Sesin 2 CROMATOGRAFA: EN CAPA FINA Y DE COLUMNA Objetivos 1.

Separar una mezcla de compuestos orgnicos en solucin, mediante cromatografa en capa fina. 2. Ensayar varias mezclas de solventes en diferentes proporciones y escoger cual de ellas efecta la mejor separacin. 3. Identificar cada uno de los compuestos separados comparndolos con muestras patrones. 4. Calcular el valor del Rf para cada compuesto en la proporcin de solvente escogida. 5. Establecer el nmero de componentes separados, en cromatografa sobre columna, de una muestra problema Aspectos tericos La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la diferencia de distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una mvil y otra estacionaria. Las molculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria y arrastradas por la fase mvil, de manera que si los componentes de la mezcla presentan diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades medias de avance a lo largo del sistema sern diferentes. La afinidad viene determinada por fuerzas de tipo Vander Waals, puentes de hidrgeno o transferencia de carga. Los componentes que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se movern ms lentamente a lo largo de dicha fase que aquellos que se unen dbilmente. Como consecuencia de esta diferencia de movilidad los componentes de la mezcla se separan en bandas discretas, que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente mediante el uso de los detectores adecuados. En la presente prctica se estudiarn dos tipos de cromatografa lquida: - Cromatografa de adsorcin en columna (CC) - Cromatografa de adsorcin en capa fina (TLC = thin layer chromatography)

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En ambas tcnicas la fase mvil est constituida por un lquido, la fase estacionaria por un slido y el mecanismo de separacin se basa en la diferencia de adsorcin de los componentes de la mezcla en la superficie activa de la fase estacionaria. En la primera (CC) la fase estacionaria se sita en un tubo (columna), en la segunda (TLC) se deposita sobre una superficie abierta plana. La cromatografa lquida suele emplearse para compuestos de poca volatilidad, tales como molculas grandes y altamente polares, a los que no es aplicable la cromatografa de gases. Cromatografa de adsorcin en columna (CC) En la figura se muestra esquemticamente una columna cromatogrfica. La fase estacionaria consiste en un slido adsorbente empaquetado en una columna de vidrio. La mezcla a separar (muestra) se deposita sobre la superficie de la fase estacionaria quedando adsorbida en ella. A continuacin, se vierte la fase mvil (eluente) en la parte superior de la columna y se permite su paso a travs de la fase estacionaria. Durante el proceso cromatogrfico los componentes de la muestra son arrastrados por la fase mvil a distintas velocidades efectundose la separacin. La velocidad de arrastre de cada componente depende de su grado de adsorcin en la fase estacionaria y de su afinidad por la fase mvil.
Durante el proceso no debe secarse la columna

Fase mvil a b

b Esquema de separacin de dos componentes por Cromatografa en Columna

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Para que la separacin de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad de migracin a lo largo de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna adecuada. Algunos adsorbentes comnmente utilizados son: slica gel, almina, sacarosa y almidn. La slica gel es la ms utilizada para separar compuestos neutros o con pocos grupos polares.
H Si O Si O O O Si O Si O O Si O O H O Si O H H O R O Enlaces de hidrgeno R

Slica gel

La almina se usa con ms frecuencia para la separacin de bases y la celulosa para la separacin de molculas polares, tales como los aminocidos, los carbohidratos y otros compuestos naturales hidroflicos. La fase mvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes, seleccionado (s) en base a su polaridad con el fin de optimizar la separacin de los componentes de la muestra en la columna. De forma orientativa se puede establecer el siguiente orden de polaridades para los disolventes ms utilizados: ter de petrleo < tetracloruro de carbono < ciclohexano < ter etlico < acetona < benceno < acetato de etilo < cloroformo < etanol < metanol < agua < piridina < cido actico Cromatografa de adsorcin en capa fina (TLC) En la cromatografa en capa fina la fase estacionaria se deposita formando una capa delgada sobre un material de soporte, como placas de vidrio o aluminio. La fase mvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad, producindose la separacin de los componentes de la muestra con base a su diferente distribucin entre la fase mvil y la fase estacionaria. En lo que se refiere a la composicin de la fase mvil y la fase estacionaria, las consideraciones que se han hecho para la cromatografa en columna son
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tambin aplicables a la cromatografa en capa fina. As mismo, el campo de aplicacin de ambas tcnicas es muy similar, de hecho, una de las principales aplicaciones de la TLC es seleccionar las condiciones ptimas para llevar a cabo una CC. Algunas de las ventajas que presenta esta tcnica son su bajo costo, su rapidez y su sensibilidad. En la Figura se muestra de forma esquemtica un proceso cromatogrfico en capa fina. La altura mxima que alcanza el disolvente en la placa recibe el nombre de frente de disolvente, y se utiliza como referencia para calcular las distancias relativas recorridas por los componentes de la mezcla en el cromatograma.

Se denomina factor de retardo (Rf) a la relacin existente entre la distancia recorrida por un compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo:
Rf = distancia recorrida por el compuesto distancia recorrida por el disolvente RfA = dA dD y RfB = dB dD

Este factor depende tanto de las condiciones experimentales (temperatura, grado de saturacin de la cmara de desarrollo, cantidad de muestra, etc.) como de la composicin de la fase mvil y de la fase estacionaria, pero es una constante fsica (al igual que el punto de fusin) de cada especie qumica. Por este motivo, para un sistema cromatogrfico dado (condiciones experimentales/fase estacionaria/fase mvil), el valor de Rf de un compuesto determinado es constante, permitiendo la identificacin de especies.

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Materiales: 2 Placas cromatogrficas 2 Cmaras 1 columna Slica gel 2 Capilares Cmara de yodo Soporte universal 2 pinzas y 2 nueces Erlenmeyer Beaker

Sustancias: Mezcla de cido glico-resorcinol-naftol Muestras problema: solucin de cido glico, resorcinol y -naftol Hexano Acetato de etilo Solucin de hidrxido de sodio al 5 % Extracto vegetal o tinta

Seccin experimental Cromatografa de adsorcin en capa fina 1. Tome dos placas cromatogrficas* y siembre en una placa utilizando un capilar (ver figura), una mezcla que contenga los siguientes solutos: cido glico, resorcinol y -naftol. Siembre al lado de la anterior una muestra desconocida que contenga uno de los compuestos anteriores.
COOH

OH OH

OH B-naftol

HO OH

OH

Resorcinol

Acido glico

Sembrado de la muestra

Las placas cromatogrficas pueden prepararse sumergiendo una placa de vidrio en una suspensin de slica gel en hexano y dejando secar a temperatura ambiente.

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2. Introduzca esta placa en una cmara que contenga una mezcla hexano-acetato de etilo en proporcin 8:2, procurando que los solutos NO estn en contacto con el solvente. 3. Repita el paso 2 en una segunda placa y colquela dentro de una mezcla de hexano-acetato de etilo en proporcin 6:4 4. Despus de que el eluente haya ascendido hasta un poco antes de la parte superior de cada una de las placas, retirlas, marque hasta donde subi el solvente y colquelas dentro de una cmara de yodo. Observe las manchas que aparecen en cada una de las placas. 5. Compare las manchas de los compuestos patrones con los compuestos orgnicos desconocidos. 6. Escoja la placa donde se obtiene mejor separacin e identifique cada uno de los compuestos separados y determine su Rf. 7. Relacione la polaridad de los compuestos orgnicos separados con la de los solventes utilizados en la fase mvil 10. Haga una relacin entre la polaridad de los compuestos y el Rf. Cromatografa de adsorcin en columna En el laboratorio se montar una cromatografa sobre columna, a manera de demostracin. Observe cuantos componentes se separan y los detalles del montaje.

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Preguntas 1. Qu tipos de cromatografa se utilizan segn la fase estacionaria? 2. Para qu se utiliza la cromatografa y en que se diferencia de la electroforesis? 3. En qu campos es ms til la cromatografa sobre papel? 4. Mencione cinco solventes que se utilicen en TLC 5. Se podr utilizar agua como solvente en TLC? Explique. 6. Si se tiene como eluente hexano-ter 1:1 y necesita aumentar la polaridad de ste, Cul de los dos componentes necesita aumentar? por qu? 7. A un eluente benceno-cloroformo 1:1 se requiere disminuir la polaridad, Cul de los dos componentes aumentara? por qu? 8. Por qu razn en una cromatografa sobre columna es necesario eliminar las burbujas de aire? 9. En que se diferencian los trminos adsorcin y absorcin? 10. Por qu razn se debe hacer la TLC previo a la cromatografa sobre columna?

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