UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGA MDICA

TEMA : Pruebas Inmunohistoqumicas, Citometra de Flujo y Gentica en el diagnstico de las Neoplasias

CURSO: PROFESOR: ALUMNOS:

HEMATOLOGIA ESPECIAL Lic. T.M. Diego Espinoza La Matta

Erika Lorena Quito Velarde Zary Charmely Zuniga Almendariz Wene Stefany Aguayo Saloma Luxmi Misme Gonzales Oscar Cruz Villacorta Jhon Joe Palomino Ccapa Carlos Alberto Quipe Orihuela

CUSCO 2013

INMUNOHISTOQUIMICA INTRODUCCION: La inmunohistoqumica es una tcnica esencial en el diagnstico anatomo patolgico de las enfermedades, fundamentalmente de las neoplsicas. Para que su utilidad sea plena es necesario realizar la fijacin de los tejidos, las indicaciones de uso, las tcnicas y la lectura y valoracin de los resultados atenindose a unos criterios de Controles de Calidad tanto internos del propio servicio, como externos HISTORIA

El uso de tinciones de tejidos para facilitar su observacin microscpica se inici con la hematoxilina-eosina en el siglo XIX. En el primer tercio del siglo XX se introduce la histoenzimologa que utiliza tejidos sin fijar y de la que quedan nicamente restos, como los estudios con DPNasa y ATPasa en enfermedades musculares. La primera inmunohistoqumica se realiz con anticuerpos fluorescentes sobre tejidos frescos como los que se utilizan actualmente en diversas enfermedades de piel y rin. CONCEPTO Los mtodos inmunoenzimticos (peroxidasa, avidita-biotina) que permitan amplificar la seal del cromgeno favorecieron la utilizacin de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Actualmente se utilizan polmeros sintticos para amplificar la seal. La inmunohistoqumica es una tcnica esencial en el diagnstico anatomopatolgico de las enfermedades, fundamentalmente de las neoplsicas. Para que su utilidad sea plena es necesario realizar la fijacin de los tejidos, las indicaciones de uso, las tcnicas y la lectura y valoracin de los resultados atenindose a unos criterios de Controles de Calidad tanto internos del propio servicio como externos, en nuestro caso los auspiciados por la Sociedad Espaola de Anatoma Patolgica

Expresin en la membrana celular Puede presentarse en diferentes circunstancias como: 1) Antgenos localizados en la membrana celular: Molculas de adhesin celular como: caderinas, molculas plaquetarias de adhesin endotelial (PECAM) , molculas de adhesin celular neural (NCAM), molculas de adhesin celular epitelial (Ep-CAM). Protenas y receptores de la superficie celular o transmembranosas, como el factor de crecimiento epidrmico (EGFR), Her2/neu (c-erbB-2), CD117 , CD31, CD34, algunos antgenos leucocitarios (CD20, CD3, CD43,CD138), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR) y la protena latente de membrana del virus de Epstein-Barr (LMP1).

2) Molculas con patrn membranoso. Se obtiene este patrn debido a que los anticuerpos se unen a protenas de membrana y con el citoesqueleto subyacente, como la distrofina (en clulas musculares) y la espectrina (en eritrocitos). Estas protenas muestran inmunorreactividad de membrana por su localizacin lineal a lo largo de la interfase membrana-citoplasma. En ocasiones, la marcacin es exclusivamente en el aparato de Golgi, cuando la densidad de las molculas en la superficie celular es muy baja para su deteccin inmunohistoqumica, como puede verse con el CD15 (LeuM1), como en algunos casos de linfoma de Hodgkin clsico. Los siguientes tres ejemplos de inmunorreaccin membranosa tienen relevancia clnica bajo ciertas circunstancias:

1) La expresin membranosa del Her-2/neu tiene implicaciones pronsticas.

Con tecnologa recombinante se desarroll un anticuerpo monoclonal contra HER-2/neu, conocido como traztuzumab que inhibe al HER- 2/neu y, a su vez, bloquea el crecimiento de la clula neoplsica.

2) Los antgenos leucocitarios, que incluyen CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5,
CD-7, CD-8, CD-19, CD-20, CD-43 y CD-45, son receptores de la superficie celular o ligandos involucrados en el reconocimiento, interaccin, adhesin y transduccin celular de seales o interaccin con protenas solublesglicoprotenas y matriz extracelular. La marcacin inmunohistoqumica para estos antgenos produce un patrn perimetral de membrana debido a la distribucin uniforme de estos antgenos en la superficie celular. La expresin de membrana en los linfocitos neoplsicos puede ser el blanco de anticuerpos teraputicos.

3) El CD117 (c-kit) es una protena transmembranosa de 145 KDa que funciona

como receptor de la tirosina cinasa. EXPRESIN NUCLEAR Existen diversos anticuerpos dirigidos contra las protenas o enzimas nucleares. La mayor parte de los antgenos nucleares incluye a protenas asociadas al ciclo celular, protenas reparadoras de genes, enzimas nucleares, factores de trascripcin, productos de genes supresores tumorales, receptores de hormonas esteroides, protenas ligadoras de calcio, y algunas protenas virales nucleares. El Pax-5 y Oct2 son marcadores de expresin nuclear intensa en linfocitos B y contribuyen al diagnstico de linfoma de Hodgkin clsico y al de predominio linfoctico. El Oct2 es un factor de trascripcin nuclear de clulas B que se une especficamente al octmero (5ATTGCAT- 3) y regula la activacin de la expresin gnica de inmunoglobulinas. El Oct2 se expresa en la mayor parte de los ncleos de los linfocitos B y en casi todos los linfomas Hodgkin clsico.

EXPRESIN CITOPLSMICA El citoplasma contiene diversos orgnulos y una red de estructuras que forman el citoesqueleto (microfilamentos, filamentos intermedios y microtbulos) responsable de la forma, rigidez, transporte intracelular y de la movilidad celular. Los antgenos citoplasmticos muestran tres patrones de tincin: a) granular, b) difuso, y c) fibrilar.

a) Patrn citoplsmico granular

Identifica los antgenos que se localizan en los orgnulos, como: anticuerpos antimitocondriales, enzimas y protenas lisozomales (CD68), grnulos citoplsmicos de los mastocitos (triptasa, CD117), grnulos citotxicos (CD56, Tia-1), grnulos secretores neuroendocrinos (cromogranina, sinaptofisina, PGP 9.5), hormonas (prolactina, ACTH, hormona del crecimiento) y algunos microorganismos.

b) Patrn citoplsmico fibrilar

El esqueleto celular est compuesto por filamentos: pequeos (actina), grandes (microtbulos) e intermedios (citoqueratina, vimentina). Las fibras del citoesqueleto forman una malla que se extiende desde la membrana nuclear hasta la membrana celular, por lo que la inmunomarcacin de estas protenas exhibe de forma caracterstica un patrn fibrilar, frecuentemente con acentuacin submembranosa debido al revestimiento laminar que estas fibras tienen por debajo de la membrana celular y simulan el patrn de marcacin de membrana. Con diversos anticuerpos en los carcinomas de clulas pequeas (queratinas), carcinomas de clulas de Merkel (CK 20, cromogranina A), tumor desmoplsico de clulas pequeas (desmina) y tumores rabdoides malignos (queratina/vimetina) puede apreciarse acentuacin en la decoracin en la regin perinuclear (punto paranuclear) debido a la existencia de cmulos o agregados de filamentos intermedios en esta regin.

c) Patrn citoplasmtico
Los antgenos que producen un patrn de marcacin citoplasmtico incluyen: protenas del citoplasma o vesculas grandes, como: hemoglobina, albmina, mioglobina, tiroglobulina, enolasa neurona especfica, inmunoglobulinas, CD3, CD79a, bcl-2 y algunas protenas virales, como el HBsAg, que produce un patrn homogneo de tincin, casi siempre paranuclear.

EXPRESIN INMUNOHISTOQUIMICA COMO REFLEJO DE EVENTOS MOLECULARES La expresin inmunohistoqumica de algunos antgenos es el resultado de productos de expresin gentica secundarios a traslocaciones especficas.

Como referencia se citan tres ejemplos.

1) ALK. La expresin de ALK (Anaplastic lymophoma kinase) en los linfomas

anaplsicos de clulas grandes (LACG) refleja la traslocacin t(2;5)(p23;q35), que se encuentra hasta en 70% de estos linfomas. El gen de la cinasa del linfoma anaplsico (ALK) codifica una tirosina cinasa transmembranosa, que pertenece a la superfamilia de receptores de insulina y se localiza en el cromosoma 2p23. La localizacin inmunohistoqumica subcelular de ALK puede correlacionarse con el patrn de traslocacin. En los LACG con t(2;5) (NPM-ALK) la expresin de ALK coexiste tanto en el ncleo como en el citoplasma.

La expresin del ALK puede identificar un subtipo de LACG que, predominantemente, ocurre en pacientes jvenes, con buena respuesta a la quimioterapia y pronstico favorable. Por excepcin, algunos linfomas difusos de clulas grandes B pueden expresar ALK. Estos casos presentan, predominantemente, morfologa inmunoblsticaplasmoblstica y pueden tener crecimiento sinusoidal.

2) BCL-2. El Bcl-2 (B-cell lymphoma-2), es una protena que se localiza en la

membrana interna mitocondrial que juega un papel fundamental en la proteccin celular contra la apoptosis.

La inmunomarcacin con este anticuerpo ha sido de gran utilidad en el diagnstico diferencial entre hiperplasias y linfomas foliculares.

3) BCL-10. El Bcl-10 es una protena adaptadora, con una unin a caspasa (caspase
recriutment domain/ CARD) que promueve la apoptosis y activa la pro-caspasa 9 y NF-kB, descrita por primera vez en los linfomas B tipo MALT.

ANTGENOS EXTRACELULARES

a) Osteocalcina
Existen diversas protenas que intervienen en el proceso de mineralizacin, que al identificarlas mediante inmunohistoqumica son de importancia diagnstica en los tumores seos. La osteocalcina es una de las principales protenas intraseas, de funcin pocoprecisa, que predominantemente se localiza en el citoplasma de los osteoblastos. Despus de su produccin por los osteoblastos, la osteocalcina se incorpora a la matriz sea y una fraccin se libera a la circulacin y puede medirse como parmetro bioqumico del metabolismo seo. En la deteccin de tumores formadores de hueso, la osteocalcina tiene 70% de sensibilidad y 100% de especificidad, comparada con 90% de sensibilidad y 50% de especificidad informada con la osteonectina. Adems, hay que considerar que la osteonectina puede ser positiva en el tumor de clulas gigantes, el condroblastoma, en clulas endoteliales y fibroblastos, por lo cual debe tenerse precaucin en su interpretacin.

b) Colgena tipo IV y laminina

La colgena tipo IV es el principal componente estructural de la membrana basal. Los genes que codifican para la molcula de la colgena IV se localizan en el cromosoma13q. La colgena IV difiere de los otros tipos de colgena en su secuencia de aminocidos, pues no forma fibras y su estructura helicoidal se interrumpe. Adems, la colgena IV forma el sustrato para el crecimiento de algunas clulas endoteliales, musculares y de nervios perifricos y participa en la interaccin intercelular.

Los anticuerpos contra colgena IV son tiles para evaluar la integridad de las membranas en clulas normales, as como la ausencia de sta en carcinomas.

c) Amiloide

El amiloide corresponde a diversos grupos de protenas fibrilares no ramificadas. Un elemento ms de ayuda para la identificacin del material amorfo eosinfilo sospechoso como amiloide es la presencia de una molcula pentagonal de 25 KDa, llamada componente amiloide P. Existen anticuerpos comerciales dirigidos en contra del componente P. Los tipos ms frecuentes de amiloidosis son los provocadas por:

a) cadenas ligeras de inmunoglobulinas b) el amiloide AA c) por transtiretina (ATTR-12%/ amiloide senil).

Para la caracterizacin de AL se utilizan anticuerpos contra las cadenas ligeras kappa y lambda de las inmunoglobulinas. CONSIDERACIONES TCNICAS Factores que influyen en la inmunomarcacin En la evaluacin de las inmunomarcaciones son importantes dos elementos: 1) el factor preanaltico (intrnseco) y 2) el factor analtico (extrnseco).

1) El factor pre-analtico se refiere a las caractersticas del tejido y su

preservacin antignica. La conservacin adecuada de las caractersticas antignicas del tejido depende del tipo de fijador empleado, de la fijacin adecuada, y del tiempo de la fijacin. Fijacin de los tejidos

El fijador que se utilizar para inmunohistoqumica es el formaldehdo al 4% tamponado a pH 7,4. Por un periodo no menor de 24 horas ni mayor de 48 horas. La inmunohistoqumica con vimentina permite observar el deterioro sufrido durante la fijacin. Las citologas, al no tener que fijarse en formol, llevan un procesamiento diferente que se recoge en el apartado correspondiente. En caso de necesitarse utilizar un mtodo de descalcificacin se elegirn los ms suaves, preferiblemente el EDTA. Si se han empleado cidos, es crtico realizar un lavado de duracin variable con agua corriente, de mayor duracin cuanto ms haya durado la descalcificacin

2) Los factores analticos (extrnsecos) son los elementos externos al tejido que
pueden controlarse en el laboratorio de inmuohistoqumica e incluyen: el tipo de anticuerpo utilizado, la sensibilidad y dilucin, el sistema de deteccin, los cromgenos empleados, el mtodo de recuperacin utilizado y la interpretacin de la reaccin por el patlogo. (Para mayor detalle sobre factores intrnsecos y extrnsecos consltese la referencia).

Mtodos de recuperacin antignica

Durante la fijacin con formalina se producen puentes metilo cruzados entre las protenas y se forman compuestos clcicos adyacentes. Estos compuestos afectan tambin a las zonas antignicas y deben eliminarse para obtener un resultado ptimo en la inmunohistoqumica. El mtodo de recuperacin antignica se realiza fundamentalmente mediante incubacin con calor, en torno a los 100 C, en bferes de citrato o EDTA. Menos frecuente es el uso de enzimas proteolticas, sin calentamiento, ya que dejan un fondo mayor y favorecen el desprendimiento del tejido. Protease-induced epitope retrieval (PIER)

En parafina tan slo es til para un nmero limitado de anticuerpos y adems es difcil de reproducir. El que da resultados ms estandarizados es la proteasa. Las variables ms importantes son el tiempo de digestin y la concentracin de la enzima. Heat-induced epitope retrieval (HIER) En microondas, entre 8 y 12 minutos, introduciendo las laminillas en buffer citrato 0,001 m a pH 6. El mayor problema es que algunos epitopos se daan con el calor de forma irreversible y esto acontece ms fcilmente si el tejido est poco fijado. Para evitar el desprendimiento de los cortes tisulares se utilizan laminillas adherentes especiales. Cuantificacin del resultado inmunohistoqumico Se seguir en general la siguiente pauta, aunque hay frecuentes casos especficos en los que los porcentajes y su significado pueden variar: Negativo (-): total negatividad o menos del 50% de las clulas diana con menor intensidad que el control. Positividad dbil (+/-): ms del 50% de las clulas diana con menor intensidad que el control. Positivo (+): ms del 50% de las clulas diana con igual o mayor inten sidad que el control. El lmite de intensidades entre negativo y positividad dbil o positivo se hace por comparacin con un control interno existente u otro externo ad hoc

Evaluacin de nuevos anticuerpos 1. Seleccin de un nuevo anticuerpo primario: los motivos pueden ser por que existan nuevas demandas o para sustituir a otro existente. Deben predecirse el nmero de test que se realizarn anualmente y el coste de cada estudio. Deben conocerse la dilucin aunque se preferirn los no diluidos previamente, el mtodo de recuperacin antignica y la sensibilidad y especificidad del anticuerpo. 2. Optimizacin de la inmunorreactividad Los factores ms importantes son. Dilucin del anticuerpo primario.

 Duracin de la incubacin del primario. Tipo y concentracin del anticuerpo secundario. Tcnica de recuperacin antignica empleada. Temperatura de incubacin. Sistema de deteccin y amplificacin. En la prctica se manejan nicamente tres variables: Dilucin del anticuerpo primario. Tiempo de incubacin del primario (si se aumenta el tiempo se pude diluir ms el anticuerpo primario). Tcnica de recuperacin antignica (el EDTA alcalino suele ser mejor que el citrato. Excepciones: LMP-1 y CD21, en los que se preferirn enzimas).

Tipos de anticuerpos Los anticuerpos pueden ser poli o monoclonales. Estos ltimos son ms especficos y se obtienen mediante el mtodo de hibridoma de Kohler que consiste en la fusin de clulas esplnicas de un ratn inmunizado con una lnea celular de mieloma no secretor murino. Dado que el conejo es ms fcil de inmunizar que el ratn actualmente se estn introduciendo anticuerpos monoclonales de conejo a pesar de que este animal no padece mieloma, por lo que deben generarse heterohibridomas conejo-ratn. Los anticuerpos de conejo son ms sensibles y parecen conservar la especificidad. (Am J Clin Pathol 2005;124:295). Hematopoyticos y afines: - Antgeno leucocitario comn (ALC: CD45RB/CD45): clulas originadas en la mdula sea, incluyendo linfocitos y monocitos. Son negativos en 50% casos: linfoma ALK y linfoblsticos. Suelen ser negativos: cel Hodgkin y plasmticas. - ALK: varias localizaciones celulares. - CD1a: cel Langerhans, timocitos corticales (inmaduros) y, a veces, Rosai-Dorfman. - CD3: policlonal. Si monoclonal usad psilon (7S1). - CD5: timocitos, linfos T, Carcinomas tmicos, LLC y linfoma del manto. - CD10: LLA, centro germinal, linfoma folicular, linf Burkitt. - CD15 (LeuM1): granulocitos, algunos macrfagos y cel Reed-Sternberg (Golgi y membrana). - CD20: linfocitos B. - CD23: LLC, cel dendrticas.

- CD30: marcador de activacin linfocitario, linfoma ALK, Carcinoma embrionario y cel Reed-Sternberg(Golgi y membrana). - CD38: linfos activados y plasmticas. - CD43: linfos T, granulocitos (LMA), monocitos, megacariocitos, mastocitos y un 30% de linfomas B. - CD45RO (UCHL1): linfos T, monocitos y granulocitos (LMA). - CD63: plasmticas (marca retculo endoplsmico). - CD68 (KP-1): positividad citoplsmica en monocitos, SER, osteoclastos, precursores mieloides y algunos linfos B. - CD79a: linfocitos B. - CD99: timocitos corticales y timomas, PNET/Ewing y LLA. - CD123: precursor dendrtico hematodrmico. - CD138: plasmticas. - Mum 1: plasmticas. - Pax-5: diferenciacin lnea B. - Bcl-2: linfomas de bajo grado y linfocitos T. - Bcl-6: origen centro germinal. - Ciclina D1: linfoma del manto. - S100 (nuclear y citoplsmico): cel Langerhans, cel interdigitantes,Rosai-Dorfman, leucemia mieloide, melanomas y cel Schwann. - TdT: leucemias linfoides agudas. - Triptasa: mastocitos. - MIB-1 (Ki-67): marcador de proliferacin. - ZAP70- indicador de peor pronstico en LLC y, probablemente, en linf manto.

CITOMETRIA DE FLUJO DEFINICION Citometria de flujo es una tecnologa (proceso) que permite la medida simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una clula singular. la citometra de flujo es una tcnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagnstico y seguimiento de muchas enfermedades tales como las leucemias, granulomatosis crnica, y sida; sin embargo tiene muchsimas otras aplicaciones en investigacin bsica, prctica y ensayos clnicos. Estas medidas se realizan mientras las clulas pasan en fila simple a una velocidad de 500 a 4000 clulas por segundo a travs de un aparato medidor en un fluido.

HISTORIA DE LA CITOMETRIA DE FLUJO El primer contador celular automtico fue desarrollado por Moldavan (1934) y consista en un tubo capilar por el que se hacan pasar clulas teidas, el capilar estaba montado sobre un microscopio ptico con un objetivo sobre el cual haba un detector fotoelctrico que registraba el paso de clulas como un cambio en la luz que reciba. Tuvo muchos problemas con el grosor del capilar y obstruccin del mismo, dificultad en el mantenimiento de presiones, etc..

CMARA DE FLUJO Y FLUIDO DE ARRASTRE

Un importante avance para el desarrollo de la citometra de flujo se consigui en 1953 al inventar Crosland y Taylor una cmara de flujo basada en la inyeccin de la muestra en el seno de un fluido de arrastre a travs de un capilar que se estrecha y centra el flujo de la misma

Con este sistema se evitaban dos grandes problemas:

-El capilar tiene mayor dimetro con lo que su obstruccin es mucho ms difcil -Permite mejor el enfoque de la muestra con la fuente de luz. Es la base de las cmaras que se usan en la actualidad.

Citmetro de Coulter W. Coulter describi (1949) el principio que lleva su nombre. Desarroll un contador celular basado en el cambio que produce una partcula al pasar por un agujero en el que hay una diferencia de potencial conocida. En 1966 tambin us cambios en ondas de radiofrecuencia.

Contador diferencial En 1953 Parker y Horst describen el primer contador diferencial hematolgico usando clulas teidas en rojo (hemates) y azul (leucocitos), luz visible y detectores para luz roja o azul.

Avances en las aplicaciones de la CMF en la investigacin mdico-biolgica

Reinherz (1975) emplea la tecnologa de los anticuerpos monoclonales de Kholer y Milstein para identificar subpoblaciones celulares en funcin de antgenos de superficie. Loken (1977) mide simultneamente dos antgenos celulares con un solo lser, emplea la compensacin electrnica de la seal entre isotiocianato de fluorescena (FITC) y la tetralmetilrodamina. Oi (1982) introduce las ficobiliprotenas como flourocromos (ficoeritrina).

Dazrynkiewicz y Traganos (1976-79) estudian con naranja de acridina el ADN y ARN.

Andreeff usa dicha tcnica para clasificar las leucemias. Grynkiewicz (1985) introduce el Indo 1 para medir concentracin intracelular de calcio. Entre 1979-80 varios autores describen tcnicas citomtricas para medir condiciones fisiolgicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de superficie), y Thorell (estado redox).

Hedley (1983) pone a punto una tcnica para el estudio por citometra de flujo del ADN de ncleos de muestras parafinadas. Gratzner (1975) describe la tcnica de la bromodeoxiuridina (BrdU) y los anticuerpos contra ella, que permite ampliar el estudio de las fases del ciclo celular. Gray (1975) realiza el cariotipo por citometra de flujo. Este procedimiento fue posteriormente mejorado por Carrano.

Principio Un rayo de luz monocromtico, usualmente de luz lser, es dirigido hacia un finsimo chorro de lquido hidrodinmicamente enfocado. Y se coloca una serie de detectores en el punto en el que el chorro de lquido atraviesa el rayo de luz. Uno se coloca en lnea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector de Dispersin Frontal), y varios angularmente a la trayectoria del rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o detectores de Dispersin Lateral); adems de uno o ms detectores de fluorescencia. Cada una de las partculas suspendidas con un tamao de entre 0,2 a 150 micrmetros que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias qumicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partculas son excitadas hasta emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinacin de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores, y por medio de un anlisis en la fluctuacin de la

intensidad luminosa recogida por cada detector, es posible derivar varios tipos de informacin acerca de la estructura fsica y qumica de cada partcula individual. El detector frontal o FSC brinda informacin acerca del volumen de la partcula, mientras que los detectores laterales o SSC brindan informacin acerca de la complejidad interna de la misma (por ejemplo la forma del ncleo celular, la cantidad y tipo de grnulos citoplasmticos o la rugosidad de la membrana plasmtica). Esto es debido a que los componentes internos de las clulas dispersan la luz. Algunos de los citmetros de flujo presentes en el mercado han eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y utilizan tan slo la informacin de luz dispersada para las mediciones. Otros citmetros de flujo son capaces de generar grficos de los datos obtenidos de la fluorescencia de las clulas, luz dispersada y luz transmitida.

ESTRUCTURA BSICA DE UN CITMETRO DE FLUJO Componente Fludico: Para introducir y focalizar las clulas a evaluar.

Componente ptico: Para generar y colectar las seales de luz.

Componente Electrnico: Para convertir las seales pticas en seales electrnicas y digitalizarlas para su anlisis.

Qu puede decirnos un Citmetro de Flujo acerca de una clula? Tamao Granularidad o Complejidad interna Intensidad Fluorescente

ANLISIS DE DATOS GATING Los datos generados por los citmetros de flujo pueden ser dibujados en relacin a una variable, en forma de histograma, o en grficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o ms variables, o incluso en grficos tridimensionales. Las regiones delimitadas en estos grficos pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "Gates" (portales). Existen protocolos especficos para hacer la separacin en Gates, proceso conocido como gating, tanto para propsitos clnicos como diagnsticos, especialmente en relacin con la hematologa. Los grficos de citometra con frecuencia se hacen en funcin de escalas logartmicas. Ya que los diferentes compuestos fluorescentes utilizados para hacer el marcado poseen espectros de emisin que con frecuencia se solapan, las seales recogidas por los detectores deben ser compensadas tanto electrnica como computacionalmente. Los datos acumulados por los citmetros pueden ser analizados utilizando diferentes softwares, tales como por ejemplo WinMDI (el nico que es freeware), Flowjo, FCS Express, VenturiOne, CellQuest Pro, o Cytospec. Una vez que se han recogido los datos, no se hace necesario que la computadora siga conectada al citmetro, razn por la cual la mayor parte de las veces el anlisis de datos se hace en otro ordenador. Esto se hace especialmente necesario en instalaciones centrales donde la utilizacin de estas mquinas se encuentra bajo alta demanda. ANLISIS COMPUTACIONAL Los progresos recientes en la identificacin automtica de poblaciones utilizando mtodos computacionales ha ofrecido una alternativa a las estrategias tradicionales del gating. Los sistemas automatizados de identificacin podran, potencialmente, ayudar a encontrar poblaciones extremadamente pequeas, raras, y ocultas.

APLICACIONES La tecnologa de la citometra de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos, incluyendo la biologa molecular, inmunologa, biologa vegetal y marina. Tiene una amplia aplicacin en medicina, (especialmente en trasplantes, hematologa,

inmunologa tumoral, y quimioterapia, diagnstico prenatal, gentica y seleccin de esperma para una preseleccin de sexo).

ALTERACIONES GENTICAS EN LAS NEOPLASIAS HEMATOLGICAS DE ORIGEN LINFOIDE: IMPLICACIONES EN LA PRCTICA CLNICA GENETICA EN EL DIAGNOSTICO DE NEOPLASIAS: Las neoplasias hematolgicas son procesos malignos que afectan a los diversos tipos celulares implicados en el sistema hematopoytico. Dentro de ellas, las neoplasias linfoides afectan a los distintos tipos celulares y grados madurativos que conforman la lnea linfoide tanto B como T. Este tipo de enfermedades es, por tanto, un grupo muy heterogneo que slo tiene en comn el origen del tipo celular transformado. Dentro de ellas, clsicamente, se han diferenciado de manera arbitraria las leucemias de los linfomas sealando a las leucemias como aquellas neoplasias que afectan a la mdula sea con expresin perifrica y a los linfomas como aquellas neoplasias que permanecen localizadas en los ganglios linfticos u otros tejidos linfoides y que carecen, al menos de manera inicial, de comportamiento leucmico. En el caso de las leucemias, asimismo, se han diferenciado los procesos agudos de los crnicos en base a las caractersticas citolgicas de las clulas proliferantes (inmaduras y atpicas en el primer caso y ms diferenciadas en el segundo). De esta forma, las neoplasias linfoides se clasificaran en leucemias y linfomas, dividindose las primeras en leucemias linfoblsticas agudas (LLA) y sndromes linfoproliferativos crnicos (SLP) y los segundos en linfomas Hodgkin (LH) y no-Hodgkin (LNH). Actualmente este modelo de clasificacin, ambiguo y con grupos muy heterogneos, est sometido, como veremos ms adelante, a una intensa revisin. LAS ALTERACIONES GENTICAS EN LAS NEOPLASIAS LINFOIDES Los procesos neoplsicos son el resultado de la expansin de poblaciones celulares clonales capaces de proliferar de manera indefinida y de escapar al control defensivo del hospedador. Para llevar a cabo esta transformacin, las clulas han debido sufrir una serie de lesiones genticas que tienen como consecuencia la desrregulacin de las vas de control del ciclo celular. La caracterizacin de este tipo de lesiones est permitiendo un considerable avance en la comprensin de los mecanismos que conducen a esta transformacin, con repercusiones importantes tanto en su diagnstico y pronstico como en su tratamiento y seguimiento. Estas lesiones son fundamentalmente de dos tipos: activacin de proto-oncogenes (que promovern la proliferacin celular) e inactivacin de genes supresores de tumores (cuya prdida de funcin lleva a la prdida de control de la proliferacin)1. Ambos tipos de lesiones pueden surgir por diferentes mecanismos: reordenaciones de material gentico, mutaciones puntuales y/o prdidas de todo o gran parte del gen. Es importante tener en cuenta que ninguna alteracin gentica aparece en todos los casos de una determinada neoplasia (a no ser que se clasifique precisamente por poseer esa alteracin) y que rara vez una alteracin es exclusiva de una entidad determinada, aunque pueda existir una cierta asociacin. Las neoplasias linfoides presentan unos procesos oncognicos muy similares al resto pero adems, y como caracterstica especial, estn sujetas a errores en los procesos de recombinacin V-(D)-J de los loci IG para la formacin de las inmunoglobulinas y en los loci TCR (T-Cell Receptor) para la formacin de los receptores de clulas T2. Esta recombinacin es un tipo de inestabilidad genmica fisiolgica que, como veremos ms adelante, permite

estudiar la clonalidad, definir el linaje celular afectado, su estado madurativo3 y la monitorizacin de la enfermedad mnima residual (EMR)4. Las alteraciones genticas pueden ser observables a nivel citogentico o no. En el primero de los casos implicara una afectacin de segmentos cromosmicos grandes y en el segundo de ellos deberan recurrirse a tcnicas de biologa molecular para ponerlas de manifiesto. Estas tcnicas han sido capaces tambin de identificar el sustrato molecular de gran parte de las anomalas citogenticas permitiendo la caracterizacin de nuevos genes implicados en el proceso transformativo. Las reordenaciones cromosmicas observadas presentan consecuencias de dos tipos: cualitativas y cuantitativas. Las primeras son debidas a la formacin de un gen de fusin hbrido con segmentos pertenecientes a dos genes diferentes (Fig. 1) que, dependiendo de los dominios que conserve de cada uno, podra mantener propiedades de ambos. As, este nuevo gen dar lugar a una protena quimrica con posibles propiedades oncognicas o a la prdida de su funcin reguladora. Son ejemplos de este mecanismo las protenas formadas por la t(9;22)(q34;q11), que genera un gen hbrido BCR/ABL presente en el 5 y 20 % de las LLA infantiles y de adulto respectivamente, y por la t(12;21)(p13;q22) que genera un gen hbrido TEL/AML1 y que se encuentra en aproximadamente la cuarta parte de las LLA infantiles5. En la tabla 1 se muestran otros ejemplos.

Las consecuencias cuantitativas hacen referencia a los procesos de activacin gnica en los que un gen de presumible actividad oncognica se pone bajo el control de los promotores de ciertos loci, dando como resultado un cambio importante en su nivel de expresin. En este tipo de neoplasias suelen estar involucrados los promotores de los loci IG/TCR (muy activos en los tipos celulares afectados) que llevan a cabo un proceso de reordenacin fisiolgica. sta, a pesar de no ser oncognica per se, podra contribuir a las alteraciones genticas causantes de la transformacin maligna ya que requiere la rotura fsica y posterior reparacin del ADN3. En las neoplasias de linaje B las translocaciones asociadas a los genes IG afectan fundamentalmente al locus IGH (cadena pesada) en 14q32 y ms rara vez a los loci IGk e IGl (cadenas ligeras) situados en 2p12 y 22q11 respectivamente. En la mayora de las translocaciones de inters diagnstico en los LNH de clulas B est involucrado el locus IGH (Tabla 1) y un ejemplo sera la t(14;18)(q32;q21) que sita al oncogn BCL2 bajo el control de expresin del locus IGH, encontrada en 70-85 % de los Linfomas Foliculares de clulas B. Por el contrario, este tipo de alteracin es infrecuente en las LLA de clulas B quedando restringida a la t(8;14)(q24;q32) c-MYC/IGH y a la t(5;14)(q31;q32) IL3/IGH. En las neoplasias de linaje T este tipo de translocacin afecta al locus TCRa/d en 14q11 y ms rara vez a los loci TCRb (en 7q35) y TCRg (en 7p15) (Tabla 1)4. Estas alteraciones son ms frecuentes en las LLA de clulas T que en las de clulas B, ya que representan la mayor parte de las alteraciones

caracterizadas molecularmente. Sin embargo no est claro si estas diferencias son debidas a la orientacin de los anlisis o a los mecanismos oncognicos reales. El anlisis citogentico tambin pone de manifiesto otro tipo de alteraciones cromosmicas como hiperdiploidas, hipodiploidas, deleciones de ciertos segmentos cromosmicos, isocromosomas (cromosomas con ambos brazos iguales), trisomas, duplicaciones y cromosomas denominados marcadores (de origen desconocido). Algunas de estas alteraciones presentan cierta significacin clnica y aparecen en pacientes de mayor edad, o con neoplasias secundarias e indican progresin de la enfermedad (Tabla 2). Ninguna de ellas, a pesar de que son sucesos no aleatorios, se ha mostrado especficamente implicada en la leuquemognesis aunque algunas parecen implicadas en la prdida de funcin de genes supresores tumorales que pueden conducir a la progresin de la neoplasia1.

TCNICAS DE ANLISIS GENTICO A continuacin se describirn de manera somera las diversas tcnicas de anlisis citogentico y de biologa molecular utilizadas para poner de manifiesto las distintas alteraciones. Lgicamente cada una presenta sus ventajas e inconvenientes y debe ser aplicada de manera adecuada y protocolizada en orden a obtener la mayor informacin posible para el adecuado manejo clnico de la enfermedad. El anlisis citogentico El cariotipo de bandas G. Es la herramienta ms utilizada de las que dispone la citogentica convencional. Este anlisis permite la identificacin de cada uno de los cromosomas por su patrn de bandas caracterstico tras su tratamiento con tripsina y tincin con Giemsa poniendo de manifiesto cualquier tipo de alteracin cromosmica, tanto numrica como estructural, en las metafases de las clulas neoplsicas20. Sin embargo, requiere la obtencin de clulas en mitosis y en el caso de algunas de estas neoplasias las clulas tumorales presentan un ndice mittico escaso. Adems su sensibilidad es limitada (se requiere la observacin de las

metafases una por una) y la resolucin es baja (haciendo que alteraciones submicroscpicas pasen desapercibidas). La citogentica molecular. Estas tcnicas se basan en la hibridacin de una sonda de ADN monocatenario (marcada con un compuesto fluorescente) sobre su secuencia complementaria en el genoma, bien en la metafase o en el ncleo en interfase. La ms importante de todas ellas y de la que derivan las dems es la Hibridacin In Situ Fluorescente o FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation)21. La citogentica molecular puede poner de manifiesto cromosomas completos o secuencias especficas de ADN presentes en una o varias copias. Para ello se pueden utilizar sondas de ADN centromricas (marcan nicamente los centrmeros), de pintado cromosmico (marcan todo un cromosoma) o de secuencias nicas (marcan regiones cromosmicas muy concretas). Frente al cariotipo convencional, el FISH realizado en interfases celulares presenta una mayor sensibilidad (ya que permite el anlisis de grandes poblaciones celulares) y elimina la necesidad de obtencin de metafases (eliminando la seleccin que pueda realizarse en el cultivo celular) pero, al igual que los anlisis basados en la biologa molecular, detecta nicamente la alteracin especfica que buscamos y no nos suministra informacin sobre otras alteraciones presentes en el genoma. Por todo ello esta tcnica es un complemento adecuado en todas las situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo por disponer de metafases de poca calidad o no haberlas obtenido, o bien cuando ste ha resultado muy complejo y hay varios cromosomas con alteraciones tan complejas que incluso el citogenetista ms experimentado es incapaz de resolver. Para intentar solucionar la falta de informacin global del FISH se han desarrollado a partir de los aos 90 dos nuevas tcnicas de anlisis, la Hibridacin Genmica Comparada o CGH (Comparative Genomic Hybridisation)22 y el Cariotipo Espectral o SKY (Spectral KarYotyping)23. La primera de ellas emplea todo el ADN del tumor (es un mtodo de anlisis global) y no analiza metafases de ste (obviando la necesidad de clulas en crecimiento). Esta tcnica se basa en la hibridacin competitiva sobre cromosomas normales de dos ADNs (tumoral y normal) mezclados en cantidades equimolares y marcados con distintos fluorocromos (verde y rojo respectivamente) y ser capaz de poner de manifiesto ganancias y prdidas de regiones cromosmicas pero no de detectar reordenaciones o translocaciones equilibradas; sin embargo abre un futuro muy esperanzador en la bsqueda y caracterizacin de nuevos oncogenes (en zonas donde se detecten ganancias recurrentes) y genes supresores tumorales (en zonas donde se detecten prdidas recurrentes) implicados en estos sndromes. Actualmente, la utilizacin del FISH y la CGH estn bastante restringidas a los SLP crnicos, ya que en stos el ndice mittico de las clulas tumorales es generalmente muy bajo. La tcnica de SKY es la consecuencia del desarrollo de nuevos fluorocromos y sistemas de anlisis de imagen con el objetivo de caracterizar la mayor cantidad de alteraciones posibles en uno o muy pocos pasos. Esta tcnica slo se utiliza, de momento, como investigacin debido a su elevado coste y se basa en marcar el ADN de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos de manera que el espectro de emisin de cada uno de ellos sea nico y diferenciable de los dems. El SKY requiere obtener metafases tumorales, pero permite observar cada cromosoma de un color. Por ello, es de gran utilidad en el caso de alteraciones complejas en las que se desconoce el origen del material reordenado, puesto que permite determinarlas de manera inequvoca.

El anlisis molecular La identificacin y caracterizacin molecular de los genes implicados en las translocaciones cromosmicas recurrentes ha permitido la utilizacin de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) para su anlisis. Esta tcnica se basa en la amplificacin enzimtica de manera exponencial del segmento de ADN de inters hasta niveles que puedan ser detectados. La PCR analiza la alteracin de manera directa lo que, como en el FISH, implica una importante especificidad y sensibilidad y es particularmente til en los casos en los que los datos histolgicos, inmunofenotpicos o citogenticos no son concluyentes y, sobre todo, en la determinacin de la EMR. Esta tcnica se puede aplicar para determinar la clonalidad de la neoplasia (por medio de las reordenaciones de los loci IG o TCR), la translocacin cromosmica asociada (mediante la amplificacin especfica del gen de fusin resultante), o para determinar posibles alteraciones en oncogenes o genes supresores tumorales. Las dos primeras determinaciones son las que generalmente se aplican en la rutina clnica y son tiles tanto en el diagnstico y pronstico de la enfermedad como en su monitorizacin o seguimiento. En la mayor parte de los casos el anlisis de mutaciones en oncogenes y supresores tumorales permanece en el campo de la investigacin encaminada al conocimiento de los procesos implicados en la leuquemognesis con vistas al desarrollo de futuros tratamientos por lo que, salvo raras excepciones, no se han incorporado a los anlisis de rutina. Los anlisis de clonalidad Debido a que el proceso de transformacin maligna es consecuencia de la expansin clonal de una nica clula progenitora, cualquier caracterstica que nos permita identificar esa clula estar presente en todas las que deriven de ella permitiendo as el seguimiento de esta poblacin celular. En el caso de las clulas linfoides esta caracterstica es la secuencia especfica que presenta cada una de ellas en los loci IG y TCR (ambos implicados en el desarrollo de los procesos inmunitarios) una vez reordenados. Durante el proceso de maduracin linfoide, los loci IG/TCR llevan a cabo un proceso fisiolgico de recombinacin y mutacin que dar lugar a secuencias de ADN especficas para cada clula (Fig. 2). Este proceso es similar en las cadenas pesadas (H) y ligeras (L) de los genes IG y en las cuatro cadenas de los genes TCR (a, b, g, d). La configuracin germinal incluira varias regiones variables (V) distintas y varias regiones de diversidad (D, slo aplicables en el caso de los loci IGH, TCRb y TCRd), de unin (J) y constantes (C)3. Durante el proceso de maduracin, una regin V se unir a una D y a una J (Fig. 2) producindose, adems, fenmenos de mutacin somtica en las zonas de unin de estos segmentos. Esto da lugar a multitud de combinaciones posibles (base de la diversidad inmunolgica), formando secuencias de ADN especficas de cada clula linfoide (una especie de huella identificativa) (Fig. 2). De esta manera, y dado que el proceso tumoral refleja una expansin clonal a partir de una clula progenitora, todas las clulas tumorales presentarn la misma secuencia a este nivel. Segn este esquema, una poblacin linfoide policlonal estara caracterizada por una poblacin heterognea en cuanto a sus secuencias V-(D)-J en estos loci y una poblacin monoclonal (a veces, pero no siempre, asociada a un proceso maligno) estara caracterizada por una homogeneidad manifestada en la existencia de una secuencia predominante (Fig. 2).

El conocimiento de la secuencia de ADN del segmento reordenado tambin puede dar informacin acerca del linaje y estado madurativo del clon maligno, lo que puede ser de utilidad en la clasificacin de la patologa. Esto es debido a que, por un lado, el locus IGH estara reordenado de manera clonal en prcticamente todas las neoplasias de clulas B y los loci TCR en las neoplasias de clulas T (el caso inverso es infrecuente, salvo en las neoplasias linfoblsticas inmaduras de clulas precursoras en las que pueden observarse reordenaciones del otro linaje) y, por otro lado, este proceso es jerrquico en los distintos loci IG/TCR24. Por todo ello, el proceso fisiolgico de reordenaciones IG/TCR que, en s mismo, no constituye una anomala gentica, puede ser explotado para la caracterizacin molecular de este tipo de neoplasias. Desde el punto de vista prctico en la mayora de las neoplasias linfoides no es necesario realizar este anlisis, ya que tanto la morfologa como el inmunofenotipo suelen ser suficientes para establecer un diagnstico. Sin embargo, puede ser de enorme utilidad en la determinacin y monitorizacin de la EMR, aspecto que se discute ms adelante. El anlisis de los reordenamientos cromosmicos En este caso, el material de partida puede ser ADN tumoral o ARN (total o mensajero) tras su paso a ADN complementario. La utilizacin de ARN est indicada en aquellas translocaciones en las que estn involucrados puntos de rotura dispersos en los genes implicados, lo que hace muy complicado el anlisis a partir de ADN genmico, pero que presentan consecuencias similares a nivel de ARN mensajero.

Dada la relativa sencillez de los anlisis mediante PCR y la poca muestra requerida, ste ha desplazado en la mayor parte de los casos al Southern-blot de ADN digerido con enzimas de restriccin y posterior hibridacin con sondas especficas, ya que ste ltimo es un proceso ms laborioso y requiere una gran cantidad de muestra. As, el Southern-blot ha pasado a utilizarse, casi de manera exclusiva, en el anlisis de genes muy promiscuos (que se reordenan con un variado nmero de otros genes) o en el caso en el que los puntos de rotura se encuentren muy dispersos24. Sin embargo, en estos casos tambin esta siendo desplazado por el FISH. Las principales ventajas de PCR (alta sensibilidad y especificidad) y de sus distintas variantes se convierten simultneamente en sus principales defectos ya que la alta sensibilidad puede llevar a la determinacin de alteraciones que se encuentren en una proporcin tan baja que realmente no tengan significado patognico, y la especificidad hace que nicamente seamos capaces de detectar la alteracin que busquemos, no suministrando ms informacin. Adems, la mayor parte de los anlisis mediante PCR son cualitativos, indicando slo ausencia o presencia de la alteracin, y en la monitorizacin de la respuesta al tratamiento o de la EMR es importante la cuantificacin de sta4,25. Para ello se han utilizado varios sistemas26 que, junto a la aplicacin de marcajes fluorescentes, estn produciendo una autntica revolucin en este campo. El sistema ms importante por su sencillez y posibilidad de estandarizacin (aunque de elevado coste) es el seguimiento de la amplificacin mediante PCR en tiempo real (real-time PCR)27 en el cual se detecta el producto especfico a medida que se produce, de manera que la comparacin de su nivel de amplificacin con los estndares adecuados suministra una medida cuantitativa del grado de afectacin. Otros anlisis a nivel molecular El anlisis de mutaciones de genes supresores tumorales y oncogenes permanece en el campo de la investigacin (dada la complejidad y coste de su implantacin en la rutina diagnstica) con el objeto de conocer la posible implicacin patognica de estas alteraciones. La aplicacin de nuevos sistemas robotizados de gran capacidad de anlisis, con indudables ventajas en cuanto a controles de calidad y estandarizacin de los protocolos mejorar la reproducibilidad de los ensayos y, permitir la comparacin de resultados entre laboratorios facilitando la realizacin de grandes estudios prospectivos28. As, sistemas como los chips o microarrays de ADN, que permiten el anlisis simultneo de un gran nmero de genes y de sus niveles de expresin en una misma muestra, suministrarn una informacin de indudable valor para el establecimiento de terapias ms adaptadas a la alteracin molecular de cada tipo tumoral (terapias genotipo-especficas)29. IMPLICACIONES DEL ANLISIS DE LAS ALTERACIONES GENTICAS DIAGNSTICO Y CLASIFICACIN DE LAS NEOPLASIAS DE ORIGEN LINFOIDE EN EL

Las neoplasias de origen linfoide forman un grupo de entidades extremadamente heterogneo y durante muchos aos han sido clasificadas teniendo en cuenta nicamente criterios morfolgicos y citoqumicos, tal y como propuso el grupo cooperativo Franco-AmericanoBritnico (FAB) en 197630,31. Este grupo clasific las neoplasias linfoides en LLA, Sndromes Linfoproliferativos Crnicos (SLP) y Linfomas (Hodgkin y no-Hodgkin). En 1994 el Grupo Internacional para el Estudio de los Linfomas propuso la clasificacin REAL (Revised European-American classification of Lymphoid neoplasms) basada en una combinacin de los datos morfolgicos, inmunofenotpicos, genticos y clnicos, variando entre las distintas entidades la importancia relativa de cada uno de ellos32. Los principios de la clasificacin REAL

han tenido un gran impacto al considerar que el diagnstico debe realizarse desde una aproximacin mltiple y que, a pesar de que en algunos casos pueden ser suficientes los datos de morfologa, la exactitud del diagnstico se ve aumentada considerablemente cuando se tienen en cuenta los datos inmunofenotpicos y genticos. Actualmente, y bajo los auspicios de la OMS, se propone una clasificacin basada en los principios establecidos en la clasificacin REAL. Basndose en su experiencia, se han propuesto varios cambios que hacen referencia a variaciones en la nomenclatura y subdividiendo categoras demasiado heterogneas. De esta forma, se reconoceran tres grandes categoras: neoplasias de clulas B, neoplasias de clulas T/NK (o agresoras naturales) y la enfermedad de Hodgkin. Las neoplasias de clulas B y T se clasificaran en linfoblsticas o de clulas precursoras y perifricas o de clulas maduras y dentro de ellas la subdivisin se realizara teniendo en cuenta su presentacin clnica principal33. Es importante destacar que en la clasificacin propuesta figuran como factores determinantes de subtipo con valor pronstico en las neoplasias linfoblsticas de precursores B, la t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL, las reordenaciones con implicacin de 11q23 (principalmente del gen MLL), la t(1;19)(q32;p13) E2A/PBX1 y la t(12;21)(p12;q22) TEL/AML1; y el establecimiento como importante factor diagnstico en el linfoma/leucemia de Burkitt de la t(8;14)(q24;q32) y de sus variantes o de las reordenaciones de c-MYC. Esta clasificacin es de especial utilidad en una entidad tan heterognea como la LLA. La clasificacin FAB nicamente estableca los tipos morfolgicos LLA-1, LLA-2 y LLA-3, pero la nueva clasificacin se basa en las caractersticas morfolgicas, citoqumicas, inmunofenotpicas y en el grado de maduracin y diferenciacin de las series celulares B y T y quiz en mayor medida que en el resto de las leucemias, la decisin teraputica en la LLA viene dada por la determinacin inmunofenotpica del linaje afectado, la determinacin de la ploida por medio de la citometra de flujo y la determinacin citogentica o molecular de la anormalidad cromosmica recurrente28. Por otra parte, en el caso de las LLC de clulas B los anlisis moleculares realizados del estado madurativo de las reordenaciones de los loci IG sugieren la existencia de al menos dos grupos con pronsticos distintos34. En un subgrupo las clulas leucmicas muestran deleciones cromosmicas en 13q14 y contienen mutaciones somticas en la regin variable de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, congruentes con un fenotipo de clula B de memoria y sugiriendo que estas clulas ya habran pasado a travs del centro germinal. Estos pacientes presentan un pronstico mejor que las LLC en las que estos genes no estn mutados y que muestran generalmente trisoma del cromosoma 12. EL ANLISIS GENTICO Y LA ENFERMEDAD MNIMA RESIDUAL (EMR) La EMR puede ser definida como "el ms bajo nivel de enfermedad detectable por los mtodos disponibles en pacientes en remisin clnica continuada". Su determinacin es til tanto para valorar la respuesta al tratamiento como para la prevencin de recadas ya que permite actuaciones teraputicas rpidas35. Tradicionalmente la tcnica utilizada para su deteccin ha sido el anlisis de la morfologa celular, definiendo en este caso la EMR como la presencia de 5% de clulas blsticas en la mdula sea. Esto puede reflejar la existencia de 1010 clulas leucmicas en el individuo 36. Esto ha hecho que en los ltimos aos se hayan desarrollado tcnicas complementarias con sensibilidades muy superiores (de 100 a 10.000 veces ms) disponindose en la actualidad de otras tres: 1) la citometra de flujo, que permite detectar clulas con inmunofenotipo especfico de leucemia; 2) la deteccin mediante PCR (y mediante FISH) de los genes de fusin

consecuencia de translocaciones cromosmicas especficas presentes en las clulas neoplsicas; y 3) el anlisis mediante PCR de las reordenaciones de los loci IG/TCR. Todas estas tcnicas han cambiado tanto el concepto como el valor de esta determinacin, ya que permiten la deteccin de una clula leucmica entre 104 a 106 clulas normales. El caso de las LLA es uno de los ms estudiados y en ella los anlisis multivariantes han puesto de manifiesto que la presencia o ausencia de EMR es un factor pronstico independiente. Como se ha sealado, en las neoplasias linfoides la determinacin gentica de la EMR se puede realizar a travs de la determinacin de translocaciones cromosmicas recurrentes o mediante el anlisis de las reordenaciones IG/TCR. La primera es relativamente sencilla pero no es factible en los casos que no presenten este tipo de marcadores genticos en el momento del diagnstico. El segundo, basado en el origen clonal del proceso tumoral, permite el seguimiento del clon maligno de manera especfica en la mayora de los casos. Esta especificidad es la causante de la complejidad tcnica y su elevado coste, ya que ser indispensable el conocimiento exacto de la secuencia de ADN de la zona reordenada del clon maligno en el momento del diagnstico para su deteccin en fases ms avanzadas. Adems, en la mayor parte de los casos existe un solo clon maligno y predominante, pero en otros casos hay varios y el seguimiento se deber realizar utilizando sondas o cebadores especficos para cada una de ellos, minimizando la posibilidad de falsos negativos y estableciendo cul de las poblaciones clonales es la causante de la posible resistencia al tratamiento y posterior recada. A pesar de estas dificultades, el problema principal de la aplicacin de la PCR en la determinacin de la EMR es que, como se ha sealado anteriormente, esta tcnica slo muestra la existencia de la alteracin pero no su magnitud o la cantidad aproximada de clulas afectadas. Esta cuantificacin es, sin embargo, de gran utilidad pronstica37. Por ello, los esfuerzos actuales se dirigen hacia la PCR con seguimiento en tiempo real, en la que la cintica de amplificacin en las primeras fases permiten una cierta estimacin cuantitativa. Como se ha sealado, esta tecnologa est suponiendo una revolucin en cuanto al tiempo invertido en el anlisis y su estandarizacin35, lo que permitira la comparacin de las diferentes series publicadas. Un ejemplo de ello es el protocolo para la deteccin de reordenaciones en los loci IG/TCR propuesto por Pongers-Willemse y col como miembros de la Accin Concertada BIOMED-1 para la investigacin de la EMR en LLA, en el que seala la posibilidad de monitorizar ms de 90% de los pacientes combinando cuatro dianas moleculares distintas38. La importancia de la determinacin cuantitativa de la EMR es manifiesta. Aproximadamente 50% de nios con LLA presentan EMR positiva mediante anlisis cualitativos al final de la terapia de induccin, pero slo EL 45% de ellos sufrirn recada. Sin embargo, los anlisis semi- o cuantitativos sealan que esta recada se produce en pacientes con niveles entre 10-2 y 10-3, mientras que con niveles menores de 10-4 stas se producen en menor medida39-42. Por otra parte, la remisin clnica continuada es mayor entre los pacientes con EMR negativa postinduccin, pero en este caso tambin se produce un pequeo nmero de recadas. En general, la asociacin entre una EMR negativa al final de la induccin y el mantenimiento de remisin clnica es mayor que la asociacin entre EMR positiva y recada. Varios estudios sugieren que el nivel de EMR es un importante indicador de riesgo de recadas y han intentado establecer grupos en funcin de ste42,43. En pacientes en edad adulta hay menos estudios y las series analizadas son menores44, 45. En general, y con independencia de la edad del paciente, se observa un consistente y continuo descenso en el nmero de individuos con EMR detectable entre los 2 y 24 meses. Su persistencia ms de 4-6 meses o su reaparicin incluso a niveles de 10-4 estara asociada a una recada. Parece que la reduccin por debajo de los lmites de deteccin por PCR (remisin molecular) a distintos tiempos durante 2 aos sera el mejor indicador de remisin clnica continuada y parece tambin que este anlisis es importante al

final del tratamiento, ya que la presencia de EMR en este punto estara asociada con un alto riesgo de recada45. Todo ello lleva a concluir42,43 que la presencia molecular de EMR es un factor pronstico importante e independiente de la edad. Su informatividad es mayor si el anlisis es negativo (con un valor predictivo de remisin clnica de ms de 82,5%), ya que la positividad tiene un valor predictivo de recada inferior a 75%45. Adems, aunque la determinacin molecular de EMR en un nico momento pueda dar cierta informacin, es conveniente la realizacin de un mayor nmero de determinaciones en momentos preestablecidos para poder determinar de manera temprana la aparicin de un clon de clulas proliferativas. En este sentido, parece conveniente realizar este anlisis al menos inmediatamente despus de la induccin, a los 3-5 meses y tras 6-9 meses de tratamiento45. IMPORTANCIA DE LAS ALTERACIONES GENTICAS EN EL TRATAMIENTO Y EN EL DESARROLLO DE NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS El conocimiento de los mecanismos moleculares que conducen a la transformacin maligna en las neoplasias linfoides conduce, como ya se ha visto, a una mejora importante en el diagnstico de las diferentes entidades y a la posibilidad de monitorizacin de los niveles residuales de enfermedad y de la respuesta al tratamiento aplicado. Actualmente parece claro que el conocimiento de la morfologa, inmunofenotipo y genotipo de las clulas malignas son factores determinantes en la seleccin de los tratamientos. De esta manera, las leucemias agudas mieloides y linfoides requieren distintas aproximaciones teraputicas, las LLA de clulas B y de clulas T deben ser tratadas de manera distinta a las LLA de precursores B para alcanzar tasas de curacin equivalentes y, mientras los nios con LLA hiperdiploide o con la t(12;21) responden bien a terapias basadas en antimetabolitos, los que presentan la t(9;22) no lo hacen de igual manera. As, la toma en consideracin de determinados factores en la eleccin del tratamiento lleva a la curacin a ms de 70% de los nios con LLA y tambin han mejorado las tasas de curacin alcanzadas en el caso de los adultos28. De la misma manera, la informacin obtenida de la monitorizacin molecular de los niveles de enfermedad residual en mdula sea o sangre perifrica ser de utilidad para determinar el grado de curacin, la duracin de los tratamientos o si son necesarios cambios en stos. Este conocimiento tambin prepara el camino para el desarrollo de terapias dirigidas al defecto gentico causante de la proliferacin anmala que presenten menores efectos secundarios, evitando tratamientos a menudo excesivos e ineficaces. En el caso de la t(15;17) asociada a la Leucemia Promieloctica Aguda o M3, la eficacia del cido retinoico ha venido explicada de manera retrospectiva por el defecto molecular asociado a esta alteracin, por lo que es de esperar que, una vez conocidas otras alteraciones moleculares y sus consecuencias, el desarrollo de nuevas drogas sea un hecho46. Por ejemplo, ya se ha desarrollado un inhibidor especfico (STI-571) de la actividad tirosn-quinasa BCR-ABL que est siendo probado en ensayos clnicos y cuyos resultados en animales han sido prometedores47. Tambin en el caso de las neoplasias hematolgicas son posibles las estrategias de terapia gnica. En principio, dado que estas enfermedades son desrdenes genticos, esta terapia sera una aproximacin muy adecuada para su tratamiento ya que conducira a la correccin de las anomalas presentes en las clulas malignas con unos efectos adversos mnimos. Sin embargo, en realidad, la ineficiencia de los actuales sistemas de vehiculizacin, su incapacidad de llegar especfica y exclusivamente a las clulas malignas y la propia naturaleza diseminada

de la mayor parte de estas neoplasias hacen que la "correccin gnica" no sea viable por el momento. Actualmente est siendo probada en ensayos clnicos la transferencia de genes de resistencia a ciertos frmacos en clulas madre hematopoyticas como medida protectora frente a la quimioterapia aunque los resultados son escasos48 y la transferencia de genes inmunoestimuladores con el fin de crear una respuesta inmune antitumoral. Otras posibilidades a desarrollar sern la liberacin dirigida de protenas citotxicas, el desarrollo de inmunoterapias de adopcin con clulas T modificadas genticamente, terapias de inmunoestimulacin mediante vacunas (en el caso de neoplasias de clulas B como los LNH y los mielomas, las regiones variables de las inmunoglobulinas de superficie de las clulas tumorales son antgenos tumorales especficos frente a los cuales se pueden producir vacunas individualizadas), o terapias basadas en oligonucletidos antisentido (para disminuir la sobreexpresin de ciertos oncogenes como BCL2, BCL-X, MDM2 y otros y promover la apoptosis)46, 49