UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS BIOTECNOLOGA

PRACTICA 2. AISLAMIENTO Y SELECCIN DE UN MICROORGANISMO OBJETIVO. Aislar Aspergillus niger a partir de un fruto ctrico y seleccionar por la cantidad de cido ctrico que forma.

INTRODUCCION. La obtencin de cido ctrico a travs de un proceso de fermentacin representa una de las industrias ms grandes dentro del mbito biotecnolgico. Esto se debe a la importancia que tiene el cido ctrico dentro de la industria alimentaria y farmacutica, ya que es un cido con una alta solubilidad, sabor cido agradable, muy baja toxicidad y es asimilable. El cido ctrico tambin se emplea en la preparacin de algunos cosmticos, limpieza de metales, recuperacin secundaria del petrleo y otras industrias. Inicialmente el cido ctrico se obtuvo de frutas ctricas, la primera sntesis qumica se desarrollo en el ao de 1860. En 1863, Wehmer descubri al cido ctrico como un metabolito microbiano. En 1917 se reporta la produccin de cido ctrico utilizando una cepa de Aspergillus niger creciendo en sacarosa como sustrato. Actualmente, aunque la sntesis qumica del cido ctrico es posible por va qumica, no es un proceso competitivo comparado con el proceso desarrollado utilizando hongos, y en especial, con el hongo filamentoso Aspergillus niger. El mecanismo bioqumico por el cual Aspergillus niger acumula cido ctrico ha despertado inters, con miras a optimizar el proceso industrial de produccin. Sin embargo, no hay una sola explicacin, ya que varios factores afectan la fermentacin y la excrecin del cido de la mitocondria. Por ejemplo, el cido ctrico se acumula cuando hay exceso de la concentracin de azcar, protones, u oxgeno disuelto; o con niveles subptimos de metales traza, nitrgeno y fosfato. Aspergillus niger posee una ruta metablica del metabolismo de la glucosa que est catalizada por la enzima glucosa oxidasa, que es inducida a latas concentraciones de glucosa y aireacin vigorosa. Aspergillus niger utiliza 1 mol de dixido de carbono, el cual proviene de la formacin del acetil-CoA y 1 mol de piruvato para formar 1 mol de oxaloacetato. Esta reaccin es acompaada por la prdida de 2 moles de dixido de carbono, por lo que slo posterceras partes del carbono de la glucosa se convierte en cido ctrico. En la presente prctica se busca aislar cepas de Aspergillus niger productoras de cido ctrico, para su posterior seleccin. Para analizar la produccin de cido ctrico los aislados son propagados en medio Czapek-Dox agar conteniendo verde de bromocresol como indicador. Las colonias fngicas formadoras producen zonas amarillas (0.5 1.5 cm) debido a la formacin de cido. Para el aislamiento de Aspergillus niger se utiliza un medio de cultivo a base de extracto de malta donde crece rpidamente. El micelio es de color amarillo brillante y produce cabezas de conidios de color caf oscuro. Las cabezas de los conidios tienen forma de globos. Ver figura abajo.

Morfologa microscpica de Aspergillus.

MATERIAL. Matraz erlenmeyer de 500 mL Probeta de 100 mL Tapones de algodn Tijeras Papel aluminio Autoclave Cajas petri estriles Asa Pipetas de 1 mL estriles Tubos con rosca o con tapn de algodn Extracto de malta Agar Agua destilada Solucin de HCl 0.1 N Solucin de NaOH 0.1 N Agar papa dextrosa (PDA) Sacarosa NaNO3 K2HPO4 MgSO47H2O KCl FeSO4 Verde de bromocresol Azul de lactofenol

METODOLOGIA. 1.- Preparacin del medio slido de Extracto de Malta (EM). Disolver 2 g de extracto de malta en aproximadamente 85 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 4.8 con una solucin de HCl 0.1 N o de NaOH 0.1 N, segn sea el caso. Agregar 2 g de agar y acompletar volumen a 100 mL con agua destilada. Calentar el medio para fundir el agar, homogenizar el medio moviendo suavemente. Esterilizar 15 minutos a 121C. Vaciar 5 cajas petri con el agar EM preparado. 2.- Preparacin del medio Agar Papa Dextrosa (PDA). Disolver 1.9 g de PDA en 50 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 5.6 con una solucin de HCL 0.1 N o de NaOH 0.1

N, segn sea el caso. Fundir el agar y repartir en 10 tubos, colocando 5 mL de medio en cada tubo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Sacar de la autoclave y colocarlos en posicin inclinada para generar una amplia superficie cuando el agar se solidifique. 3.- Preparacin del medio Czapek-Dox. Disolver los siguientes componentes en las cantidades indicadas en 80 mL de agua destilada: sacarosa 3 g, NaNO3 0.2 g, K2HPO4 0.1 g, MgSO4.7H2O 0.05 g, KCl 0.05 g, FeSO4 0.001 g, 4 mL de verde de bromocresol al 1% P/V. Ajustar el pH a 6. Adicionar el agar y ajustar el volumen a 100 mL con agua destilada. Fundir el agar y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Vaciar en cajas de Petri. 4.- Preparacin azul de lactofenol. Medir agua destilada 20 mL, cristales de fenol 20 g, acido lctico 20 mL, glicerina 20 mL, azul de algodn 0.05 g. Enseguida disolver el fenol en el agua, agregar el cido lctico y la glicerina, calentar a 70 C, adicionar el azul de algodn. Guardar en frasco de vidrio perfectamente etiquetado. 5.- Tincin con azul de lactofenol. Colocar el material a observar en un portaobjetos y aadir de 1 a 2 gotas de solucin de azul de lactofenol, colocar el cubreobjetos y despus de 2 minutos observar al microscopio. AISLAMIENTO. 1.- Tomar con un asa al hongo que est visible en la superficie de un limn picado y colocado en la oscuridad por una semana. Aspergillus niger forma esporas de color oscuro. 2.- Sembrar colocando el hongo en el centro de una caja Petri que contenga medio slido de Extracto de Malta. 3.- Incubar las cajas de petri inoculadas a 30C durante un periodo de 4 a 6 das, para permitir el crecimiento del hongo. 4.- Preparar frotis de las colonias fngicas, adicionar 2 gotas de azul de lactofenol, esperar os minutos y observar la microscopio. 5.- Las colonias jvenes de Aspergillus niger son transferidas con un asa a tubos con agar PDA inclinado. 6.- Incubar los tubos con agar inclinado inoculados a 30C por un periodo de 4 a 6 das para lograr una esporulacin abundante. Los conidios de Aspergillus niger son de color oscuro. 7.- Conservar los tubos esporulados a 4C, como cultivos de trabajo. SELECCIN DE CEPAS. 1.- Transferir aspticamente 0.5 mL de una suspensin de esporas de los tubos de mantenimiento a las placas con medio Czapek-Dox. Rotar las placas para que el lquido se incorpore en su superficie. 2.- Incubar las placas a 30C durante 5 das. La formacin de zonas amarillas indica la formacin de cido ctrico. 3.- Medir la zona amarilla en cada colonia. 4.- Seleccionar las mejores colonias, sembrndolas en tubos inclinados con PDA. 5.- Incubar tubos con PDA a 30C durante un periodo de 4 a 6 das, hasta obtener una esporulacin abundante. 6.- Conservar en refrigeracin a 4C.

REPORTE PRACTICA. Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la prctica, objetivo, introduccin breve, metodologa, resultados, discusin, conclusin, bibliografa. Como gua puede utilizar el formato de cualquier artculo cientfico.

CUESTIONARIO 1.- Para qu sirve el verde de bromocresol? 2.- El cambio de la coloracin del medio de cultivo alrededor de la colonia de Aspergillus niger es suficiente para saber que se est formando cido ctrico. Explique. 3.- Cul es el objetivo de mantener cepas fngicas en PDA inclinado? 4.- Qu efecto tiene un medio con una alta concentracin de iones amonio? 5.- Qu puede suceder si al hongo Aspergillus niger se le somete a altas concentraciones de oxgeno disuelto en presencia de altas concentraciones de glucosa? 6.- El colorante de azul de lactofenol tiene tres funciones en la tincin de hongos, cules son? 7.- Qu tcnica sugiere para aumentar la productividad del hongo? 8.- Qu sistema de cultivo propone para tener altos rendimientos de cido ctrico utilizando Aspergillus niger?