EVALUACIN DE DE RIESGOS RIESGOS CUANTITATIVO CUANTITATIVO EVALUACIN VALORACIN DE DE LA LA EXPOSICIN EXPOSICIN VALORACIN

Obtencin de de datos datos cinticos cinticos y y modelos modelos matemticos matemticos Obtencin de inactivacin inactivacin y y crecimiento crecimiento de

COMMISSION REGULATION (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs Article 3 As necessary, the food business operators responsible for the manufacture of the product shall conduct studies in accordance with Annex II in order to investigate compliance with the criteria throughout the shelf-life. In particular, this applies to ready-to-eat foods that are able to support the growth of Listeria monocytogenes and that may pose a Listeria monocytogenes risk for public health.

Annex II

When necessary on the basis of the above mentioned studies, the food business operator shall conduct additional studies, which may include: predictive mathematical modelling established for the food in question, using critical growth or survival factors for the micro-organisms of concern in the product,

Sistemas Sistemas de de gestin gestin de de la la seguridad seguridad alimentaria alimentaria

Anlisis Anlisis de de Peligros Peligros y y Puntos Puntos Crticos Crticos de de Control Control (APPCC) (APPCC)

Microbiologa Microbiologa Predictiva Predictiva

Anlisis Anlisis de de Riesgos Riesgos

Obtencin de de datos datos cinticos cinticos Obtencin Termo-resistencia Termo-resistencia Baro-resistencia Baro-resistencia Pulso-resistencia Pulso-resistencia

Generalidades sobre sobre los los modelos modelos Generalidades matemticos predictivos predictivos matemticos

La forma tradicional de establecer la seguridad de un alimento es mediante un test de desafo.

El mtodo ms antiguo parti de la conservacin por calor y es lo que se denomina: Inoculacin experimental de envases

La tcnica tiene inconvenientes: ) Es cara ) Es lenta ) Requiere habilidades microbiolgicas y laboratorios ) Cuando se cambia la formulacin de un producto o un perfil tiempo-temperatura, es necesario repetir el test de desafo

La alternativa es entender con ms profundidad la respuesta de los microorganismos a los factores medioambientales del alimento y desarrollar la forma de interpolar respuestas microbiolgicas mediante clculo

Microbiologa Predictiva

Microbiologa Predictiva
Campo de estudio que combina elementos de microbiologa, matemticas y estadstica para desarrollar modelos que describan y predigan matemticamente el crecimiento o muerte de los microorganismos, cuando se les somete a condiciones medioambientales especficas (Whiting, 1995).

"Los modelos son descripciones simplificadas de la realidad "La realidad descrita por el modelo se denomina Espacio Modelo

" Los modelos deben reflejar lo que est pasando y deben ser capaces de predecir con precisin los estados presente y futuro de las cosas que describen " Hay que ser conscientes de que un modelo no puede dar una representacin total de la realidad. Un modelo particular puede describir algn aspecto de forma muy adecuada mientras que falla en la descripcin de otro

Suposiciones en modelizacin Espacio Modelo: No se puede modelizar todo, hay que escoger la parte de la realidad que se quiere modelizar. A esto se le llama espacio modelo y no tiene conexin con el resto de la realidad realidad espacio modelo

Espacio modelo: Se define como todos los factores que juegan un papel en la determinacin del fenmeno bajo estudio, los conocidos y no conocidos

Fenmeno: Los modelos se usan para describir relaciones entre variables dependiente e independientes. V. dependiente Relacin V. Independientes Fenmeno

Para poder modelizar un fenmeno en un espacio modelo determinado es necesario entender la relacin entre las variables dependiente e independientes. Este ejercicio ayudar a elegir el modelo apropiado Variables dependientes: tiempo de tratamiento Variables independientes: Nmero final de microorganismos

Microbiologa predictiva El objetivo de la microbiologa predictiva es conseguir un Espacio Modelo para describir un Fenmeno de forma matemtica o probabilstica Espacio modelo Medioambiente Temperatura pH aw Respuesta microbiana Crecimiento Inactivacin

Fenmeno

La microbiologa predictiva no revela, generalmente, comportamientos inesperados de los microorganismos. La microbiologa predictiva cuantifica los efectos de la interaccin entre dos o ms factores y permite la interpolacin de combinaciones de factores no comprobados de forma explcita

Clasificacin de los modelos Modelos de nivel primario: Modelo de Bigelow Modelos de nivel secundario: Superficie de respuesta Modelos de nivel terciario: Tejedor y Martnez

Los modelos de nivel primario describen cambios en el nmero de microorganismos u otras respuestas microbianas con el tiempo.
conc. conc.(log10 (log10cfu/ml) cfu/ml)
10 10 88 66 44 22 00 00

conc. conc.(log10 (log10cfu/ml) cfu/ml)

0.5 0.5

inactivacin

10 10 88 66 44 22 00

crecimiento

0.1 0.1

0.2 0.2

0.3 0.3

0.4 0.4

00

10 10

20 20

30 30

time(h) (h) time

time(h) (h) time

Los modelos secundarios describen las respuestas de los parmetros de los modelos Primarios (D, , ) a los cambios en las condiciones medioambientales superficie de respuesta
-1 -1 -1.4 -1.8 -2.2 -2.6 1 2 5.6 6 4 5 6.8 6.4

Ln(spec.g.rate)

-1.4 -1.8 -2.2 -2.6

Na 3 (% Cl )

pH

Los modelos terciarios son programas de ordenador que transforman a los modelos primarios y secundarios en herramientas de facil uso para los usuarios del modelo

Inactivacin

crecimiento

Consideraciones en el desarrollo de un modelo " Precisin en el ajuste. " Capacidad de predecir combinaciones de factores no probadas. " Incorporacin de todos los factores relevantes. " Que tenga el mnimo nmero de parmetros. " Especificacin del trmino de error. " Los parmetros deben tener un significado biolgico y valores realistas. " Reparametrizacin si se mejoran las propiedades estadsticas.

Modelos primarios de inactivacin/supervivencia

Bacillus stearothermophilus
7 6 5 4 3 2 1 0 116

Log N

experimental predicho

118

120 122 124 126 Temperatura (C)

128

Obtencin de datos cinticos de termoresistencia

Tratamiento isotermo (T constante)

Tratamiento no isotermo (Rampa de T) (Rampa de T-T constante)

TRATAMIENTO TRMICO DE Lactobacillus plantarum EN SUERO DE JUGO DE NARANJA

Llenado de capilares (100 l)

Cerrado a la llama

Tratamiento trmico

50- 57.5 C durante 10 a 120 s

Siembra y recuento

L. plantarum CECT (220) [ ] inicial

9 x 108 ufc/ml

Fase estacionaria

Tratamiento trmico de los capilares

Capilares Data logger

Bao calentamiento

Bao enfriamiento

Detalle termorresistmetro

Modelos de inactivacin: Velocidad alta de muerte de los microorganismos por la accin de un agente activo Modelos de supervivencia: Disminucin de la carga microbiana de forma mas lenta y no implica esterilidad comercial Los modelos matemticos son los mismos en ambos casos

Modelos primarios A) Modelos logartmicos La modelizacin matemtica comenz en 1920 con los clculos de tiempo de destruccin trmica. Los valores D y Z se usaron con xito para asegurar que los alimentos enlatados estaban libres de riesgo de alteracin por Cl. botulinum Estos modelos establecen la relacin existente entre el tiempo y la inactivacin de un microorganismo a una temperatura dada.

Los datos experimentales para la obtencin de los parmetros, D y Z, que definen la inactivacin de los microorganismos se pueden analizar de diferentes maneras: " Dos regresiones lineales consecutivas " Una regresin no lineal en un solo paso

Curva Curvade desupervivencia supervivencia Log. supervivientes

3 2 DT 1

Tiempo de exposicin

Curva rmica Curvade demuerte muertet trmica

Log DT

DT2 DT1 z

T1 T2 Temperatura

log(D2) log(D1) 1 = T1 T2 Z

Una regresin no lineal

Tratamiento isotrmico

log N = log No

1 DR 10
TR T z

Parmetros cinticos predichos para dos cepas de Bacillus cereus

.

Temperature (C)
Linear 85 90 95 100 105
a 165 3.90.7 0.940.17 0.220.06

D value (min)
AV TZ415 Non-linear
a 17.10.5 4.040.08 0.950.02 0.007 0.225

AV Z421 Linear
ND

Non-linear
ND
a 393 9.80.5 2.480.06 0.630.03 8.40.2

ND

ND

z (C)
ND not determined.
a

8.10.3

7.970.10

4020 113 2.50.4 0.600.19 8.00.6

a

D value confidence interval (95%).

Curvas de equivalencia
Log (No/N) observed
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5

Log (No/N) predicted Log (No/N) observed

4 3 2 1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5

Log (No/N) predicted

25 20 15 10 5

Residuos normales con media cero

Frequency

0 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3

(Log Nexp - Log Ncal)

35 30 25

Frequency

20 15 10 5 0 -0.7 -0.46 -0.22 0.02 0.26 0.5

(Log Nexp - Log Ncal)

CLCULO DE LAS REGIONES DE CONFIANZA

SSQ =
i =1

No No log log m N N f

9.1

Regiones de confianza conjunta

8.7

z (C)

8.3

90C

7.9

AV TZ415

95C
AV Z421

7.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

D (min)

Efecto del pH sobre el valor D del B. stearothermophilus en ensaladilla

14 12
Z (C) 118 C Z (C)

14 12 10 8

115 C

10 8 6 1 2 3
D (min)

8
D (min)

10

12

Efecto del pH sobre el valor D del B. stearothermophilus en ensaladilla

14 12
Z (C)

14
121 C

125 C

12
Z (C)

10 8 6
1 1,2 1,4 1,6 D (min) 1,8 2

10 8 6 0 1 2

D (min)

Diferentes tipos de curvas de supervivencia

Hombro

Log. supervivientes

3
Lineal

Concavidad hacia abajo

2 1

Concavidad hacia arriba

Cola

Tiempo de exposicin

Los hombros se han atribuido: a la necesidad de mas de un evento daino a la necesidad de una activacin de las esporas

Presencia de colas

Teora vitalista vitalista Teora

Distribucin de termorresistencia

Teora mecanicista mecanicista Teora

La termorresistencia depende del ciclo celular en que se recoja la clula

Otras explicaciones explicaciones Otras

Presencia de artefactos experimentales mezcla de poblaciones

Nueva aproximacin aproximacin Nueva

La curva de supervivencia es una forma acumulativa de distribucin de eventos letales con el tiempo

Cada organismo individual o espora de una poblacin muere a un tiempo especfico

Curvas con hombros

1 85C 0.1 90C 0.01
S(t) (N/No)

0.001

AVTZ415 strain

95C

0.0001

100C

0.00001 0 8 16 Time (min) 24 32 40

Funcin de supervivencia

MODELO DE WEIBULL

S(t)

= e

t - a

a= Scala n= Forma

El parmetro de forma n se puede considerar como un ndice de comportamiento Si n >1 describe una curva con hombro Si n < 1 describe una curva con cola Si n = 1 la curva de supervivencia sera lineal en coordenadas semilogartmicas y se comportar como una reaccin de primer orden El parmetro de escala ase puede considerar como una constante de velocidad de reaccin. Similar al Valor D

Curvas de supervivencia
1.00 0.80 0.60
S(t) (N/No)

95C AVZ421 strain 97.5C 100C

0.40 102.5C 0.20 105C 0.00 0.00 3.20 6.40 9.60 12.80 16.00

Time (min)

Medida de la resistencia trmica

tc = a 1 + n
= Funcin Gama

-1

Comparacin entre el nmero supervivientes experimentales y predichos

t N

(min) 0 4 8 12 16 Af

N obs 19900000 13266000 8360000 3450000 1417000 -

NW 19900000 13710010 7629650 3759861 1688864 1.10

NB 24130989 12433299 6406158 3300722 1700671 1.20

Parmetros para la distribucin de Weibull y valor D

T Weibull distribution Bigelow model

(C) 95.0 97.5 100.0 102.5 105.0 z (C)

scale (a) 8.3 4.5 2.10 1.35 0.65

shape (n) 1.36 1.72 1.58 2.03 1.69

tc (min) 8.0 4.0 1.85 1.20 0.58 (8.9)

D (min)
a 14 5

5.9 1.5 2.5 0.5 1.5 0.5

0.76 0.18 8.1

Curva de supervivencia para Bacillus pumillus en condiciones isotrmicas

1 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001 0.00 2.40 4.80 7.20 9.60 12.00

Fraccin supervivientes

Tiempo (min)

Curva de supervivencia para Bacillus pumillus mediante Weibull en condiciones isotrmicas

Ln fraction of survivors
0 90 C -3 a=5.47, -6 -9 -12 -15 0.00 2.20 4.40 6.60 8.80 11.00 n=0.32

Time (min)

M todos no rmicos Mtodos noisot isotrmicos Ventajas todos no rmicos Ventajasde delos losm mtodos noisot isotrmicos Se obtiene una gran informacin de cada experimento Se ahorra tiempo Se ahorra material y costo en mano de obra Son mas cercanos a lo que en realidad pasa en un proceso industrial

Tratamiento no isotrmico Ecuacin 1

n No 1 = Log t Log Log TR T N i =1 z 10 D R

Ecuacin 2

T T0 10 1 T0 TR No z z = 10 Log N DR ln 10 a z

a=Velocidad de calentamiento

Bacillus stearothermophilus
7 6 5 Log N 4 3 2 1 0 116 118 120 122 124 126 128 experimental predicho

Temperatura (C)

80 70 60 50 Frecuencia 40 30 20 10 0 -0.4

Distribucin de residuos

-0.2

0.2

0.4

(Log Nexp - Log N cal)

Regiones de confianza conjunta

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
125 C 124 C 123 C 122 C

z (C)

D (min)

Bacillus cereus
Temperature (C) 85 90 95 100 z ( C) Af
b

D (min) non-isothermal 16.0 3.93 0.96 0.236 8.19 1.11 Isothermal 17.1 4.04 0.95 0.225 7.97
a a a

Modelos secundarios de inactivacin

-1 -1.4 -1.8 -2.2 -2.6 1 2 3 4 5 6.8 6.4 6 -1 -1.4 -1.8 -2.2 -2.6 5.6

Los modelos secundarios describen las respuestas de los parmetros de los modelos primarios a los cambios en las condiciones medioambientales

superficie de respuesta
-1 -1 -1.4 -1.8 -2.2 -2.6 1 2 5.6 6 4 5 6.8 6.4

Ln(spec.g.rate)

-1.4 -1.8 -2.2 -2.6

Na 3 (% Cl )

pH

Modelos secundarios

Tanto los parmetros que definen las curvas de Inactivacin D z, como los que definen las curvas De crecimiento , se ven afectados por factores Mediombientales pH, ClNa, aw, entre otros.

Los modelos probabilsticos o matemticos que relacionan las variables dependientes, parmetros cinticos, con los factores medioambientales son los denominados modelos secundarios

Modelos secundarios de inactivcin

Modelo basado en la ecuacin de Arrhenius (Davey, 1993)

Lnk = c0+(c1/T)+c2pH+c3(pH)2+

Modelo basado en la ecuacin de Bigelow (Mafart y Legurinel, 1998)

LogD = LogD*-(1/zT)(T-T*)-(1/zpH)2(pH-pH*)2+

Modelo cuadrtico polinomial (Fernndez y col., 1996)

LogD = c1+c2T+c3pH+c4(TpH)+c5T2+c6(pH)2 +

Modelo bsico (Fernndez y col., 1996)

LogD = c1+c2T+c3pH+

Curvas con colas o con hombros

Modelo basado en la distribucin de Frecuencia de Weibull (Fernndez y col., 2001)

t Ea 1 1 ( ) Ln = pH pH exp ref ref (T , pH) R T T ref

Obtencin de datos y modelos matemticos de crecimiento

Obtencin de curvas de crecimiento

Microorganismo de coleccin

Condiciones de recuperacin

Condiciones de crecimiento en medio de referencia

Curva de crecimiento en el alimento

Microorganismo de coleccin
Se obtiene de colecciones tipo en forma liofilizada: CECT (Coleccin Espaola de Cultivos Tipo) ATCC (American Type Culture Collection)

Condiciones de recuperacin
Siguiendo las instrucciones de la coleccin: Transferir el lifilo a medio lquido de referencia para el microorganismo a su temperatura de crecimiento

Condiciones de crecimiento en medio de referencia

Especficas para cada microorganismo: Medio lquido de referencia para el microorganismo a su temperatura de crecimiento Toma de muestra a intervalos y lectura de absorbancia en espectrofotmetro: Absorbancia Densidad ptica Crecimiento

Obtener poblacin homognea

Curva de crecimiento en el alimento

Se parte de un vial de microorganismo crecido anteriormente Inoculacin en el alimento a estudio a la temperatura problema Recuento en placa a intervalos determinados

Microbiologa predictiva

Diseo Experimental

Obtencin de Datos

Ajustar Curvas

Determiar Cinticas

Modelizar Parmetros Ajustados

Validar

Crecimiento de Salmonella typhimurium en medio de referencia (TSB) a 37 C

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

A b so rb an cia

Fase Latencia
2 4 6

Fase log Fase estacionaria

8 Tiempo (h) 10 12 14 16

Modelos matemticos de de crecimiento

Los modelos de nivel primario describen cambios en el nmero de microorganismos u otras respuestas microbianas con el tiempo.
10 10

conc. conc.(log10 (log10cfu/ml) cfu/ml)

88 66 44 22 00

crecimiento
00 10 10 20 20 30 30

time(h) (h) time

Modelos primarios de crecimiento

10

conc. (log10 cfu/ml)

8 6 4 2 0 0

Bacterial growth curves at different temperatures

Constant spec.rate

10

20

30

time (h)

Tipo de modelos
Crecimiento/no crecimiento Es la situacin mas simple El parmetro a medir es el tiempo desde la inoculacin hasta la aparicin de turbidez o formacin de toxina Son modelos sofisticados a travs de los cuales se deducen distintos parmetros que definen el crecimiento de la bacteria

Tiempo para crecimiento

Modelos de crecimiento

Tiempo formacin toxina Heat time 27 27 27 27 27 156.7 156.7 156.7 156.7 156.7 C. botulinum Inc.temp Prediction (ln) Prediction (days) 6 3.17 23.78 8 2.73 15.40 10 2.33 10.31 12 1.97 7.14 25 0.38 1.47 6 3.47 32.05 8 3.04 20.90 10 2.65 14.09 12 2.28 9.82 25 0.75 2.11

=(4.61+0.00228*A7-0.276*B7+0.000026*(A7*B7)0.000000724*(A7)^2+0.00415*(B7)^2)

Exponencial Logstico

ln( N ) = ln( N 0 ) + t
ln( N ) = ln( N 0 ) + a [1 + exp (b cx )]

Gompertz

max e ( t ) + 1 ln( N ) = ln( N 0 ) + A exp exp A

exp ( max An (t ) 1) ln( N ) = ln( N 0 ) + max An (t ) ln 1 + exp( A)

Baranyi

Modelos de crecimiento El modelo primario ms utilizado ha sido la ecuacin de Gompertz. La ecuacin es una funcin doble exponencial con cuatro parmetros que describe una curva sigmoidea asimtrica

Yt=A*Cexp{-exp[-B(t-M)]}

Yt= logartmo de UFC por mililitro en el tiempo t A= logartmo de la concentracin inicial C= Cambio en el nmero de clulas entre el inculo y la fase estacionaria B= ritmo de crecimiento relativo M= tiempo al que se alcanza el ritmo mximo de crecimiento

Parmetros de crecimiento bacteriano. Clsicos

Ln Xmax

BC/e A M C

Ln X0

M-(1/B)
lag (tiempo)

Los cuatro parmetros se pueden relacionar matemticamente con caractersticas culturales familiares a los microbilogos.
= Velocidad de crecimiento exponencial {[log(cfu/g)]/hr}

BC/e GT =Tiempo de generacin (hr) Ln(2)*e/CB

= Duracin fase de latencia (hr) M-1/B

Los parmetros de la funcin de Gompertz se pueden determinar mediante una regresin no lineal, tal como se haca para la determinacin de los parmetros de las curvas de inactivacin

Para un buen ajuste se necesitan como mnimo 10 puntos por curva de crecimiento

La ecuacin de Gompertz ha sido reparametrizada para poder obtener los parmetros , directamente (Zwietering y col).

lnNt/No= Bexp{-exp[( e/B)(-t)+1]} C= e/B B=( e/C) +1

Modelo de Baranyi y Robert Para solucionar los defectos del modelo de Gompertz Baranyi y Robert proponen un modelo nuevo.

Incluye una fase de crecimiento exponencial lineal (x) Incluye una fase de latencia que se calcula mediante una funcin de ajuste (t)

La solucin para el logaritmo natural de la concentracin de clulas y=lnx(t), es:

y (t ) = y o + max

m max A (t ) 1 e 1 1 + m ( y max y o ) A (t ) ln m e

Yo=lnx(to) logartmo de la concentracin de clulas a tiempo 0 ymax=lnxmax logartmo de la concentracin mxima de clulas m= Parmetro de curvatura

La funcin A(t) es el retraso gradual en el tiempo

A(t ) = t +

ln e

max t

+e

ho

vt ho

max
ho= -ln o

z1 (t0 ) o = K z + z1 (to )
o= Estado fisiolgico de las clulas a tiempo 0 Z1(t)= La cantidad por clula de una sustancia crtica que causa un cuello de botella en el crecimiento

Modelos log concentr vs tiempo

12 9 6 3 0 0 10 20 30 Arc ta nge nt time (h) 40 log conc. (cfu/ml) Gompe rtz Ba ra nyi

Gompertz Lag: 8.6 h : 1.11 h-1 Error: 0.10

Arctangent Lag: 8.5 h : 1.35 h-1 Error: 0.14

Baranyi Lag: 7.6 h : 0.97 h-1 Error: 0.07

Modelos secundarios de crecimiento

Sqr(slope) at different temperatures

Sqr(slope)

0.1

Constant b-value (Ratkowsky)

0 14 15 16 17 18

temperature (C)

Modelos secundarios de crecimiento

Los modelos secundarios de crecimiento se pueden Agrupar en tres categoras: ) Modelos de raiz cuadrada (Blenrdek) ) Modelos basados en la ecuacin de Arrhenius (Davey) ) Modelos polinomiales o de superficie de respuesta

Modelos secundarios de crecimiento

Lineal Polinmicos

b c ln ( ) = a + + 2 + daw + eaw 2 T T

log( ) = a + b1T + b2 pH + .....bi T 2

Raz cuadrada

k = a (T T0 )

Superficie de respuesta

Es una ecuacin de regresin ajustada usando tcnicas de regresin normales y que puede contener trminos lineales, cuadrticos, cbicos incluyendo interacciones.

La ecuacin es totalmente descriptiva del grupo particular de datos usados para su clculo y sin implicar relaciones Tericas o mecansticas.

Ejemplos

Relacin lineal para describir alteracin en pescado (Spencer y Baines 1964)

Velocidad de alteracin (k)= Ko(1+aT) a= constante lineal Ko= Velocidad a 0C T= Temperatura

Se han utilizado ecuaciones polinmicas para Predecir el valor de los parmetros B y M de la Ecuacin de Gompertz en funcin del pH, Atmsfera anaerbica y aerbica, la concentracin de NaCl y la temperatura de almacenamiento en Salmonella y Listeria (Gibson y col 1988, Buchanan y col 1989)

Los modelos actuales son deterministas Evolucin Modelos probabilsticos que describan la Variabilidad y las incertidumbre
N bt n N = exp 0

Modelo de Weibull

Factores a tener en cuenta en Estudios cinticos

Clostridium sporogenes

Para conseguir conseguir alargar alargar la la vida vida del del alimento alimento Para pH pH Tratamiento trmico trmico suave suave Tratamiento MAP + MAP + Baja actividad actividad de de agua agua Baja Antimicrobianos naturales naturales Antimicrobianos Conservadores (ClNa, (ClNa, NO NO Conservadores )) 22 Refrigeracin Refrigeracin

Otras consideraciones a tener en cuenta en estudios cinticos

Posibles causas de modificaciones genticas y/o proteicas

Dao subletal: Primeros estudios aseguraban que el efecto de las tecnologas emergentes sobre los microorganismos era un caso de todo o nada (Simpson et al. 1999; Dutreux et al. 2000; Russell et
al. 2000; Ravishankar et al. 2002; Ulmer et al. 2002; Wuytack et al. 2003)

Estudios posteriores ya indican la presencia de clulas con dao subletal a ciertas condiciones de tratamiento (Aronsson et
al. 2004; Lado et al. 2004; Yaqub et al. 2004; Garca et al. 2005, 2006, 2007; Rodrigo et al. 2007).

Posibles causas de modificaciones genticas y/o proteicas

Una de las causas propuestas son los efectos de las tecnologas de procesado de alimentos

Modificaciones genticas y/o proteicas

Mecanismos de inactivacin de estas tecnologas afectan principalmente a la membrana celular de microorganismos.

Technology Heat High Pressure Electric Pulsed Fields Ionizing Radiations UV light Natural Antimicrobials

Mechanism of inactivation Protein, DNA, RNA denaturisation Changes in membrane structure and functionality Changes in membrane structure and functionality DNA, RNA denaturisation DNA, RNA denaturisation Changes in membrane structure and functionality

Possible hazard for food safety Mutation Transformation Transformation Mutation Mutation Transformation
Lado andYousef (2002)

Efecto de PEF y HHP sobre microorganismos

Agente estresante Modificaciones en membrana celular

Formacin poros Irreversible

Cambios estructurales Degradacin protena Reversible

Muerte microorganismo

Dao subletal

Recuperacin clula

Introduccin material gentico ajeno al moo

Cambios en resistencia a tto, antibiticos, antimicrobianos, etc

Modificaciones genticas y/o proteicas

Inters de organismos internacionales por el estudio de cambios en resistencia de microorganismos a antibiticos o antimicrobianos

Foodborne antimicrobial resistance as a biological hazard

The EFSA Journal (2007) ****

Evaluacin y validacin de los modelos

Cmo se puede validar un modelo

A travs de ciertos ndices (Estadsticamente)

Con nuevos datos obtenidos de forma independiente

En condiciones reales de elaboracin del alimento

VALIDACIN Y EVALUACIN DE LOS MODELOS La validacin es una de las etapas ms importantes en el desarrollo de un modelo de inactivacin o de crecimiento. Dos fases Validacin matemtica Validacin en alimento

ndices estadsticos
Coeficiente de determinacin Estudio de los residuos Datos influyentes Multicolinealidad ndices para evaluar modelos en microbiologa de alimentos

Coeficiente de determinacin

Este coeficiente indica la proporcin de variabilidad de las observaciones de la variable dependiente (lnK) explicada por el conjunto de las variables independientes consideradas en cada caso.

Estudio de los residuos

Los residuos se definen como la diferencia entre el valor observado de la variable dependiente y el valor ajustado en el modelo.

Pruebas habituales para los residuos

Descriptivas bsicas Test de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) Linealidad, homocedasticidad (igual varianza) y valores atpicos Autocorrelacin entre residuos consecutivos (Durbin-Watson)

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -,40 -,35 -,30 -,25 -,20 -,15 -,10 -,05 -,00 ,05 ,10 ,15 ,20 ,25 Desv. tp Media = 0,00 N = 60,00
,4 ,3 ,2 ,1 0,0 -,1 -,2 -,3 -,4 -,5 -,4 -,3 -,2 -,1 ,0 ,1 ,2 ,3 ,4

Normalidad

grfico P -P de los Residuos

Residuos

Valor Normal esperado

Valor observado

Homocedasticidad y valores atpicos

,3 ,2 ,1 ,0

residuos

- ,1 - ,2 - ,3 - ,4 - ,5 - 1,5 - 1,0 - ,5 0,0 ,5 1,0 1,5

valores ajustados

,8 ,6 ,4 ,2 ,0 -,2 -,4 -,6

Linealidad

,4

,2

-,0

-,2

LOGD

-,4

-1,0 -2000 -1000 0 1000 2000

LOGD

-,8

-,6 -2,0 -1,5 -1,0 -,5 0,0 ,5 1,0 1,5 2,0

TEMP2

NACL

,6

,4 ,2

-,0

-,2 -,4 -,6 -20

LOGD

-10

10

PH2

Autocorrelacin 0 dl du 4-du 4-dl 4

0<d<dl = aceptamos correlacin positiva dl<d<du= test no concluyente du<d<4-du= no autocorrelacin 4-du<d<4-dl= test no concluyente 4-dl<d<4= autocorrelacin negativa

Tabla test Durbin-Watson nmero datos Nmero de variables 1 2 3 du dl du dl du 4

dl

dl

du

15 16 17 18 19

0.95 1.23 0.83 1.40 0.98 1.24 0.86 1.40

Datos influyentes En algunos problemas se observa que un nmero pequeo de observaciones tienen una influencia exagerada sobre el modelo ajustado. Una forma de averiguar la presencia de datos influyentes es mediante la distancia de Cook.

Se considera que un dato es influyente si el valor de la distancia de Cook que le corresponde es mayor de 1

Valores mximos de la Distancia de Cook para cada uno de los modelos analizados
Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) N 32 32 32 30 30 12 12 Arrhenius Bigelow Cuadrtico Bsico 0,663 0,502 0,347 0,233 0,502 0,324 0,600 0,334 0,323 0,263 0,168 0,689 0,293 0,480 0,402 0,429 0,156 0,133 0,337 0,374 1,265 0,636 0,525 0,426 0,241 0,424 0,354 0,788

Nuevos datos obtenidos de forma independiente Hay dos dos ndices ndices que que nos nos pueden pueden dar dar de de forma forma rpida rpida Hay la diferencia diferencia entre entre los los valores valores predichos predichos por por el el modelo modelo la y aquellos aquellos obtenidos obtenidos de de forma forma independiente independiente para para y distintas combinaciones combinaciones de de las las variables variables independientes independientes distintas BIAS Factor de exactitud
n

B f = 10

(log ( predichos / observados ))

A f = 10

(log ( predichos
n

/ observados

))

Valores del factor BIAS para cada uno de los modelos analizados
Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n 32 32 32 30 30 12 12 Arrhenius Bigelow Cuadrtico Bsico 0,98 0,98 1,00 1,00 1,00 1,01 1,00 1,01 1,00 1,00 1,00 1,01 1,00 1,00 0,96 1,06 2,02 1,11 0,93 0,50 4,10 1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 0,92 1,08

Valores del factor de exactitud para cada uno de los modelos analizados
Microorganismo/ alimento C. botulinum Spaghetti Macarrn Arroz C. sporogenes Tampn fosfato Pur de guisantes B. stearothermophilus Champin (ctrico) Champin (GDL) n 32 32 32 30 30 12 12 Arrhenius Bigelow Cuadrtico Bsico 1,17 1,17 1,17 1,27 1,23 1,29 1,32 1,07 1,06 1,06 1,10 1,11 1,15 1,15 1,07 1,08 2,02 1,12 1,09 2,01 4,10 1,14 1,16 1,18 1,10 1,09 1,13 1,13

Every model is wrong. The question is, how much wrong still useful it can be. (Box and Draper)