INTRODUCCIN

El fraccionamiento celular es un conjunto de mtodos y tcnicas que permite obtener fracciones

purificadas o enriquecidas en un determinado componente celular, como por ejemplo: organelas,
fracciones de membrana, complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtbulos, etc.) y
fraccin citoslica, para su estudio. El tejido es triturado en un homogeneizador de tal forma que
las clulas se comprimen y se libera su contenido. Posteriormente este extracto es sometido a
centrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de esta forma se obtienen fracciones
enriquecidas de los distintos orgnulos. Podemos dividir en dos etapas la obtencin de estas
fracciones: Homogeneizacin y Fraccionamiento:
La Homogeneizacin consiste en la rotura de las clulas que forman el tejido o cultivo de tal
modo que se liberen sus componentes. El primer paso entonces ser la utilizacin de
procedimientos mecnicos suaves que permitan obtener y proteger el complejo proteico o la
estructura subcelular en condiciones ptimas. Se buscar romper las membranas celulares,
suavemente, para lograr la liberacin del contenido celular. Los ms comunes son: 1) Sonicacin:
el grado de ruptura depender de la frecuencia, intensidad y energa del ultrasonido aplicado. 2)
Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares. 3) Pasaje de las clulas a travs de
orificios de dimetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares. 4) Uso de
homogeneizadores: rotura de las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que se ajusta a las
paredes de un tubo de cristal (Potter).
El Fraccionamiento: Una vez obtenido los componentes celulares libres se puede proceder a su
fraccionamiento. Para ello, se utilizan distintos tipos de centrifugacin:
1) Centrifugacin diferencial 2) Centrifugacin en gradiente de densidad, la que se divide en: a)
centrifugacin zonal en gradiente y b) centrifugacin isopcnica.
Centrifugacin diferencial. Es la tcnica ms empleada. Se basa en la precipitacin, por efecto de
la gravedad, de partculas de densidad mayor a la del medio en que se encuentran. Para acelerar
este proceso se somete a la muestra a una fuerza centrfuga. Si se centrifuga poco tiempo y con
poca fuerza de aceleracin sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas. Cuando el
sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de ms
tiempo y ms fuerza de aceleracin sedimentarn las partculas ms densas presentes, y as
sucesivamente.
En el esquema se puede observar un ejemplo de los tiempos y fuerzas utilizadas en un
fraccionamiento subcelular:
Al movimiento de las partculas hacia el fondo del tubo se van a oponer dos fuerzas: la fuerza de
friccin y la fuerza de flotacin. Cuando una partcula en el seno de un lquido es sometida a un
movimiento circular, sufre la accin de una fuerza centrfuga (F
c
) que la aleja del eje de rotacin. Al
mismo tiempo se genera una fuerza de rozamiento (F
r
) de sentido opuesto al movimiento,
resultante de la friccin con las molculas del medio y la fuerza de flotacin (F
f
) generada por el
lquido desplazado. En un punto las fuerzas se equilibran dando una resultante nula, y la velocidad
de la partcula es constante Fr Ff Fc + = o sea 0 = fr Ff Fc .Esta contraposicin de
fuerzas hace que eventualmente cada partcula sedimente a velocidad constante, de acuerdo a la
siguiente ecuacin:
( )
|
|
.
|

\
|


=
0

e
1
2
f
r m
v

Donde m es la masa de la partcula,
2
r es la aceleracin que se genera en el rotor,
o
es la
densidad del lquido en el que estn suspendidas las partculas,

es la densidad de la partcula y f
es el coeficiente de friccin de la partcula. Reacomodando esta ecuacin, se obtiene:

S
f
m
r
v
=
|
|
.
|

\
|
=

e
0
2
1

La diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partculas se puede aprovechar para
realizar una centrifugacin diferencial en gradiente, es decir en un medio en el que exista un
gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior del tubo. Despus
de un tiempo las diferentes poblaciones de partculas se sitan en distintas profundidades del
tubo. Para realizar estos gradientes se utilizan sustancias como sacarosa, percoll, cloruro de cesio,
etc.
Determinacin de a Concentracin de Protenas por el Mtodo De Biuret
El mtodo de Biuret, para la determinacin de protenas, es una de los ms simples en este tipo;
es reproducible, pero requiere una alta concentracin de protenas para la formacin de color. La
sensibilidad del mtodo es de 0,25- 200 mg de protenas por mL de solucin. La reaccin de Biuret
es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin de un complejo de Cu en un medio
alcalino en compuestos que poseen ms de un enlace peptdico, como las protenas.
Objetivos:
Generales:
-Familiarizarse con las tcnicas de fraccionamiento subcelular a partir de animales de laboratorio.
-Obtener homogeneizado de tejido animal e identificar las fracciones celulares aisladas.
Especficos:
-Mediante centrifugacin diferencial, separar fracciones subcelulares del homogeneizado de
hgado de un animal(rata) y determinar su aspecto, tanto de la fraccin nuclear, como de la
moticondria.
-Determinar la concentracin de protenas en una muestra de 1,5g de hgado de rata ocupando
tcnicas espectroscpicas mediante el mtodo de Biuret.
CONCLUSIONES
En la prctica la proteccin de las personas que la estn desarrollando es importante, as
como tambin la seguridad y confianza al momento de realizarla, para evitar aspectos
negativos, como sufrimiento del animal empleado o contacto directo con su sangre.
Es importante trabajar los diferentes pasos del fraccionamiento celular a bajas
temperaturas ya que esto retarda la accin degradativa de enzimas sobre las protenas.
La centrifugacin diferencial es una tcnica muy til para separar organelas. En esta
tcnica, son importantes factores como densidad de la muestra, densidad del medio,
velocidad de la centrfuga, tiempo de centrifugacin. Con esta tcnica se logr distinguir los
aspectos de la fraccin nuclear y la organela separada(mitocondria).
Aplicando el mtodo de Biuret se puede determinar en una muestra problema la
concentracin protena, que resulta al interpolar los valores de absorbancia en una curva
de calibracin originada a partir de concentracin de protena conocida.


CUESTIONARIO
2. Qu se puede determinar en cada una de las fracciones obtenidas?
En la primera fraccin celular, se obtiene fragmento nuclear, mientras que en la segunda se
obtiene como organela a la mitocondria.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
-Jan Koolman, Klaus-Heinrich Rhm. Bioqumica: textos y atlas.3ra Edicin. Editorial Mdica
Panamericana. Madrid 2005. Pag.198-201.
-Jeremy M. Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko. Bioquimica/ Biochemistry: Y Otros A4 Del
Proyecto Segun El Cte/ and Other 4a of the Proyect According to Cte. Editorial Reverte. Barcelona
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