Actividad antimicrobiana de los flavonoides Abstract Resumen Los flavonoides estan presentes en la fotosntesis en las clulas y se encuentran comnmente

en frutas, hortalizas, nueces, semillas, tallos, flores, t, vino, propleos y miel. Durante siglos, los preparados que contengan estos compuestos como el principal constituyente fisiolgicamente activos se han utilizados para tratar enfermedades humanas. Cada vez ms, esta clase de productos naturales se est convirtiendo en el tema de la investigacin anti-infecciosos, y muchos grupos han aislado e identificado las estructuras de los flavonoides que poseen actividad antifngicos, antivirales y antibacteriales Adems, varios grupos han demostrado la sinergia entre los activos flavonoides, as como entre los flavonoides y quimioteraputicos existentes. Reports of activity Informes de actividad en el mbito de la investigacin antibacteriana de flavonoides son muy conflictivos, probablemente debido a la inter e intra-ensayo de variacin en la susceptibilidad pruebas. Sin embargo, varias investigaciones de alta calidad han examinado la relacin entre estructura y la actividad antibacteriana de los flavonoides y estos se mantienen en estrecho acuerdo. Adems, numerosos grupos de investigacin han tratado de elucidar el mecanismo de accin antibacteriana de seleccionados flavonoides. La actividad de la quercetina, por ejemplo, ha sido al menos parcialmente atribuido a la inhibicin de la ADN girasa.Tambin se ha propuesto que sophoraflavone G y ()-galato de epigalocatequina inhibin la funcin de la membrana citoplasmtica, y que licochalcones A y C inhiben el metabolismo energtico. Otros flavonoides cuyos mecanismos de accin han sido investigados incluyen robinetin, myricetin, apigenin, rutina, galangin, 2,4,2 -trihydroxy-5 -methylchalcone and lonchocarpol A. Estos compuestos representan novela lleva, y los estudios futuros pueden permitir el desarrollo de un agente antimicrobiano farmacolgicamente aceptables o clase de agentes. 1. 1. Introduction Introduccin Resistencia a los antimicrobianos se ha convertido en una creciente y cada vez ms importante problema global. De los 2 millones de personas que adquieren infecciones bacterianas en los hospitales de EE.UU un 70% de los casos actuales implican que las cepas son resistentes al menos a una droga [1]. Una de las principales causas de preocupacin en el Reino Unido es Staphylococcus aureus (MRSA), que es meticilina-resistente estaba bajos niveles de una dcada, pero ahora hace cuentas para ca.50% de all S. todos S. aureus isolates [2] . sustancial inversin y la investigacin en el mbito de antiinfecciosos se necesitan desesperadamente, para evitar una crisis en la saslud publica Modificacin estructural de los antibiticos que han desarrollado resistencia se ha desarrollado y demostrado ser un medio eficaz de extender la vida til de los agentes antifngicos como la azoles [3] , los agentes antivirales como inhibidores no nuclesidos de la transcriptasa inversa y varios agentes antibacterianos incluyendo-lactmicos y quinolonas [5]. No es de extraar entonces, que en respuesta a la resistencia a los antimicrobianos, las grandes empresas farmacuticas han tendido a concentrar sus esfuerzos en mejorar las clases establecidas de los agentes antimicrobianos Sin embargo, con la cartera de quimioteraputicos actualmente disponibles, se ha reconocido que los investigadores cerca del final del juego en trminos de modificar la estructura padre. A call has therefore been made for the development La convocatoria se ha hecho para el desarrollo de nuevas clases de drogas que funcionan en diferentes lugares de destino a los de uso actual [7,8]. Diseo racional de frmacos antimicrobianos el rendimiento no siempre es efectivo En el pasado, los potentes inhibidores de enzima ha sido diseado y sintetizado, pero slo haba actividad antibacteriana, probablemente debido a al complejo tema de la absorcin de la droga por las clulas. Amplia proyeccion emprica de entidades qumicas de actividad antimicrobiana representan una estrategia alternativa para el desarrollo de nuevos frmacos. Los productos naturales han sido particularmente rica fuente de agentes anti-infecciosos, produciendo, por ejemplo, las penicilinas in 1940, las tetraciclinas en 1948, y los glucopptidos 1955 [9] . La siguiente revisin examinar la actividad antimicrobial de flavonoides, una clase de productos naturales que poseen una amplia gama de propiedades farmacolgicas. Compuestos con actividad antifngicas, antivirales y antibacteriales cada uno sera analizado a su vez, pero el mayor nfasis sera a la actividad antimicrobiana de los flavonoides. 2. 2. Flavonoides: ocurrencia, funciones, estructura y nomenclatura Los flavonoides estan presentes celulas fotosnteticas y se producen ampliamente en el reino de las plantas Son por lo tanto encontrados en frutas hortalizas, nueces, semillas, tallos y flores as como el t, el vino propleos y de miel [12], y representan un componente comn de la dieta humana [13]. En los EE.UU., la ingesta alimentaria diaria de mezclas de flavonoides se estima que esta en el rango 500-1000 mg pero esta cifra puede ser tan alta para las personas que complementa su dieta con preparados a base de plantas

La funcin de los flavonoides de las flores es proporcionar a los atractivos colores para los polinizadores de plantas [11,15]. En las hojas, estas compustos se considera cada vez ms para promover la supervivencia de la planta por ejemplo, protegerla de hongos patgenos y la radiacin UV-B [13,15]. Adems, los flavonoides estn involucrados en la fotosensibilizacion, la transferencia de energa, las acciones de las hormonas de crecimiento de plantas y reguladores del crecimiento, del control de la respiracin y la fotosntesis, la morfognesis y la determinacin del sexo La base estructural de los compuestos flavonoides consiste en ncleo 2-fenil-benzo [] pyrane o flavane , que consiste de dos anillos de benceno (A y B) vinculados a travs de un anillo piran heterocclicos Flavonoides pueden clasificarse segn su origen biosintticos Algunas clases, por ejemplo flavanones, flavan-3-aminoetanoles y flavan-3 ,4-dioles son intermediarios en la biosntesis, as como productos finales que pueden acumularse en los tejidos de la planta Otras clases. slo se conoce como productos finales de la biosntesis, por ejemplo antocianidinas, proantocianidinas flavonas y flavonoles Otras dos clases de flavonoides son aquellos en los que la cadena lateral2-fenil de flavonoide se isomerisa a las posicin 3 dando lugar a isoflavonas y isoflavonoides. la neoflavonoid se forma mediante la isomerizacin de la 4 posicin e structuras de los principales tipos de flavonoides son dados en la fig. 2 . Las estructuras de compuestos especficos dentro de la clases, que poseen actividad antimicrobiana y que son analizados en la presente revisin se resumen en la Tabla 1. Flavonoides individuales se le puede asignar los nombres de tres diferentes maneras. nombres Triviales se emplean ampliamente y a veces indican la clase de flavonoides o fuente vegetal. Por ejemplo, los nombres que terminan en "inidin 'puede denotar una antocianidina nombres que terminan en "etin generalmente denotan un flavonol y compuestos tricin se han extrado de plantas pertenecientes a los gneros Triticum y Hypolaena. Los flavonoides tambin pueden ser nombrados de manera semi-sistemtico sobre la base de nombres triviales como flavone o como chalcona como la estructura matriz por ejemplo, 3,5,7,3 4-pentahydroxyflavone o 3,3 ,4 ,5,7-pentahydroxyflavone. Por ltimo, flavonoides pueden nombrarse por los dado el nombre qumicos, por ejemplo, 3,4-dihidro-2-fenil - 2H-1-benzopyran para flavan, pero este mtodo es engorroso y rara vez se usa. En la presente revisin, se utilizar siempre que sea posible nombres trivial 3. 3. propiedades medicinales de flavonoides Cada vez ms, los flavonoides se estn convirtiendo en el tema de investigacin en medicina Ellos se han comunicado a poseer muchas propiedades tiles incluida la actividad anti-inflamatoria, un efecto estrognico inhibicin de enzimas, actividad antimicrobiana actividad vascular actividad antioxidante y la actividad antitumoral citotxica. Para un grupo de compuestos de estructura relativamente homognea, los que inhiben un sorprendente nmero y variedad de enzimas eucarioticas y tienen una gran amplia gama de actividades En el caso de la inhibicin de enzimas, esto se ha postulado que se debe a la interaccin de enzimas con diferentes partes de la molcula de flavonoides por ejemplo, hidratos de carbono, fenilo anillo, fenol y anillo benzopirona Varios comentarios han sido Escritos la no interaccion entre los flavonoides y las celulas mamiferas incluidos los artculos de amplio Harborne y Williams y Middleton Una extensa revisin sobre la bioqumica y la importancia mdica de flavonoides Recientemente se ha producido por Havsteen [21]. 4. 4. Historia de uso de flavonoides en el tratamiento antimicrobiano Durante siglos, los preparados que contienen flavonoides como el principal componente fisiolgicamente activo se han utilizado por mdicos y sanadores laicos en los intentos para tratar enfermedades humanas. Por ejemplo, la planta Tagetesminuta (que contienen quercetagetin-7-arabinosyl-galactoside) se ha utilizado ampliamente en la Argentina por la medicina popular para tratar la enfermedades infecciosas. Las propiedades curativas de propleos (o "tzori en Hebreo) se hace referencia en todo el Antiguo Testamento y este blsamo es prescrita por Hipcrates (460-377 aC) en la Antigua Grecia para el tratamiento de heridas y lceras.La propiedades antimicrobianas de propleos se han atribuido a su alto contenido de flavonoides y, en particular, a la presencia de los flavonoides galangin y pinocembrin. Huang -chin ( Scutellaria baicalensis ) es otro ejemplo.Estas hierbas medicinales se ha utilizado sistemticamente y de forma tpica miles de aos en China para el tratamiento periodontal y heridas infectadas por va oral informes el flavone baicalein es reportado de que en gran medida es el responsable de los efectos antimicrobianos de esta planta. 5. 5. Toxicidad de los flavonoides Se ha sugerido que, debido a que los flavonoides son ampliamente Distributed in edible plants and beverages and have previously han sido utilizado en la medicina tradicional, es probable que tengan un mnimo de toxicidad Sin embargo, esta familia de compuestos tiene una amplia gama de actividades en clulas de mamferos y una segunda en vivo, la confirmacin de sus efectos secundarios seran necesarios para una evaluacin completa de su utilidad prctica en el mbito de la medicina moderna Given that the selectivity of flavonoids para las enzimas eucariotas parece variar de

compuesto en compuestos un estudio de ese tipo tendra que evaluar la toxicidad de estos fitoqumicos sobre una base individual. 6. 6. actividad antifngica de flavonoides Debido a la amplia capacidad de los flavonoides de inhibir esporas de los patgenos de plantas, se han propuesto para su uso contra los hongos patgenos del hombre. Una nueva prenylated flavanone recientemente aislado del arbusto Eysenhardtia texana ha sido identificado como 5,7,4-trihydroxy-8 methyl-6-(3-methyl-[2-butenyl])-(2 S )-flavanone y se muestra poseer actividad contra els patgenos oportunistas Candida albicans el Flavonoides 7-hidroxi-3, 4 (metilenodioxi) flavan, aislado cscara de fruta de Terminalia bellerica tambin ha demostrado poseer actividad contra C. albicans. Dos nuevos flacones de Artemisia giraldihan identificados como 6,7,4-trihydroxy-3, 5-dimethoxyflavone y 5,5 dihidroxi-8, 2, 4trimethoxyflavone, junto con 5,7,4 trihydroxy-3, 5-dimethoxyflavone se ha informado al exhibir la actividad contra el Aspergillus flavus, una especie de hongos que causa enfermedad invasiva en pacientes inmunosuprimidos La actividad de propleos contra dermatofitos y Candida spp se ha atribuido, al menos parcialmente, a su alto contenido de flavonoides. Galangin, flavonol un commonly comnmente encontrados en las muestras de propleos, ha demostrado que tienen actividad inhibitoria contra el Aspergillus tamarii, A. flavus , flavus, Cladosporium, Penicillium digitatum y Penicillium italicum . 7. 7. Actividad antiviral de flavonoides Un reciente campo de la investigacin que es de particular inters es la aparente actividad inhibitoria de algunos flavonoides contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Hasta la fecha, la mayora, si no todos all investigations have in volved work with the pandemic HIV-1 strain and its enzymes Los estudios in vitro han demostrado que baicalin inhibe la infeccin y la replicacin VIH-1. Inhibicin de entrada del VIH-1 en clulas que expresan CD4 y co-receptores chemokine and antagonismo of HIV-1 reverse transcriptase by the flavone O glycoside se ha demostrado por Li y sus colegas. Baicalein robustaflavone y hinokiflavone Tambin se han demostrado para inhibir el VIH-1 transcriptasa inversa, al igual que varios de catequinas, pero catequinas otros inhiben la ADN polimerasa y su interaccin con del VIH-1 es la enzima, por lo tanto, cree que no especfica en la naturaleza Adems, se ha demostrado que varios flavonoides, incluyendo demethylated gardenin A y3,2-dihydroxyflavone, inhibir la proteinasa VIH-1 [41]. Robinetin, myricetin, baicalein, quercetagetin [42] y quercetina3 - O - (2-galloyl) --l-arabinopyranoside inhibir la integrasa VIH-1 aunque existe la preocupacin de la enzima que el VIH inhibicin por quercetagetin y myricetin no es especfica. Tambin se ha informado de que los flavonoides chrysin, acacetin y apigenin prevenir la activacion VIH-1 a travs de la activacin de un nuevo mecanismo que probablemente implica la inhibicin de la transcripcion viral. Interesantemente, en un estudio realizado por Hu y colegas, chrysin se inform de que el ms alto ndice teraputico de 21 naturales y 13 de flavonoides sinttica contra el VIH-1 [46]. Varios grupos de investigacin han investigado la relacin entre estructura y actividad inhibitoria contra el VIH-1 y sus enzimas Adems, en menos dos grupos han propuesto mecanismos de accin para la inhibicin de la enzima VIH-1 Los flavonoides tambin tienen actividad inhibitoria contra una variedad de otros virus Por ejemplo, los informes que Morin, rutina, dihydroquercetin, dihydrofisetin, leucocyanidin cloruro de pelargonidin y catequina poseer actividad contra hasta siete tipos de virus, incluyendo herpes simple virus sincicial respiratorio, el poliovirus y Sindbis virus [11,47]. Propuesta de mecanismos de accin antiviral incluyen la inhibicin de la polimerasa viral y vinculantes de virales de cidos nucleicos o protenas cpside viral [47]. Adems de los flavonoides mencionado anteriormente, tres de las proantocianidinas de Pavetta owariensis (con la semejanza estructural a proantocianidinas A2 y cinnamtanninas B1 y B2 han demostrado tener actividad contra el VHS y el virus de Coxsackie B .It has also been demonstrated that two of the flavonoids found in propoleo, chrysin y kaempferol, de inhibir la replicacin viral de HSV, rotavirus y coronavirus humanos [50]. Ms recientemente, el flavonol galangin Se ha informado que tienen actividad antiviral contra el VHS y el virus de Coxsackie B [51]. Aunque el origen natural de flavonoides con actividad antivirales han sido reconocidos desde la dcada de 1940, slo en los ltimos 25 aos se ha intentado sintetizar flavonoides modificados para mejorar la actividad antiviral One such synthesised compound is 6,4 -dichloroflavan. However a pesar de fuerte actividad in vitro, este compuesto nunca, sin xito en los ensayos clnicos Se ha demostrado la sinergia entre distintas combinaciones de flavonoles Por ejemplo, kaempferol y luteolina mostrar la sinergia contra VHS. Esto a sugerido That this is why propolis is more active than its individual component compounds La sinergia tambin se ha informado entre los flavonoides y otros agentes antivirales. Quercetina, por ejemplo, potencia los efectos de la 5-etil-2-

dioxyuridine y aciclovir contra HSV y infecciones seudorrabia Apigenin t6ambien realza la actividad antiviral de acyclovir contra estos virus 8. 8. Actividad antibacteriana de flavonoides 8.1. Informes de flavonoides que poseen actividad antibacteriales La actividad antibacteriana de los flavonoides se cada vez ms existente en documentados Extractos crudos de plantas con una historia de uso en la medicina popular han sido examinados in vitro por muchos grupos de investigacin por su actividad antibacteriana extractos vegetales de las especies de Hypericum [54], 12Capsella Capsella y Chromolaena ricos en Flavonoides se ha informado de que poseen actividad antibacteriana Muchas otras preparacines de fitoqumicos con un alto contenido de flavonoides tambin se han reportado de exhibir actividad antibacterial propleos se han anilzados en muchas ocasiones tambien y muestran contener una alta concentracin de flavonoides que frecuentemente reporte muestran tener actividad antibacteriana Muchos grupos de investigacin han ido un paso ms y ya se a aislado e identificado la estructura de los flavonoides que poseen actividad antibacteriana, o cuantificado la actividad de los flavonoides comercialmente disponibles Ejemplos de tales flavonoides son apigenin galangin pinocembrin ponciretin genkwanin sophoraflavanone G y sus derivados naringina y naringenin galato de epigalocatequina y sus derivadosluteolina y luteolina 7 --glucosid quercetina3 - O-methylquercetin y diversos glucsidos de quercetina kaempferol y sus derivados Otros Flavonas isoflavonas flavanones, isoflavanones, isoflavans flavonoles glucsidos flavonol y charcones con actividad antivacteral han sido tambien identificados Algunos investigadores han informado de la sinergia entre natural ocurridos flavonoides y otros agentes antibacterianos contra las cepas resistentes de bacterias Ejemplos de esto incluye galato de epicatequina y sophoraflavanone G. Al menos un grupo ha demostrado sinenerga entre los flavonoides con actividad antibacteriana [126]. Otros han modificados sintticamente Flavonas naturales y analizados lar actividad antibacteriana [94,127-131]. Por ejemplo, Wang y sus colegas han complejado 5-hidroxi -7,4-dimethoxyflavone con un nmero de metales de transicin y demostrado que este proceso aumenta la actividad antibacteriana Otro grupo inform de una mayor actividad antibacterianas de 3- methyleneflavanones cuando el anillo B tiene sustituyentes de bromo o cloro [131]. Dos grupos de investigacin han descrito el uso de flavonoides en vivo. En un estudio realizado por Vijaya y Ananthan, la administracin oral de cualquierade, 142,9 mg / kg de quercetina o 214,3 mg / kg quercetrin protegida contra los cobayos inducida por una infeccin por Shigella que mataron a los animales control no tratados [132]. Ms recientemente, Dastidar y compaeros de trabajo inform de que la inyeccin intraperitoneal de cualquiera1,58 mg / kg sophoraisoflavone A o 3,16 mg / kg 6,8 diprenylgenistein dio una proteccin significativa a los ratones desafos con ~ 9,5 10^8 unidades formadoras de colonias (CFUs), de Salmonella typhimurium 8.2. Discrepancias entre los informes de la actividad antibacteriana de flavonoides Cuando los informes de la actividad antibacteriana de los flavonoides son comparadas los resultados aparecen ampliamente en conflicto Por ejemplo, se public que apigenin no tena ninguna actividad contra S. aureus en concentraciones de hasta 128 ug/ ml [72]; un estudio separado en el mismo ao se informaba de que el flavone inhibi el crecimiento de 15 cepas de MRSA y 5 cepas de S. aureus sensibles en concentraciones entre 3,9 g / mL y de 15,6 g / mL. De la tabla 2 se puede ver que tal discrepancias quizs podra atribuirse, en ocasiones, a distintos ensayos que se est utilizando. Muchos ensayos diferentes different assays are employed in flavonoid research, incluyendo la tecnica de la dilucion en agar , el ensayo de disco de papel difusin en agar, el metodo de placa agujero difusin, la tecnica de la macrodilucion en caldo y la tecnica de microdilucion en caldo. En particular, los ensayos apoyndose en la difusin de flavonoide la prueba no podr dar medida cuantitativa de la potente actividad antibacteriana debido a un bajo ndice de difusin Sin embargo, se desprende de la Tabla 2 que factores adicionales son implicados en el origen de estas discrepancias, ya que incluso los grupos utilizando el mismo ensayo son la obtienen distintos resultados Estas inconsistencias pueden deberse a variaciones dentro de cada ensayo Por ejemplo, los diferentes grupos utilizando la tcnica de dilucin en agar han utilizado diferentes tamaos de inculo bacteriano En un informe de la Comisin Nacional de estandares de laboratorios clinicos (NCCLS), tamao inculo se consider la variable ms importante en la sensibilidad de la prueba Cabe sealar que muchos grupos ensayando la actividad antibacteriana de flavonoides no han cuantificado la prueba de suspensin bacteriana y otros no lo han normalizado el tamao de susinculo A partir de la obra publicada es evidente que, adems del tamao del inculo hay muchas otras variables factores para cada tipo de ensayo Estos incluyen el volumen de caldo o agar el tipo de caldo el tamao de los pozos, el tamao de los discos de papel y en particular las cepas bacterianas usadas y el periodo de incubacion Recientemente, un conjunto de directrices para la norma se public para estandarizar los metodos de dilucion en agar, macrodilucion y microdilucion en caldo. Esto puede ayudar a reducir el

nmero de conflictos de informes de actividad antibacteriana flavonoides en el futuro. Sin embargo, seguir siendo necesario examinar cuidadosamente adicionales variables tales como el disolvente utilizado para disolver prueba flavonoides Ha sido demostrado que la precipitacin se produce cuando se selecciona flavonoides que se disuelven en solventes organicos y diluidos con soluciones polares neutras.precipitacin de flavonoides en una concentracin mnima inhibitoria de ensayo puede causar disminucin de contacto entre clulas bacterianas y molculas flavonoides y puede dar lugar a informes falsas negativos de la actividad antibacteriana Asimismo en experimentos controlados adecuadamente, la precipitacin flavonoides podra ser malinterpretado como crecimiento de bacterias y los resultados como consecuencia pueden ser registrados como falsos negativos. La alteracin de las Estructuras de los flavonoides tal como galangin en disolventes alcalinos es otra cuestin para considerar su examen Si sales de flavonoides se forman y se han aumentado o disminuido la potencia en comparacin con la estructura de los padres, esto puede conducir a falsas a informes positivo / negativo de actividad antibacteriana Otras variables permite destacar incluyen si la prueba se flavonoides Other variables worth noting include whether the test flavonoids are obtenida de una fuente natural o comercial y which companies natural products the compounds are from 8.3. De relacin estructura-actividad actividad antibacteriana de los flavonoides La amplia gama de funciones de las clulas afectadas por flavonoides en los sistemas eucariticos est bien documentado Aunque ha habido relativamente pocos estudios en los mecanismo underlying flavonoid antibacterial activity ,information, la informacin de la literatura publicada indica que los diferentes compuestos dentro de esta clase de fitoqumicos pueden incluir diferentes compuestos and functions of the bacterial cell If this is the case ,it is surprising that the small number of groups which han investigado la relacin entre la estructura flavonoides y la actividad antibacteriana (resumen a continuacin) han sido capaces de identificar elementos estructurales comunes entre los compuestos activos Sin embargo, puede ser que cada flavonoides antibacterial tienen mltiples objetivos celulares en lugar de un sitio especfico de accin Como alternativa, estas caractersticas estructurales comn pueden ser simplemente necesario para flavonoides para ganar proximidad a la captacin to or uptake into the bacterial cell. Tsuchiya y colegas trataron de establecer una relacion estructura actividad para flavanones por aislamiento de un nmero de compuestos sustituido y determinar su MICs Contra MRSA Su estudio indica que el2, 4-o 2 ,6 -dihydroxylation del anillo B y 5,7-dihydroxylation del anillo A en la estructura del flavanone es importante para la actividad anti-MRSA Sustitucin en la posicin 6 u 8 con un grupo de alifticos de cadena larga como lavandulyl (5-metil-2 - isopropenyl-hex-4-enyl) o geranyl (trans-3 ,7-dimetil-2, octadienyl) tambien aumenta la actividad Interesantemente, un reciente informe de Stapleton y sus colegas demostraron que los subtitucion con cadenas c8 y C10 tambien aumenta la actividad contra lastaphylococcal de flavonoides pertenecientes a la flavan 3-ol Osawa et al evaluaron la actividad de una serie de estructuras de diferentes flavonoides incluidos Flavonas, flavanones, y isoflavanones basada en el ensayo difusin en agar por disco de papel Se ha demostrado que 5-hydroxyflavanones y 5hydroxyisoflavanones con uno, dos o tres grupos adicionales hidroxilo en las posiciones 7, 2 y 4 inhibe el crecimiento de Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus. Estos resultados se correlacionan bien con los de Tsuchiya y colegas Tambin se inform por Osawa y colegas que 5-hydroxyflavones y con 5-hydroxyisoflavones con grupos hidroxilos adicionales en la posicin 7 y 4 no presentan actividad inhibitoria Sin embargo cuando Sato et al examino dos isoflavonas con grupos hidroxilo en la posicin 5, 2 y 4 mediante un ensayo de dilucin en agar, intensidad de actividad inhibitoria Se detect actividad contra un amplio rango de especies estreptococos. Esto puede sugerir que la hidroxilacion de la posicin 2 es importante para la actividad Alternativamente, la falta de actividad detectado por Osawa et al pueden ser simplemente debido a la escasa difusin de flavanas sin e isoflavonas (en comparacin con flavanones e isoflavanones) a travs del medio Un trabajo ms reciente informa la importancia del grupo hiroxilo en la posicin 5 del flavanones y Flavonas para la actividad contra el MRSA, apoya a las conclusiones anteriores de Tsuchiya et al Asimismo, afirma que chalconas son ms eficaces contra MRSA que flavanones o Flavonas, y que grupos hidroxilo en la posicin 2 son importantes para la actividad contra staphylococcal de estos compuestos Se inform que grupos Metoxi disminuyen drsticamente la actividad antibacteriana de flavonoides La importancia de la hidroxilacin en la posicin 2 para la actividad antibacteriana de chalconas se apoya de la labor anterior de Sato y colegas que encontr que 2,4,2-trihydroxy-5-methylchalcone y 2,4,2 trihydroxychalcone inhibe el crecimiento de 15 cepas de estreptococoscariognicos. Como se mencion anteriormente, Ward y colegas sintetizaron una serie de halogenados derivados de 3 methyleneflavanone Sustitucin del anillo B se encontro que mejora la actividad antibacteriana, con 3-cloro, 4-cloro y 4-bromo cada anlogos existente es aproximadamente dos veces tan eficaz como su compuesto contra S. aureus y cuatro veces ms activo frente a Enterococcus faecalis. Asimismo, el derivado 2, 4-dicloro mostraron de cuatro a ocho veces la mejora en la actividad contra

S. aureus y de dos a cuatro veces la mejora contra E. faecalis Por el contrario3-metilen-6-bromoflavanone- fue menos potente que los compuestos originales y los autores sugirieron que halogenacin en el anillo A puede disminuir la actividad Sin embargo, es evidente que habra que preparar anlogos sustituidos en otras posiciones del anillo A antes de que este se puede decir algo con certeza En chalconas, ni fluoracin ni clorinacion en la posicin 4 del anillo B es informado que afecta significativamente la potencia antibacteriana. Otra vez sin embargo otras estructuras analogas de esa clase de flavonoides se necesitaria sintetizar y examinar antes the effect of halogenation upon antibacterial activity could be properly assessed

8.4. 8.4. Nature of flavonoid activity: bacteriostatic or bactericidal? Several research groups have attempted to determine whether flavonoid activity is bacteriostatic or bactericidal by conducting timekill studies. In such experiments, epi- gallocatechin gallate [89] , galangin [75] a nd 3- O -octanoyl- (+)catechin [94] 13have been shown to cause a reduction of 1000-fold or more in viable counts of MRSA-YK, S. aureus aureus NCTC6571andEMRSA-16,respectively.Thiswouldimme- diately appear to suggest that flavonoids are capable of bac- tericidal activity. However, it has recently been demonstrated that 3- O -octanoyl-()-epicatechin induces the formation of pseudomulticellular aggregates both in antibiotic-sensitive and antibiotic-resistant strains of S. aureus [94] . If this phenomenon is induced by other compounds within the flavonoid class (and liposomal studies suggest that this is the case for epigallocatechin gallate [88] ) , questions are raised regarding the interpretation of results from timekill studies. It may Puede be that flavonoids are not killing bacterial cells but merely inducing the formation of bacterial aggregates and thereby reducing the number of CFUs in viable counts. 8.5. 8.5. Antibacterial mechanisms of action of various flavonoids flavonoides 8.5.1. Inhibition of nucleic acid synthesis In a study using radioactive precursors, Mori and col- leagues showed that DNA synthesis was strongly inhibited by flavonoids in Proteus vulgaris , whilst RNA synthesis was most affected in S. aureus [138] . Flavonoids exhibiting this activity were robinetin, myricetin and ()-epigallocatechin. Protein and lipid synthesis were also affected but to a lesser extent. medida. The authors suggested that the B ring of the flavonoids may play a role in intercalation or hydrogen bonding with the stacking of nucleic acid bases and that this may explain the inhibitory action on DNA and RNA synthesis [138] . Ohemeng et al. screened 14 flavonoids of varying struc- ture for inhibitory activity against Escherichia coli DNA gyrase, and for antibacterial activity against Staphylococ- cus epidermidis , S. aureus , E. coli , S. typhimurium and Stenotrophomonas maltophilia [68] . It was found that E. coli coli DNA gyrase was inhibited to different extents by seven of the compounds ,including quercetin,apigeninand 3,6,7,3 ,4 pentahydroxyflavone. Interestingly, with the exception of 7,8-dihydroxyflavone, enzyme inhibition was limited to those compounds with B-ring hydroxylation [68,141] . The authors proposed that the observed antibacterial activity of the seven flavonoids was due in part to their inhibition of DNA gyrase. However, since the level of antibacterial activity and enzyme inhibition did not always correlate, they also suggested that other mechanisms were involved [68] . More recently, Plaper and colleagues reported that quercetinbindstotheGyrBsubunitof E.coli DNAgyraseand inhibits the enzyme's ATPase activity [142] . Enzyme binding was demonstrated by isolating E. coli DNA gyrase and mea- suring quercetin fluorescence in the presence and absence of the gyrase subunits. The flavonoid-binding site was pos- tulated to overlap with those of ATP and novobiocin, since addition of these compounds interfered with quercetin fluo- rescence. Inhibition of GyrB ATPase activity by quercetin was also demonstrated in a coupled ATPase assay. This Esto research is in agreement with the earlier findings of Ohe- meng et al. [68] a nd supports the suggestion that quercetins antibacterial activity against E. coli may be at least partially attributable to inhibition of DNA gyrase. When screening natural products for type II topoisomerase inhibitors, Bernard and co-workers found that the glycosy- lated flavonol rutin was very effective [143] . This compound exhibited antibacterial activity against a permeable E. coli coli strain (a strain into which the envA1 allele had been incor- porated [144,145] ) . Using enzyme assays and a technique known as the SOS chromotest, it was shown that rutin selec- tively promoted E. coli topoisomerase IV-dependent DNA cleavage, inhibited topoisomerase IV-dependent decatena- tion activity and induced the SOS response of the E. coli coli strain. cepa. The group suggested that since topoisomerase IV is essential for cell survival, the rutin induced topoisomerase IV-mediated DNA cleavage leads to an SOS response and growth inhibition of E. coli cells [143] . Within our own laboratory,

a 4-quinolone-resistant S. aureus strain was shown to have increased susceptibility to the flavonol galangin compared with other 4-quinolone- sensitive and -resistant strains [146] . Interestingly, this strain possesses a distinct amino acid substitution (serine to pro- line) at position 410 of the GrlB subunit. This may suggest that topoisomerase IV and the relatively homologous gyrase enzyme are involved in the antibacterial mechanism of action of galangin. Clearly, however, further work with mutant strains and purified enzymes would be necessary before this could be verified. 8.5.2. Inhibition of cytoplasmic membrane function A research team that had previously found sophorafla- vanone G to have intensive antibacterial activity against MRSA and streptococci [8385] r ecently reported attempts to elucidate the mechanism of action of this flavanone [139] . The effect of sophoraflavanone G on membrane flu- idity was studied using liposomal model membranes and compared with the less active flavanone naringenin, which lacks 8-lavandulyl and 2 -hydroxyl groups. At concentra- tions corresponding to the MIC values, sophoraflavanone G was shown to increase fluorescence polarisation of the liposomes significantly. These increases indicated an alter- ation of membrane fluidity in hydrophilic and hydrophobic regions, suggesting that sophoraflavanone G reduced the flu- idity of outer and inner layers of membranes. Naringenin Naringenin also exhibited a membrane effect but at much higher con- centrations. centraciones. This correlation between antibacterial activity and membrane interference was suggested to support the theory that sophoraflavanone G demonstrates antibacterial activity by reducing membrane fluidity of bacterial cells [139] . Another group, Ikigai and colleagues, carried out research on ()-epigallocatechin gallate, a strongly antibacterial cat- echin found in green tea. Catechins are a group of flavonoids that appear to have greater activity against Gram-positive than Gram-negative bacteria [88] . In this study, liposomes were again used as model bacterial membranes, and it was shown that epigallocatechin gallate induced leakage of small molecules from the intraliposomal space. Aggregation was also noted in liposomes treated with the compound. The El group therefore concluded that catechins primarily act on and damage bacterial membranes. It was not known how this damage occurred but two theories were put forward. First, catechins may perturb the lipid bilayers by directly penetrating them and disrupting the barrier function. Alterna- Alterna - tively, catechins may cause membrane fusion, a process that results in leakage of intramembranous materials and aggrega- tion. cin. Interestingly, the group also demonstrated that leakage induced by epigallocatechin gallate was significantly lower when liposome membranes were prepared containing nega- tively charged lipids. It was therefore suggested that the low catechin susceptibility of Gram-negative bacteria may be at least partially attributable to the presence of lipopolysaccha- ride acting as a barrier [88] . As mentioned previously, Stapleton and colleagues found that substitution withC 8 8 andC 10 10 chains increased the antibacterial activity of selected flavan-3-ols (catechins). The group El grupo went on to show that cells of an MRSA clinical isolate treated with ()-epicatechin gallate and 3- O -octanoyl-(+)-catechin, respectively, exhibited moderately and highly increased levels of labelling with the selectively permeable fluorescent stain propidium iodide. In addition, when S. aureus cells were grown in the presence of either ()-epicatechin gallate or 3- O -octanoyl-()-epicatechin and examined by transmission electron microscopy, they were shown to form pseudomulti- cellular aggregates [94] . This work constitutes a substantial advance in the development of catechins as antibacterial agents and lends support to Ikigai's argument that catechins act on and damage bacterial membranes. It has also been demonstrated by Sato and colleagues that the chalcone 2,4,2 -trihydroxy-5 -methylchalcone induces leakage of 260 nm absorbing substances from S. mutans . This observation generally indicates leakage of intracellular material such as nucleotide, and the authors suggested that 2,4,2 -trihydroxy-5 -methylchalcone exerts its antibacterial effect by changing the permeability of the cellular membrane and damaging membrane function [140] . In addition, the effect of galangin upon cytoplasmic integrity in S. aureus has been investigated by measuring loss of internal potassium [147] . When high cell densities of S. de S. aureus were incubated for 12 h in media containing 50 g/mL of the flavonol, a 60-fold decrease in the number of CFUs was noted and cells lost ca. 20% more potassium than untreated control bacteria. These data strongly suggest that galangin induces cytoplasmic membrane damage and potassium leakage. Whether galangin damages the mem- brane directly, or indirectly as a result of autolysis or cell wall damage and osmotic lysis, remains to be established however [147] . In an investigation into the antimicrobial action of propolis, Mirzoeva and colleagues showed that one of its constituent flavonoids, quercetin, caused an increase in permeability of the inner bacterial membrane and a dissipation of the membrane potential [148] . The electrochemical gradient of protons across the membrane is essential for bacteria to maintain capacity for ATP sntesis ,membrane transport and motility. motilidad. Mirzoeva et al. suggested that the effect of

propolis on membrane permeability and membrane potential may contribute enormously to its overall antibacterial activity and may decrease the resistance of cells to other antibacterial agents. agentes. It was thought that this might explain the synergistic effect that occurs between propolis and other antibiotics such as tetracycline [148] 14and ampicillin [149] . The group also demonstrated that the flavonoids quercetin and naringenin significantly inhibited bacterial motility, providing further evidence that the proton motive force is disrupted. Bacte- rial motility and chemotaxis are thought to be important in virulence as they guide bacteria to their sites of adherence and invasion. Mirzoeva et al. suggested that the antimotil- ity action of propolis components may have an important role in inhibition of bacterial pathogenesis and the develop- ment of infection [148] . The cytoplasmic membrane activ- ity detected for quercetin by Mirzoeva and co-workers may represent one of the additional mechanisms of antibacterial action that was suspected to be present among the seven DNA gyraseinhibiting flavonoid compounds tested by Ohemeng and colleagues [68] . 8.5.3. Inhibition of energy metabolism Haraguchi and colleagues recently carried out an investi- gation into the antibacterial mode of action of two retrochal- cones (licochalcone A and C) from the roots of Glycyrrhiza inflata [137] . Theseflavonoidsdemonstratedinhibitoryactiv- ity against S. aureus and Micrococcus luteus but not against E. coli , and in preliminary tests licochalcone A inhibited incorporation of radioactive precursors into macromolecules (DNA, RNA and protein). The group hypothesised that the licochalcones may be interfering with energy metabolism in a similar way to respiratory-inhibiting antibiotics, since energy is required for active uptake of various metabolites and for biosynthesis of macromolecules [137] . Interestingly, the licochalcones were found to inhibit strongly oxygen con-sumption in M. luteus and S. aureus but not in E. coli , which correlated well with the observed spectrum of antibacterial activity. actividad. The group further demonstrated that licochalcones A and C effectively inhibited NADH-cytochrome c reduc- tase, but not cytochrome c oxidase or NADH-CoQ reductase. It was therefore suggested that the inhibition site of these retrochalcones was between CoQ and cytochrome c in the bacterial respiratory electron transport chain [137] . Merck Research Laboratories recently reported that the flavanone lonchocarpol A inhibits macromolecular synthesis in Bacillus megaterium . Using radioactive precursors, it was demonstrated that RNA, DNA, cell wall and protein synthesis were all inhibited at concentrations similar to the MIC value [150] . This may represent another example of a flavonoid that interferes with energy metabolism. 9. 9. Concluding remarks Observaciones finales With regard to natural products, it is generally accepted that phytochemicals are less potente antiinfectives than agents Of microbiol origin ,ie antibiotics [48] . However, new classes of antimicrobial drug are urgently required and the flavonoids represent a novel set of leads. Future optimisation of these compounds through structural alteration may allow the development of a pharmacologically acceptable antimicrobial agent or group of agents. Existing structureactivity data suggest that it might be possible, for example, to prepare a potent antibacterial flavanone by synthesising a compound with halogenation of the B ring as well as lavandulyl or ger- anyl substitution of the A ring. Also, it is worth noting that the rapid progress which is being made toward elucidation of flavonoid biosynthetic pathways [151] 14may soon allow the production of structural analogues of active flavonoids through genetic manipulation. Screening of these analogues might lead to the identification of compounds that are suffi- ciently potent to be useful as antifungal, antiviral or antibacterial chemotherapeutics. In addition to the structural alter- ation of Peak and moderately active antimicrobial flavonoids, investigation into the mechanisms of action of these compounds is likely to be a productive area of research. Such Tal information may assist in the optimisation of a lead com- pound's activity, provide a focus for toxicological attention and aid in the anticipation of resistance. Also, characterisa- tion of the interaction between antimicrobial flavonoids and their target sites could potentially allow the design of second- generation inhibitors. Acknowledgments