Tema: glucogenolisis Laboratorio: 06

I Introduccin Nuestro organismo obtiene energa a partir de la glucosa, que puede ser almacenada en el hgado y en los msculos, en forma de glucgeno. Por lo tanto el glucgeno, constituye la principal fuente de energa para los msculos. El glucgeno es un polisacrido de reserva energtica de los animales, formado por cadenas ramificadas de glucosa. Est formado por varias cadenas cortas (12 a 18 unidades) de glucosa. Los enlaces presentes en el glucgeno son del tipo glucosidico cada intervalo de entre 8 y 10 residuos enlazados de esta forma. El hgado, capta y almacena glucosa transformndola en glucgeno, proceso conocido como glucognesis. En esta prctica determinaremos cuantitativamente el glucgeno en un corte de hgado y la glucosa en el filtrado obtenido de este mismo, luego de incubarlo. De esta manera cuando se coloca un trozo de hgado en un medio salino, sin sustratos, va a predominar la glucogenolisis, es decir, la despolimerizacin del glucgeno.

II Objetivos

 estudiar el proceso metablico de la glucogenolisis en el hgado y la cuantificacin del glucgeno y la glucosa liberada, para determinar su relacin con la temperatura y con el tiempo.

III marco terico

Glucogenolisis La glucogenlisis es un proceso catablico llevado a cabo en el citosol que consiste en la remocin de un monmero de glucosa de un glucgeno mediante fosforlisis para producir glucosa 1 fosfato, que despus se convertir en glucosa 6 fosfato, el segundo paso de la gluclisis. Es antagnica de la glucognesis. Estimulada por el glucagn en el hgado, epinefrina (adrenalina) en el msculo e inhibida por la insulina. Es un proceso que requiere un grupo especfico de enzimas citosolticas: la glucgeno fosforilasa que segmenta secuencialmente los enlaces glucosdicos, la fosfoglucomutasa que convierte la G1P en G6P la cual puede hidrolizarse a glucosa (en hgado) o seguir la va glucoltica (hgado y msculo) y por ltimo la Glucosil Transferasa (14) y la amilo1,6-glucosidasa, que se encarga de hidrolizar las ramificaciones. Su deficiencia produce la Enfermedad de Cori y la Enfermedad de Pompe La regulacin de la glucogenlisis La glucgeno fosforilasa es, de entre los varios enzimas que participan en el Catabolismo del glucgeno, el enzima que ms eficazmente regula la Glucogenolisis.

La regulacin de la glucgeno fosforilasa heptica y la muscular es diferente La regulacin de la glucogenolisis puede tener lugar por tres vas diferentes: Interconversin enzimtica de la glucgeno fosforilasa (mecanismo dependiente de CAMP; hgado) Activacin del enzima por mecanismos dependiente de Ca2+ (msculo e hgado) Activacin alostrica (AMP) Dado que el destino metablico del glucgeno es diferente, la glucogenolisis est regulada por seales hormonales diferentes en cada tejido (glucagn en el hgado y -adrenrgicos en el msculo). El glucagn se produce en respuesta a niveles bajos de glucosa. La epinefrina es parte de la respuesta, de alerta del individuo ante el peligro.

Regulacin de la glucogenolisis (I) La glucgeno fosforilasa (hgado y msculo) existe bajo dos formas: "a" es una forma activa del enzima, fosforilada, cuya actividad es poco sensible a reguladores alostricos. La de msculo es sensible a glucosa "b" es una forma defosforilada del enzima que es mucho menos activa, pero que puede ser activada por efectores alostricos (ms en msculo que en hgado).

Regulacin de la glucogenolisis (II) En el hgado y msculo, la glucgeno fosforilasa es fosforilizada, y activada, por la fosforilasa quinasa Este enzima existe tambin bajo dos formas, una fosforilizada que es activa y otra no fosforilizada que es mucho menos activa En hgado, la fosforilizacin y activacin del enzima escatalizada por la protena quinasa A, dependiente de CAMP GLUCOGENOLISIS

El cAMP es un mensajero intracelular que es sintetizado por la adenilato ciclasa, a partir de ATP, y rpidamente degradado por la 3-5 fosfodiesterasa

Regulacin de la glucogenolisis en el msculo tiene ciertas singularidades: La glucgeno fosforilasa de msculo, adems de su interconversin y activacin por fosforilizacin, es tambin regulable alostricamente por glucosa, AMP, ATP, y G6P. Glucosa es un efector alostrico negativo de la forma a (fosforilizada, activa) heptica. AMP, que aumenta cuando los niveles de ATP son bajos, activa la forma b (no fosforilizada) del enzima. ATP y glucosa-6-fosfato, poseen sitios de unin que se solapan con los de AMP, e inhiben la forma b de la fosforilasa activada por AMP La degradacin del glucgeno se inhibe cuando existe suficiente ATP y glucosa-6fosfato.

Los mecanismos de desactivacin de la glucogenolisis: Los mecanismos descritos explican cmo tras una seal apropiada, se pone en marcha la glucogenolisis pudiendo dar la impresin de que una vez activada no cesara hasta haber degradado totalmente el glucgeno. Sin embargo existen en la clula toda una serie de mecanismos de desactivacin que garantizan que la glucogenolisis solo estar activa si existe un estmulo continuado para que as sea. En cuanto cesa ese estmulo, cesa poco despus la degradacin del glucgeno.

Los mecanismos de inactivacin actan a varios niveles: 1. Disminucin de los niveles de cAMP Inactivacin de la adenilato ciclasa por separacin de G-GTP a G-GDP y su separacin del enzima Hidrlisis del cAMP por la fosfodiesterasa Inactivacin de la Protena quinasa A 2. Disminucin del Ca2+ intracelular por bombeo a los correspondientes reservorios 3. Defosforilizacin de la glucgeno fosforilasa y la fosforilasa quinasa por una fosfoproten-fosfatasa que se inactiva por efecto del glucagn y protena quinasas

Glucogenolisis en la amilasa La glucogenlisis aumenta en el msculo varios cientos de veces inmediatamente despus del comienzo de la contraccin. Esto comprende la activacin rpida de la fosforilasa causada por la activacin rpida de la fosforilasa cinasa por el calcio, la misma seal que inicia la contraccin. La fosforilasa cinasa muscular tiene cuatro tipos de subunidades: alfa, beta gamma y delta, en una estructura representada como (alfa-beta gamma-delta). Las subunidades alfa y beta contienen residuos de serina que son fosforilados por la proteincinasa dependiente de AMPc. La subunidad beta fija 4 iones calcio y es idntica a la protena fijadora de calcio, calmodulina. La fijacin del calcio activa el sitio cataltico de la subunidad gamma en tanto que la molcula permanece en la configuracin b desfosforilada. Sin embargo, la forma a fosforilada slo es activada en forma total en presencia de calcio. En un hecho significativo que la calmodulina sea anloga en estructura a la TpC, la protena fijadora de calcio en el msculo. Una segunda molcula de calmodulina o de TpC puede interactuar con la fosforilasa cinasa, aumentando la activacin. Por lo tanto la activacin de la contraccin muscular y de la glucogenlisis son realizadas por la misma protena fijadora de calcio, que asegura su sincronizacin (9).

Las enzimas que participan en la glucogenlisis son: a) Fosforilasa: Es la enzima ms importante para el desdoblamiento del glucgeno. Rompe el enlace 1,4 de la unidad de glucosilo del extremo de una rama o cadena de glucgeno, y cataliza simultneamente la transferencia del glucosilo liberado a un fosfato inorgnico. De esta manera, la fosforilasa puede desdoblar casi la tercera parte de la molcula de glucgeno en glucosa 1-fosfato. Lo que queda de la molcula de glucgeno despus de que la fosforilasa ha ejercido su efecto mximo se llama "dextrina lmite". La fosforilasa heptica se activa por transfosforilacin (del ATP), debida a la enzima cinasa de desfosfofosforilasa, en presencia de magnesio. Esta activacin es acelerada varias veces por el monofosfato cclico de adenosina (AMP, o fosfato de 3,5-ribosaadenina cclica). El AMP se forma a partir del ATP por efecto de la enzima ciclasa de adenilo, que se encuentra en las membranas celulares. El glucgon y la adrenalina triplican la formacin de AMP, por lo tanto, activan as la fosforilasa heptica, lo que explica su potente efecto glucogenoltico.

b) Fosforilasa del Msculo: Esta enzima difiere de la fosforilasa heptica por varias razones, principalmente porque existe en dos formas, las variedades a y b. La fosforilasa a del msculo (P.M. 495 000) es un dmero de b, y contiene cuatro unidades de fosfato de piridoxal por molcula, en tanto que la variedad b slo contiene dos.

Las dos variedades presentan transformaciones mutuas. En el msculo en reposo predomina ampliamente la fosforilasa b; se activa y convierte en fosforilasa a por efecto de la cinasa de fosforilasa b, activada a su vez por el AMP cclico. Puesto que la adrenalina (pero no el glucgon) aumenta considerablemente la formacin de la AMP cclico en el msculo, esta hormona aumenta la actividad de las fosforilasas del msculo e hgado, mientras que la accin del glucgon slo se ejerce sobre el hgado. En reposo, el AMP cclico del msculo no basta para activar la fosforilasa, pero el ejercicio muscular y la anaerobiosis probablemente aumentan localmente la concentracin del adenilato cclico.

c) Enzima de desramificacin (glucosidasa de 1,6 amilo): Puesto que la fosforilasa slo ataca los enlaces 1,4 glucosdicos, deja de actuar cuando llega a un punto de ramificacin. Cori y Larner (1951) dedujeron que la fosforlisis de las principales cadenas externas se detiene a varias unidades glucoslicas de distancia de un punto de ramificacin; pero en el caso de las ramas laterales, prosigue hasta que slo queda la unidad de glucosilo fijada por el enlace 1,6. La molcula de glucgeno "deshojada" o podada por la fosforilasa se llama "dextrina lmite". En este punto, la enzima de desramificacin ataca el enlace 1,6 en cuestin, liberando unas molculas de glucosa por cada punto de ramificacin, lo que permite que vuelva a actuar la fosforilasa. En teora cuando menos, estas intervenciones sucesivas de fosforilasa y enzima de desramificacin pueden llevar el glucgeno al estado de cadena basal solamente, lo que se podra llamar el tronco; se puede producir as de 92 a 93% de glucosa 1-.fosfato y de 7 a 8% de glucosa libre.

d) Glucotranferasa de oligo 1,4 --------1,4: Walker y Whelan ya sospechaban la presencia de esta enzima como contaminante en los preparados de glucosidasa de 1-6 amilo. En diversos anlisis efectuados se obtuvieron resultados que hasta la fecha sugieren que la accin de la fosforilasa sobre las cadenas terminales se detiene a cuatro unidades de glucosilo de distancia de un punto de ramificacin. En esta etapa (dextrina lmite), la mayor parte de las cadenas externas "desprendidas" de la molcula parecen formadas por cuatro unidades alfa- 1,4-glucosilo, a partir de un punto de ramificacin. Se cree que la glucotransferasa de oligo- 1,4 --------1,4, pasa tres de estas unidades al extremo de otra cadena; por consiguiente, la fosforilasa puede volver a actuar sobre la cadena, ya ms larga, y la enzima de desramificacin puede atacar el enlace 1,6 en el punto de ramificacin.

e)Alfa amilasas: Olivarra y Torres (1962) demostraron que el alfa-amilasa del hgado poda atacar el glucgeno mediante: 1) Produccin de oligosacridos de cadena recta, como maltotriosa y maltotetrosa, a partir de las ramas externas del glucgeno, y 2) Liberacin de sacridos ramificados y de maltosa, desde el interior de la molcula. Existen varias maltasas

(glucosidasas alfa 1,4) para transformar estos productos en glucosa. Sin embargo, todava se ignora la importancia de la va alfa-amilasa-oligosacrido maltasa en el catabolismo del glucgeno.

f) Glucgeno de lisosomas: Los lisosomas poseen un conjunto de enzimas capaces de hidrolizar prcticamente cualquier componente del citoplasma que contienen entre otras, fosfatasa cida, RNA asa, DNA asa, catepsina, beta-glucoronidasa, sulfatasa de arilo, beta-Nacetilglucosaminidasa, beta-galactosidasa y alfa-1,4(glucosidasa). La funcin de esta ltima enzima en el metabolismo celular normal no se conoce todava, pero la falta de maltasa cida de lisosomas en la enfermedad de Pompe tiene como consecuencia el almacenamiento de glucgeno en acmulos limitados por membranas (lisosomas).

Cascada amplificadora de la degradacin del glucgeno, estimulada por adrenalina: Este proceso se inicia cuando la adrenalina estimula la degradacin del glucgeno en el hgado para convertirse a glucosa, originando una serie de reacciones de amplificacin (cascada amplificadora), con lo cual se eleva la concentracin de glucosa sangunea. El mecanismo se lleva a cabo como sigue:

EFECTO DE TEMPERATURA Y PH EN LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LA AMILASA La amilasa, denominada tambin ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de diastasa. En pocas palabras, en biologa es una enzima presente en la saliva, que hidroliza el almidn de todo alimento.

Clasificacin -Amilasa (Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa) Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2 -Amilasa (Nombres alternativos: 1,4--D-glucano-maltohidrolasa; amilasa sacarognica) Otra forma de amilasa, la -amilasa es tambin sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Acta desde el extremo no reductor de la cadena, catalizando la hidrlisis del segundo enlace -1,4, rompiendo dos unidades de glucosa (maltosa) a la vez. Durante el proceso de maduracin de la fruta la -amilasa rompe el almidn en azcar dando lugar al sabor dulce de la fruta. La amilasa presente en el grano de cereal es la responsable de la produccin de malta. Muchos microorganismos tambin producen amilasa para degradar el almidn extracelular. Los tejidos animales no contienen -amilasa, aunque puede estar presente en microorganismos saprfitos del tracto gastrointestinal. Tiene un pH ptimo de 12. -Amilasa (Nombres alternativos: Glucano 1,4--glucosidasa; aminoglucosidasa; Exo-1,4-glucosidasa; glucoamilasa; -glucosidasa lisosmica; 1,4--D-glucano glucohidrolasa) Adems de romper el ltimo enlace (1-4)glucosdico en el extremo no reductor de la cadena de amilasa y amilopectina, liberando glucosa, la -amilasa puede romper los

enlaces glucosdicos (1-6). A diferencia de las otras amilasas esta forma es ms eficaz en medios cidos y su pH ptimo es de 3. Tambin colabora en el momento de la excitacin.

Usos Sirve en el diagnstico de enfermedades determinando sus niveles en plasma para saber si se puede producir una pancreatitis. Sus niveles pueden estar elevados por un dao a las clulas productoras de la enzima en el pncreas, o bien, por una deficiencia renal (excrecin reducida) o tambin por paperas. Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricacin de pan para romper azcares complejos como el almidn (presente en la harina) en azcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azcares simples y convertirlos en productos de fermentacin alcohlica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las clulas de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidn. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentacin (especialmente para determinadas masas). Las tcnicas modernas de elaboracin de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos. Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales. En la maduracin de frutas la amilasa es sintetizada en la maduracin, degradando el almidn de las frutas en azcar, y volvindolas ms dulce

IV Materiales Materiales y reactivos: 3.1Muestra Hgado de res licuado.

Almidn

agua

3.2 Materiales: Vasos de precipitado

pH metro

olla

matraz

lugol

3.3 Equipos: balanza analtica

V Parte experimental: 1.- se midi el pH a la muestra (hgado licuado) obteniendo como resultado un pH igual a 5.

2.- Se adiciono 5 ml de extracto de hgado a un tubo de ensayo y luego se le adiciona 3 gotas de lugol y se comprob que la reaccin fue negativa ya que no hubo cambio de color.

3.- Se pesa 10 gr de almidn y 1 gr de cloruro de sodio.

4.- Se llena 10 ml de agua en un vaso precipitado.

5.- La muestra de almidn cloruro de sodio se adiciono en los 10 ml de agua.

6.- Se adiciona la solucin de almidn y cloruro de sodio a los 125ml de hgado licuado y luego se mide el pH cuyo valor fue 6.

8.- La nueva solucin (almidn + NaCl+ hgado licuado) se le adiciona en 4 tubos de ensayo utilizando un tubo de control que contiene 5 ml de agua.

9.- Los tubos de ensayos fueron puestos a bao Mara a 37 para luego hacer la prueba de lugol y observar.

10.- Cada 2s se iba retirando un tubo de ensayo para luego adicionarle 3 gotas de lugol, en nuestra experiencia el segundo tubo fue donde se pudo observa el cambio de color mostrndose de color blanco evidenciando presencia de glucosa.

VI Discusin El resultado para la obtencin de glucgeno a partir de hgado de res fue positiva, as como la prueba testigo, ya que ambas mostraron el color que el lugol debe marcar cuando es negativa en polisacridos: un color blanco. Los resultados arrojados por los dems tubos de prueba muestran que obtuvieron pequeas cantidades de glucgeno, y en ocasiones hasta la muestra testigo daba negativa siendo que esta era glucgeno al 1%; las respuestas de esta problemtica creo que se deben al control que se tuvo ese da en el laboratorio por situaciones externas ya que, el manejo del recipiente que contena al glucgeno pudo ser contaminado, ya que este era pipeteado con la boca; entre otros factores externos del medio ambiente que pudieron haber influido. Con respecto a la muestra, por lo cual no se obtuvieron los resultados deseados, esto se debe a que el animal pudo a ver sido sacrificado con muchos das de anticipacin, lo que llevo a la prdida del glucgeno, ya que para que la prueba de positiva debe ser sacrificado el animal al momento de la prctica.

VII Conclusiones Se determino la presencia de glucosa, derivado de la reaccin del glucgeno heptico y la enzima glucgeno fosforilaza en una muestra de hgado licuado.

Se conoci el proceso de glucogenolisis mediante el cual el glucgeno es catalizado por la enzima glucgeno fosforilaza hasta la obtencin de glucosa.

Se llego a determinar la presencia de glucosa derivado de la glucogenolisis, en los tubos de ensayo mediante la prueba de lugol dando positivo solo para un tubo de cuatro, el color blanco que apareci en el tubo, efectivamente nos demuestra la presencia de glucosa en la muestra de hgado licuado.

VIII Recomendaciones No excederse en el tiempo ni en el aumento de la temperatura de incubado de la muestra que fue de 37C, ya que esto podra provocar una desnaturalizacin de la enzima glucgeno fosforilaza.

Lo ideal para este tipo de anlisis cualitativo es medir el pH del extracto enzimtico con un potencimetro (pH-metro) y no con una cinta de pH.

IX Bibliografa Alemany M, Font S (1983): Prcticas de Bioqumica, 1 ed. Editorial Alhambra (Madrid, Espaa), pp 99-107. Clark JM (1966): Bioqumica Experimental, 1 ed. Editorial Acribia (Zaragoza, Espaa), pp 40-42.