Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Fisiologa BIO177- 1 Semestre 2013 TRABAJO PRCTICO N3

CULTIVOS CELULARES.

1. INTRODUCCION Las clulas son la unidad estructural y funcional de todo organismo vivo, las cuales, dependiendo el tejido que conforman, tienen caractersticas propias y a veces nicas, que las diferencian de otros tipos celulares. Actualmente, los cultivos celulares son empleados como modelos de estudio en investigaciones cientficas, los cuales sirven para determinar, el posible comportamiento que presenta un determinado tipo celular en un sistema biolgico (Ej: frente a un frmaco, un agente infeccioso, etc.). El cultivo de clulas es una de las tcnicas de mayor uso y trascendencia en la investigacin cientfica. Constituye el elemento fundamental para la multiplicacin celular in vitro, ya que ofrece a las clulas de un medio que provee el mximo de condiciones favorables para su divisin. La adaptacin de un sistema celular a un medio que permita su crecimiento y mantenimiento ofrece muchas ventajas para estudiar la interaccin clula-clula. Las condiciones ptimas de cultivo varan con los diferentes tipos de clulas, lo cual exige el conocimiento del sistema para asegurar buenos resultados. Son muchas las variables a tener en cuenta y cada una de ellas merece particular atencin segn el tipo de cultivo que se realice y las clulas con que se trabaje (monocapa esttica, cultivos en suspensin, cultivos de alta densidad, etc). Los factores ms importantes son: 1) Temperatura 2) Composicin del medio de cultivo 3) pH 4) Concentracin de gases disueltos 5) Caractersticas del soporte inerte en el cual se propaga el cultivo 6) Otros factores especficos.

TIPOS DE CULTIVOS CELULARES SEGN SU CONSTITUCIN CELULAR Primario: Es el primer cultivo de clulas a partir de un tejido (embrin de pollo, membrana corioalantoidea, dermis, rin, pulmn, tumores). Constituye una poblacin mixta de clulas obtenida a partir del tejido original donde se utiliza una enzima (tripsina) y/o sustancia quelante (EDTA) para disgregar las clulas. Secundarios: Son los subcultivos del cultivo primario. En la mayora de los casos slo son posibles un nmero limitado de subcultivos constituyendo una CEPA CELULAR DIPLOIDE que permanece inalterada en sus propiedades morfolgicas y de crecimiento. Estas clulas deben subcultivarse con un conteo inicial relativamente alto. Lnea celular: Es una poblacin uniforme de clulas, con un ndice de multiplicacin adecuado, derivada de un cultivo celular primario que ha sido subcultivado durante un gran nmero de subpasajes (generalmente ms de 50 pasajes). La uniformidad celular se puede lograr por seleccin espontnea de una subpoblacin celular a lo largo de los pasajes o por clonacin mltiple. La American Type Culture Collection (ATCC) ha editado publicaciones donde se describen las caractersticas de una amplia variedad de lneas celulares, su disponibilidad para diversos fines y, donde se proveen instrucciones para la preparacin, congelamiento y almacenamiento de las mismas (Catlogo de lneas celulares e hibridomas de ATCC). Actualmente la ATCC posee lneas celulares de referencia caracterizadas, derivadas de una amplia gama de especies, hibridomas, lneas obtenidas por ingeniera gentica, etc. Todas estn conservadas en nitrgeno lquido. Adems de su papel como proveedor de lneas celulares, la ATCC tambin funciona como Centro Internacional de Referencia para cultivos celulares de la OMS. La contaminacin cruzada entre lneas celulares en cultivo es un problema ampliamente demostrado y, para verificar la identidad y excluir contaminacin inter o intraespecie se utilizan perfiles cariotpicos y de isoenzimas de las lneas celulares, as como ensayos moleculares e inmunolgicos. La especie de origen se verifica por reaccin con anticuerpos fluorescentes, hemoaglutinacin indirecta, anlisis de isoenzimas, estudio de cariotipo, etc y este ltimo estudio incluye el anlisis comparativo del nmero total de cromosomas en 100 o 200 metafases, con bajo aumento, estimando el nmero de clulas poliploides en la poblacin. Estas observaciones se hacen sobre clulas del primer o segundo pasaje despus de la recuperacin de ampollas congeladas de la semilla de referencia. Las lneas celulares de referencia se verifican tambin para determinar la presencia de micoplasmas, bacterias, hongos, protozoos y virus. Cuando es necesario se registra la presencia o ausencia de partculas de determinado tipo viral por microscopa electrnica. TIPOS DE CULTIVOS CELULARES EMPLEADA PARA SU DESARROLLO. SEGUN LA METODOLOGA

En suspensin: Las clulas, una vez dispersadas, se mantienen en frascos especiales bajo agitacin permanente. Los puntos crticos son la agitacin, la aireacin y la concentracin de gases (O2 y CO2) disueltos. En monocapa: Las clulas se encuentran estticas, luego de la dispersin se permite la adherencia a una superficie lisa (vidrio o plstico). Los cultivos estticos pueden hacerse crecer en medio lquido y medio semislido.

Explantos: Consisten en el mantenimiento de un pequeo trozo de tejido (1 mm de lado) bajo un medio de cultivo rico en plasma, logrndose la extensin del mismo a partir de su base de adherencia. Las condiciones de incubacin de los cultivos celulares varan de acuerdo al tipo de incubador que se posea. Puede ser con temperatura controlada en cuyo caso el cultivo deber mantener su medio ambiente completamente cerrado o, con temperatura, humedad y tensin de CO 2 controlada, en cuyo caso el cultivo se har en frascos o placas de cultivo especiales, manteniendo la esterilidad y que permiten el intercambio gaseoso. Para ser inoculados con virus debe considerarse que las clulas luego de la dispersin tienen un perodo de refractariedad a la infeccin, por lo tanto la inoculacin debe realizarse en el momento de sembrar las clulas o una vez formada la monocapa. MEDIOS DE CULTIVO Existen ms de 50 formulaciones diferentes para los componentes de los medios de cultivo. En la mayora de los laboratorios se usa tambin un nmero variado de suplementos y mezclas de las diferentes frmulas dando una diversidad total muy grande. En general y siempre que est disponible, se usan medios deshidratados de origen comercial. Al lquido reconstituido se le agregan cantidades apropiadas de suero previamente evaluado, bicarbonato de sodio y otros suplementos si fuera necesario. Los elementos imprescindibles en la composicin de un medio de cultivo son: Soluciones salinas balanceadas. Sirven como diluyentes y mantienen la tonicidad, aportan agua y sales. Las ms comunes son: Earle, Hanks, gey, Eagle, etc. (forman la base de otros medios ms complejos). Las sales ms comunes presentes en estos medios son: NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4 H2O2, NaH2PO4, NaHCO3. Estas sales se diluyen en agua bidestilada en las proporciones establecidas y se esterilizan por filtracin o autoclavado. Bicarbonato de sodio (NaHCO3). El uso del bicarbonato de sodio, con o sin CO2 agregado a la fase gaseosa, mejora significativamente la situacin de regulacin del pH. Se debe entender claramente la interrelacin entre la concentracin del ion bicarbonato (HCO3-) en el medio, el pH y la presin parcial de CO2 en la fase gaseosa. El CO2 gaseoso es muy soluble en el medio de cultivo, una pequea proporcin (menos del 1%) se combina qumicamente con el agua para formar cido carbnico (H2CO3), muy dbil, que se disocia para producir HCO3- + H+. As la acidez aumentar gradualmente a medida que aumenta la presin parcial de CO2. Por simplicidad, el contenido de bicarbonato de sodio de la mayora de los medios usados ser ajustado para mantener un pH de 7,4 cuando se equilibra a 37C, con 5% de CO2 en aire. Hidratos de carbono. La glucosa es la ms utilizada, toma parte en los procesos biosintticos como as tambin en la oxidacin del cido lctico. Slo la D-manosa, D-fructosa y D-galactosa pueden reemplazar a la glucosa satisfactoriamente. Los hidratos de carbono son importantes por el papel que juegan en la oxidacin del cido lctico, su integracin a protenas y en la composicin de la ribosa y desoxirribosa.

 Aminocidos. Se usan los L-aminocidos. Existen aminocidos esenciales y no esenciales de acuerdo al sistema clula-medio empleado. Se preparan concentrados 100X o 50X. Su adicin a algunas soluciones balanceadas ms vitaminas les da el carcter de medios ricos. Se guardan a 4C. Vitaminas. La mayor parte de los medios sintticos contienen colina, cido flico, inositol, nicotinamida, cido pantotnico, piridoxal, riboflavina y tiamina. Se guardan congelados a -20C. Lpidos. Se usan en forma de steres en algunos medios. Antibiticos. Rutinariamente se utiliza penicilina/estreptomicina a 100mg y 50g/m L respectivamente. Como antimictico puede usarse Nistatina o fungizone a 500 U/mL y 2,5 g /mL respectivamente. Se guardan congelados a 20C. Suero (protenas). Se utilizan sueros homlogos y heterlogos. Aportan protenas, hidratos de carbono, aminocidos y factores de crecimiento. Previo a su uso se deben descomplementar calentndolo a bao de Mara a 56C durante 30 minutos. Se esteriliza por filtracin y se conserva a -20C. Comercialmente se adquieren estriles. Otros Pueden adems adicionarse: hidrolizado de lactoalbmina, caldo triptosa fosfato, extracto de levadura, plasma, etc. OTRAS SOLUCIONES DE USO CORRIENTE EN EL MANTENIMIENTO DE CULTIVOS CELULARES Solucin tamponada de fosfatos (PBS) 0,141M. Se emplea como diluyente de la tripsina, antibiticos, para suspensiones celulares, etc. NaCl 0,13 M KCl 0,002 M Na2HPO4 0,008 M KH2PO4 0,0014 M Rojo fenol. Es un indicador de pH para los medios, tripsina, PBS. Se utiliza en solucin acuosa al 1% de 4-6 ml por cada 1000 ml de solucin. Los medios de cultivos comerciales pueden venir con o sin el rojo de fenol incorporado. Tripsina. Se utiliza como agente disgregante, se usa segn el tejido y su concentracin vara desde 0,25 a 0,50 % en PBS. Su pH debe ser de 7,2-7,5

 NaOH 1M. Se utiliza para ajustar el pH de las soluciones. Todos los medios deben tener pH entre 7.0-7.4.
Los conceptos claves que debe manejar previo al trabajo prctico:

Clula Cultico celular Condiciones del medio de cultivo

2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Las clulas PC12, son una lnea de clulas provenientes de un feocromocitoma, tumor ubicado en la mdula suprarrenal de ratas. Estas clulas al ser estimulada con NGF (neural growth factor) tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas, permitiendo ser empleadas como un modelo de estudio neuronal. Las clulas EA.hy, son una lnea inmortal de clulas proveniente de endotelio de vena humano, lo que permite emplearlas como modelo de clulas endoteliales. Mediante la observacin en un microscopio ptico se comparar los tipos celulares: neuronas (PC12) y clulas endoteliales (EA.hy). Experimento 1 Observar detenidamente las 2 placas que les fueron entregadas al inicio del prctico y responder las siguientes preguntas.

Experimento 2 A cada placa de cultivo, sacar 1 mL de medio y agregar 1 mL de agua destilada. Observar detenidamente y responder las siguientes preguntas.

PRCTICO N3 CULTIVOS CELULARES 3. RESULTADOS Y DISCUSION

GRUPO N: __________ FECHA: __________ INTEGRANTES DEL GRUPO ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

Experimento 1 Observar detenidamente las 2 placas que les fueron entregadas al inicio del prctico y responder las siguientes preguntas. 1. Describir las diferencias morfolgicas de cada tipo celular (ej: tamao, forma, prolongaciones etc.)

2. Segn lo anterior por qu tienen esas caractersticas (ventajas fisiolgicas)

3. Que confluencia presenta cada cultivo celular?

4. Segn lo anterior por qu presentan esas confluencias (ventajas fisiolgicas)

Experimento 2 A cada placa de cultivo, sacar 1 mL de medio y agregar 1 mL de agua destilada. Observar detenidamente y responder las siguientes preguntas. 1. Describir las diferencias morfolgicas de cada tipo celular

2.

Segn lo anterior qu efecto produjo el agua destilada en las clulas?

3.

Qu cultivo resisti de mejor manera el cambi en la osmolaridad? Por qu?