Utilisation des marqueurs molculaires dans les tudes de diversit des plantes :

Module denseignement
Technologies bases sur lADN

Technologies bases sur la PCR

Polymorphisme de longueur des fragments amplifis (AFLP)

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Sommaire
f La technologie AFLP, tape par tape
Quatre tapes Digestion dADN et ligation PCR et dtection Rsum de la technologie

f f f f

Equipement Interprtation des bandes AFLP Avantages and inconvnients des AFLPs Applications
Limonium sp. Stylosanthes spp. Moutarde brune

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La technologie AFLP*, tape par tape

Principales caractristiques: f Une combinaison des technologies RFLP et PCR f Base sur lamplification slective par PCR de fragments de restriction dun ADN digr f Mthode extrmement sensible pour raliser une empreinte gntique sur un ADN de nimporte quelle origine et complexit. f Peut tre ralise avec de lADN gnomique total ou des ADNc ('transcript profiling')
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*La technique AFLP a t dveloppe par KeyGene (Hollande), une compagnie prive de biotechnologies qui a pos des droits de proprit sur la technologie. Pour plus dinformations, voir le site internet de Keygene; http://www.keygene.com Reference Zabeau, M. and P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Publication 92402629 (Publication No. EP0534858A1).

Quatre tapes
f LADN est digr par deux enzymes de restriction diffrentes f Des adaptateurs oligonuclotidiques sont lis aux extrmits des fragments dADN f Des sous-ensembles spcifiques des produits de digestion de lADN sont amplifis, en utilisant des combinaisons damorces slectives f La dtection du polymorphisme se fait avec des radioisotopes, des sondes fluorescentes ou une coloration largent.
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Digestion de lADN et ligation

f Lune des enzymes de restriction coupe frquemment lADN (site de reconnaissance de 4 bases, p.e. MseI) f La seconde enzyme de restriction coupe peu frquemment lADN (site de reconnaissance de 6 bases, p.e. EcoRI) f Des adaptateurs double-brin synthtiques, spcifiques de chaque site de restriction, sont attachs aux fragments dADN gnrs
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LADN tudi est digr avec deux enzymes de restriction diffrentes, lune coupant frquemment (enzymes de restriction reconnaissant 4 bases) et lautre coupant plus rarement (enzymes de restriction reconnaissant 6 bases). Diffrentes combinaisons enzymes/amorces peuvent tre utilises. MseI et EcoRI sont mieux utilises pour des gnomes riches en AT; elles donnent moins de fragments dans les gnomes riches en GC. Des adaptateurs synthtiques, spcifiques de chaque site de restriction, sont ensuite attachs (ligus) lADN digr. Les deux tapes de restriction et de ligation peuvent tre ralises en une seule raction.

PCR et dtection
f Une premire PCR (pr-slective) est ralise, en utilisant des amorces oligonuclotidiques complmentaires des adaptateurs et sites de restriction. Un nuclotide est ajout aux amorces pour slectionner seulement un sous-ensemble de fragments. f Les produits damplification pr-slective sont soumis une autre PCR, et ainsi un sousensemble de ces fragments est slectionn. Gnralement, pour la seconde amplification slective, deux nuclotides supplmentaires sont ajouts aux amorces. f Les fragments sont spars par lectrophorse sur polyacrylamide (gels de squence) ou lectrophorse capillaire
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Disons quun nuclotide A est ajout aux amorces prslectives. De ce fait, seul un sous-ensemble des fragments du mlange (c.a.d. Ceux pour lesquels le site de restriction est suivi dun A) est amplifi. Les amorces ont gnralement une longueur de 17 21 nuclotides, et shybrident parfaitement leur squence cible. Une seconde amplification est alors ralise, en utilisant le mme type damorces, mais avec deux bases supplmentaires (p.e. AC). De ce fait, seul un sous-ensemble de la premire raction damplification va tre amplifi son tour pendant la deuxime PCR (c.a.d. Ceux pour lesquels le site de restriction est suivi de la squence AC). Le sous-ensemble de fragments est analys par lectrophorse sur gel de polyacrylamide dnaturant pour gnrer une empreinte gntique et les bandes ADN peuvent tre dtectes selon diffrentes mthodes. En plus de lavantage de ne pas ncessiter des radioisotopes, les amorces fluorescentes peuvent tre charges par groupes de trois, chacune marque avec un colorant diffrent, dans la mme piste du gel, maximisant ainsi le nombre de donnes par gel (Zhao et al., 2000).

Reference Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa and J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semi-automated fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.

Rsum de la technologie*
ADN gnomique Digestion avec deux enzymes de restriction

Ligation des adaptateurs

Pramplification: Amorces = adaptateurs + 1 base Amplification slective : Amorces = adaptateurs + 1 + 2 bases

Profil AFLP

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*Daprs le site internet de KeyGene: http://www.keygene.com

Equipement
f Ressources:
Eau distille et/ou dsionise Ractifs Rfrigrateur et conglateur Hotte flux laminaire Centrifugeuse Thermocycleur Gnrateurs pH mtre Balance standard Units dlectrophorse sur gel vertical Transilluminateur UV Squenceur automatique
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f Equipement:

Plaque chauffante ou micro-onde

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Interprtation des bandes AFLP

La technique AFLP dtecte des polymorphismes qui rsultent de changements (prsence ou taille) dans les sites de restriction ou adjacents ces sites
f Differentes enzymes de restriction peuvent tre utilises, et diffrentes combinaisons de nuclotides pr-slectifs et slectifs vont augmenter la probabilit de trouver des polymorphismes utiles f Plus on ajoute de bases slectives, moins on dtectera de polymorphisme f Les bandes sont gnralement codes comme prsentes ou absentes f Des bandes htrozygotes peuvent tre dtectes comparativement des homozygotes, sur la base de lpaisseur du signal, mais cest un peu compliqu
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La base molculaire des polymorphismes AFLP se trouve gnralement au niveau nuclotidique. Des changements nuclotidiques uniques sont dtects quand (1) les sites de restrictions actuels sont affects; et (2) les nuclotides adjacents aux amorces sont affects, ce qui provoque des msappariements lextrmit 3 et empchent lamplification. La plupart des marqueurs AFLP sont mono-allliques, cest dire quun seul allle peut tre cod et lallle correspondant nest pas dtect. Peu frquemment, des marqueurs bi-allliques sont identifis, rsultant de petites insertions ou dltions dans les fragments de restriction.

Un profil AFLP avec marqueurs fluorescents

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Cette image montre le rsultat dun profil AFLP obtenu dans un squenceur automatique. Avant de charger le gel, les chantillons sont marqus avec lune des trois couleurs fluorescentes (jaune, bleu ou vert). Le rouge reprsente un chantillon tmoin qui a t inclus avec les autres chantillons pour tester la performance de llectrophorse. Reprer la prsence ou labsence dune bande particulire directement du gel est pratiquement impossible cause du grand nombre de bandes obtenues normalement par la procdure AFLP, et parcebque les traceurs fluorescents ne peuvent tre vus loeil. Les bandes sont repres avec un laser, et la collecte des donnes est assiste dun logiciel spcialis.

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AFLP dtects par coloration largent

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Cette image montre le rsultat dun gel AFLP dans un systme manuel (unit dlectrophorse verticale), marqu au nitrate dargent. La figure montre que certaines rgions du gel sont trs charges en bandes, alors que dautres sont moins remplies. La collection des donnes de gels colors largent peut tre faite loeil, ou laide dun ordinateur aprs que le gel ait t scann de faon approprie.

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Avantages des AFLP

f Les AFLP permettent le balayage rapide du gnome complet pour identifier des polymorphismes f A cause du grand nombre de bandes gnres, chaque marqueur donne une empreinte gntique trs informative f Ils sont aussi extrmement reproductibles f Aucune information pralable de squence ou gnration de sonde ne sont ncessaires f Extrmement utile pour crer rapidement des cartes gntiques f Il est possible dobtenir des profils de transcrits (Transcript profiling)

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La technologie AFLP peut tre applique tout chantillon dADN, y compris ADN d homme, animal, plante ou microorganisme, lui donnant le potentiel de devenir un systme dempreinte gntique universel. A cause de la nature des amorces AFLP, les marqueurs obtenus sont trs fiables et robustes, non affects par de petites variations dans le processus damplification. Un profil AFLP type contient entre 50 et 100 fragments amplifis, beaucoup d entre eux, sinon la plupart, pouvant servir de marqueurs gntiques. La gnration de profils de transcrits en utilisant les AFLP avec des ADNc est un moyen efficace pour identifier des ARNm exprims diffrentiellement. Cet outil a plusieurs avantages qui peuvent tre utiles pour dcouvrir des gnes dans les ressources gntiques.

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Inconvnients des AFLP

f Les AFLP gnrent des quantits normes dinformations qui peuvent ncessiter des analyses automatises, et pour cela des technologies informatiques. f Les marqueurs AFLP sont des marqueurs dominants f En cartographie gntique, les marqueurs AFLP se regroupent souvent au niveau des centromres et tlomres f Ils demandent une technicit leve dans le laboratoire, et tout particulirement dans lanalyse des rsultats

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Un autre inconvnient de la technologie AFLP est peut-tre le manque de garantie dhomologie entre bandes de poids molculaires similaires, crant ainsi des difficults pour certaines tudes comme les analyses phylogntiques. Cependant, alors que des bandes non homologues avec des poids similaires sont galement trouvs avec dautres marqueurs comme les RAPD, ils sont en fait moins frquents avec la technologie AFLP, parce que la rsolution du gel est trs leve et, de ce fait, la probabilit que des bandes non homologues aient par coincidence le mme poids molculaire est trs faible.

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Applications
f Evaluation de la diversit gntqiue f Analyse de distances gntiques f Empreintes gntiques f Analyse de collections de ressources gntiques f Cartographie des gnomes f Marqueurs diagnostics de contrle
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Les rfrences prcdes dun * sont expliques en dtail dans les diapositives suivantes.
Badr, A., K. Mller, R. Schfer-Pregl, H. El Rabey, S. Effgen, H.H. Ibrahim, C. Pozzi, W. Rohde and F. Salamini. 2000. On the origin and domestication history of barley (Hordeum vulgare). Mol. Biol. Evol. 17(4):499-510. Barret, B.A. and K.K. Kidwell. 1998. AFLP-based genetic diversity assessment among wheat cultivars from the Pacific Northwest. Crop Sci. 38:1261-1271. Beebe, S., J. Rengifo, E. Gaitn, M.C. Duque and J. Tohme. 2001. Diversity and origin of Andean landraces of common bean. Crop Sci. 41:854-862. Gilbert, K.G., S. Garton, M.A. Karam, G.M. Arnold, A. Karp, K.J. Edwards, D.T. Cooke and J.H.A. Barker. 2002. A high degree of genetic diversity is revealed in Isatis spp. (dyer's woad) by amplified fragment length polymorphism (AFLP). Theor. Appl. Genet. 104:1150-1156. Miyashita, N.T., A. Kawabe and H. Innan. 1999. DNA variation in the wild plant Arabidopsis thaliana revealed by amplified fragment length polymorphism analysis. Genetics 152: 1273-1731. * Palacios, C. and F. Gonzlez-Candelas. 1999. AFLP analysis of the critically endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 90(4):485-489. Rouf-Mian, M.A., A.A. Hopkins and J.C. Zwonitzer. 2002. Determination of genetic diversity in Tall Fescue with AFLP markers. Crop Sci. 42:944-950. Sawkins, M.C., B.L. Maass, B.C. Pengelly, H.J. Newbury, B.V. Ford-Lloyd, N. Maxted and * R. Smith. 2001. Geographical patterns of genetic variation in two species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment length polymorphism. Mol. Ecol. 10:1947-1958. * Srivastava, A., V. Gupta, D. Pental and A.K. Pradhan. 2001. AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomically important natural and some newly synthesized lines of Brassica juncea. Theor. Appl. Genet. 102:193-199. Vuylsteke, M., R. Mank, B. Brugmans, P. Stam and M. Kuiper. 2000. Further characterization of AFLP (R) data as a tool in genetic diversity assessment among maize (Zea mays L.) inbred lines. Mol. Breed. 6(3):265-276.

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Exemple: Limonium sp.

f Titre:
AFLP analysis of the critically endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae). J. Hered. 1999. 90(4):485-489 Comparer la performance des AFLP pour lanalyse de la diversit gntique de L. cavanillesii et leur efficacit par rapport une tude prcdente utilisant des RAPD LADN a t extrait de 29 individus sauvages. Ces individus taient les mmes que ceux utiliss dans une tude RAPD prcdente *. Trois combinaisons d amorces ont t slectionnes.

f Objectif:

f Matriel et mthodes:

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(suite diapositive suivante) *Palacios, C and F. Gonzlez-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare and endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol. Ecol. 6:671-675.

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Exemple: Limonium sp. (suite)

f Rsultats:
un total de 231 fragments ont t gnrs: en moyenne, 223 par individu et 77 par combinaison damorce. seulement 6% des marqueurs AFLP taient polymorphes. Parmi ceux-ci, 11 profils AFLP diffrents peuvent tre distingus dans lespce, alors que dans une tude RAPD prcdente*, aucun marqueur polymorphe navait t obtenu. Les AFLP savrent tre un type de marqueur utile pour rassembler des informations critiques pour lidentification des populations naturelles risque et prvoir des stratgies de sauvetage pour L. cavanillesii. Le faible niveau de variabilit gntique peut sexpliquer comme la consquence soit du systme de reproduction apomictique, soit dun vnement de goulot dtranglement rcent et svre.

f Discussion:

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* Palacios, C and F. Gonzlez-Candelas. 1997. Lack of genetic variability in the rare and endangered Limonium cavanillesii (Plumbaginaceae) using RAPD markers. Mol. Ecol. 6:671-675.

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Exemple: Stylosanthes spp.

f Titre:
Geographical patterns of genetic variation in two species of Stylosanthes Sw. using amplified fragment length polymorphism. Mol.Ecol. 2001. 10:1947-1958

f Objectif:
Analyser la variation gntique dans deux espces du genre tropical Stylosanthes Sw.

f Matriel et mthodes:
Pour lanalyse, 111 accessions ont t slectionnes: 59 S. viscosa et 52 S. humilis, reprsentant la distribution gographique des deux espces. Cinq combinaisons damorces ont t utilises pour S. humilis et quatre pour S. viscosa
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(suite diapositive suivante)

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Exemple: Stylosanthes spp. (suite)

Rsultats:
S. humilis: 316 des 417 bandes totales taient polymorphes (75%). Le taux de similarit moyen parmi les accessions tait de 0.71, et la distance gntique tait de 0.17 (coefficient de Jaccard) S. viscosa: 312 des 373 bandes totales taient polymorphes (83%). Le taux de similarit moyen parmi les accessions tait de 0.67, et la distance gntique tait de 0.20 Lanalyse en groupement et les ACP ont regroup les accessions par leur origine gographique, avec quelques exceptions. Une explication peut tre lincidence dvnements de dispersion vaste chelle, ou des introductions de gnotypes dune aire lautre par intervention humaine.

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(suite diapositive suivante)

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Exemple: Stylosanthes spp. (suite)

f Discussion:
Ces rsultats dmontrent lutilit de la technique AFLP, non seulement pour dtecter la diversit gntique de Stylosanthes, mais aussi pour identifier des individus qui auraient pu tre mal classs.

f Conclusions:
Cette tude montre la capacit des AFLP dtecter des profils gographiques dans la variation gntique, cette information tant ncessaire pour dvelopper une stratgie pour une conservation optimale des ressources gntiques
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Exemple: moutarde brune

f Titre:
AFLP-based genetic diversity assessment amongst agronomically important natural and some newly synthesized lines of Brassica juncea. Theor. Appl. Genet. 2001. 102: 193-199 Etudier la variation gntique parmi des accessions de B. juncea Identifier des combinaisons d amorces AFLP informatives pour lidentification varitale Chercher des marqueurs polymorphes pour le ciblage de caractres agronomiques dans la diversit tudie

f Objectifs:

f Matriel et mthodes:

Ltude utilise 30 accessions de B. juncea, reprsentant 21 populations naturelles tablies et 9 varits synthtiques et lignes. Lamplification slective a t ralise avec 21 combinaisons damorces EcoRI/MseI

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(suite diapositive suivante)

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Exemple: moutarde brune (suite)

Rsultats:
Pour les 30 gnotypes, 1251 fragments ont t analyss. En moyenne, 37 bandes par combinaison damorce taient polymorphes Aucune paire damorces na pu distinguer elle seule les 30 gnotypes sur la base de la prsence ou labsence de bandes spcifiques de varit Quatre paires damorces ont t les plus informatives avec un pouvoir de discrimination de 100% Lanalyse en groupements base sur ces quatre paires damorces informatives confirme les rsultats dtudes prcdentes bases sur des caractres morphologiques* et des donnes RAPD**
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(continued on next slide) **Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash and M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122. *Pradhan, A.K., Y.S. Sodhi, A. Mukhopadhyay and D. Pental. 1993. Heterosis breeding in Indian mustard (Brassica juncea (L.) Czern. & Cross): analysis of component characters contributing to heterosis for yield. Euphytica 69:219-229.

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Exemple: moutarde brune (suite)

f Discussion et conclusions:

Dans une prcdente tude RAPD mene avec 32 amorces, une moyenne de 12 locus polymorphes par amorce avaient t obtenus. De ce fait, la technique AFLP a apport une meilleure rsolution que les RAPD pour discriminer parmi des ressources gntiques proches. Lanalyse AFLP a donc le potentiel de complmenter la fois les donnes conventionnelles et les autres types de marqueurs molculaires.

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*Jain, A., S. Bhatia, S.S. Banga, S. Prakash and M. Lakshmikumaran. 1994. Potential use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet. 88:116-122.

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En rsum:
f La technologie AFLP est base sur lamplification slective de fragments de restriction aprs digestion dADN. f Elle dtecte des polymorphismes provoqus par des changements dans les sites de restriction ou leurs rgions flanquantes. f Cette technologie produit un grand nombre de bandes par gel, mais ils sont dominants et cette mthode est techniquement exigeante.
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A ce stade vous devez savoir:

f Les diffrentes tapes impliques dans la gnration des AFLP f Les principales considrations pour linterprtation des bandes AFLP f Les avantages et les inconvnients des AFLP pour lanalyse de la diversit gntique

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Rfrences de base
Brown, S.M. and S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. Pp. 85-93 in Genome Mapping in Plants (H. Paterson, ed.). RG Landes Company and Academic Press, Austin, TX. KeyGene, N.V. 2001. Empowering genomics. http://www.keygene.com (30 June 2002) Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper and M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414. Zabeau, M. and P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Publication 92402629 (Publication No. EP0534858A1). Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa and J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semi-automated fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.
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Suite Les technologies bases sur lADN

Les technologies bases sur la PCR
Les squences cibles (STS: sequences-tagged sites) f Les technologies bases sur ADN
Les technologies bases sur la PCR
Les stratgies les plus rcentes

f Technologies complmentaires f Considrations finales f Glossaire

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