Aula Prática sobre

Enzimas de Restrição

Carlos André de Castro Herklotz

28/10/2003
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Índice

Índice ...................................................................................................................................... 2
Introdução............................................................................................................................... 3
História ............................................................................................................................... 3
Tipos de Sistemas de Restrição/Modificação..................................................................... 3
Nomenclatura...................................................................................................................... 4
Sítios de reconhecimento.................................................................................................... 4
Tipos de Extremidades Geradas por Digestão por Enzima de restrição............................. 5
Tipos de amostras de DNA................................................................................................. 5
DNA de Plasmídeo ......................................................................................................... 6
Produtos de PCR............................................................................................................. 6
DNA Genômico.............................................................................................................. 6
Metodologia............................................................................................................................ 7
Objetivos............................................................................................................................. 7
Materiais utilizados............................................................................................................. 7
Enzimas .......................................................................................................................... 7
Amostra de DNA ............................................................................................................ 7
Marcador de Peso Molecular.......................................................................................... 7
Protocolo da Digestão por Enzima de Restrição ................................................................ 8
Enzima BamHI ............................................................................................................... 8
Enzima Csp6I ................................................................................................................. 8
Protocolo da Eltroforese em Gel de Agarose ..................................................................... 8
Resultados Esperados ......................................................................................................... 9
BamHI ............................................................................................................................ 9
Csp6I............................................................................................................................... 9
Referências Bibliográficas...................................................................................................... 9
Apêndice 1............................................................................................................................ 10
Sítios de restrição do pTZ57R .......................................................................................... 10
Apêndice 2............................................................................................................................ 15
Esquema de Aplicação de Amostras ................................................................................ 15

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Introdução

História

Enzimas de restrição também conhecidas como endonucleases de restrição, são

responsáveis pelo fenômeno nas bactérias conhecido como restrição/modificação
controlada pelo hospedeiro. Os bacteriófagos utilizam a maquinária das bactérias para
replicar o seu genômas. Após a multiplicação de várias centenas de cópias ocorre a morte
da bactérias e a liberação de novas cópias de vírus bacteriófagos.
No começo dos anos 50, Luria et al obeservou que bacteriófagos que infectavam
facilmente uma determinada linhagem de bactéria, falhavam em se replicar em outra
linhagem diferente. Ou seja, a replicação do fago estaria restrita a determinada linhagem de
bactérias (1).
Em 1962 Arber and Dussuoix, propuseram um mecanismo molecular para a o
fenômeno da “restrição” (2,3). Foi postulado que certas linhagens de bactérias conteriam
endonucleases capazes clivar o DNA invasor desprotegido, e metilases capazes de proteger
o seu próprio DNA. Estas atividades enzimáticas nuclease/metilação seriam chamadas de
sistema restrição e metilação.
Em 1968 enzimas EcoB and EcoK foram isoladas e classificadas com enzimas de
restrição/modificação tipo I, contendo sítios de nuclease e metilação na mesma enzima
(4,5) . Dois anos depois, Smith and Wilcox (6,7) isolaram e classificarm a primeira enzima
endonuclease de restrição, a HindII, que clivava o DNA em fragmentos bem definidos,
atuando seqüencia-especificamente e não apresentava atividade de metilação. A mesma
enzima foi utilizada por Daniel Nathans para cortar o DNA circular de virus SV40 em 11
fragmentos específicos originando o primeiro mapa de restrição (8)

Tipos de Sistemas de Restrição/Modificação

Os sitemas RM ficaram subdivididos em, tipo I, II e III. Embora a maioria das

endonuclease de restrição caracterizas pertençam ao tipo II (9,10), cada vez mais surgem
enzimas que não podem ser classificadas em nenhum dos três tipos. Novos tipos vem sendo
criados para classificar novas enzimas como tipo IIs, tipo IV, BCG e tipo 1 ½ (12, 13).
Os sistemas RM do tipo II são os mais simples e melhor estudados, compostos por
enzimas de restrição e metilação separadas. As enzimas de restrição requerem apenas o íon
de Mg++ como cofator e clivam o DNA dentro do sítio de reconhecimento deixando
extremidades 5-P e 3-OH. As metilases correspondentes requerem a S-adenosilmetionina
como cofator e adicionam grupos metil nas duas fitas de DNA resultando em N6-
Metiladenina, 5-metilcitosina, ou N4- metilcitosina (14,15).

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Nomenclatura

A descoberta de um vasto número de enzimas de restrição levou à criação de uma

nomenclatura uniforme inicialmente proposta por Smith and Natans (11). A espécie da
bactéria determina o gênero a primeira letra e o genero as duas próximas letras. Ex. Uma
Enzima estraída de Escherichia coli começa com o nome Eco. A linhagem da bactéria viria
logo em seguida em letra maiúscula e sem o caracter itálico. Ex EcoR. Se a linhagem
apresentar mais de uma enzima de restrição adiciona-se uma numeração em agarismos
romanos. Ex. EcoRI, EcoRV.

Sítios de reconhecimento

Enzimas de restrição reconhecem sítos específicos de diferentes tamanhos e

composição de bases. Tipicamente as enzimas de restrição dos sistemas tipo II reconhecem
palíndromes perfeitos de 4,5,6,7, e 8 bases, com um eixo rotacional perfeito ex. O sítio de
restrição da EcoRI é GAATTC, cuja seqüência complementar é CTTAAG Figura 1

G^AATT C G5-P OH-3AATTC

C TTAA^G CTTAA 3-OH P-5G
a) Antes da ação da Enzima b) Extremidades após o corte

Figura 1. Esquema de Corte da Enzima EcoRI

As seqüências palindrômicas podem ser interrompidas por séries de 1 a 9

nucleotídeos inespecificos. Veja o exemplo do sítio de reconhecimento da enzima SfI
GGCNNNNNGGCC, aonde N pode ser qualquer base. Algumas enzimas de restrição
reconhecem sítios que toleram ambigüidade no palíndrome. Ex: A enzima AccI reconhece
o sítio GTMKAC, nq qual o M pode ser A ou C, independentemente o K poder ser G ou T.
Outras enzimas do tipo IIS reconhecem seqüências diferentes dos palindromes Ex.
MboII CAAGA e corta 8 base 3’ a frente na fita de reconhecimento e 7 bases na direção 5’
da fita de baixo.
A Maioria das enzimas não corta DNA metilado em uma ou duas fitas, embora
algumas enzimas requeiram DNA metilado para sua atividade.
O numero e a freqüência de ocorrência dos sítios de restrição depende do tamanho
dos sítios. Assumindo uma proporçãso de 50% G+C, um sítio de 4 bases deveria ocorrer a
cada 44= 256 bases, um sítio com 6 base, a cada 46 = 4096 bases, de 8 bases a cada 48 =
65536 bases.
Sendo assim, para aplicação de “ fingerprinting ” o DNA seria digerido em vários
fragmentos por uma enzima de 4 bases, como a HaeIII. Para clonagem em regiões de sítios
únicos nos plasmídeos (polylinkers) utiliza-se as enzimas de 6 bases. Para Clonagem de
fragmentos genômicos o mapeamento cromossômico utiliza-se as enzimas de 8 bases. É
muito importante salientar que o mesmo sítio pode ser cortado mais de uma enzima de
restrição.

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Chama-se protótipo a primeira enzima descrita que reconhece um determinado sítio,

e de isoeschizômero as outras enzimas descritas postertiormente que possuem afinidade
pelo mesmo sítio, ou sequência de pares de base. Isoeschizômeros podem ser isolados de
microorganismos completamente distintos filogenéticamente, determinando condições
ideais de reação completamente distintas em relação ao protótipo, como composição do
tampão ou até mesmo temperatura. Finalmente deve ter em mente que embora o
isoeschizômero possa reconhecer as mesma região de DNA, seu corte pode ser diferente.
Ou seja um protótipo pode deixar as extremidades coesivas enquanto os o isoeschizêomero
pode dixars as extremidade “cegas” (ver próxima seção tipos de extremidade)

Tipos de Extremidades Geradas por Digestão por Enzima de

restrição

O corte de DNA por enzimas de restrição pode gerar diferentes tipos de

extremidades. Usualmente estas contém extremidades 5’ fosfato e 3’ hidroxila. Entretanto a
enzima NciI gera extremidades 3’fosfato e 5’hiroxila. Enzimas de restrição que reconhecem
palíndromes tipicamente cortam dentro do sítio, deixando extremidades simples fita 3’, 5’
ou nenhuma extremidade siples fita, ou corte cego “blunt end”.
Enzimas de restrição que não atuam sobre sequências palindrômicas, geralmente
cortam o DNA um número definido de bases distantes dos sítios produzindo extremidades
5’ou 3’ simples fita. As extremidades simples fita 5’ou 3’ podem ser “aneladas”e “ligadas”
com extremidades compatíveis. Estas extremidades são tipicamente compostas por 2 ou 4
bases, embora 1 ou 3 bases também possarm ocorrer.
Geralmente, fragmentos longos, com alto conteúdo GC apresentam maior
eficiências de ligação. Extremidades 5’ou 3’simples fita podem ser transformadas
enzimaticamente em corte cego. Enzimas do tipo II s geram extremidades ambíguas que
podem ser difíceis de ligar.

Tipos de amostras de DNA

Os substratos de DNA mais comuns são DNA de plasmídeo, Genômico e de Fago λ.

Plasmídeos intactos são vetores circulares de 3-10Kb. O DNA de fago λ é linear e tem um
tamanho aproximado de 48kb. O DNA genômico também é linear, e de alto peso
molecular, mais de 1000. vezes maior do que o DNA plasmidial.
O padrão da indústria para determinação da atividade de enzima de restrição é o
DNA de Fago λ. Ficou convencionado a unidade de enzima seria a quantidade necessária
para digerir completamente 1ug de Fagoλ a 37ûC por uma hora. Como cada tipo de DNA
apresenta suas particularidades e em um ou mais aspectos difere do padrão de Fago λ,
alguns cuidados devem ser tomados para cada tipo de amostra de DNA.

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DNA de Plasmídeo

O DNA de plasmídeo, por ser circular, apresenta estruturas de conformação que

dificultam a interação com a Enzima. Sendo assim este tipo de amostra requer mais
unidades de enzima para a disgestão completa. Outra característica importante é o padrão
de mobildade eletroforética que também é influenciado pela variação na conformação.
Utiliza-se a digestão de DNA de plasmídeo, ou vetores de clonagem, para inserção
de fragmentos exógenos de DNA em sítios únicos. Esta condição de sítios únicos ocasiona
uma grande diferença na proporção de sítios por massa (µg) em relação ao padrão fago λ,
que deve ser levada em consideração no planejamento da reação com enzimas de restrição.

Produtos de PCR

Em experimentos com DNA amplificado, a digestão com enzima de restrição ocorre

diretamente na mistura de PCR, sem procedimentos caros e demorados de purificação do
produto e PCR. A maioria das enzimas possui atividade de mais de 20% nos tampões da
reação de PCR, algumas requerem adição de seu tampão específico e apenas 8 enzimas não
digerem produtos de PCR.
Os produtos de PCR podem ser digeridos na região amplificada, ou na região dos
primers. No primeiro caso utiliza-se a amplificação antes da digestão para aumentar a
massa de DNA específico em relação a amostra original. O excesso molar de sítios devem
ser conisiderado também neste caso também.
No segundo caso, utiliza-se o a digestão na região do primer para depois clonar este
fragmento em um vetor digerido com a mesma enzima de restrição. Ou seja neste caso
ocorre a disgestão perto da extremidade do produto de PCR. A eficiência da digestão de
produtos de PCR varia em função da enzima e da distância em pares de base do sítio de
clivagem à extremidade do fragmento. Existem enzimas que apresentam 100% de atividade
quando o sítio de clivagem está a apenas 1 base da extremidade e outras que não digerem
produtos mesmo que o sítio esteja há 20 pares de base da extremidade.
É importante salientar que para clonagem é recomendável purificar o produto de
PCR para evitar que a Taq DNA polymerase altere as extremidades coesivas.

DNA Genômico

Alguma particularidades não comuns a outros tipos de DNA devem ser

consideradas em procedimentos e de disgestão e DNA genômico. Estas são a metilação, a
escala a digestão, a abundância de sítios, a qualidade da enzima e os contaminantes. Os
métodos de purificação de DNA genômico geralmente apresentam mais impurezas que o de
DNA plasmidial. Os melhores resultados são obtidos quanda a amostra apresenta uma
relação de Absorbância A260/A280 superior a 1,8.
O reagente espermidina pode ser adicionado na concentração final de 1mM para
resolver problemas de baixa qualidade da amostra. A albumina de soro bovino, BSA, pode

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também ser adicionada com ou sem espermidina. A BSA apresenta a propriedade de

estabilizar a enzima e se ligar a impurezas da amostra.

Metodologia

Objetivos

O objetivo desta aula prática é a realização de uma digestão de um DNA plasmídial

com duas enzimas de restrição diferentes, e análise por eletroforese em gel de agarose,
corada com brometo de etídeo, transiluminada por uma luz ultravioleta. O tamanho dos
fragmentos deve ser estimado com o auxílio de um padrão de peso molecular. Os resultados
serão comparados com o mapa de restrição do vetor utilizado.

Materiais utilizados
Enzimas

Serão utilizadas as enzimas Csp6I, e BamHI, gentilmente cedidas pela Fermentas

Life Sciences Inc. Ambas as enzimas na concentração de 10 unidades por microlitro em
tampão 10mM Tris-HCl pH 7,5, 100mM KCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 0,2mg/ml BSA e
50% Glicerol.

Amostra de DNA

Vamos utilizar um vetor de clonagem derivado da inserção da região intergênica do

fago F1 no plasmídeo pUC19 e da região promotora do virus T7 perto da região do
polilinker o pUC19, gerando o pTZ19R, que com algumas modificações se torna o pT57R,
gentilmente cedido pela Fermentas Life Sciences Inc., na concentração de 100ng/µl e
2886 bp. Veja a tabela com os mapas de restrição do vetor pTZ57R no Apêndice 1.

Marcador de Peso Molecular

Vamos utilizar o marcador de peso molecular Gene Ruler 1Kb Ladder ready to use,
gentilmente cedido pela Fermentas Life Sciences Inc., que apresenta os seguintes
tamanhos de fragmentos (bp): 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000,
1500, 1000, 750, 500, 250, na concentração de 0,5µg/µl, em tampão 10mM Tris-HCl (pH
7,6), 10mM EDTA, 0,015% Azul de Bromofenol , 0,015% xileno cyanol FF e 10%
glicerol.

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O Marcador de peso molecular da Fermentas e fornecido com uma solução 6X

concentrada para corrida de amostras de DNA composta por 0,09% de azul de bromofenol,
0,09% de xileno cianol, 60% de glicerol, e 60mM de EDTA.

Protocolo da Digestão por Enzima de Restrição

Enzima BamHI

1.Adiciona-se a um tubo de 200µl:

19µl do Mix de reação que contém:
1µ do Vetor PTZ57R, 2µl do Tampão 10X BamHI+, 16µl de agua autoclavada
1µl da Enzima BamHI

2.Coloca-se em um banho seco à 37ûC por 1 hora

3.Adiciona-se à reação 4µl de solução 6X Loading Dye

4.Aplica-se todo o volume em um gel de agarose 1%

Enzima Csp6I

1.Adiciona-se a um tubo de 200µl:

19µl do Mix de reação que contém: 1µ do Vetor PTZ57R, 2µl do Tampão 10X B+, 16µl de
água autoclavada
1µl da Enzima BamHI

2.Coloca-se em um banho seco à 37ûC por 1 hora

3.Adiciona-se à reação 4µl de solução 6X Loading Dye

4.Aplica-se todo o volume em um gel de agarose 1%

Protocolo da Eltroforese em Gel de Agarose

1.Prepara-se adiciona-se 1g de Agarose à 100ml de TBE e leva-se ao forno microondas por

1min.

2.Adiciona-se 1µl de uma solução 2% de Brometo de Etídeo ao gel de agarose ainda

líquido

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3.Verte-se a o gel em um aparato de Eletroforese e deixa-se solidificar

4. Aplicam-se as amostras (20µl), e o marcador (5µl) por poço de acordo com a tabela do
Apêndice 2

5. Adiciona-se o tampão de corrida TBE.

6. Liga-se a fonte de força a 160V por 40 min

7. Retira-se o gel para visualização em um sistema de fotodocumentação UV 340nm

Resultados Esperados

BamHI

Como pode-se ver no apêndice 1, o vetor pTZ57R apresenta 1 sítio de restrição para
BamHI na posição 653. Como já dito na introdução o vetor circular de DNA apresenta uma
estrutura conformacional super espiralada, que migra mais rápidamente em um gel de
Eletroforese, dando a impressão de um banda de menor peso molecular. Com a digestão
completa do vetor, o vetor ficaria linear, sem a estrutura super espiralizada apresentando
uma banda única de 2886 bp.

Csp6I

Esta enzima apresenta 2 sítos de restrição no vetor pTZ57R, na posição 628 e 2448.
O resultado esperado seriam dois fragmentos um de 1820Kb e outro de 1066Kb.

Referências Bibliográficas
1. Roberts, R (1978) Nature 275, 689.
2. Arber, W and Dussoix, D. ( 1962) J. Mol. Biol.5, 18.
3. Dussoix, D. Arber, W. (1962) J. Mol. Biol 5, 37.
4. Linn. S. and Arber, S. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 1300.
5. Meselson, M. and Yuan, R. (1968) Nature 217, 1110.
6. Smith, H.O. and Wilcox, K. W. (1970) J. Mol. Biol 51, 379.
7. Kelly, T.J. Jr and Smith, H.O. (1970) J. Mol. Biol 51, 393
8. Dana, K. and Nathans, D. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2913.
9. Yuan R. (1981) Annu. Review Biochem. 50, 285.
10. Smith, H.O. (1979) Science 205, 455.

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11. Smith, H.O. and Nathans, D. (1973) J. Mol. Biol 81, 419.
12. Szybalski, W. et al., (1991) Gene 100, 13.
13. Janulaitis, A. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 6043.
14. Mclelland, M., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 169.
15. Janulaitis, A. et al. (1983) Feebs Lett. 161, 131.

Apêndice 1.

Sítios de restrição do pTZ57R

Número de sítios de reconhecimento

Enzima
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Acc65I 627
AdeI 230
AflIII 1076
AloI 279
Alw21I 621 1390 2551 2636
Alw26I 2036 2801
Alw44I 1390 2639
ApaI 661
BamHI 654
BceAI 189 606 1562
BcgI 2485
BcnI 658 659 1455 2151 2502
BfiI 583 2014
BfmI 9 672 699 1341 1532 2210
BfuI 1285 2812
BglI 464 2083
Bme1390I 573 658 659 815 1103 1224 1237 1455 2151 2502

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BsaAI 230
BsaWI 1282 1429 2260
BseDI 573 658 815 1236
BseGI 540 1949 2130 2417
BseLI 7 333 918 1092 1110 1276 1555
BseMI 2023 2205
BseMII 1351 1760 1926 2466
BseNI 316 584 610 876 1479 1492 1609 2015 2133 2176 2440 2615
BseSI 661 1390 2636
BseXI 50 473 546 900 981 999 1418 1483 1486 1692 2020 2386
Bsh1236I 3 27 47 423 634 922 924 1122 1703 2033 2526 2858
Bsh1285I 495 989 1413 2336 2485
BshNI 191 627 820 1917
Bsp68I 633
Bsp120I 661
Bsp143II 73 81 950 1320
BspLU11I 1076
BspPI 654 637655 1643 1717 1729 1814 1827 2291 2594 2612
BssSI 1249 2633
BtsI 863 2362 2390

CaiI 1487
CfrI 607 915 2357
Cfr9I 658
Cfr10I 127 2049
Cfr13I 238 505 661 662 2011 2090 2107 2329
Csp6I 628 2448
DdeI 1351 1760 1926 2466
DraI 1833 1852 2544
DrdI 273 1178
Eam1104I 509 954 2758
Eam1105I 1964

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EciI 1148 1294 2122

Ecl136II 621
Eco24I 157 621 661
Eco31I 2036
Eco32I 648
Eco47I 2107 2329
Eco57I 1603 2651
Eco57MI 1603 2054 2651
Eco88I 658
Eco147I 678
EcoRI 615
GsuI 2054

HgaI 1 1178 1756 2506

Hin1I 2505
Hin4I 648 1964 2038
HincII 667
HindIII 690
HinfI 280 302 706 911 976 1051 1447 1964
HpaII 128 659 794 1283 1430 1456 1646 2050 2084 2151 2261 2503
HphI 220 1820 2047 2443 2669 2684
Hpy8I 227 282 299 667 1390 1878 2636
Hpy99I 591 604 666 1177 1971 2234
Hpy188I 173 652 1188 1266 1619 1753 1888 2334 2345 2465
Hpy99I 588 633 644 880 1309 1443 1541 1639 1722 1796 2055 2804
KpnI 627
LweI 641 1164 2216 2426 2656
MaeI 79 645 1571 1824 2159
MaeIII 43 55 567 587 1433 1496 1612 1895 2226 2284 2437 2625
MbiI 86 766 1007 2808
MboII 101 510 955 1574 1726 1817 2572 2650 2759
Mph1103I 639

12
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MslI 2217 2376 2735

MspI 128 659 794 1283 1430 1456 1646 2050 2084 2151 2261 2503
MspA1I 525 898 1416 1661 2602
Mva1269I 637
MvaI 573 815 1103 1224 1237
NlaIII 685 731 1077 1797 2288 2298 2376 2412 2805
NmuCI 55 587 2226 2437
NsbI 475 2189
PaeI 684
PagI 1796 2804
PdiI 127
PdmI 2564
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SacI 621
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ScaI 2447
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TaaI 256 481 1038 1109 1579 1892 2407

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TaiI 121 231 274 286 593 1779 2195 2568

TaqI 197 619 668 1176 2620
TasI 416 427 453 616 757 774 849 1837 2143 2398
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TauI 14 28 1002 1120 1275 2359 2481 2710
TfiI 911 1051
TseI 50 473 546 900 981 999 1418 1483 1486 1692 2020 2386
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XceI 684 1076
XmiI 667

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Apêndice 2

Esquema de Aplicação de Amostras

Grupo Poço nû Poço nû

Descrição
Volume

15