMENT DELCOMPLEX PRINCIPAL DHISTOCOMPATIBILITAT zaba entre donante y receptor de cepas distintas, se produca un rechazo. Se asumi, por tanto, que la capacidad para reconocer aquello propio de lo ajeno era algo que poda hereGorer i Snell (1930-1950) darse. El rechazo de los tejidos a ajenos esforanis el resultado de una respuesta inmunitaria a diversas a El rebuig teixits era el resultat duna resposta immunitria molculas de supercie (antgenos o genes de histocompatibilidad ). dhistocompatibilitat) diverses molcules de superfcie (antgens/gens

Experimentos de Gorer y Snell. Los injertos entre animales de la misma cepa singnica o endogmica son acepMHC: cepas Major Histocompatibility tados. Los injertos entre animales de diferentes alognicas o no endogmicas son Complex destruidos por el sistema inmunitario.

28

Un gen o alelo polimrco es aquel en que en la poblacin, y con frecuencias estables, existen en formas alternativas. Por contra, un gen o alelo no polimrco es aquel que est representado por una nica secuencia, a excepcin de mutaciones extraas. 54

H-2: antgens dhistocompatibilitat 2, per lantigen polimrfic sanguini Antigen II identificat per Snell i col.

Cuando los genes de histocompatibilidad se identicaron en el genoma, se observ que stos estn localizados en un locus gentico amplio, en que hay genes de clase I, de clase II y de clase III. Los de clase III estn relacionados con la respuesta inmunitaria, pero no tienen nada que ver con la histocompatibilidad. En los humanos, el sistema MHC se denomina HLA (Eng: human leukocyte antigens), mientras que en ratn se denomina H-2.
HLA: human leukocyte antigens

Complejo HLA humano.

Los genes de la histocompatibilidad son altamente polimrcos: hay muchas formas alternativas del gen o los alelos para cada locus (pueden dar lugar a molculas con hasta 20 aas distintos) 29. Es posible que una persona forme MHCs que no puedan reconocer a un pptido en concreto (el MHC pertenece a la inmunidad innata). Los genes de la histocompatibilidad tambin son polignicos: dan lugar a grupos de protenas con estructura y funcin similares pero no idnticos. La suma del polimorsmo y la poligenia contribuyen a la diversidad individual y poblacional del MHC (dicultad para realizar transplantes).
Reconocimiento del complejo MHC-pptido

La clula T reconocer a un antgeno presentado por una molcula MHC. El MHC interaccionar tanto con el pptido as como tambin con el linfocito T: se unir a unos residuos de anclaje del pptido a presentar y tambin interaccionar con el TCR directamente. Estas dos interacciones son claves para que el sistema inmunitario pueda discernir entre lo ajeno y lo propio. nicamente podremos reconocer antgenos unidos a MHCs propios. La molcula de MHC tiene dos roles muy importantes: - Presentacin de antgeno. Es la funcin ms evidente: presenta el antgeno al LT. El pptido presentado presenta unos residuos de contacto (unin a TCR) y otros de anclaje (unin a MHC). Estas dos clases de residuos son responsables de la elevada especicidad del reconocimiento. - Restriccin por MHC. Los linfocitos T nicamente podrn reconocer a un antgeno presentado por una molcula de MHC propia. Las interacciones entre aminocidos, ya sea entre TCR y Ag o TCR y MHC, sern no covalentes (puentes de hidrgeno, interacciones de carga, etc). Los residuos del MHC que son ms
29

(Roitt pg. 81): A diferencia de lo que ocurre con el sistema de la inmunoglobulina, en el cual hemos visto, la variabilidad se logra en cada individuo por un sistema multignico, el MHC evolucion en lo que se reere a la varabilidad entre los individuos con un sistema altamente polimorfo basado en mltiples alelos. En el genoma humano los genes de la clase I y clase II son los ms polimorfos; en algunos de estos genes se identicaron ms de 200 variantes allicas. 55

determinantes, que en su mayora van a ser polimrcos, son los que forman el surco de interaccin con el antgeno y los que contactan con el TCR (responsables de la restriccin por MHC de las clulas T).

Reconocimiento por los linfocitos T de un complejo pptido-MHC. Este esquema muestra una molcula del MHC unindose y presentando un pptido a un receptor de linfocitos T, que reconoce dos residuos polimrcos de la molcula del MHC y un residuo del pptido.

Estructura de la molcula del MHC de clase I y II

Una molcula del MHC es una glucoprotena transmembrana constituida por dominios Ig y con una pequea ranura para que se aade el pptido que debe ser presentado. El patrn de plegamiento es similar entre las molculas de clase I y II. Los residuos polimrcos estn en la ranura y en zonas adyacentes. Los dominios Ig no polimrcos contienen lugares de unin para las molculas CD4 y CD8 de los linfocitos T. Molcula de clase I del MHC La molcula de clase I del MHC es un heterotrmero: (a) cadena ; (b) microglobulina 2 y (c) pptido. La cadena consta de tres dominios Ig (1, 2 y 3), los dos primeros (1 y 2) formarn la famosa ranura a la que se unir un pptido de 8 a 11 aas; en esta ranura hay residuos polimrcos. El segmento 3 no es polimrco, consta de una parte transmembrana y es donde se unir CD8. Por lo que respecta al dominio microglobulina 2 , no es polimrco, no est codicado por el MHC, es de naturaleza Ig e interacciona de una manera no covalente con los tres segmentos de la cadena alfa.

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Molcula de clase II del MHC Al igual que la molcula de clase I del MHC, la molcula de clase II es un heterotrmero formado por: (a) cadena , (b) cadena , y (c) pptido. La cadena es una glicoprotena que consta de dos segmentos, uno polimrco (1) y otro no polimrco o Ig (2). La cadena presenta una estructura similar a la alfa: un segmento polimrco (1) y otro no polimrco o Ig que se une a CD4 (2). La ranura que interaccionar con el pptido que presente la molcula de clase II est formada por el segmento 1 y 1. Los dominios C-terminales de la cadena alfa y de la cadena beta estn anclados en la membrana (regin transmembrana).
Achtung! Sabemos que las molculas de clase I del MHC casi siempre presentan pptidos propios. Ahora bien, las molculas de clase II del MHC tambin presentan casi siempre pptidos propios. Las clulas que son capaces de expresar MHCII en su membrana, lo harn siempre, no nicamente cuando incorporen un elemento extrao. Por tanto, cuando no se ha incorporado nada ajeno (cls. viejas por ejemplo), se expresan en la membrana MHCII unidos a pptidos propios.

Los pptidos se unen a las molculas del MHC I por sus extremos, mientras que las que se unen a las del MHC II lo harn por medio de interacciones a lo largo del surco de unin. Esto permite que una molcula del MHC pueda unirse a pptidos distintos con unos residuos comunes en posiciones concretas (residuos de anclaje) 30. El pptido que se una al MHCII tendr que tener sus residuos de anclaje a unas distancias especcas (la longitud del pptido ser variable).
Polimorsmo en las molculas del MHC de clase I y II

En la poblacin existen diferentes alelos para los diferentes genes del sistema MHC. Las diferencias entre estos alelos se dan en lugares especcos dentro de la molcula del MHC. Los polimorsmos se centran en los residuos del surco de unin al antgeno y la de la regin de interaccin con el TCR (se determina la especicidad de unin del pptido y el reconocimiento del antgeno por el TCR).
Unin de pptidos a las molculas de clase I y II del MHC

Las molculas del MHC presentan una amplia especicidad de unin a pptidos (en este aspecto las molculas del MHC son promiscuas). Esta promiscuidad se basa en tres aspectos:

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En general los residuos N- y C-terminales del pptido son hidrofbicos e interaccionan con los residuos del surco de la molcula del MHC I. 57

- Cada molcula del MHC I y II tiene un surco nico en el que se pueden unir pptidos diferentes. Y tambin un pptido puede interaccionar con MHC distintos. - Los pptidos que se unen tienen caractersticas estructurales comunes. - Los polimorsmos ubicados en el surco de unin y regiones prximas determinan que diferentes alelos de un mismo gen unan pptidos distintos. La asociacin pptido-MHC es bastante estable. La interaccin es de baja anidad, pero la velocidad de asociacin es ms rpida que la de disociacin (la asociacin puede durar de horas a das). Finalmente la molcula del MHC de un individuo no discrimina entre pptidos extraos y propios (lo ms comn es que se unan a pptidos propios). La diversidad en las molculas del MHC de clase I y II (existencia de mltiples alelos) es importante a nivel poblacional ya que asegura que al menos algunos individuos puedan responder a todos los antgenos de los patgenos. El conjunto de molculas del MHC inuencia directamente en el repertorio de antgenos que pueden ser detectados por TH y TC,y por tanto est relacionado con la respuesta a infecciones y con los procesos de autoinmunidad.

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10. EXPRESIN Y REGULACIN DEL MHC Introduccin

Como ya se vio en el tema anterior, los genes de histocompatibilidad se encuentran en un locus extenso, el complejo HLA en humanos (y el complejo H-2 en ratones). Dentro de esta regin del genoma distinguimos entre genes de clase I, de clase II y de clase III. Las tres clases de genes dan lugar a protenas del sistema inmunitario, pero nicamente los de clase I y II estn relacionados con la histocompatibilidad. - Genes de clase I. Se expresan en todas las clulas y presentan el Ag a los TC. - Genes de clase II. Se expresan en cls. presentadoras de antgenos (macrfagos, cls. dendrticas, LB) y presentan el Ag a los TH. - Genes de clase III. Dan lugar a protenas del complemento, moleculas inamatorias, etc. Como vemos, no tienen nada que ver con la histocompatibilidad. Los genes de clase I y II son los clsicos. Despus tambin podemos encontrar (no s si en el complejo HLA) los genes del MHC no clsicos, que se pueden expresar en algunos tipos celulares y que tienen funciones especializadas o poco conocidas. Los genes del MHC no clsicos tambin se pueden distinguir entre de clase I o de clase II en funcin a su estructura.
Genes de clase I del MHC

En los humanos encontramos tres grandes genes de clase I clsicos: HLA-A, HLA-B y HLA-C (en ratn son H-2K, H2D y H-2L). Se encargan de presentar el antgeno a los linfocitos T CD8 (citotxicos). Adems de estos genes clsicos, encontramos las molculas de clase I del MHC no clsicas, cuya funcin an se discute. Se cree que: (a) presentan pptidos a cls. T, y que (b) activan/ desactivan a cls. NK. Tanto las molculas clsicas como no clsicas tienen en comn la presencia de la 2-microglobulina en su estructura. Se comentaron las siguientes molculas no clsicas31: - HLA-G y HLA-E. Presentan Ag a cls. NK. - HLA-H. Implicada en el metabolismo del hierro. - MIC. Su expresin en el epitelio intestinal es inducida por el estrs. La protena MIC es reconocida por los receptores NK, de cls. T y TC. - CD1 [no presente en la regin MHC]. Hasta ahora hemos visto molculas no clsicas presentes en la regin MHC, sta no lo est. Ya vimos que CD1 era una molcula MHC-like que presentaba antgenos lipdicos o glicolipdicos a cls. T.

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Todos los ejemplos que ahora pondremos son humanos. En clase se coment tambin el gen H-2M de ratn, que se encarga de presentar pptidos con una Met terminal aminoformilada (pptidos derivados de procariotas que crecen intracelularmente, como el Mycobacterium tuberculosis). 59

Genes de clase II del MHC

En los humanos encontramos mltiples alelos de las cadenas y de DR, DP y DQ (en ratn de IA e IE). Se encargan de presentar el antgenos a los linfocitos T CD4 (colaboradores). Adems de estos genes clsicos, encontramos las molculas de clase II del MHC no clsicas, que son molculas implicadas en el procesamiento y presentacin del antgeno. Tienen un patrn de expresin distinto en comparacin con las molculas clsicas, aqu vemos algunos ejemplos: - DM. Se trata de una molcula MHC-like y facilita la carga del pptido antignico. - DO. Regula el procesado del Ag de clase II. Se observa en el timo y LB maduros. - TAP1/2. Son transportadores del pptido a presentar del citosol al retculo. - LMP2/7. Son subunidades del proteasoma.
Expresin de las molculas del MHC I y II

Las molculas del MHC I se expresan en la gran mayora de tipos celulares, aunque con notables diferencias por lo que respecta al nivel de expresin. Las clulas con una mayor cantidad de expresin de MHC I son las del sistema inmunitario: linfocitos, macrfagos, cls. dendrticas y neutrlos. Las clulas que expresan niveles bajos son los broblastos, las cls. epiteliales, las musculares, los hepatocitos y las neuronas. Hay clulas que no expresan estas molculas, como los eritrocitos y algunos estadios de diferenciacin de neuronas y esperma (evitar el rechazo). La expresin de estas molculas es inducible por citocinas (IFNs I/II). Las molculas del MHC II se expresan en un nmero ms reducido de clulas. De manera constitutiva la expresan las cls. presentadoras de antgeno (CPA): dendrticas, LB y epiteliales tmicas (para que as los LT que se formen en el timo puedan interaccionar con pptidos). Los eritrocitos no expresan MHC II. La expresin de estas molculas se puede inducir o depende de: (a) citocinas (IFN que estimula su expresin en macrfagos, cls. dendrticas y broblastos); (b) estmulos va TLRs; (c) estados de diferenciacin en el LB (la cl. pre-B ni la cl. plasmtica no expresan MHC II; la B madura s).
Factores reguladores de la expresin de molculas del MHC I y II Citocinas Interferones (, y ) TNF MHC I

IFN MHC II Corticoesteroides(1) MHC II Prostaglandinas Virus(2) Citomegalovirus (CMV) MHC I Hepatitis B (VHB) Adenovirus 12 (Ad12) (1) Los corticoesteroides tienen una funcin antiinamatoria, lo cual tiene sentido si vemos que inducen una reduccin de la expresin de las molculas del MHC II: se diculta la presentacin de Ag a los LT CD4. (2) Los virus reducen la expresin de MHC I a modo de estrategia evasiva.

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Los promotores de los genes del MHC II (y creo que los de clase I tambin, entre ellos) son similares, por lo que tienen mecanismos reguladores parecidos (p. ej., factores de transcripcin). La regulacin es coordinada tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. Expresin de los alelos Generalmente expresamos uno de los dos alelos de un gen, ya sea el paterno o el materno. Con los genes del MHC esto no sucede as, puesto que hay una codominancia, se expresan los dos alelos dando lugar a la formacin de molculas heterlegas con genes paternos y maternos, incrementando as la diversidad. Diferentes individuos dentro de una especie podrn unir grupos diferentes de pptidos virales. Los genes del MHC presentan un polimorsmo muy elevado. Entendemos por haplotipo del MHC el conjunto de alelos del MHC presentes en cada cromosoma. Los heterocigotos tienen dos haplotipos del MHC, generalmente uno idntico al paterno y el otro al materno. Para que un transplante sea lo ms efectivo posible, la diferencia entre el haplotipo del MHC del receptor y el del donante debe ser mnima. Existe, tericamente un total de 2,25 1018 combinaciones posibles de haplotipo del MHC, aunque esta diversidad es inferior (hay que tener en cuenta factores como la presin selectiva o la frecuencia de recombinaciones ms elevada en determinadas regiones del DNA que determinan la frecuencia de asociacin allica). Recordemos que una clula sana presentar pptidos propios, mientras que una clula infectada presentar pptidos propios y ajenos. Se comenta en las diapositivas que por polimorsmo se entiende la existencia de mltiples alelos de un locus gentico dentro de una especie y de bastantes alelos de un locus en cada individuo, que pueden diferir en un 5-10% de la secuencia de aas con otro individu y tambin en el nmero de alelos. Yo tambin comentara que estas diferencias deben ser estables en la poblacin. Este polimorsmo nos lleva a una gran diversidad (tanto a nivel individual como de especie).
Ejemplo histocompatibilidad con ratones. Donador BB, si le damos un tejido a un KK hay rechazo y si se da a un BB hay aceptacin. Si el donador es B/K, el rechazo se produce en homocigotos y se acepta en los heterocigotos.

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RECONEIXEMENT DE DEL LANTIGEN PER LA CL.LULA 11. PROCESAMIENTO Y PRESENTACIN ANTGENO A LOS LINFOCITOS T
Introduccin La majoria de cl.lules T reconeixen pptids i no altres molcules

Los linfocitos T, a de los B, no puedenlineals reconocer un antgeno de manera directa, si Les cl.lules Tdiferencia reconeixen determinants i no comformacionals dels pptids no que requieren que este antgeno, que adems generalmente ser de naturaleza proteica, sea presentado por una molcula (no reconocen Ag solublesa ). cl.lules El eptopo(presentats que suelen reconocer los Les cl.lules T reconeixen antigens associats per molcules linfocitos T es ide carcter lineal (secuencial). del MHC) no antigens solubles

Activacin de linfocitos T. La activacin de la clula T requiere del procesado del antgeno. Ya hemos dicho que el LT no puede reconocer un antgeno soluble. Lactivaci de la cl.lula T

requereix el un antgeno a los linfocitos T: las Existen dos grandes clases de clulas que pueden mostrar processament de lantigen (a) clulas diana, y las ya conocidas (b) clulas presentadoras de antgeno (CPA). (a) Cls. diana. Son aquellas clulas que presentan pptidos a travs del MHC I a los linfocitos T CD8. Casi todas las clulas son diana, puesto que la expresin del MHC I es casi constitutiva. Las clulas que sern atacadas por los T CD8 son las infectadas, las cancerosas, las viejas, las apoptticas, las alognicas y todas aquellas que expresen algo ajeno en su MHC I. (b) CPA. Son aquellas clulas que presentan pptidos a travs del MHC II a los linfocitos T CD4. Dentro de las CPA distinguimos entre: - CPA profesionales. Cls. dendrticas, macrfagos y linfocitos B. - CPA no profesionales [no pertenecen al sistema inmunolgico]. Fibroblastos (piel), gla, cls. pancreticas, cls. epiteliales tmicas, epiteliales tiroideas y endoteliales vasculares.
Procesamiento del antgeno

Existen dos grandes vas de procesamiento y presentacin del antgeno: (1) va citoslica (o va del MHC I); y la (2) va endoctica (o va del MHC II). La primera va presenta antgenos intracelulares o endgenos, tales como protenas celulares normales, protenas tumorales o, en el caso de que la clula est infectada, protenas virales y bacterianas. La segunda va presenta antgenos extracelulares o exgenos, incorporados por endo-/pinocitosis. Aqu encontramos antgenos de complejos extracelulares o de virus o bacterias en su fase extracelular.
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Transport dels pptids des del citosol al reticle endoplasmtic rugs TAP (transporter associated with antigen processing): heterodmer transmembrana format per TAP1 i TAP2 (protenes de la famlia ATP-binding cassetes) que media el transport depenent dATP de sucres, ions, aminocids i pptids (preferentment hidrofbics i bsics) -Polimrfics: diferent resposta individual front antgens endgens -Deficincies: sndrome amb aspectes dimmunodeficincia i autoimmunitat

Va citoslica

Toda protena tiene un ciclo de vida que generalmente naliza con su degradacin en el proteasoma. Esta degradacin no suele ser absoluta, siempre suelen quedar algunos pptidos que, si no hay nada que lo impida, acabarn tambin siendo degradados hasta descomponerlos en aminocidos. Es posible que alguno de estos pptidos pase al interior del RER a travs de un transportador TAP. El transportador TAP (Eng: transporter associated with anti. Una deciencia que afecte a la produccin de gen processing) es un heterodmero trans- TAP TAP1/2 se maniesta en forma de procesos de inmumembrana formado por TAP1 y TAP2, que me- nodeciencia y autoinmunidad. Por un lado nuestro dia el transporte dependiente de ATP de gl- sistema inmunitario ser deciente ya que habrn pptidos que no podrn ser presentados (no se acticidos, iones, aas y pptidos (preferentemente van los LT). Por el otro lado, si no podemos presentar hidrofbicos y bsicos). Los genes que codi- algunos pptidos por el MHC (y para ello es esencial procesado previo), no podremos seleccionar y can para TAP1/2, que ya vimos que eran mol- su omitir aquellos linfocitos T que reconozcan antgeculas no clsicas de clase II del MHC, son bas- nos propios. La inmunodeciencia y la autoinmunitante polimrcos, lo cual permite que haya dad no son absolutas. diferencias individuales en lo que respecta la presentacin de pptidos (y por tanto condicionamos tambin la respuesta inmune). Si nos centramos de nuevo en el pptido interiorizado en el RER con la ayuda de TAP, veremos como ste se unir a una molcula de clase I del MHC conjugada con varias protenas. La unin se producir gracias a unas chaperonas. En el RER, la cadena de la molcula de clase I del MHC se une a la calnexina, que favorece su plegamiento. Acto seguido, se une al complejo cadena -calnexina tres elementos adicionales: (a) tapasina, (b) calreticulina (estas dos acercan el TAP a las MHC I), y (c) 2 microglobulina. Finalmente, de este complejo saldr la calnexina para que entre el pptido (si VIA CITOSLICA ste es afn) y nalmente tambin saldrn la tapasina y la calreticulina, dejando ya a una molcula de clase I del MHC conjugada con un pptido, que saldr a la supercie celular va Associaci i estabilitzaci de les molcules MHC I Golgi.

Asociacin estabilizacin de las MHC del I. En las diapositivas tambin se habla de una protena adiEls y pptids sassocien a molculas les molcules MHC I ajudats per xaperones cional, ERp57, pero no se coment nada acerca de su funcin.

calnexina: protena del reticle endoplasmtic sassocia amb al cadena del MHC I i facilita el seu plegament calreticulina i tapasina: acosten el TAP a les MHC I que poden unir el pptid ERp57
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El complex MHC I/pptid s estable i es poden dissociar la calreticulina i la tapasina, i anar a la superfcie cel.lular via Golgi

Va endoctica La va endoctica consiste en la presentacin de pptidos que se generan a partir de molculas incluidas en el interior de vesculas endocticas gracias a una fagocitosis y/o endocitosis (mediada por receptor/pinocitosis). El antgeno ser procesado en tres compartimentos cidos cuyo pH va disminuyendo progresivamente (endosoma temprano, tardo y lisosoma). En los lisosomas, adems, hay toda una serie de enzimas hidrolticos. La molcula de clase II del MHC se forma en el RER, tanto la cadena como la (DR, DP y DQ). Como esta molcula es un heterotrmero, es decir, que necesita de un pptido para ser estable, se le unir una cadena invariante (li) que facilita el plegamiento de la molcula, evita que se una a pptidos dentro del RER y dirige el transporte de las molculas MHC II a las vesculas endocticas. El complejo MHC II-li ir desde el RER al Golgi, donde sufrir un procesado. Este complejo adems viajar en forma de trmeros: (MHC II-li)3. Las vesculas emitidas por el trans-Golgi llegarn a los endosomas tempranos y desde stos el contenido de las vesculas (MHC II-li) llegarn hasta los lisosomas. A medida que se pasa a un compartimento con mayor capacidad proteoltica (endosoma temprano > tardo > lisosoma), la cadena li se ir degradando y quedar nicamente en un fragmento CLIP (Eng: class II-associated invariant chain peptide), que impide la unin prematura del pptido. La molcula HLA-DM, que es una molcula MHC ni clsica ni polimrca que se expresa en compartimentos endosomales, cataliza el intercambio del fragmento CLIP por el pptido antignico. El heterotrmero MHCII-pptido es ms estable 32 y es transportado a la membrana.

Va de presentacin endoctica.

Presentacin cruzada

Es un fenmeno que nicamente se da en cls. dendrticas. Consiste en que los pptidos generados a partir de la digestin de protenas endocitadas pueden entrar al RER y ser presentados por molculas de clase I del MHC. As pueden presentar antgenos procedentes de cls. infectadas o tumorales a T CD8. Con esto podemos hacer que una clula dendrtica presente

32

Esta interaccin es tan fuerte que es difcil intercambiar el pptido del MHC II en condiciones siolgicas. 64

pptidos virales sin que sta tenga que ser infectada. Habra que preguntar si las clulas dendrticas pueden incorporar el antgeno por fagocitosis adems de por pinocitosis (en Histologa se dijo lo contrario).

Presentacin cruzada de los antgenos a los linfocitos T CD8+. Las clulas infectadas por grmenes intracelulares, como virus, son ingeridas por las clulas dendrticas, y los antgenos de los grmenes infecciosos son procesados y presentados a los linfocitos T CD8 asociados a molculas del MHC de la clase I. As, las cls. dendrticas son capaces de presentar los antgenos vesiculares endocitados por la va de la clase I.

Inmunogenicidad de los antgenos proteicos

En el tema en el que se trataron los antgenos se dijo que la inmunogenicidad era la capacidad de una molcula para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa. Los eptopos peptdicos inmunodominantes son aquellos, de entre los mltiples eptopos de un antgeno, que pueden unirse al MHC del individuo y por tanto inducir esa respuesta. Recordemos que cada CPA muestra continuamente pptidos derivados de protenas propias o extraas. nicamente algunos de los complejos pptido-MHCII sern susceptibles de activar una clula T especca (0,1%).
Presentacin de antgenos no peptdicos

La molcula CD1, que es una molcula MHC I no clsica y asociada con la 2 microglobulina, puede presentar antgenos no peptdicos (lpidos y glicolpidos) derivados de antgenos bacterianos a T, T y diversas T. Las clulas NKT (subpoblacin de NK que presenta TCR) pueden reconocer CD1d presentando pptidos propios, por lo que estas clulas pueden servir para eliminar clulas alteradas por estrs, envejecimiento o neoplasia. La va por la cual la CD1 presenta un antgeno es distinta a la observada para la presentacin a travs del MHC I. La CD1 tiene un surco de unin al pptido ms grande y profundo respecto a la MHC I.

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12. LINFOCITOS T: RECEPTOR Y ONTOGENIA Receptor de la clula T

El receptor de la clula T (TCR) se caracteriza por toda una serie de rasgos. En primer lugar tiene una especicidad dual; es decir, que reconoce tanto unos residuos del pptido unido al MHC (especicidad) as como tambin los residuos polimrcos del MHC (restriccin por el MHC). En segundo lugar el TCR se expresa de forma clonal; todos los TCR de la clula son idntidos entre s ya que se forman a partir del mismo gen. En tercer lugar, al igual que observamos con los BCR, el gen que da lugar al TCR se recombina de una manera muy similar (para as generar diversidad). En cuarto lugar, y a diferencia del BCR, el TCR se forma siempre con una zona transmembrana; no existe una forma soluble. En quinto y ltimo lugar, la clula T dispone de unos 100.000 receptores en su membrana.
Estructura del TCR

El receptor de la clula T es un heterodmero formado por una cadena y o bien una y una . Como otras protenas del sistema inmunitario, el TCR basa su estructura en dominios Ig. El dominio Ig que ocupa la posicin N-terminal es el dominio Ig variable y el que es ms cercano al C-terminal es el dominio Ig constante. Como ocurra con las inmunoglobulinas, el dominio Ig variable es el que condiciona la especicidad de unin al pptido presentado. El dominio Ig variable dispone de tres regiones hipervariables33 (el V dispone de cuatro). La diferencia que hay entre el TCR y el TCR es el ngulo que forman sus dominios Ig Estructura del TCR. Si nos jamos, recuerda al variables respecto a los dominios Ig constantes fragmento de unin al antgeno de la inmunoglobulina (Fab). (147 vs 111).
Organizacin genmica

Como ya hemos dicho en el primer apartado de este tema, el gen que da lugar al TCR se recombina de una forma muy similar al gen del BCR. La parte variable de la cadena (Chr. 7) est formada por la suma de tres segmentos gnicos: V, D y J. A continuacin encontramos un dominio C que da lugar al dominio constante de la cadena y nalmente el dominio transmembrana. La cadena (Chr. 14) sera lo equivalente a la cadena ligera de una Ig. Su parte variable se forma a partir de la suma de dos segmentos gnicos: V y J. Despus, igual que con la ca33

Equivalente a los CDRs de las Ig. 66

dena , hay un dominio constante C y un dominion transmembran. La cadena presenta la peculiaridad de formarse a partir de unos segmentos gnicos ubicados dentro del locus donde estn los segmentos gnicos que dan lugar a la cadena (Chr. 14 entonces). Esto implica que cuando se recombine el gen de la cadena , es posible que se pierda la informacin que da lugar a la cadena (y este es uno de los mecanismos que impide a la cl. T expresar a la vez TCR y ). El dominio Ig variable de la cadena se forma a partir de la unin VDJ.

Organizacin de los genes del TCR. Fijmonos en la posicin en la que se encuentran los segmentos gnicos que dan lugar a la cadena .

Finalmente la cadena se forma de una forma similar a la (la parte variable est formada por la suma de VJ), con la excepcin de que los fragmentos gnicos que la codican se encuentran en un locus independiente (Chr. 7), distanciado de otros locus que dan lugar a otras cadenas del TCR.
Reordenamiento de los segmentos gnicos del TCR

La recombinacin se da igual que en las Igs: se emplean secuencias RSS y RAGs. En primer lugar habr un reconocimiento de las RSSs por parte de las RAG1/2, despus la sinapsis, despus la ruptura y nalmente la unin. Si recordamos, la unin poda ser por delecin (si los dos fragmentos gnicos V y J estn en la misma orientacin) o por inversin (si estn en orientacin opuesta). En primer lugar se recombina la cadena (que sera equivalente a la cadena pesada de las Ig): unin D-J y despus V-DJ (diversidad). Cuando se produce esta unin tenemos una serie de mecanismos generadores de diversidad: (0) ruptura de la horquilla covalente al azar; (1) adicin de nucletidos-P; (2) adicin de nucletidos-N (a travs de la TdT); (3) exibilidad de
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unin. En segundo lugar ya se podr pasar directamente a la transcripcin del gen ya funcional, ya que se ha acercado el promotor a una regin que acta a modo de enhancer. Finalmente se dar la traduccin. Como la cadena no se forma a la par que la , la cadena se expresar en la membrana de la clula T junto a un sucedneo de la cadena (como ocurra con el BCR). La cadena formar su parte variable con la unin de un segmento V con uno J. Tras la transcripcin y posterior traduccin, tendremos un pptido que podr unirse al : el heterodmero podr expresarse en la membrana (TCR funcional). La recombinacin se gracias a que las RAG1/2 reconoce segmentos gnicos anqueados por RSS de una vuelta o dos. Las uniones se dan siguiendo la regla 12/23. Ahora bien, mientras que los segmentos D del gen del BCR estaban anqueados por RSS del mismo nmero de vueltas, los segmentos D del TCR (cadena , ) estn anqueados por RSS de diferente nmero de vueltas. Esto permite que dos segmentos D puedan unirse entre s, dando lugar a nuevas combinaciones (p. ej., V-D-D-J). Este es un mecanismo generador de diversidad adicional que no encontramos en el BCR. Atencin, en la recombinacin somtica del TCR no se da la hipermutacin somtica. Esto asegura que no haya un cambio de anidad del TCR despus de la seleccin tmica. Esto reduce las posibilidades de generar TCRs autorreactivos.
Posible lio. Para aclararnos, los mecanismos de generacin de diversidad son (segn las diapostivas): (a) combinatoria de unin V-J y VDJ; (b) unin alternativa de segmentos D; (c) exibilidad de unin; (d) adicin de nucletidos-N (y P no?).

Ontogenia de las clulas T (mirar esquema de las diapositivas)

El primer precursor de la clula T es la ya famosa clula madre hematopoytica (HSC), presente en la mdula sea. sta da lugar al precursor linfoide, que una vez formado migrar al timo, donde encontramos un microambiente adecuado para que se d la maduracin. Al entrar al timo (precursor de la clula T), se induce la expresin de RAG y produce la unin de los segmentos D-J (clula pro-T doble negativa CD4-/CD8-). A continuacin se da la unin de los segmentos V-DJ (clula pre-T doble negativa)34. En este estadio de pre-T DN comenzar la expresin de CD3 y en su membrana tambin encontraremos la cadena junto al sucedneo de la cadena (pre-T). Finalmente se producir la recombinacin de la cadena (V-J) (clula pro-T doble positiva CD4+/CD8+). La clula pro-T acabar expresando nicamente CD4 o CD8 mientras que se da una seleccin positiva (reconocimiento de MHCs propios) y negativa (se eliminan las clulas T que reconocen pptidos propios). El receptor pre-TCR, formado por el TCR y pre-T, produce toda una serie de seales intracelulares: (a) se detiene la recombinacin del gen de la cadena (exclusin allica); (b) se estimula la proliferacin; (c) se estimula la expresin de CD4 y CD8 (DP); (d) empieza la recombinacin de la cadena 35.

34 35

Doble negativo = DN; doble positivo ser DP.

No hay un proceso estricto de exclusin allica para la cadena , se pueden llegar a recombinar los dos alelos. 68

Debido a la seleccin positiva y la seleccin negativa cerca de un 98% de los timocitos mueren (proceso muy costoso por tanto). Si la seleccin positiva elimina a aquellas clulas T que no reconocen las molculas del MHC propias, estamos generando un repertorio de clulas T restringido por el MHC propio. Por el otro lado, si la seleccin negativa omite aquellas clulas T que reconocen, con una gran anidad, a pptidos propios, estaremos generando un repertorio de clulas T auto-tolerante.

Maduracin de los linfocitos T en el timo.

Para que se d la seleccin positiva necesitamos que haya una interaccin entre clula T y molculas de clase I y de clase II del MHC. Las clulas epiteliales tmicas eliminan a aquellas T que no pueden interaccionar con estas clulas a travs del MHC (las que pueden interaccionar reciben seales de supervivencia). Una vez tenemos un repertorio de clulas T que reconocen el MHC propio, aquellas clulas T que reconozcan un pptido presentado por una clula dendrtica del timo (va MHC I y II) con una elevada anidad entrar en apoptosis. Hemos de pensar que por narices reconocern un pptido propio, ya que las molculas del MHC se expresan en la membrana siempre con algn pptido. Sobre el papel ninguna clula T podra madurar, cosa que no sucede (incgnita de la seleccin tmica). La hiptesis que actualmente dispone de ms adeptos es la que hemos comentado de la anidad36. La presentacin de los pptidos en el timo se da gracias a las clulas epiteliales tmicas (forman una red en la que estn los timocitos madurando; elevada expresin de MHCI/II) y otras clulas estromales (macrfagos y dendrticas), que tambin expresan MHCI/II. Como no todos los pptidos pueden ser presentados por el timo (p. ej., especcos de tejidos con-

Existe otra hiptesis, la de la sealizacin diferencial, que consiste en que la seleccin est determinada por seales diferentes en lugar de por la intensidad de la misma seal. 69
36

cretos), las clulas epiteliales del timo expresan la protena AIRE (Eng: autoimmune regulator), una protena nuclear que induce la expresin de genes tejido-especcos en el timo.
Paso de doble positivo (DP) a single positive (SP)

Existen dos modelos que explican como se pasa de DP a SP. El modelo estoclstico arma que al azar se deja de expresar CD4 o CD8 independientemente de la especicidad por el TCR. nicamente los timocitos con un TCR y un co-receptor que reconozcan a la misma clase de molcula del MHC sobrevivirn. El modelo instructivo (el ms aceptado) dice que el TCR especco para MHC I + CD8 genera una seal diferente a la del TCR especco para MHC II + CD4. Estas seales diferentes instruyen a los timocitos a diferenciarse en CD4+ o CD8+. La gran mayora de los linfocitos T en el timo son DP, y en la sangre son SP (aunque pueden haber DP y DN). Cuando se est en el estado de DP, en primer lugar se pasar a un estado de CD4+ y CD8lo (lo = low) antes de acabar siendo un CD4+ o CD8+. En sangre la proporcin entre colaboradores (CD4+) y citotxicos (CD8+) es de 2:1.

Expresin de CD4 y CD8 en los timocitos. La imagen A corresponde a una citometra de ujo en dos colores (se emplean anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 marcados con uorocromos distintos).

Los T nicamente representan entre el 5 y el 10% de los linfocitos T en sangre. La recombinacin de los genes de la cadena y se da a lo largo de la vida del individuo (en diferentes etapas vitales). El reordenamiento se da en grupos de clulas que expresan diferentes segmentos V y V. Entre los T podemos distinguir una subpoblacin que expresa CD8. Los T se les puede considerar un brazo de la inmunidad innata ya que pueden reconocer estructuras presentes en microorganismos habitualmente localizados en las barreras epiteliales.
Alorreactividad

La alorreactividad es el reconocimiento de aloantgenos. Un aloantgeno es una molcula que diere entre los miembros de una misma especie por variaciones genticas, como por ejem70

plo los polimorsmos. Un ejemplo de aloantgeno son las molculas del MHC. En la alorreactividad se da una respuesta directa de clulas T a las molculas del MHC alognicas. Para comprenderlo mejor: la alorreactividad abre una modalidad adicional de activacin de la clula T: - Mtodo tradicional. Una CPA propia presenta gracias a su MHC un pptido alognico, como puede ser uno formado por la incorporacin de una molcula de MHC alognica. - Mtodo nuevo (alorreactividad) 37. La clula T es capaz de reconocer directamente la molcula de MHC alognica que tiene en su membrana la clula ajena. Esto se explica por la reactividad cruzada: hay un parecido estructural entre el MHC propio y el alognico. A esta similitud estructural puede contribuir o no el pptido presentado por el MHC alognico. Del total de clulas T, entre el 1 y el 5% son alorreactivas para un determinado aloantgeno. Las dos clases de activacin se dan simultneamente. Esto es lo que se da en los transplantes de rganos, de ah el uso de los inmunosupresores.

37

Se rompe, por tanto, el dogma TCR-Ag/MHCpropio (ahora puede ser TCR-Ag/MHC ajeno). 71

13. MOLCULAS DE ADHESIN Introduccin

Las molculas de adhesin las encontramos en clulas del sistema inmunitario y otras que no pertencen al mismo. Son las encargadas del homing (dirigir a los leucocitos a los tejidos adecuados) y la recirculacin de los linfocitos. Las molculas de adhesin aumentan la intensidad de las interacciones funcionales entre las molculas del sistema inmunitario (entre CPA y TH, B-TH y cl. diana-TC). Supogamos un leucocito formado en la mdula sea que est circulando por el torrente sanguneo. En el tejido subyacente al endotelio se produce una infeccin que produce la liberacin de toda una serie de citocinas. Estas citocinas activan al endotelio, que mostrar una serie de molculas de adhesin en su membrana apical que permitirn que el leucocito disminuya su velocidad, se adhiera al endotelio y nalmente se extravase para combatir la infeccin.
Molculas de adhesin

Hay cuatro grandes familias de molculas de adhesin: (a) mucinas; (b) selectinas; (c) superfamilia de las Igs (ICAM); (d) integrinas. Las interacciones sern entre mucinas y selectinas, y entre ICAMs e integrinas. (a) Mucinas. Las mucinas son unas protenas muy glicosiladas ricas en Ser y Thr. Presentan ligandos carbohidratados y sializados (cido silico) en las lectinas. - CD34 y GlyCAM-1. Presentes en las cls. endoteliales de los ndulos linfticos. Son reconocidas por las L-selectinas de los leucocitos. - PSGL-1. Presentes en los neutrlos; interacta con las selectinas E y P. (b) Selectinas. Son unas glicoprotenas de membrana con dominios lectina-like que se unen a carbohidratos especcos (presentes en las mucinas). Las selectinas son las responsables de la adhesin inicial de los leucocitos al endotelio. - Selectina L. Presente en los leucocitos circulantes. - Selectinas E y P. Presentes en las clulas endoteliales activadas. (c) Integrinas38 . Las integrinas son unas protenas heterodimricas (cadena y ). Se expresan en leucocitos (diferentes formas en diferentes poblaciones) y facilitan y regulan la (1) interaccin cl-cl y la (2) adhesin al endotelio (extravasacin). La unin entre integrina y ligando suele requerir una activacin (quimiocinas regulan la anidad de unin). Se habl de Mac-1 que forma parte del CD11b de los leucocitos. (d) ICAMs. Son unas protenas formadas por dominios Ig-like. Se expresan en las cls. endoteliales. En el endotelio vascular encontramos ICAM-1/2/3 y VCAM. En el endotelio de la mucosa encontramos MadCAM-1, que contiene dominios Ig-like (unin a integrinas) y mucina-like (a selectinas) [molcula bifuncional]. Permiten la entrada de linfocitos a la mucosa.
38

Una deciencia a nivel de integrinas puede causar una alteracin de la respuesta inmunitaria (p. ej., LAD; Eng: leukocyte-adhesion deciency). 72

Extravasacin/homing de linfocitos

Los homing receptors son aquellos que dirigen las subpoblaciones de linfocitos a un rgano linfoide concreto o a los lugares de inamacin. Estos receptores son distintos en las diferentes subpoblaciones de leucocitos y linfocitos (distintos, p. ej., entre T naive, efectores y de memoria). Las quimiocinas regulan la expresin y la anidad de los homing receptors39. Las vnulas de endotelio alto (HEV; Eng: high-endothelial venules) son unas clulas especializadas del endotelio vascular de las vnulas post-capilares de los rganos linfoides (excepto bazo). Disponen de toda una serie de molculas de adhesin, algunas tejido-especcas (adresinas vasculares) que permiten una extravasacin de un gran nmero de linfocitos por segundo. Esta extravasacin est regulada por las citocinas producidas en respuesta a la captura de un antgeno. A continuacin veremos como un T naive puede extravasarse a travs de una HEV. En primer lugar hay una interaccin entre la L-selectina y CD34 (HEV). Esto une el T naive dbilmente a la HEV. En segundo lugar una quimiocina expresada por la HEV inducir un cambio en la conformacin de la integrina LFA-1 del T naive, lo que har que la clula T se una fuertemente a la HEV gracias a la interaccin entre LFA-1 e ICAM-1 (HEV). Las clulas T efectoras y de memoria harn un homing dirigido al paso a tejidos especcos o inamados por medio de la interaccin entre receptores homing y molculas de adhesin especcas. A nivel del intestino, por ejemplo, es importante la interaccin entre LPAM-1 (T) y MadCAM-1 (endotelio). A nivel de la piel, es importante la interaccin entre CLA (T) y la E-selectina (endotelio) [vaya broma, de verdad me lo tengo que aprender?].
Recirculacin de los linfocitos

La recirculacin de los linfocitos es un mecanismo que incrementa las posibilidades de encuentro de un linfocito con el antgeno que reconoce especcamente. Eminentemente se basa en la extravasacin, el paso (mediado por molculas de adhesin) de linfocitos desde la sangre a los tejidos (linfoides y extralinfoides).
Molculas accesorias de la clula T

Las molculas accesorias de la clula T son una serie de protenas de membrana del linfocito T, diferentes del TCR40 que tienen un papel crucial en la respuesta al antgeno (activacin de la clula T). Interaccionarn con otras molculas (ligandos) de otras clulas (p. ej., CPA) y son no polimrcas e invariantes. La anidad del TCR por complejo MHC-pptido es baja en comparacin con la unin Ag-Ig o ligando-receptor; las molculas de adhesin (accesorias) aumentan la fuerza de interaccin entre cl. T y CPA. Un ejemplo de molcula accesoria clave es CD3, que permite la transduccin de seales. Sin CD3, no se expresa el TCR.
39

Con esto lo que se quiere decir es que, por ejemplo, la IL-8 puede hacer que las integrinas que presenta la membrana de un neutrlo cambien su conformacin y puedan interaccionar con las ICAM del endotelio.
40

Si nos jamos, el TCR apenas tiene residuos citoslicos ms all del dominio transmembrana. La activacin de la clula T (va de sealizacin intracelular) se dar gracias a las protenas que veremos a continuacin. 73

MOLCULES ACCESSRIES DE LA CL.LULA T

MolculasAugment accesorias de la clula T. Ya dinteracci las iremos viendo, pero se avanzaron que siguientes molculas de la fora entre la cl.lula T las i la cl.lula APC eran importantes: CD3, CD28 (que determina si el T naive se acaba activando), CD4, CD8, CD2 y diversas integri(integrines i ICAMs) nas. CD28 interaccionar con CD80/86 de la CPA, que tambin puede denominarse B7-1/2.

+ Transducci de senyals La activacin de una clula T naive requiere dos seales (smil de la guerra nuclear):

- Seal 1. Es la dependiente del antgeno (estmulo) y por tanto especca. TCR-Ag-MHC-

CD4/CD8. - Seal 2. Independiente del antgeno (coestmulo). CD28-CD80/86 (o B7-1/2). Las clulas que no expresen B7 no podrn activar un gran nmero de T naive. Las clulas activadoras de T naive por antonomasia son las clulas dendrticas maduras. Los LB y los macrfagos 41 tambin pueden llegar a activar T naive. Los T efectores y los de memoria ya no precisan del seal coestimulador. Si la clula T naive recibe un estmulo antignico en ausencia de coestmulo, no podr volver a ser activada aunque reciba un nuevo estmulo + coestmulo (base para la tolerancia perifrica a antgenos propios); el T naive en este caso habr entrado en anergia.

41

Los macrfagos tambin pueden expresar B7, aunque en menor cuanta. No podrn activar demasiados T naive ya que el macrfago no puede migrar, reside en el tejido al que se ha extravasado (y hay pocos naive en los tejidos periricos). 74

14. ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS T Introduccin

La activacin es una fase que va entre la fase de reconocimiento (CPA o clula diana que interacciona con la clula T) y la fase efectora (proliferacin, diferenciacin y funciones efectoras). La interleucina 2 (IL-2) ser esencial para que se d esta proliferacin, ya que permite el paso del linfocito T de G0 a G1. El T naive migrar al ganglio linftico, interaccionar con una clula dendrtica que le presentar el antgeno y se producir la activacin. Una vez activada, las clulas efectoras que se forman migrarn al tejido donde est la infeccin, donde se producir una segunda activacin (ya sin que se necesite el coestmulo).
Formacin de la sinapsis inmunolgica

Antes del reconocimiento del antgeno, los receptores de la clula T y sus ligandos en la CPA estn dispersados por la membrana plasmtica de las dos clulas. Cuando se da el reconocimiento del antgeno, habr una redistribucin de molculas dando lugar a un rea concreta de contacto clula-clula (sinapsis inmunolgica). Esta sinapsis consta de dos partes: un crculo central (cSMAC; Eng: central supramolecular activation cluster) y un anillo perifrico (pSMAC; Eng: peripheral supramolecular activation cluster). En el crculo central est el TCR (en T) y el MHC (en la CPA) mientras que en el anillo perifrico estn las molculas de adhesin.
Complejo TCR-CD3

CD3 es un dmero formado por dos de cinco cadenas polipeptdicas invariantes; los dmeros pueden ser (o ), y . Dispone de unos dominios ITAM (Eng: immunoreceptor tyrosine based activation motif) citoslicos que contienen residuos Tyr a una cierta distancia unos de otros que pueden ser fosforilados y as reclutar a diferentes sustratos relevantes para la sealizacin de la clula T. CD3 no tiene actividad enzimtica y es necesario para la expresin del TCR en la membrana (y que ste sea estable). Funciones de los motivos ITAM Las funciones de los motivos ITAM son las siguientes: (a) Importantes en la transmisin de seales. Permite que la interaccin antgeno-TCR d lugar a una respuesta intracelular mediada por estos dominios. (b) Sustrato y ligando de protenas-tirosina-cinasas (PTK). Las tirosinas son el sustrato de PTKs de la familia Src (como lck y fyn) o bien un ligando para la familia de las Syk (como ZAP-70). (c) Multiplicidad vs especicidad de las ITAM. Sern importantes para la amplicacin y la diversicacin de la seal.

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Transduccin de seales por el TCR/CD3. Va Ras-MAPK

Cuando se produce la interaccin entre el TCR y el antgeno la membrana de la clula T sufre una redistribucin de las molculas formndose la sinapsis inmunolgica. Esta recolocacin permite que las PTKs lck y fyn puedan fosforilar los dominios ITAM de CD3. Atencin, lck est asociada con CD4/8. Estas tirosinas fosforiladas sern el ligando al que se unirn los dominios SH242 de ZAP70. Esta PTK se caracteriza por tener dos dominios SH2 a una distancia determinada, lo que le permite interactuar especcamente con un dominio ITAM en concreto. Uno de los sustratos de ZAP70 ser la protena de membrana adaptadora LAT, que dispone de un dominio citoslico rico en tirosinas. Por protena adaptadora entendemos que est constituida por dominios de interaccin protena-protena. Las fosfotirosinas de LAT sern el punto de unin de otras protenas, como por ejemplo la fosfolipasa C (PLC). Como resultado de todas estas fosforilaciones y reclutamientos, llegaremos a la activacin de toda una serie de vas intracelulares por medio del incremento del Ca2+, y se Cinasas implicadas en la activacin de la clula T. Se puede ver de qu domiproducirn cambios en el citoesqueleto de actina. Ya que nios consta cada una de las cinasas. hemos hablado de los dominios SH2, comentar que en algunas protenas de estas vas de transduccin encontraremos los dominios SH3, que reconocen zonas ricas en prolina presentes en otras protenas (median, por tanto, interacciones entre protenas). Volviendo a LAT, sus fosfotirosinas pueden servir para unir la protena GRB2, que dispone de un dominio SH2 para ello. GRB2 adems dispone del dominio SH3 (dispone de dos) que acabamos de comentar, por lo que podr unirse a una zona rica en prolina presente en la protena SOS. Esta ltima protena induce el intercambio del GDP de Ras a GTP, activando a esta protena G monomrica e induciendo la va de las MAPK (Ras-GTP libera a Raf y se une a ella Raf fosforila MEK MEK fosforila a ERK-1,2). En ltimo trmino se produce la sntesis y activacin de factores de transcripcin (TF).
Regulacin del metabolismo de los fosfoinositoles y el Ca2+ (Fig. 7-15 Abbas 7a ed)

La PLC hidrolizar el fosfatidil-inositol-(4,5)-difosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG), que permanecer en la membrana, y en inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3), que ir hacia el retculo endoplasmtico y abrir unos canales de Ca2+, incrementando la concentracin intracelular del mismo. Este incremento del Ca2+ citoslico se producir en poco tiempo y adems se mantendr durante una hora gracias a que la protena STIM1 del retculo interactuar con el canal
Los dominios SH2 tienen una alta anidad por las fosfotirosinas. Su nombre procede de uniones con homologa a Src, el primer oncogen descubierto (ratn). 76
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CRAC de la membrana plasmtica, un canal de calcio que permitir el paso de calcio extra-

celular al citosol. Huelga decir que el incremento del Ca2+ citoslico mediar una respuesta celular.

Transduccin de seales por TCR/CD3 (va Ras-MAPK). Esta imagen corresponde al aparado anterior. Ntese como ZAP-70, una vez acoplada a los dominios ITAM de (en este caso) , ha podido tambin fosforilar a la fosfolipasa C1.

Factores de transcripcin implicados

Los diferentes factores de transcripcin activados y translocados al ncleo se unirn al promotor de un gen. A continuacin veremos algunos: - Jun. Ras-GTP permitir que JNK fosforile a Jun y as ste pueda translocarse al ncleo. Para activarse precisar de la protena Fos. Fos-Jun-P se unir al promotor del gen de la interleucina-2, permitiendo que se forme el mRNA de IL-2 (ser uno de tantos TFs que se unen a ese promotor). - ELK. Ras-GTP permtir que ERK fosforile a ELK. En su forma fosforilada, ELK se translocar al ncleo y se unir al promotor del gen fos, dando lugar a la protena Fos en ltimo trmino. - NFAT. A diferencia de otros TFs, NFAT est fosforilado en el citosol e inactivo. Cuando la concentracin de Ca2+ citoslico incrementa, la calmodulina se unir a la calcineurina (S/T fosfatasa), y sta a su vez desfosforilar a NFAT. NFAT ser uno de los TFs implicados en la regulacin del gen IL-2. Sin la expresin de NFAT no podr formarse IL-2, por lo que la clula T no se podr activar. - NF-B. El factor de transcripcin NF-B est secuestrado en el citosol porque est unido a IB. Una vez fosforilamos a este protena secuestradora, IB es degradada y NF-B puede translocarse al ncleo, donde ir al promotor del gen de la IL-2.
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Detalle de las diferentes vas de activacin de los factores de transcripcin implicados en la expresin de genes de la respuesta inmunitaria. Hay un error, Ras-GDP no activa a ERK, es Ras-GTP

Activacin de la clula T por CD28

Las clulas T naive no se activarn nicamente con la interaccin entre su TCR y el MHC que presente un pptido especco, precisan adems de una seal coestimuladora (CD80/86; B7-1/2). Si esto no se da as, la clula T entrar en un estado de anergia. Las molculas B7 estn en la CPA, generalmente una clula dendrtica, e interactuarn con CD28, presente en la membrana de la cl. T. La va de transduccin generada a partir de este contacto y a las vas ya vistas por la interaccin entre el TCR y el antgeno dan lugar a tres efectos principales: (a) Supervivencia celular. Por incremento de la produccin de genes antiapoptticos como Bcl-xL y Bcl-2. (b) Proliferacin celular. Por el incremento de la formacin de IL-2, la sntesis del receptor de dicha interleucina (IL-2R), la formacin de ciclinas y la disminucin de los inhibidores del ciclo celular. (c) Diferenciacin a clula efectora y de memoria. A travs del mltiples mecanismos.
Funcin de CD40 en la activacin de la clula T

Cuando una cl. T reconoce a un antgeno, haya o no coestimulador, se inducir la expresin en la misma del ligando CD40 (CD40L). Este ligando interactuar con CD40 de la clula dendrtica, lo que har que sta forme B7 as como tambin libere citocinas encargadas de estimular la proliferacin y diferenciacin de la clula T.
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Papel de CTLA-4

Tras la activacin de la clula T, sta acabar expresando la protena de membrana CTLA-4 con el n de controlar la respuesta (es un inhibidor del linfocito T). Esta inhibicin se realiza por medio de desfosforilaciones, de impedir que se formen los IP3, etc.

Inhibicin de la transduccin de seales. A continuacin se muestran mecanismos para inhibir la transduccin de seales. (izquierda) Se puede observar como se reclutan protein-tirosina-fosfatasas (SHP1/2) para desfosforilar las fosfotirosinas. Estas fostasas se reclutan en los dominios ITIM (Eng: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. (derecha) Se puede observar como se reclutan ubiquitin-ligasas (como Cbl-b) que se encargan de, por ejemplo, mandar a degradar la ZAP-70. Adems de los ITIM estn los ITSM, que tendran una doble funcin, tanto activar como inhibir (Eng: immunoreceptor tyrosine-based switch motif).

Superantgenos

Los superantgenos (p. ej., staphylococcal enterotoxins; alimentos) son protenas virales o bacterianas que se unen simultneamente a la cadena del MHC de clase II y al dominio V del TCR. Son peligrosos ya que pueden hacer que haya una activacin policlonal del 5% de TH, lo que conlleva una sobreproduccin de citocinas y una toxicidad sistmica.
Ciclosporina: inhibe a la calcineurina para que NFAT no se desfosforile y as no se forme IL-2, evitando la activacion de las clulas T. sta y FK506 son frmacos inmunosupresores. Otros mecanismos en la diapositiva.

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15. ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS B Introduccin

La mayor parte de los linfocitos B precisan contactar con el antgeno y con otro estmulo, como una interaccin con un linfocito T colaborador, para activarse. Estas dos seales harn que el LB abandone su estado de quiescencia (Go) y que entre en el ciclo celular, dando lugar a la expansin clonal. Los productos de esta expansin clonal son clulas plasmticas (o efectoras) que han incrementado la anidad de su BCR (hipermutacin somtica), han sufrido un cambio de isotipo o bien son clulas B de memoria. Adems del TH y del antgeno, que hacen que el LB entre en el ciclo, se precisan toda una serie de seales de progresin que hacen que el proceso aqu explicado siga adelante (citocinas y otros elementos).
Subpoblaciones de Bs

Tenemos dos grandes poblaciones de linfocitos B: B1 y B2; y los B2 pueden distinguirse en B2 foliculares y B2 de la zona marginal. Los B2 foliculares estn presentes en el bazo y otros rganos linfticos, y para ser activados precisan de una interaccin con un TH adems de con el antgeno. Los B2 de la zona marginal (tambin tpicos del bazo y otros rganos linfticos) y los B1 (mucosas, peritoneo) son T-independientes43 y forman clulas plasmticas secretoras de IgM y de vida corta (el pie de pgina aclara bastante).

Diferentes subgrupos de linfocitos B median diferentes tipos de respuestas de anticuerpos. Los LB foliculares son clulas recirculantes que reciben ayuda del LT cuando responden a antgenos protenicos, y as inician respuestas de anticuerpos dependientes de T. Estas respuestas pueden llevar a la formacin de centros germinales, donde puede producirse el cambio de clase y la mutacin somtica del gen del anticuerpo, lo que da lugar a respuestas especializadas de anticuerpos de anidad alta. Las respuestas independientes de T frente a antgenos multivalentes, como los lpidos, los polisacridos y los cidos nucleicos, estn mediadas, sobre todo, por LB de la zona marginal en el bazo y B1 en las mucosas.
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Las respuestas de anticuerpos frente a antgenos multivalentes (que presentan varios eptopos idnticos) no protenicos como los polisacridos, algunos lpidos y los cidos nucleicos, no requieren T cooperadores especcos frente al antgeno. 80

Activacin de un linfocito B por un antgeno timo dependiente (v. Fig. 11-7 Abbas)

Remito al tema 8 (Ontogenia de los linfocitos B), aunque no sin antes hacer una aclaracin adicional. Cuando se produce la interaccin entre linfocitos B y linfocitos T, algunos de los LT pueden diferenciarse en linfocitos T foliculares colaboradores (TFH). stos migrarn al folculo para activar a los LB. En los folculos se formarn los centros germinales, lugares de extensa proliferacin de los linfocitos B, cambio de isotipo, mutacin somtica, acontecimientos selectivos que conducen a la maduracin de la anidad, la generacin de linfocitos B de memoria y la induccin de clulas plasmticas de vida larga que migran a la mdula sea.
Complejo BCR

El BCR no es ms que la forma de membrana de un anticuerpo (mIgM). Como estas formas tienen una parte intracelular ms bien corta (tres aas), no se puede dar la transduccin de la seal. En su lugar, la transduccin de la seal fruto de la interaccin entre Ig y Ag se realizar gracias a dos molculas, Ig e Ig, unidas entre s por enlaces disulfuro y que se expresan en los LB asociadas de forma no covalente a la Ig de membrana. Estas protenas contienen un dominio ITAM en su cola citoplasmtica y van a ser necesarias para el transporte de molculas mIg hacia la supercie celular. La suma de estas dos protenas junto a la Ig de membrana de turno (en funcin de si ha habido cambio de isotipo o no) constituye el complejo receptor del linfocito B (BCR).
Complejo receptor para el antgeno del linfocito B. La IgM de membrana (y la IgD) en la supercie de los LB maduros se asocia a las molculas invariantes Ig e Ig, que contienen ITAM en sus colas citoplasmticas, que median la transmisin de seales.

Transduccin de seales por el complejo BCR/Ig/Ig

La transduccin seales se inicia cuando se produce el entrecruzamiento entre el BCR y un antgeno multivalente, permitiendo que cinasas de la familia Src (como Lyn, Blk y Fyn) unidas a la membrana puedan fosforilar las tirosinas de los dominios ITAM de la Ig e Ig. Una vez fosforiladas, stas sern el punto donde se acoplarn protenas con dominios SH2, como la tirosina cinasa Syk (que tiene dos dominios SH2 en tandem). La interaccin con las fosfotirosinas activa a la cinasa, que empezar a fosforilar a toda una serie de sustratos intracelulares. En el caso en el que el antgeno sea monovalente (incapaz de entrecruzar mltiples molculas de Ig), se puede producir la sealizacin intracelular pero puede ser necesaria una activacin adicional derivada de los TH para activar completamente al linfocito B.
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Una de las molculas que participa en la va de transduccin de seal es la btk (Brutons tyrosine kinase). Una mutacin en el gen que codica esta protena puede producir un defecto en la transduccin de seales, comprometiendo la activacin de la clula B. Esto es lo que se conoce como agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (no hay Ig en el suero).

Transduccin de seales por el complejo BCR. La tirosina cinasa Syk fosforilar a la protena adaptadora SLP65, que est unida a la btk que hemos comentado en el cuerpo del texto. La fosforilacin de SLP-65 permite que se una Grb2, y sta recibir a SOS, un intercambiador de nucletidos de guanina. Ras-GTP activar la cascada MAPK. La PLC que aqu se muestra es la isoforma 2 (la 1 es la tpica de los LT). Esta fosfolipasa liberar IP3 (que incrementar el Ca2+ citoslico) y DAG (que activar a la PKC). Como resultado nal tenemos la activacin de una serie de factores de transcripcin que modularn la expresin gnica.

Transduccin de seales por el correceptor de la cl. B (complejo CR2, CD19 y CD81/TAPA1)

La clula B dispone de un correceptor formado por el receptor del complemento CR2, CD19 y CD81 (o TAPA1). CR2 se unir al fragmento C3b que estar unido a un microorganismo (que puede tener eptopos susceptibles a ser reconocidos por el BCR tambin). CD19 dispone de un dominio citoslico ITAM que permite, una vez fosforilado por Syk, el reclutamiento de la PI3-cinasa (que fosforilar a toda una serie de sustratos intracelulares, favoreciendo la activacin del LB). La cola fosforilada de CD19 tambin permite un mejor reclutamiento de Lyn, que si recordamos es la encargada de fosforilar los dominios ITAM de Ig/Ig. Generalmente el linfocito B sufrir simultneamente las dos vas de sealizacin: (1) BCR; (2) correceptor de la clula B. Esto es especialmente til cuando hay poca cantidad de antgeno.
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Papel del complemento en la activacin del linfocito B. Los antgenos microbianos que se han unido al fragmento del complemento C3b pueden unirse simultneamente a la molcula CR2 y a la Ig de membrana en la supercie de un linfocito B. Esto inicia las cascadas de transmisin de seales a partir del complejo BCR y el complejo CR2, debido a lo cual la respuesta a los complejos C3b-antgeno aumenta mucho en relacin con la respuesta al antgeno solamente. Este sera un buen ejemplo de relacin entre la inmunidad innata (complemento) y la adaptativa. (creo que es C3b y no C3d)

Los TLRs tambin pueden tener un efecto similar al producido por la interaccin entre antgeno-C3b y correceptor de la clula B: amplicar la seal. Una vez se produce la activacin del BCR, habr toda una serie de respuestas funcionales: (a) supervivencia; (b) proliferacin; (c) expresin de B7-1/2; (d) expresin de reptores de citocinas; (e) expresin de CCR7 y migracin desde el folculo hacia zonas donde haya linfocitos T. Como vemos, el LB se empieza a preparar para su interaccin con los linfocitos colaboradores.
Activacin del linfocito B mediada por el linfocito T

Se trata de un proceso que consta de las siguientes etapas: (A) En primer lugar se produce el entrecruzamiento (crosslinking) entre antgeno y mIg [seal 1] Esto producir un incremento en la expresin de MHCII y de B7. A continuacin se producir la internalizacin de los complejos mIg-Ag (endocitosis mediada por receptor) y posterior degradacin para que as se pueda presentar en la membrana el complejo MHCII-pptido. (B) Llegados a este punto, el TH ser capaz de reconocer el antgeno presentado por la molcula de MHCII y gracias a las seales coestimuladoras (B7-CD28), se dar la activacin de la clula T.
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(C) La clula TH expresar el ligando CD40L, que interaccionar con CD40 de la clula

B. Esta es la seal 2. (D) Fruto de esta interaccin la clula B formar receptores de citocinas y la clula T expresar citocinas (IL-2, IL-4,). Estas citocinas secretadas son seales que promueven la proliferacin, diferenciacin, cambio de isotipo, maduracin de la anidad y la memoria de la clula B. La respuesta humoral de la clula B frente a antgenos proteicos precisa, por tanto, de tres eventos: (a) reconocimiento del Ag por la LB; (b) reconocimiento del Ag por el TH; (c) cooperacin entre LT y LB especcos para el antgeno. Todo se da gracias a interacciones bidireccionales (MHCII-Ag/TCR-CD4; CD40/CD40L; B7/CD28) y monodireccionales (las citocinas liberadas por el TH). En funcin de las citocinas a las que quede expuesta la clula B se producir un cambio de isotipo u otro. En un principio, los LB forman IgM pentamricas. A partir de aqu pueden suceder tres cosas: - Exposicin a IFN. Se producir un cambio hacia IgG (principalmente IgG1 e IgG3). Estas Ig pueden interaccionar con receptores de la Fc de las Ig presentes en macrfagos. Participan en la activacin del complemento y en la inmunidad neonatal. - Exposicin a IL-4. Se producir un cambio hacia IgE, que est relacionada con procesos de hipersensibilidad (liberacin de grnulos por parte de los mastocitos) y defensa contra parsitos. - Exposicin hacia citocinas que suelen estar en mucosas (TGF-). Se producir un cambio hacia IgA, importante para la inmunidad de las mucosas. Para que el cambio de isotipo, adems de ser necesarias estas citocinas, es importante que se produzca la interaccin entre CD40 y CD40L. Si no se da (por una deciencia en CD40L), entonces no habr cambio de isotipo, ni hipermutacin somtica ni se formarn clulas de memoria. Esto es lo que se conoce como sndrome de hiper-IgM ligado a X.
Activacin de un LB por antgemos timo independientes

Los antgenos timo independientes (antgenos TI-1) son antgenos no proteicos (polisacridos, lpidos, cidos nucleicos) que se entrecruzan (crosslinking) con mltiples mIg y que pueden activar al complemento. Pese a poder inducir una activacin policlonal, no lograrn que se d un cambio de isotipo, ni una maduracin de anidad, ni se generar memoria ni habr una respuesta secundaria (en cambio, todo esto s que se da en el caso de que la clula B haya sido activada por un antgeno TD o timo dependiente).
Regulacin de la activacin de la clula B

En el sistema inmunitario es tanto o quiz ms importante la activacin como el control de la activacin. A continuacin se van a discutir toda una serie de mecanismos que participan en la regulacin de la activacin de la clula B.
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- Feedback negativo por anticuerpos a travs de FcR. Simplicando mucho se basara en una

inhibicin por producto. La Ig secretada inhibir la activacin continuada de la clula B formando complejos que se unen simultneamente al BCR y a los receptores FcRIIB. Este ltimo receptor tiene un motivo ITIM que sirve de punto de unin para tisosina fosfatasas como SHIP (que desfosforilarn las fosfotirosinas del complejo BCR). - Receptor CD22. El receptor CD22 de la clula B contiene tambin dominios ITIM que son el punto de unin para tirosina fostatasas (SHIP-1). - Competicin antignica. La exposicin a un antgeno competitivo puede regular la respuesta a un antgeno no relacionado por el cual se d una reaccin cruzada. La exposicin previa a un antgeno puede dar lugar a la tolerancia y a la generacin de clulas de memoria (ni idea).
Regulacin de la activacin del LB por FcRIIB. Los complejos Ag-Ig pueden unirse simultneamente a la Ig de membrana (a travs del antgeno) y al receptor FcRIIB a travs de la porcin Fc del anticuerpo. Como consecuencia de esta unin simultnea de receptores, las fosfatasas asociadas a la cola citoplasmtica del receptor de la Fc inhiben las seales producidas por el complejo BCR y bloquean la activacin del LB.

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16. CITOCINAS Introduccin

Las citocinas son protenas reguladoras de bajo peso molecular asociadas a muchos tipos celulares distintos (tanto del sistema inmunitario como no) y secretadas en respuesta a diferentes estmulos. Las citocinas controlan la proliferacin, la diferenciacin, y el desarrollo, intensidad y duracin de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Intervienen, por tanto, en la regulacin de la hematopoyesis, de la inamacin y de la inmunidad. Las interleucinas son citocinas producidas por leucocitos que actan sobre otros leucocitos. Las quimiocinas son citocinas que afectan a la quimiotaxis y al trco de los leucocitos (entre otras funciones). Tan importante es la seal (citocina) como el receptor que la recibe. La expresin de receptores de citocinas permite que una clula pueda responder ante stas.
Estmulo inductor (PAMPs, DAMPs, antgeno, citocina) afecta a una clula productora de citocinas formacin de citocinas recepcin de la citocina por parte de una clula diana transduccin y cambios en la expresin gnica efecto biolgico (respuesta).

Propiedades de las citocinas

Las citocinas pueden tener una accin autocrina, paracrina o incluso endocrina. No obstante, principalmente se van a dar los dos primeros casos. Para que haya una accin endocrina debe haber una estimulacin persistente (y generalmente suele ser transitoria). Las citocinas tienen cuatro propiedades principales. - Pleiotropa. Es la capacidad para actuar sobre distintos tipos celulares y mediar diversos efectos biolgicos. P. ej., la IL-4 activa e induce la proliferacin y la diferenciacin de los linfocitos B; mientras que a los timocitos y a los mastocitos nicamente estimula la proliferacin.

- Redundancia. Muchas citocinas tienen los mismos efectos funcionales. - Sinergia. Dos o ms citocinas pueden tener un efecto superior que individualmente. - Antagonismo. La accin de unas citocinas es inhibida por otras (se dar aquel efecto

biolgico provocado por la citocina que est en mayor cuanta). Muchas veces las citocinas actan en forma de cascada; es decir, que una citocina estimula la sntesis de otra citocina o bien inuye sobre su accin. Como ejemplo tenemos el eje THmacrfago. Una clula TH(1) activada libera IFN, el cual es recibido por el macrfago y ste, como respuesta, liberar IL-12. La IL-12 ser clave para conectar la inmunidad innata con la adaptativa, puesto que activar a los linfocitos T colaboradores e inducir una diferenciacin hacia un perl TH1.
Citocinas en la hematopoyesis

Hay toda una serie de citocinas que son importantes para la hematopoyesis. Si nos centramos en la lnea mieloide, se precisa IL-3, IL-6 y GM-CSF para el paso del progenitor mieloide hacia tipos celulares ms diferenciados. Dentro de la misma lnea mieloide, la IL-5 ser im86

portante para la formacin del progenitor eosinlo, y la IL-3 para el paso del progenitor de granulocitos-monocitos a neutrlo. Si nos centramos en la lnea linfoide, la IL-7 es importante para la formacin tanto de linfocitos B y T.
Citocinas en el desarrollo de las subpoblaciones de linfocitos T

La activacin de un linfocito T naive precisa de una doble seal tal como vimos en captulos anteriores. Ahora bien, si bien esta activacin promueve la diferenciacin, no la determina hacia ningn perl en concreto. Las citocinas sern las encargadas de determinar el destino de la diferenciacin. Estas citocinas pueden ser secretadas por la propia clula presentadora de antgeno (como una cl. dendrtica) u otras que estn en el medio. - Linfocito Treg. El TGF liberado por los macrfagos de perl M2 (antiinamatorio) estimular esta clase de diferenciacin. Los Treg libera a su vez el mismo TGF y tambin IL-10. - Linfocito TFH. Estos linfocitos son los que estn presentes en el centro germinal y los que favorecen la diferenciacin de las clulas B. IL-6 es la encargada de estimular la diferenciacin hacia esta clase de linfocito. - Linfocito TH1. Tanto esta poblacin como la siguiente (TH2) fueron las dos primeras subpoblaciones de linfocitos T que se descubrieron. En este caso, IL-12 (macrfagos M1) e IFN favorecer esta clase de difenciacin. Los TH1 forman IL-2 e IFN. - Linfocito TH2. Esta clase de diferenciacin se favorece por medio de la IL-4. Produce IL-4 e IL-5. Las poblaciones TH1 y TH2 se encuentran en equilibrio. La IL-4 que estimula la diferenciacin hacia TH2 inhibe la diferenciacin a TH1. Con el IFN ocurre algo similar: favorece la diferenciacin hacia TH1 e inhibe la diferenciacin a TH2. - Linfocito TH17. Esta poblacin se denomina as porque forma IL-17 (e IL-6) La diferenciacin hacia este perl se da gracias a la exposicin a IL-1, IL-6 (citocinas proinamatorias) y TGF (esta ltima de forma indirecta) Adems de todas las interleucinas que hemos comentado que son importantes para hacer que el linfocito T se diferencia hacia un perl u otro, se necesita la IL-2 en todos los casos. Una manera de distinguir las distintas subpoblaciones es observar los factores de transcripcin que se activan y translocan cuando las citocinas interactan con su receptor.
Citocinas de la inmunidad innata y adaptativa Inmunidad innata Inmunidad adaptativa Citocinas Sntesis Funciones TNF, IL-1, IL-6, IFN/, IL-12, IL-10, quimiocinas Macrfagos, dendrticas, NKs Mediadiores de la inmunidad innata y la inamacin (local y sistmica) PAMPs, DAMPs Elevada; detectable en suero Sistmicas (p. ej., shock sptico) Corticoesteroides 87 IL-2, IL-4, IL-5, IFN, TGF Linfocitos T Proliferacin y diferenciacin del linfocitos; activacin de clulas efectoras (macrfagos, eosinlos, mastocitos) Antgenos proteicos Generalmente local Herida tisular local (granuloma, inamacin) Ciclosporina, FK-506

Estmulos Concentracin Enfermedades Inhibidor sntesis

Funciones del TNF, IL-1 e IL-6

El TNF, la IL-1 y la IL-6 son los principales mediadores de la respuesta inamatoria aguda (tienen funciones redundantes). Favorecen el reclutamiento y la activacin de neutrlos y macrfagos. Activan las clulas endoteliales, lo cual favorece la inamacin y la coagulacin. Sobre la mdula sea estimula una hematopoyesis dirigida hacia la formacin de neutrlos. Sobre el hipotlamo estimulan la ebre. Sobre el hgado favorece la sntesis de protenas de la fase aguda. Sobre el msculo y el tejido adiposo favorece el catabolismo y una resistencia a la insulina. Sobre muchos tipos celulares favorecen la apoptosis. A nivel cardaco puede incrementar la frecuencia cardaca.
Exceso de citocinas. Una cantidad elevada de citocinas puede tener efectos muy perjudiciales para el organismo (shock sptico o tormenta de citocinas). Un shock txico podra darse por los superantgenos (activacin parcial de la poblacin de linfocitos T).

IL-12

La IL-12 es liberada por macrfagos y clulas dendrticas activadas gracias a los receptores de patrones comunes. sta actuar sobre clulas NK, linfocitos T citotxicos (incrementa su capacidad citotxica) e inducir el paso de linfocito T a linfocito TH1. Estas tres clulas liberarn el famoso IFN, que activa a los macrfagos44 (se establece un feedback positivo). Se la considera como el principal mediador clave de la respuesta innata frente a patgenos intracelulares. Es un regulador clave de la inmunidad adaptativa celular.
Funciones de los interferones de tipo I

A veces los patgenos intracelulares, como los virus, no son bien eliminados por las especies reactivas del oxgeno. Para destruirlos entonces se recurre a otros mecanismos, como los interferones /, que se agrupan bajo la familia de interferones de clase I. Estas molculas son liberadas eminentemente por las clulas dendrticas plasmacitoides y tambin algunos tipos de clulas epiteliales. Los interferones de clase I afectan a todos los tipos celulares promoviendo un estado antiviral (incremento de la expresin de MHC I e inhibicin de la replicacin viral). Adems, se estimula la activacin de las clulas NK.
IL-2

La IL-2 es producida principalmente por los linfocitos T CD4+ una vez que stos han interactuado con el antgeno. El receptor de la IL-2 est formado por tres protenas asociadas no covalentemente: IL-2R, IL-2/15R y c. De las tres cadenas. slo IL-2R es exclusiva del IL-2R. La IL-2 se une al a cadena sola con baja anidad, y esto no produce ninguna transduccin de seales citoplasmtica detectable ni ninguna respuesta biolgica. Sern las otras dos protenas las encargadas de activar la va de transduccin de seales.

44

Estrictamente, parece ser que estimula la expresin de los mecanismos microbicidas (iNOS). 88

Un linfocito T en reposo (naive) expresar, en un principio, en su membrana nicamente el complejo IL-2Rc (solamente las cadenas y ). Este complejo puede unirse a la IL-2 con una Kd de aproximadamente 10-9 M. La expresin de la cadena , inducida por estimulacin antignica, harn que el complejo receptor pueda unirse a la IL-2 con mayor avidez (Kd = 1011 M aprox). Con esto aseguras que nicamente los linfocitos especcos para un determinado antgeno capten la mayor parte de IL-2.

Regulacin del receptor para la expresin de la IL-2. Los linfocitos T en reposo (vrgenes) expresan el complejo IL-2R, que muestra una anidad moderada por la IL-2. La activacin de los linfocitos T por el antgeno, los coestimuladores y la propia IL-2 lleva a la expresin de la cadena IL-2R y de cantidades altas del complejo IL2R de anidad alta.

Y qu hace la IL-2? Pues tiene una multitud de acciones biolgicas, quiz la ms destacable es que
induce la proliferacin y diferenciacin tanto de los linfocitos T como B activados por antgeno. Tambin

induce la proliferacin y la diferenciacin de las clulas NK. Finalmente, tambin potencia la apoptosis de aquellas clulas T activadas por antgeno de forma constante (expresin de Fas y FasL) 45.
Acciones biolgicas de la IL-2. La IL-2 estimula la supervivencia y la proliferacin de los linfocitos T, con lo que acta como un factor autocrino de crecimiento. La IL-2 tambin mantiene funcionales a los linfocitos T reguladores, y as controla las respuestas inmunitarias (p. ej., contra antgenos propios). Hay Treg especcos para un antgeno).
45

Hemos de pensar que un estmulo persistente quiz lo es porque en realidad es un estmulo propio. Se tratara por tanto de un mecanismo de tolerancia perifrica. 89

Interfern

El interfern (o interfern de tipo II) desempea un papel clave tanto en la respuesta inmunitaria innata como en la adaptativa. En primer lugar, es un activador de los macrfagos (favorece la actividad microbicida) y de las clulas NK. En segundo lugar estimula la diferenciacin de los T hacia un perl TH1 e inhibe la diferenciacin hacia TH246 . En tercer lugar favorece la expresin de MHCI/II en las CPA. Finalmente, tambin promueve en linfocitos B cambios hacia isotipos opsonizantes (IgG2a, IgG3). Recordemos que es liberado por TH1, NK y TCD8+.

Acciones biolgicas del IFN. El IFN activa a los fagocitos y las CPA (que expresen ms MHC) e induce el cambio en los LB a algunos isotipos de Ig que con frecuencia se unen al complemento y a los receptores de la Fc de los fagocitos (diferentes a los isotipos que induce la IL-4). El efecto inductor de los TH1 del IFN puede ser indirecto, mediado por un aumento de la sntesis de la IL-12 y de la expresin del receptor.

IL-4

Es formada por los TH2, mastocitos y baslos. Se trata de un antagonista del IFN, por lo que inhibe las reacciones de la inmunidad celular. Promueve, en los LB, el cambio hacia isotipos no opsonizantes como IgE (a pesar de tener receptores para la Fc) e IgG4. Tiene una accin proliferativa autocrina para los TH2 (es esencial para la diferenciacin haia este perl.
IL-5

La forman las clulas TH2 CD4+. Promueve la activacin, la proliferacin y la diferenciacin de los eosinlos. Promueve la proliferacin de los linfocitos B y un cambio de isotipo hacia la IgA (inmunidad de las mucosas).
46

Osea, que promueve las reacciones inamatorias medidas por macrfagos e inhibe las dependientes de IgE. 90

TGF

El TGF es formado por macrfagos (M2) y otras clulas (queratinocitos, Treg). Junto con la IL10 regulan de manera negativa la respuesta inmune (inhibe la proliferacin y activacin de linfocitos y otros leucocitos). Estimula la produccin de IgA (inmunidad de las mucosas).
IL-10

La IL-10 es formada por macrfagos y por linfocitos TH2 (caray, y antes no se dice). Inhibe a los macrfagos activados y a las clulas dendrticas. Adems, tambin inhibe la expresin de IL-12, la expresin del MHC II y los coestimuladores. Como vemos, la IL-10 es importante para regular las reacciones de la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa celular.
Receptores de citocinas

Las citocinas nicamente podrn afectar a una clula si sta expresa en su supercie receptores para dicha citocina. Existen diferentes familias de receptores de citocinas: (a) de tipo I; (b) de tipo II; (c) receptor de la familia TNF; (d) receptor de la familia IL-1; (e) receptores con 7 dominios transmembrana acoplados a protenas G.

Familias de receptores para citocinas. Los receptores para diferentes citocinas se clasican en familias en funcin de dominios extracelulares conservados y de mecanismos transmisores de seales Las citocinas u otros ligandos que se unen a cada familia de receptores se enumeran debajo de las guras.

Dentro de la familia de receptores de citocinas de tipo I, encontramos diferentes subfamilias: (a1) subfamilia del receptor de IL-2 [cadena c]; (a2) subfamilia del receptor de GM-CSF; [cadena ]; (a3) subfamilia del receptor de IL-6 [subunidad gp130]; Cada subfamilia tiene subunidades de sealizacin que son comunes (dentro de los miembros de una misma subfamilia). La cadena o subunidad entre corchetes tras cada subfamilia es la subunidad que se tiene en comn.

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Composicin de las subunidades de los receptores para citocinas. Los grupos de receptores para citocinas comparten cadenas de subunidades idnticas o muy homlogas.

Sealizacin de los receptores de citocinas de tipo I y II

La sealizacin intracelular se basa en la va JAK/STAT. Las protenas Jak (Janus kinase) tienen actividad tirosina cinasa y forman una familia formada por varios miembros, unos presentes en todos los tipos celulares (Tyk2, Jak1/2) y otros presentes en tipos celulares concretos, como Jak3, presente en clulas hematopoyticas. En cuanto a su estructura, las protenas Jak tienen unos dominios de unin al receptor y un dominio JH1 con la actividad tirosina cinasa que carateriza a esta familia47.

Receptor de citocinas. Vemos como el receptor de citocinas dispone de las protenas Jak en su dominio intracelular para que sus tirosinas puedan ser fosforiladas y que stas sirvan como punto de anclaje para protenas con dominios SH2.

El otro componente de la va es el factor de transcripcin STAT (Eng: signal transducers and activators of transcription) que adems de ser un TF puede actuar como molcula transductora de seales. Dispone de un dominio SH2 (de unin a fosfotirosinas), uno SH3 y una regin de unin al DNA.
47

Existe un dominio JH2 adyacente al JH1 que es pseudo-TK (no tiene actividad cataltica). 92

Cuando la citocina interacciona con su receptor, las JAK fosforilarn tirosinas presentes en el dominio citoslico de dicho receptor. Estas fosfotirosinas sern el punto de anclaje de las protenas STAT (a travs de SH2). Las propias STAT tambin sufrirn una fosforilacin (en tirosinas) por parte de JAK y entonces se dar una dimerizacin que preceder a la posterior translocacin al ncleo. Una vez en el ncleo, el dmero STAT se unir al DNA y regular la expresin gnica. Como hemos dicho antes, podemos hablar de tres clases de receptores de citocinas de tipo I en funcin de la cadena que tienen en comn (c, y gp130). Ser esta cadena la que se encargar de contactar con la cinasa (Jak), que fosforilar a un STAT especco. En clase se recalcaron cuatro interacciones.
Citocina Receptores de tipo I (cadena en comn ) IL4 Receptores de tipo I (subunidad gp130 en comn ) IL12 Receptores de tipo II IFN/ IFN JAK-cinasa Jak1, Jak3 Tyk2, Jak2 Jak1, Tyk2 Jak1, Jak2 STAT STAT6 STAT4 STAT1, STAT2 STAT1

El resto de receptores generalmente se asocian con STAT3 y 5. Los STATs diferencian tres grandes poblaciones de linfocitos T. TH1 se asocia con STAT4, TH2 con STAT6 (vemos su relacin con IL-4).
Bloqueo de STAT4. No dispondremos de TH1. Bloqueo de STAT3. El ratn no llegar a nacer puesto que este factor de transcripcin participa en las vas de sealizacin de varias citocinas y adems tambin es importante en la hematopoyesis. Bloqueo de STAT1/2. Este factor participa principalmente en la sealizacin de los interferones. Sin ste, el individuo no podr defenderse de las infecciones, pero podra vivir perfectamente en un ambiente asptico.

En la inmunodeciencia combinada severa (SCID) hay un defecto tanto en la cadena c (comn a varios receptores de citocinas) como de Jak3. En la SCID estn afectados tanto los linfocitos B como los T. Hay virus que evitan el sistema inmunitario por medio de mecanismos basados en las interleucinas. Por ejemplo, el virus de Epstein-Barr libera un homlogo de la IL-10, que como sabemos es una citocina inmunosupresora. Otro ejemplo es el virus de la viruela, que libera un receptor soluble de la IL-1, interaccionando con la IL-1 que pudiera haber en el medio. Actualmente se estn desarrollando terapias que se basan en las citocinas.

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16(2). ANEXO CITOCINAS Lepra

La lepra es una enfermedad causada por el Mycobacterium leprae. Existen dos formas polares de la lepra: (a) lepromatosa y (b) tuberculoide. No obstante, muchos pacientes no pueden ser catalogados en uno de los dos tipos, sino que se encuentran en medio. - Lepra lepromatosa. Hipergammaglobulinemia (muchas Ig especcas para el bacilo). Respuesta celular dbil por parte de las clulas T. Se detectan bacterias en el interior de los macrfagos. El crecimiento y la persistencia de las bacterias, junto con una activacin insuciente de los macrfagos, dan lugar a lesiones destructivas de la piel y los tejidos subyacentes. - Lepra tuberculoide. Al contrario que el tipo anterior, los niveles de Ig son normales, pero la respuesta celular es potente, por lo que apenas hay bacterias. Aparecen granulomas y lesiones en los nervios perifricos, lo que provocar que secundariamente haya lesiones en la piel (insensibilidad). Por qu unas personas desarrollan un tipo de lepra y otros otra? Est claro que tiene que estar relacionado con la expresion de citocinas y la diferenciacin de los TH. El patrn de diferenciacin de stos y la sntesis de citocinas pueden variar entre las personas. Los enfermos de lepra tuberculoide se caracterizan por presentar IFN e IL-2 en las lesiones, que como sabemos son las citocinas producidas por los TH1. En cambio, los enfermos de lepra lepromatosa se caracterizan por tener menos IFN y ms IL-4 e IL-10 (tpicas de los TH2). En el caso de la lepra lepromatosa, tanto la ausencia de IFN como la presencia de IL-4 e IL-10 hace que la respuesta celular sea pobre y por tanto las bacterias no pueden ser controladas.
Funciones de los TH1

La diferenciacin del TH a un perl TH1 est inducida por la IL-12 y el IFN. El TH1 libera el propio IFN e IL-2. Destacamos que el IFN activa a los macrfagos, incrementando su capacidad microbicida (induce la iNOS), favoreciendo la sntesis y liberacin de citocinas inamatorias (IL-1, IL-6 y TNF), y aumentando la expresin de B7 y MHC. Recordemos tambin que, a nivel de las clulas B, el IFN va a ser importante para inducir un cambio hacia isotipos opsonizantes (IgG).
Funciones de los TH2

La diferenciacin del TH a un perl TH2 est inducida por la IL-4. El TH2 libera la propia IL-4 e IL-5. La IL-4 es un antagonista del IFN, por lo que es lgico pensar que induce una activacin del macrfago hacia el perl M2 (junto con la IL-13) La IL-4 tambin favorece el cambio de isotipo de los linfocitos B hacia la IgE (degranulacin de mastocitos) y la IgG4. De la IL4 hay un efecto que no se coment previamente: promueve el peristaltismo y la secrecin intestinal. Sobre la IL-5, recordemos que sta es importante para la activacin de los eosinlos.
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Funcin de los TH17

Los TH17 producen varias citocinas, pero nosotros destacamos la IL-17. Esta citocina tiene dos efectos principales. En primer lugar induce la liberacin de quimiocinas y citocinas proinamatorias (IL-1, IL-6 y TNF) para favorece una respuesta neutrla (reclutamiento y activacin de neutrlos, que atacarn patgenos extracelulares = hongos y bacterias). En segundo lugar, estimula la produccin de sustancias antimicrobianas, como las defensinas, en numerosos tipos celulares.
Inmunidad frente a las bacterias intracelulares

Una caracterstica de las bacterias intracelulares es su capacidad para sobrevivir e incluso replicarse en el interior de los fagocitos. Dado que estos microorganismos pueden encontrar un nicho donde son inaccesibles a los anticuerpos circulantes, su erradicacin requiere la participacin de la inmunidad celular. Los fagocitos (neutrlos y macrfagos) podrn reconocer a un patgeno intracelular y fagocitarlo, pero no lo podrn degradar: habrn quedado infectados. Las clulas infectadas liberarn IL-12, un poderoso inductor de la respuesta innata contra patgenos intracelulares: la caballera llega en forma de clulas NK. stas liberan IFN, que incrementa la actividad microbicida de macrfagos para as intentar cargarse lo que tienen en su interior. Pese a que la inmunidad innata puede controlar la infeccin, es insuciente para erradicarla. Para ello necesitamos el concurso de la inmunidad adaptativa: TH (en realidad TH1, recordemos que hay IL-12 en el medio) y TC.
Inmunidad frente a las bacterias extracelulares

Para enfrentarnos a las bacterias extracelulares nos basaremos bastante en la inmunidad innata humoral (complemento) y la adaptativa. El complemento recordemos que puede inducir la inamacin, la lisis de patgenos o su fagocitosis. La inmunidad adaptativa actuar en dos frentes: LB que liberan Ig, y T que libera citocinas que regulan la respuesta inmunitaria (inamacin, activacin de macrfagos vas IFN, induccin del cambio de isotipo en LB).
Inmunidad frente a virus

Aqu tambin acta la inmunidad innata como la adaptativa. Cuando nos referimos a innata recalcamos el papel de las clulas dendrticas plasmacitoides en la induccin del estado antiviral, la liberacin del IFN/ y la destruccin de clulas infectadas por parte de las clulas NK. La inmunidad adaptativa colabora con los TC y los LB especcos para el virus.

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17. CITOTOXICIDAD Introduccin

Hay dos clulas en nuestro sistema inmunitario con una clara funcin citotxica. Por un lado tenemos a los linfocitos T citotxicos (TC o CTL), de la inmunidad adaptativa, y por el otro lado encontramos las clulas NK, de la inmunidad innata. Los requisitos para que las dos clulas puedan realizar su funcin citotxica sern distintos.
Generacin de CTLs efectores y de memoria

Para que un CTL naive se active vamos a necesitar tres seales: (a) pptido presentado va MHC I; (b) coestmulo CD28-B7; y (c) IL2-/IL-2R (recordemos que la IL-2 la liberan las clulas TH1). Podemos hablar de tres grandes clases de CTL: - CTL-P naive (P = precursor). Precisarn de las tres seales que acabamos de comentar para su activacin. Apenas tendr en su interior los mecanismos necesarios para realizar su funcin citotxica (no habrn madurado). Estn en los ganglios linfticos. - CTL efector. Su activacin y proliferacin ya no necesita la ayuda de los TH. Los mecanismos citotxicos ya sern maduros. - CTL de memoria. Exactamente igual que el efector: su activacin y proliferacin no precisa la ayuda de los TH.
Mecanismos efectores de los CTL

Principalmente encontramos dos mecanismos que provocan la muerte de la clula diana. Por un lado tenemos la (a) va de la perforina/granzimas. Esta va consiste en la liberacin direccional de protenas citotxicas (perforina y granzimas) por parte de las CTLs hacia las clulas diana, provocando su apoptosis. Por el otro lado est la (b) va de Fas/FasL. Esta va consiste en la interaccin entre el ligando de Fas, presente en la supercie de los CTLs, con el receptor de Fas, presente en la supercie celular. Tras este contacto, se induce la apoptosis de la clula diana. Va de la perforina/granzimas La perforina es una molcula perturbadora de la membrana homloga a la protena C9 del complemento y est contenida en unos grnulos intracelulares en los que tambin estn las granzimas, unas serina-proteasas que acabarn activando las caspasas inductoras de la apoptosis celular. Cuando se produce la interaccin entre clula diana y CTL, ste ltimo experimenta un incremento del Ca2+ intracelular que llevar a la liberacin de estos grnulos repletos de perforina y granzimas. Una vez liberado el contenido al espacio extracelular, la perforina se introducir en la membrana de la clula diana y se polimerizar para formar poros cilndricos. Estos poros pueden matar a la clula diana por el choque osmtico y adems van a ser la va de entrada de las granzimas.
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LISIS DE LA CL.LULA DIANA PELS LIMFCITS CITOT

de perforina a la sup Liberacin de los grnulos de granzimas y perforinas. Como vemos, el espacio existente entre Porus la clula diana y el linfocito T citotxico es muy pequeo, hecho que favorece que la perforina se acople rpidamente a la membrana de la clula diana. 1. Laugment en Ca2+ intracel.lular induit per la interacci CTL-cl.lu

Exocitosis dels grnuls del CTL que es fusionen amb la membra Las granzimas, como 2. hemos dicho, pueden entrar a travs 3. por Alliberament perforina en el petit espai entre les dues cl.lules de los poros formados la perforina ode bien ser endoci4. Inserci lade perforina a la tadas por la clula diana y despusde salir la vescula de membrana de la cl.lula diana 5. de Polimeritzaci dels monmers de perforina dins la membrana endocitosis por medio un proceso dependiente de la porus cilndrics perforina. Parece ser 6. que Formacio para que se de d esta ltima va las granzimas deben unirse a unos receptores de manosa-fosfato. Tanto las granzimas (una vez dentro de la clula diana) como la va de Fas logran que la procaspasa-8 (inactiva) pase a activarse (caspasa 8), induciendo la apoptosis de la clula diana. Esta apoptosis tambin se puede dar por la va mitocondrial. En el marco de la apoptosis, habr una fragmentacin del DNA celular y viral (hay una inhibicin de la replicacin viral antes de la destruccin de la clula diana). Las clulas diana son destruidas de manera selectiva, sin que las clulas vecinas se vean afectadas. Esto se puede realizar gracias a que hay un reconocimiento especco de la clula infectada y que los grnulos se liberan en una direccin en concreta (liberacin polarizada).
Pasos en la lisis mediada por el CTL de las clulas diana (imagen superior). Un CTL reconoce a la clula diana que expresa el antgeno y se activa. La activacin da lugar a la liberacin del contenido de los grnulos de los CTL hacia la clula diana a travs de la zona de contacto (sinapsis inmunitaria). El contenido de los grnulos da un golpe mortal a la diana. El CTL puede desprenderse y matar otras clulas diana. La formacin de conjugados entre un CTL y su diana y la activacin del CTL tambin requieren interacciones entre molculas accesorias (LFA-1, CD8) situadas en el CTL y sus ligandos especcos situados en la clula diana.

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Clulas NK

Las clulas NK constituye el otro gran tipo celular con capacidad citotxica (aunque no tan especca). El IFN, el IFN y la IL-12 [PAMPs?] estimulan la actividad de estas clulas, y stas a su vez liberan mltiples citocinas, como IFN y TNF (participan as en la inmunidad innata y en la adaptativa). Las clulas NK pueden ser consideradas como la primera lnea de defensa contra la infeccin viral antes de que aparezcan los CTLs especcos. Tambin participaran en la respuesta antitumoral. Podemos hablar de diferentes poblaciones de clulas NK en funcin a los niveles de expresin de CD16 (un receptor de la Fc) y de CD56 (marcador de la NK humana). (a) NK CD56bright/CD16dim. Principalmente forman IFN y TNF. (b) NK CD56dim/CD16+. Tienen capacidad citotxica. En su interior tienen grnulos con perforina y granzimas que, a diferencia de los CTLs, ya estn presentes desde un inicio (no ocurra as con los CTLs-P naive). Esta poblacin es la mayoritaria.
Reconocimiento de las clulas infectadas por parte de las NK

Los CTLs pueden reconocer un pptido a travs del MHC I. Las clulas NK no disponen de este mecanismo. Entonces cmo es posible que puedan reconocer, y por tanto nicamente atacar, a aquellas clulas infectadas? Existen dos opciones. En primer lugar est la conocida como citotoxicidad dependiente de anticuerpo, que no es ms que la NK lo que hace es reconocer, va CD16, la Fc de una Ig que est unida a un eptopo de una molcula de la supercie de la clula diana. Este mecanismo tambin lo usan macrfagos, eosinlos y neutrlos En segundo lugar est la citotoxicidad independiente de anticuerpos, en el que la interaccin entre NK y la clula diana se da por medio de una serie de ligandos y receptores especcos. Este ltimo mecanismo tambin se puede denominar modelo de las seales opuestas y consiste en que la NK inducir la apoptosis de la clula diana en funcin al equilibrio de seales positivas y negativas que recibe. Es decir, una seal negativa puede ser, por ejemplo, la deteccin del MHC I en la clula diana. Mientras la clula diana tenga unos niveles adecuados de MHC I, no tiene por qu ser destruida por la NK. Ahora bien, si tras ser infectada por un virus esta clula empieza a presentar niveles ms bajos de MHC I (estrategia tpica de evasin del sistema inmunitario), las seales positivas vencern a las negativas y entonces la clula diana ser destruida. Este modelo de seales opuestas necesita de receptores inhibidores y activadores en la supercie de la clula NK48. Los receptores inhibidores tienen motivos ITIM49 y son especcos para MHC I. Los receptores estimuladores disponen de motivos ITAM y son especcos para diversos ligandos.
Funciones de los receptores activadores e inhibidores de los linfocitos NK (pgina siguiente). (A) Los receptores activadores de los linfocitos NK reconocen ligandos en las clulas diana y activan la protena tirosina
48 49

A modo de curiosidad: estos receptores son polimrcos. Hay diferencias entre individuos.

Los dominios ITIM contactan con fosfotirosina fosforilasas que desfosforilarn a las tirosinas fosforiladas de los dominios ITAM (vaya trabalenguas). 98

cinasa (TK), cuya actividad es inhibida por los receptores inhibidores que reconocen molculas de la clase I del MHC y activan las protenas tirosina fosfatasas (PTP). Los linfocitos NK no matan de modo eciente clulas sanas que expresen la clase I del MHC. (B) Si una infeccin vrica u otro tipo de estrs inhibe la expresin de la clase I del MHC en las clulas infectadas e induce la expresin de ligandos activadores adicionales, el receptor inhibidor del linfocito NK no se une a su ligando y las funciones del receptor activador sin ninguna oposicin desencadenan respuestas de linfocitos NK, como la muerte de clulas diana y la secrecin de citocinas. (C) Las clulas estresadas por la infeccin o por la transformacin neoplsica pueden expresar mayores cantidades de ligandos activadores, que se unen a los receptores activadores del linfocito NK e inducen una mayor fosforilacin de tirosinas de las que pueden compensar las fosfatasas asociadas al receptor lo que provoca la (CTLs) NATURAL KILLERS (NKs) inhibidor, I LIMFOCITS T CITOTXICS EN LA INFECCI VIRAL muerte de las clulas estresadas.

Adems de para eliminar clulas infectadas o estresadas, las clulas NK tambin realizarn una especie de control de calidad de las clulas dendrticas (si no tienen suciente MHC I por ejemplo). Las NK se forman en la mdula sea y de ah irn hacia los tejidos y los ganglios linfticos.
Papel de las NK y los CTL en la infeccin viral. Tras una infeccin viral, en primer lugar veremos unos niveles elevados de IFN/ liberado por las clulas plasmacitoides y clulas infectadas. A continuacin aparece la primera lnea de defensa: las clulas NK, que empezarn a contener la infeccin. Despus, al cabo de unos das ya aparecera la segunda (y denitiva) lnea de defensa: los CTLs especcos. Las NKs son importantsimas para contener la infeccin hasta que llegue la caballera (CTLs especcos). 99

18. SISTEMA DEL COMPLEMENTO Introduccin

Hacia nales del s. XIX Jules Bordet demostr que, si aada a las bacterias un suero fresco que contena un anticuerpo antibacteriano a temperatura siolgica (37 C), las bacterias se lisaban. Sin embargo, si se calentaba el suero a 56 C o ms, ste perda su capacidad ltica. Esta prdida de capacidad ltica no se deba a la falta de actividad de los anticuerpos, ya que stos son termoestables e incluso el suero caliente era capaz de aglutinar a las bacterias. Bordet concluy que el suero deba contener otro componente termolbil que ayuda, o complementa, la funcin ltica de los anticuerpos; este componente recibi ms adelante el nombre de complemento. Molecularmente, el complemento consta de toda una serie de protenas que actan en forma de cascada, en el que cada enzima cataliza la reaccin del siguiente. Se trata de un sistema muy regulado que puede ser activado por medio de tres vas: (a) va clsica [inm. adaptativa]; (b) va alternativa [inm. innata]; (c) va de las lectinas [inm. innata]. La actividad biolgica del complemento afecta a la inmunnidad innata y a la adaptativa.
Componentes del sistema del complemento

Como hemos dicho, el complemento est formado por toda una serie de protenas sricas. stas generalmente se encuentran en una forma inactiva (proenzimas) y su activacin se da por protelisis (se omite un fragmento inhibidor y se expone el centro activo). A continuacin se exponen los diferentes elementos que forman el complemento: - Protenas C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9. - Factores B, D, H e I. Properdina (P). - Mannose binding lectin (MBL). Serina-proteasas asociadas a MBL (MASP-1/2). - Inhibidor de C1 (C1-INH, serpin), C4-binding protein (C4-BP), decay accelerating factor (DAF), protena S (vitronectina). - Receptor C1q (C1qR), receptor C1 (C1R). Cuando hay una protelisis de una protena del complemento, se genera un fragmento grande y otro pequeo. El fragmento grande suele unirse a la membrana cerca del lugar de activacin (complejo de activacin) y el fragmento pequeo queda soluble y puede iniciar respuestas inamatorias (analotoxina) unindose a receptores especcos. En cuanto a la nomenclatura, se suele aadir una letra b al fragmento grande, y la letra a al fragmento pequeo (C3b/C3a). Atencin, hay una excepcin: C2a es el fragmento grande unido a la membrana y C2b el fragmento pequeo soluble. Los fragmentos del complemento interaccionan los unos con los otros para formar complejos funcionales. Los complejos que tienen actividad enzimtica y los componentes activados, en general, se indican con una lnea por encima del nombre (p. ej., C4b2a).

100

Va clsica de activacin

Las tres vas de activacin convergen en un mismo punto: la activacin de C3 y la generacin de la convertasa C5. La va clsica pertenece a la inmunidad adaptativa puesto que necesita anticuerpos. La protena C1 inicia la va clsica al unirse al anticuerpo con un antgeno. La protena C1 (tambin se puede escribir como C1qr2s2) es un complejo heteromrico: C1q, que se une a la Fc de los anticuerpos con antgeno unido; C1r, que es una serina proteasa que fragmenta C1s convirtindola en una proteasa activa; y C1s, una serina proteasa que rompe C4 y C2. de C1. Se pueden observar las diferentes Una Ig puede tener una conformacin Estructura subunidades. Recordemos que C1q ser el punto de distinta en funcin de si est unida o no a un unin a la Fc de un anticuerpo unido a antgeno. antgeno. Los lugares de unin de Fc de la IgM a la C1q son ms accesibles cuando la IgM est unida a un antgeno (forma de grapa y pentamrica) que cuando est libre (forma planar y pentamrica). La IgG tambin puede unirse a C1q activar el complemento. Cada molcula C1 debe unirse almenos a dos lugares Fc para que haya una unin estable. Esto en realidad no supone ningn problema, ya que generalmente las primeras Ig en formarse son las IgM, que son a su vez las ms ecientes para activar el complemento.
Unin de C1 a las porciones Fc de la IgM y la IgG. El C1 debe unirse a dos o ms porciones Fc para iniciar la cascada del complemento. (A) Las porciones Fc de la IgM soluble no son accesibles a C1. (B) Despus de que la IgM se una a antgenos adheridos a la supercie, sufre un cambio de forma que le permite unirse al C1 y activarlo. (C) Las molculas solubles de IgG no activarn el C1, porque cada IgG tiene solo una regin Fc. (D) Tras unirse a los antgenos de la supercie celular, las porciones Fc adyacentes de la IgG pueden unirse al C1 y activarlo.

Al producirse la unin entre Fc de la Ig y C1q, C1r se activar autocatalticamente y activar a la otra serina proteasa C1r (hay dos). Las dos C1r activarn a la serina proteasa C1s. Esta ltima proteolizar C4 y C2, dando lugar a C4a, C4b, C2a y C2b. Tanto C4b como C2a (recordemos la excepcin) se unirn a la supercie diana cerca de C1, formando el complejo C4b2a o convertasa C3. La convertasa C3, como su nombre indica, tiene la capacidad de es101

cindir C3 en C3a (soluble) y C3b (unin a la membrana). Algunas de las molculas C3b se combinan con la convertasa C3 para dar lugar al complejo C4b2a3b o convertasa C5. La convertasa C3 tiene una gran capacidad de generacin de molculas de C3b, hay una gran amplicacin. La membrana de las clulas de mamfero tienen niveles elevados de cido silico (Neu5Ac), que inactiva rpidamente a las molculas de C3b. Con esto logramos no destruir clulas propias. El componente C3b de la convertasa C5 se une a C5, permitiendo que C4b2a (el resto de la convertasas C5) corte C5 y d lugar a C5a y C5b. C5b se unir a C6 para iniciar la formacin del complejo de ataque a la membrana (MAC). Tras C6 se unirn secuencialmente C7, C8, C9 (varias) y C10 (sin que haya una protelisis). Finalmente se formar un canal a travs de la membrana de la clula diana que permite la difusin libre de iones y pequeas molculas a travs de la membrana. Esto lleva a la prdida de la estabilidad osmtica y a la muerte celular. Hemos de pensar que adems del MAC se habrn formado muchas molculas con inamatorias.
Va clsica de activacin del complemento (derecha) Los complejos antgeno-anticuerpo que activan la va clsica pueden ser solubles, estar jados a la supercie de las clulas o depositarse unidas a su antgeno.

ltimos pasos en la activacin del complemento y la formacin del MAC. Se muestra una imagen esquemtica de los acontecimientos que tienen lugar en la supercie celular y que llevan a la formacin del MAC. La C5convertasa asociada a la clula escinde el C5 y genera C5b, que se une a la convertasa. El C6 y el C7 se unen de forma secuencial y el complejo C5b,6,7 se inserta directamente en la bicapa lipdica de la membrana plasmtica, seguido de la insercin estable del C8. Pueden polimerizar entonces hasta 15 molculas de C9 alrededor del complejo para formar el MAC, lo que crea poros en la membrana e induce la lisis celular. El C5a liberado en la protelisis de C5 estimula la inamacin. 102

Va alternativa

Tanto esta va como la siguiente (la de las lectinas) son independientes de anticuerpos y por ello pertenecen a la inmunidad innata. De manera basal, una pequea cantidad de C3 soluble se escinde espontneamente para formar C3a y C3b. El fragmento grande (C3b) podr unirse a una supercie extraa, como una pared bacteriana. Si no se produce esta unin, C3b quedar inactivo por hidrlisis. La C3b, una vez unida a a una supercie extraa, puede servir como punto de unin para el factor B, que ser escindido por el factor D y as liberar un pequeo fragmento denominado Ba. Esta hidrlisis da lugar al complejo C3bBb, que es equivalente a la convertasa C3. La properdina estabiliza esta convertasa. La C3 convertasa escinde C3 en C3a y C3b (amplicacin) 50, y una pequea proporcin de este ltimo se une a la convertasa C3 para formar el complejo C3bBb3b, que es una convertasa C5. Lo que sigue es lo mismo que hemos visto antes: C5b se une a C6 y as se iniciar la formacin del complejo de ataque a la membrana (MAC)

La va alternativa de activacin del complemento. El C3 soluble en el plasma sufre una hidrlisis espontnea a baja intensidad de su enlace tioster interno, lo que lleva a la formacin de una C3-convertasa en la fase lquida (no mostrado) y a la generacin de C3b. Si el C3b se deposita en las supercies de los microbios, se une al factor B y forma la C3-convertasa de la va alternativa. Esta convertasa escinde el C3 para producir ms C3b, que se une a la supercie microbiana y participa en la formacin de una C5-convertasa. La C5 convertasa escinde el C5 para generar C5b, acontecimiento iniciador de los pasos tardos de la activacin del complemento.

50

De hecho en unos cinco minutos se pueden conseguir unas 105 molculas de C3b en la supercie celular. 103

Va de las lectinas

La va de las lectinas se inicia en la unin de la lectina ligadora de manosa (MBL; Eng: mannose-binding lectin) a residuos de manosa presentes en la supercie de patgenos. La MBL es una protena con una funcin similar al C1q de la va clsica y es producida en la respuesta inamatoria (hgado). Esta lectina est a su vez asociada con las MASP-1 y MASP-2, dos serina-proteasas anlogas a C1r y C1s que escindirn C4 y C2. Los dos fragmentos grandes producidos por esta escisin, C4b y C2a, forman la convertasa C3. A partir de aqu todo igual (formacin de C3b, convertasa C5, C5b, C6 e inicio de la formacin del MAC).
Regulacin del sistema del complemento

La regulacin del complemento est medida por varias protenas circulantes y de membrana. Muchas de estas protenas, as como varias protenas de las vas clsica y alternativa, pertenecen a una familia llamada reguladores de la actividad del complemento (RCA; Eng: regulators of complement activity). Es necesario regular la actividad del complemento por dos razones: (1) Activacin baja del complemento espontnea. El complemento puede activarse de manera espontnea. Esto puede ser daino para las clulas normales y los tejidos. (2) Limitar su accin. Incluso cuando se activa el complemento all donde es necesario, como en un microbio o un complejo antgeno-anticuerpo, necesita ser controlado, porque los productos de degradacin de las protenas del complemento pueden difundirse a clulas adyacentes y daarlas. Para regular el complemento tendremos: (a) reguladores del inicio de las vas de activacin, como el inhibidor de C1 (C1Iab); (b) reguladores de la formacin/actividad de las convertasas, como la protena de unin de C4b (C4bBP), el factor I, CRI, MCP, el factor H y DAF; (c) reguladores de la formacin de MAC, como la protena S, HRF y CD59. La protena S evita la insercin del componente del MAC C5b67 a la membrana. Las protenas HRL y CD59 (o MIRL) se unen a C5b678 en clulas autlogas y evitan el ensamblaje del poli-C9. As se evita la lisis no especca de las clulas propias. Estas dos protenas son responsables de la restriccin homloga.
Funciones del complemento

Las principales funciones efectoras del sistema del complemento en la inmunidad innata y en la humoral especca son (a) promover la fagocitosis de los microbios sobre los cuales se activa el complemento, (b) estimular la inamacin e (c) inducir la lsis de estos microbios.

El complemento
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tambin puede

Funciones del complemento (pg. anterior). El C3b unido a la clula es una opsonina que promueve la fagocitosis de las clulas cubiertas.

ser vir para neutralizar partculas vricas. Puede bloquear la infeccin viral impidiendo la adhesin a la clula husped. Facilita la unin del virus a clulas con receptores Fc o CR1 (fagocitosis). Puede llegar a lisar virus. Una funcin adicional del complemento es la de solubilizar y aclarar los inmunocomplejos. Un inmunocomplejo no es ms que un antgeno unido a su anticuerpo. Si stos se acumulan en la sangre, pueden depositarse en las paredes vasculares y provocar reacciones inamatorias que daen los vasos y los tejidos que los rodean. Para evitarlo, C3b puede unirse a la Ig de estos inmunocomplejos. Los eritrocitos disponen de receptores CR1 (CD35) en su membrana que pueden unirse a C3b. En este momento el eritrocito podr transportar el inmunocomplejo asociado al complemento hacia el hgado y el bazo, donde ste podr ser fagocitado. En cuanto a la funcin de estimulacin de las reacciones inamatorias, las analotoxinas C3a, C4a y C5a son las responsables de esta funcin. Los leucocitos pueden ser reclutados y activados por medio de C3a y C5a (favorecen la extravasacin y la quimiotaxis).

Estmulo de reacciones inamatorias. Los productos proteolticos C5a, C3a y (en menor grado) C4a estimulan el reclutamiento de los leucocitos y la inamacin.

Receptores del complemento

Queremos destacar tres: - CR1: acabamos de ver que est en los eritrocitos y permite la fagocitosis de los inmunocomplejos. Tambin est presente en clulas dendrticas foliculares. - CR3. Est formado por CD11b/18. CD11b lo emplabamos en la citometra de ujo para identicar poblaciones celulares. Este receptor se une a iC3b. - Receptor de C5a. Se une a C5a y est presente en mastocitos, baslos, granulocitos, monocitos, macrfagos, plaquetas y clulas endoteliales. Induce la liberacin de grnulos por parte de baslos y mastocitos.
Resumen nal a) Benecios del complemento: (1) opsoniza e incrementa la fagocitosis; (b) lisis de bacterias y cls. infectadas; (c) regulacin de la respuesta a anticuerpos; (d) eliminacin de complejos inmunitarios; (d) eliminacin de cls. apoptticas; (f) atraccin y activacin de fagocitos. b) Perjuicios: inamacin y analaxis. c) Deciencias: infecciones recurrentes e incremento de los inmunocomplejos (con el consiguiente dao celular). 105