LA CITOMETRIA DE FLUJO

Jos Enrique OConnor

Centro de Citometra y Citmica Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular Facultad de Medicina jose.e.oconnor@uv.es

LA CELULA COMO UNIDAD FUNCIONAL DEL ORGANISMO

DIAGNOSTICO MORFOLOGICO

DIAGNOSTICO FUNCIONAL

LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO

DIAGNOSTICO BIOQUIMICO

DIAGNOSTICO GENOMICO

LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO

Se necesita una tcnica de diagnstico e investigacin que permita: Integrar el nivel celular y molecular Resolver la heterogeneidad celular de los tejidos Detectar clulas muy infrecuentes

LA CELULA COMO UNIDAD DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO

CITOMETRIA DE FLUJO!!!!

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples fluorescencias y la dispersin de luz de clulas o partculas microscpicas, alineadas mediante una corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una o mltiples fuentes de iluminacin.

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

Protenas extracelulares Secuencias de ADN o ARN libres Complejos inmunes circulantes

Viriones individuales Liposomas Cromosomas aislados Orgnulos aislados Ncleos aislados

Bacterias Hongos unicelulares Clulas humanas y animales Protoplastos vegetales Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Cuerpos embrioides Larvas y embriones Organismos pluricelulares

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

Clulas o partculas biolgicas individuales en suspensin

Mtodo analtico que mide la emisin simultnea de mltiples fluorescencias y dispersin de luz

CITOMETRIA DE FLUJO

Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto ptimo de iluminacin

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro

FUNCIONAMIENTO DE UN CITOMETRO DE FLUJO

Sistema de Fluidos Sistema Optico Sistema Electrnico

Partculas en suspensin individual que fluyen secuencialmente a travs de un volumen iluminado donde dispersan luz y emiten fluorescencia que es dirigida y filtrada y convertida a valores digitales que se almacenan en un ordenador

SISTEMA DE FLUIDOS

Inyeccin de la muestra y cmara de flujo

SISTEMA DE FLUIDOS

La base de la aplicacin ms comn de la Citometra de Flujo es el uso de luz lser enfocada para iluminar clulas alineadas mediante un sistema de fluidos capaz de enfoque hidrodinmico
Lquido envolvente

Cmara de Flujo

Fluorescencia

Laser enfocado

SISTEMA DE FLUIDOS

Enfoque Hidrodinmico

SISTEMA OPTICO

Lmparas: Xenon, Mercurio Lser: Refrigerados por aire: Ar, He-Ne Refrigerados por agua: Ar, Kr, He-Cd Diodos

Filtros: Bloqueo Dicroicos Paso de Banda

Emisin de fluorescencia y bancada ptica: Epics XL

SISTEMA ELECTRONICO

Deteccin y Amplificacin de seal:

Transformacin de seal luminosa en pulso elctrico

SISTEMA ELECTRONICO

Eliminacin de seales no deseadas: Discriminador

SISTEMA ELECTRONICO

Conversin Analgica-Digital

SISTEMA ELECTRONICO

Clasificacin de las seales: Histograma de frecuencias

SISTEMA INFORMATICO Histogramas Dot-plots

Representacin Lineal

Representacin Logartmica

SISTEMA INFORMATICO

Acotamiento de subpoblaciones de inters

SISTEMA INFORMATICO

Anlisis Cintico

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

LA LUZ ES ENERGIA

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

1
Un fotn de energa hnEX es absorbido por la molcula fluorescente, creando un estado excitado (S1)

2
El estado excitado tiene una duracin de 110 10-9 segundos

3
Un fotn de energa hnEM es emitido para devolver la molcula fluorescente a su estado basal (S0)

FLUORESCENCIA

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

LA LUZ ES COLOR

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

EL COLOR ES INFORMACION

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUOROFORO

`PROPIEDAD BIOLOGICA

`PROPIEDAD BIOLOGICA FLUOROCROMO FLUOROCROMO

FLUOROCROMOS, FLUOROFOROS Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL INDICADORES Y QUELANTES DE IONES SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES

CLASIFICACIN FUNCIONAL DE MARCADORES FLUORESCENTES

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

Emisin

Excitacin

Longitud de onda

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

Transferencia de energa entre molculas vecinas

Estado Excitado

Estado Basal
Molcula Dadora PE Molcula Aceptora Texas Red/Cy5/Cy7

TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)

Fluorescencia

Energa

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

Molecule 1
Fluorescence
DONOR

Molecule 2
Fluorescence
ACCEPTOR

Absorbance Absorbance

Wavelength

TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)

The Visible Spectrum FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

Fluorocromos en tndem Ficoeritrina + Cianinas

R-Phycoerythrin

488 nm Argon

Cy 5 Cy 5.5

675 nm

675 nm 575 nm

Cy 7

760 nm

FLUOROCROMOS EN TANDEM: FICOERITRINA +CIANINAS

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

PE-AF610 615 FITC 520 PE 575 ECD 615

APC 660 PC5 665 PC7 670 APC-AF750 785

<390

400-450

450-500

500-570

570-590 590-620

620-750

>750

ultravioleta

violeta

azul

verde

amarillo

naranja

rojo

infrarrojo

LASER 488

LASER 630

FLUOROCROMOS EN TANDEM PARA ROJO LEJANO

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro

PARAMETROS ANALIZABLES POR CITOMETRIA DE FLUJO

Parmetros Nucleares
Enzimas Proteinas

Pared celular

Molculas de superficie
Proteinas Enzimas

Molculas de superficie

Enzimas

Parmetros de Superficie

Parmetros Citoplasmticos
Proteinas secretadas

Parmetros Extracelulares

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones clnicas de la citometria de flujo La citometra del futuro

APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: OBJETIVO

Determinar la presencia y cuantificar la expresin de protenas (antgenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las clulas de la sangre, tejidos linfoides, lquidos biolgicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos fluorescentes.

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: METODOLOGIA

Se realiza mediante el marcaje de antgenos de la membrana plasmtica con anticuerpos mono- o policlonales conjugados con fluorocromos. El proceso de preparacin de la muestra es mnimo en la mayora de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: Concentracin celular: lquidos biolgicos (LCR, orina, etc.) Dispersin celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido Disgregacin mecnica: tejidos linfoides, tejidos mucosos Disgregacin enzimtica: tejidos slidos, cultivos en monocapa Estimulacin celular controlada: estudios de activacin

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INFORMACION

Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y tcnicas de anlisis permiten identificar subpoblaciones especficas de clulas y determinar:

Linaje celular

Grado de maduracin

Grado de activacin

Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR

Expresin de protenas de fusin en translocaciones cromosmicas

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMATOLOGIA

Diagnstico y pronstico de leucemias, linfomas, sndromes linfoproliferativos y sndromes mielodisplsicos

Deteccin de Enfermedad Mnima Residual

Recuento absoluto de clulas CD34+ viables circulantes o en preparaciones celulares para el auto- o alotransplante de precursores hematopoyticos

Diagnstico de Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna

Deteccin de fenotipo MDR (resistencia a frmacos) mediado por la glicoprotena-P

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INMUNOLOGIA

Determinacin de porcentaje y recuento absoluto de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK en el seguimiento de inmunodeficiencias y otras alteraciones de la respuesta inmunitaria

Recuento absoluto de CD4+ y cociente CD4/CD8 en pacientes con VIH

Deteccin de leucocitos activados en sangre perifrica o en preparaciones celulares estimuladas

Deteccin de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos a clulas

Diagnstico de deficiencias en molculas de adhesin

Identificacin de basfilos circulantes y deteccin de la desgranulacin provocada por alergenos.

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMOSTASIA

Diagnstico de deficiencias congnitas de glicoprotenas plaquetarias

Deteccin ex vivo de plaquetas activadas circulantes in vivo

Determinacin de la reactividad plaquetaria ex vivo

Cuantificacin de receptores gpIIb/IIIa ocupados en la terapia antiagregante plaquetaria con antagonistas de gpIIb/IIIa

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : OBJETIVO

Determinar la presencia y cuantificar la expresin de protenas (antgenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmtica, citoplasma, vesculas o ncleo de las clulas de sangre, tejidos linfoides, lquidos biolgicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: METODOS

El proceso de preparacin de la muestra requiere etapas de fijacin y permeabilizacin para hacer accesibles los epitopos intracelulares. El proceso de preparacin de la muestra es menor en la mayora de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: Concentracin celular: lquidos biolgicos (LCR, orina, etc.) Dispersin celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido Disgregacin mecnica: tejidos linfoides, tejidos mucosos Disgregacin enzimtica: tejidos slidos, cultivos en monocapa Estimulacin celular controlada: estudios de activacin Bloqueo de la exportacin de protenas: protenas de secrecin (citoquinas)

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: INFORMACION

Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y tcnicas de anlisis permiten identificar: Linaje celular Grado de maduracin Grado de activacin Expresin de enzimas intracelulares Activacin de enzimas intracelulares Expresin de protenas reguladoras del ciclo celular Expresin de antgenos relacionados con la apoptosis Expresin de protenas de fusin en translocaciones cromosmicas.

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES

Diagnstico y pronstico de leucemias, linfomas y sndromes linfoproliferativos

Deteccin de Enfermedad Mnima Residual

Deteccin de leucocitos activados en sangre o preparaciones celulares estimuladas

Identificacin de clulas productoras de citociinas

Estudio de la polarizacin TH1/TH2/TH17 en linfocitos TH activados

Identificacin de clulas Tregs

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES

Identificacin de clulas en fase de proliferacin

Identificacin de clulas tumorales en muestras complejas

Identificacin y cuantificacin de clulas tumorales circulantes en sangre y lquidos biolgicos

Estudio de la regulacin del ciclo celular

Identificacin de clulas en apoptosis temprana o tarda

Anlisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES

Diagnstico de deficiencias en molculas de adhesin leucocitarias

Diagnstico de anomalas congnitas en el citoesqueleto

Diagnstico de deficiencias congnitas de almacenamiento en plaquetas

Identificacin y cuantificacin de eritrocitos con hemoglobina fetal en el adulto

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVO

Determinar la presencia y cuantificar los niveles de cidos nucleicos (ADN y ARN) en clulas enteras, clulas permeabilizadas o suspensiones de ncleos aislados a partir de sangre perifrica, tejidos linfoides, lquidos biolgicos, biopsias y otras muestras de tejidos slidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los cidos nucleicos.

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: METODOLOGIA

La determinacin de la ploida o el ciclo celular, requieren el acceso estequiomtrico del fluorocromo al ncleo celular, por lo que utilizan clulas fijadas y/o permeabilizadas, o suspensiones de ncleos aislados. Segn la aplicacin, el proceso de preparacin de la muestra puede ser mnimo o requerir etapas de fijacin y permeabilizacin. Los fluorocromos permeables de cidos nucleicos penetran en clulas en fresco y permiten distinguir las clulas nucleadas en sangre entera u otras muestras hematolgicas o detectar los cidos nucleicos residuales en eritrocitos y plaquetas inmaduras. Los fluorocromos impermeables de cidos nucleicos se usan para detectar cambios en la permeabilidad de membrana asociados con apoptosis y necrosis.

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: INFORMACION

Las tcnicas de anlisis basadas en el uso de fluorocromos especficos de cidos nucleicos en clulas permeabilizadas permiten:

Determinar la ploida celular

Detectar la presencia de clulas en proliferacin

Calcular la distribucin en las fases del ciclo celular

Identificar clulas nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos)

Estimar el grado de maduracin de precursores de eritrocitos y plaquetas

Identificar y cuantificar clulas vivas, apoptticas y necrticas

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: APLICACIONES

Pronstico de leucemias, linfomas y sndromes linfoproliferativos. Clculo de la ploida en tumores slidos y neoplasias hematolgicas. Identificacin de clulas en fases de proliferacin en tumores slidos y hematolgicos. Determinacin del ciclo celular en cultivos celulares in vitro. Determinacin de la activacin de linfocitos por mitgenos in vitro. Anlisis de la proliferacin de clulas tumorales en muestras complejas. Identificacin y cuantificacin de clulas tumorales circulantes Estudio de la regulacin del ciclo celular Identificacin de clulas en apoptosis temprana o tarda. Anlisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis. Determinacin de la viabilidad celular. Cuantificacin de la actividad citotxica de clulas NK y linfocitos CD8 activados. Identificacin de reticulocitos y clculo del Indice de Madurez Reticulocitaria (RMI). Identificacin de plaquetas reticuladas y clculo del Indice de Madurez Plaquetaria (PMI).

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: OBJETIVO

Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenmenos dinmicos o transitorios de la Bioqumica intracelular, cuya alteracin sea causa, consecuencia o est relacionada con situaciones fisiopatolgicas de relevancia clnica.

+ADP

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: METODOS

Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorognicos especficos o partculas fluorescentes cuyas propiedades varan en funcin de: Entorno celular: pH, iones, molculas oxidantes, reductoras Actividad de enzimas intracelulares especficos: oxidasas, peptidasas Transporte a travs de membrana plasmtica o de orgnulos Acumulacin selectiva en compartimentos intracelulares El proceso de preparacin de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematologa, el anlisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulacin mnima. En estudios de activacin, se puede requerir una etapa de estimulacin celular controlada.

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: INFORMACION

Fluidez y permeabilidad de membrana Fagocitosis de microorganismos Transporte de partculas y molculas solubles al interior de la clula Retencin intracelular de molculas Extrusin de sustratos a travs de bombas de eflujo Potenciales de membrana plasmtica y mitocondrial pH intracelular y su regulacin dinmica

Movimientos de iones a travs de membrana o desde depsitos intracelulares, Generacin de especies reactivas de oxgeno y xido ntricoNiveles de gluttion Citoenzimologa de flujo Sntesis de ADN Niveles de depsitos de lpidos metablicos y estructurales

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: APLICACIONES

Identificacin de blastos en el diagnstico de leucemias. Seguimiento de la activacin de leucocitos o plaquetas. Anlisis del contenido en iones y la regulacin del equilibrio inico celular. Deteccin de la expresin de superficie procoagulante en plaquetas. Seguimiento y cuantificacin de fagocitosis de microbios o partculas sintticas. Anlisis de la respuesta oxidativa en fagocitos ("Burst oxidativo"). Anlisis de la actividad de proteasas intralisosomales en fagocitos. Anlisis de la actividad proteoltica intracelular en clulas tumorales invasivas. Determinacin del pH intracelular y su regulacin. Anlisis del estrs oxidativo inducido y de las defensas antioxidantes celulares. Identificacin y cuantificacin de clulas en apoptosis.

ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro

LA EVOLUCION DE LA CITOLOGIA ANALITICA CITOLOGIA CITOMETRIA CITOMICA

Aumento de complejidad tcnica y de informacin generada Demanda de mejor rendimiento y mayor capacidad de anlisis de datos Bsqueda de nuevos parmetros biolgicos y nuevas reas de aplicacin

NUEVA INSTRUMENTACION

Flow Cytometry

Confocal Microscopy

Laser Scanning Cytometry Mass-Spectrometry Flow Cytometry High Content Analysis by Automated Bioimage Analysis Multispectral Image-in-flow Cytometry

CITOMETRIA ACSTICA: AUMENTO DE VELOCIDAD

Acoustic focusing cytometry uses ultrasound waves (over 2 MHz) to position cells into a single focused line along the central axis of a flow channel without high velocity or high volumetric sheath fluid, which can damage cells. The acoustic focusing actually concentrates the cells in the center of the fluid with sound energy. This means considerable flexibility in the sample concentration. The end result is more accurate and precise data. Acoustic focusing separates the alignment of cells from the particle flow rate. This allows to increase or decrease flow without disrupting the focus of cells in the capillary.

CITOMETRIA DE ALTO RENDIMIENTO: SCREENING

HERRAMIENTAS BIOINFORMTICAS: MAYOR INFORMACION

CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIN

Cells are hydrodinamically focused into a core stream and orthogonally illuminated for both darkfield and fluorescence imaging. The cells are simultaneously transilluminated via a spectrally limited source for brightfield imaging. Light is collected from the cells with an imaging objective lens and is projected on a charge coupled detector(CCD). Prior to projection on the CCD, the light is passed through a spectral descomposition optical system that directs different spectral bands to different lateral positions across the detector.

CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIN

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http://www.uv.es/~oconnor/IES-JJ-2012