Clasificacin de protenas de la membrana nuclear en la mitosis Philippe Collas Jean-Claude Courvalin

Instituto de Bioqumica Mdica, Universidad de Oslo, Oslo, Noruega

Abstracto La envoltura nuclear (NE) se descompone reversible y vuelve a montar en la mitosis. Dos modelos de mittico membrana nuclear desmontaje y reforma han surgido de los estudios de la dinmica de NE en las clulas somticas y extractos de huevo. Uno de los modelos sugiere que las membranas fragmento nuclear reversiblemente por vesiculacin, produciendo vesculas NE-derivados separados desde el retculo endoplsmico. El segundo modelo propone que las membranas nucleares desaparecen por difusin de sus protenas integrales a travs de un retculo endoplsmico continua. A continuacin, se discuten crticamente los fundamentos de la elaboracin de estos puntos de vista aparentemente excluyentes. Nuestras conclusiones a favor de un modelo en el que las membranas nucleares no vesicular durante la mitosis. La envoltura nuclear (NE) compartimenta el ncleo de las clulas eucariotas (de mayor . Fig. 1 ). Se compone de dos bicapas concntricas, la membrana nuclear externa y la membrana nuclear interna (INM), que estn conectados por dominios de la membrana fuertemente dobladas asociados con complejos de poro nuclear (NPC). La membrana nuclear externa est en continuidad directa con el retculo endoplsmico (RE) y es bioqumicamente y funcionalmente similar a la membrana del RE. Por lo tanto, la NE puede ser considerado como un subcompartimento especializado de la sala de emergencias. El INM contiene protenas integrales de membrana especficos que proporcionan sitios de unin para la heterocromatina y la lmina nuclear, una malla de filamentos intermedios. Como se fenestrado la lmina, el INM tambin interacta directamente con la cromatina. Las membranas de la APN tambin puerto protenas integrales especficos que se cree que anclar los NPC y desempear un papel en su conjunto.

representado. Protenas integrales de la membrana nuclear interna (INM) incluyen el receptor de lamina B (LBR) 26 , polipptidos lmina-asociados (PAL) 9 , emerina 27 y man1 28 . Una protena adicional politpica INM integral, Nurim, se ha caracterizado recientemente 29 , aunque su topologa es provisional en la actualidad (T. Rapoport, com. commun.). LAP2 es el componente mejor caracterizada de una familia de varias protenas generadas por splicing alternativo a partir de una sola copia del gen 19 . Las glicoprotenas gp210 30y POM121 31 residen en la membrana de poro. Despus de la sntesis, las protenas difunden rpidamente y libremente dentro de las membranas de retculo endoplasmtico (ER) y llegar a ser completamente inmovilizados por la unin fuerte de la heterocromatina y / o la lmina, o a los componentes de la APN.

El NE es una estructura dinmica que se desarrolla en la interfase, se descompone en la profase de la mitosis y la vuelve a montar en la anafase, telofase y G1 temprana. Los datos acumulados en los ltimos 30 aos se han generado dos modelos para la mitosis desmontaje y montaje de las membranas nucleares. En un modelo, fragmento nuclear membranas reversiblemente durante la mitosis por vesiculacin y / o fusin intraluminal, la generacin de vesculas NE-derivados distintos de la sala de emergencias. El segundo modelo excluye cualquier vesiculacin mittico del NE y propone que los dominios de la membrana nuclear desaparecen transitoriamente por la difusin de sus protenas integrales especficas a travs de una ER continua. Se argumenta aqu que estos modelos aparentemente mutuamente excluyentes se han originado a partir de la utilizacin de diferentes mtodos de anlisis, la combinacin de los datos obtenidos a partir de dos sistemas biolgicos diferentes y la extrapolacin de las membranas nucleares de los mecanismos de formacin de vesculas de membrana y la fusin se describe para otros compartimentos de membrana. Para mayor claridad, se discuten por separado los datos obtenidos a partir del anlisis de las clulas somticas mitticas y de los sistemas de reconstitucin nucleares libres de clulas, principalmente derivados de huevos. Mittico nuclear de desmontaje y montaje en las clulas somticas Varias observaciones e hiptesis han prestado apoyo al modelo de la membrana nuclear desmontaje por vesculas. En primer lugar, los anlisis ultraestructurales han demostrado que las membranas nucleares se descomponen en la mitosis por la fragmentacin progresiva, dando la impresin de un proceso de escisin 1 aleatoria . En segundo lugar, los estudios de trfico intracelular membrana condujeron a la propuesta de que, como con el aparato de Golgi y la sala de emergencias, la estructura de la NE representa un equilibrio entre las 2 actividades de escisin y de fusin . Durante la mitosis, escisin prevalecera sobre la fusin, la generacin de vesculas NE derivados, mientras predominio de la fusin en la interfase permitira la reconstitucin del NE. En tercer lugar, a partir de hace una dcada, la identificacin de un nmero cada vez mayor de los marcadores del INM y la membrana NPC proporciona herramientas muy valiosas para el estudio de NE desmontaje y montaje durante la mitosis (ver fig. 1 para una descripcin de estos marcadores). El uso de anticuerpos contra las protenas del INM y de la membrana de la APN, que

FIGURA 1. Diagrama de los dominios de la membrana nuclear y protenas integrales representativos. Para mayor claridad, el complejo del poro nuclear (CPN) no est

mostramos en los estudios morfolgicos y bioqumicos de y las clulas HeLa mittico 3 4 que el huso mittico, aparentemente excluido membranas que contienen estos marcadores, lo que permite la segregacin completa de los cromosomas en metafase. Por otra parte, los marcadores del INM [lamin B receptor (LBR) y lamina asociada polipptido 2 (LAP2)] y de la membrana NPC (glicoprotena gp210) fueron atacados de nuevo a la cromatina secuencialmente, a principios de anafase y telofase tarde, respectivamente. Por ltimo, las fracciones de membrana enriquecidas en los marcadores INM o gp210 podran aislarse a partir de homogeneizados de clulas mitticas. En el marco conceptual de la fragmentacin de la membrana nuclear durante la mitosis, estos datos fueron interpretados como un argumento a favor de una vesiculacin dominio y especfico de las membranas nucleares 3 4 (ver . Fig. 2a ).

superficie de cromosoma y de gp210 a la cromatina decondensing.

Interpretacin de los datos a favor de la existencia de vesculas NE especficos est abierto a la crtica. En primer lugar, una estructura membranosa ronda observado por microscopa electrnica podra reflejar ya sea una vescula o un tbulo interconectado a otras estructuras de membrana. En segundo lugar, la fragmentacin de la NE en la mitosis puede producirse por un mecanismo diferente de la brotacin y la fusin que tiene lugar en la va secretora en interfase. En tercer lugar, la focalizacin secuencial a la cromatina de los marcadores de la INM y de la protena de membrana gp210 APN (posteriormente confirmado por Yang et 5 6 al. y Bodoor et al. ) no inferir su presencia en las vesculas aisladas. Por ltimo, como homogeneizacin celular promueve inevitablemente vesiculacin membrana y la fragmentacin, el aislamiento de fracciones de membrana enriquecidas en uno marcador podra reflejar su concentracin en microdominios de un sistema de membrana continua, en vez de su presencia en las vesculas. Tres estudios recientes han proporcionado argumentos a favor de la desaparicin de los dominios de la membrana nuclear en la mitosis por la difusin de sus protenas integrales especficas a travs de una ER continuo ( . Fig. 7 2b ). Ellenberg et al. utiliza la recuperacin despus de fluorescencia photobleaching (FRAP) y la prdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) para demostrar que difunde LBR-GFP rpida y libremente dentro de las membranas del ER de clulas en metafase y la inmoviliza en regiones ER que contactan cromatina en anafase y telofase. Aunque estos datos se basan en la sobreexpresin de LBR-GFP, lo que podra plantear cuestiones relacionadas con la distribucin de LBR endgena, que favorecen fuertemente el punto de vista de una red ER continua en la mitosis en las clulas cultivadas. Estudios de imagen confocal de 5 inmunofluorescencia y de Yang et al. mostraron adems que las protenas de la MNI LAP1 y LAP2, y la protena de membrana gp210, APN colocalize con marcadores de ER en la mitosis. Por lo tanto, en este nivel de resolucin, parece que los marcadores de todos los dominios de la membrana nuclear se dispersan a lo largo de las membranas ER durante la mitosis. Por ltimo, Bodoor et. 6 al mostr que dos marcadores de la membrana APN, POM121 y gp210, se dirigen de forma secuencial a los cromosomas despus de la metafase, lo que hace improbable la existencia de un conjunto de membrana especfico de la APN de vesculas mitticas. Estos datos recientes favorecen el modelo de un sistema de membrana del RE-NE interconectado de forma permanente, en el que las protenas integrales de la membrana de la NE inmovilizan tanto en la interfase y la anafase-telofase por el contacto con protenas de la cromatina y / o laminas, o componentes de la APN ( . Fig. 2b ) . La fosforilacin y / o la desfosforilacin de estas protenas integrales podra permitir que se disocian reversiblemente desde sus ligandos durante la y mitosis 8 9 . Curiosamente, NE montaje por coalescencia de elementos ER fue el modelo preferido 1 por las observaciones ultraestructurales primeros .

FIGURA 2. Modelos de envoltura nuclear (NE) desmontaje y reforma en la mitosis. Dominios de la membrana que albergan la membrana nuclear interna (INM), receptor de protena lamina B (LBR) y los poros gp210 glicoprotena de membrana se consideran como ejemplos. En todos los modelos, LBR se encuentra en el (ER) de la red retculo endoplsmico en la mitosis 7 . En la metafase, los cromosomas se segregan en el husillo, evitando cualquier contacto con las membranas NEderivados. A partir de la anafase, estos contactos se restablecen progresivamente 4 . (A) En el modelo de vescula, gp210 se encuentra en vesculas de membrana distintos de la sala de emergencias. Asamblea de las membranas nucleares implica la focalizacin secuencial de LBR por difusin dentro de la sala de emergencia y el anclaje a la superficie cromosoma, seguido de la fusin de la membrana y la orientacin de gp210 a la cromatina. (B) Tanto LBR y gp210 se encuentran dentro de la sala de emergencias. Dos escenarios se prevn. En primer lugar, la prdida de la integridad de los dominios de la membrana nuclear en los resultados de la mitosis en la difusin de todas las protenas de la membrana nuclear en toda la sala de emergencia (modelo de difusin al azar). Alternativamente, microdominios de membrana enriquecidos en protenas nucleares especficas de la membrana nuclear se mantienen en el RE mittico (modelo de dominio). La reunin en microdominios de varias protenas de una ubicacin similar NE se puede imaginar (por ejemplo, LBR y lamina-asociado polipptidos). En ambas situaciones, montaje de la membrana nuclear se produce por la focalizacin secuencial de LBR a la

Extractos de huevo: un mundo diferente Una gran cantidad de informacin sobre el conjunto de las membranas nucleares se ha originado en el uso de extractos libres de clulas derivadas en particular a partir de huevos de Xenopus o erizo de mar, 10 yDrosophila embriones . En general, estos estudios promueven una va de la membrana nuclear reensamblaje de la cromatina de metas, la unin y la fusin de las "vesculas de membrana nuclear. Los datos obtenidos a partir de ensayos de reconstitucin de huevo y de los estudios de clulas somticas que a menudo se han combinado para presentar un modelo unificado de NE reensamblaje. Sin embargo, los huevos y las clulas somticas representan dos mundos diferentes en varias formas. En primer lugar, a diferencia de las clulas somticas, los huevos se cargan con las existencias de molculas y membranas necesarios para soportar divisiones celulares rpidas sin la necesidad de sntesis de nuevas membranas.Por lo tanto, los huevos pueden contener vesculas que podran contribuir a la 11 asamblea NE . En segundo lugar, las divisiones de clulas de embriones no mamferos a menudo ocurren mucho ms rpido que los de las clulas somticas, lo que podra implicar a las vas alternativas de distribucin NE y montaje. En tercer lugar, la reconstitucin nuclear en los extractos de huevo comnmente implica cromatina de los espermatozoides como un sustrato para la unin a las membranas, por lo que los sobres pronuclear, en lugar de los NE somtica, se ensamblan. Existen diferencias estructurales y bioqumicas entre proncleos y ncleos somticos en el nivel de organizacin de la cromatina y la composicin de lmina que pueda afectar a la naturaleza de las protenas de membrana especficas para cromosomas. Aunque la terminologa de 'vescula de la membrana nuclear' se ha utilizado ampliamente en el campo de montaje NE in vitro , la evidencia de tales vesculas sigue siendo circunstancial. Observaciones ultraestructurales de fertilizados huevos de erizo marino han informado de 12 que "vesculas" y "membranosa cisternas ' se acumulan en la periferia de decondensing cromatina espermtica. Evaluaciones detalladas de la formacin de las membranas nucleares en los extractos de huevo se han basado en las observaciones de microscopa electrnica y mostrar constantemente la agregacin de 10 vesculas en la superficie de la cromatina . Las poblaciones de vesculas con capacidades diferentes para unirse a la cromatina o fusionarse entre s se han aislado de Xenopus y erizo de mar huevo y extractos 13 14 . La identificacin de marcadores de membrana nucleares con anticuerpos de reaccin 15 16 cruzada (p56/LBR , LRBx ), anticuerpos especficos 16 17 18 (NEP-B78 , gp210 D , Xenopus gp210 ) o por 18 y clonacin ( Xenopus Xp58/LBR y LAP2 19 20 ) ha permitido la recuperacin de fracciones de membrana enriquecidas en protenas de la membrana nuclear externa, interna o poro. El uso de estos marcadores, la orientacin secuencial de protenas del INM y de la membrana de la APN a la cromatina espermtica se y demostr 15 18 . Estos datos se interpretaron como que muestra la existencia de varias poblaciones de vesculas en el citoplasma de huevo ( Fig.. 2a ), algunos de los cuales podran contribuir a las membranas nucleares. Independientemente de si existen tales

vesculas o como resultado de ER fragmentacin durante la preparacin del extracto de huevo, estas observaciones indican que las protenas de la membrana nuclear no se distribuyen de manera uniforme dentro de las membranas citoplasmticas de huevo. Sigue siendo posible que las protenas de la membrana nuclear se dispersan inicialmente en todo el ER huevo del huevo no fertilizado y se vuelven secuestradas desde el RE para formar el sobre pronuclear en la fertilizacin. Esto sera coherente con el conjunto de la ER-como las estructuras membranosas en Xenopusextractos de huevo y el mar erizo, la continuidad de la sala de emergencia con la NE en los huevos y el reclutamiento dramtica de una red de la membrana ER-como alrededor de los erizos de mar en desarrollo proncleo masculino en huevos 21 fecundados . Una distribucin no uniforme de las protenas de la membrana nuclear en el ER mittico? Aumento de la evidencia obtenida por localizacin directa de marcadores de membrana en las clulas somticas intactas indica claramente que, durante la mitosis, las protenas integrales de las membranas nucleares se difunden a lo largo de la sala de emergencias, que permanece como una red cisternal tubular intacto en 1 muchos tipos de clulas ( . Fig. 2b ). Esto favorece en gran medida un modelo en el que las membranas nucleares no vesicular durante la mitosis. Ya sea que las protenas derivadas de un dominio membrana particular dispersan completamente ( Fig. 2b. ; modelo de difusin al azar) o permanecen asociados en microdominios de la membrana del RE ( Fig. 2b. ; modelo de dominio) podra resolverse mediante el uso de inmunomarcaje (FRIL) 22 tcnicas de congelacin-fractura o la tecnologa de fluorescencia en clulas vivas de transferencia de energa de resonancia (FRET). El ltimo mtodo ya ha demostrado tener xito en la deteccin de las interacciones moleculares entre las protenas etiquetadas con variantes espectrales de GFP o GFP y con un 23 segundo fluorforo y se ha demostrado la existencia de 24 microdominios en la membrana plasmtica . Es de suponer que debido al grosor de intacta Xenopus , Drosophila o huevos de erizo de mar, ningn estudio de "en vivo" NE desmontaje y montaje se ha informado hasta la fecha en estos sistemas. El uso de microscopa de excitacin multifotnica, que proporciona una resolucin en tres dimensiones de hasta varios cientos de micrmetros de profundidad y minimiza photobleaching y fotodao, junto con FRET permitira estudios de dinmica de NE en los huevos y los embriones vivos, similares a las realizadas en las clulas 25 somticas . Con este tipo de herramientas, el grado en que la membrana nuclear de desmontaje y montaje de los procesos son similares a, o diferentes de, los de las clulas somticas puede ser desenredado.