Repblica Bolivariana de Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanlisis Ctedra: Anlisis Instrumental

Tcnicas Cromatogrficas

Maracaibo, 24 de Julio de 2008

Cromatografa de Gases: 1. Estudie las definiciones y trminos siguientes Cromatografa Cromatograma Elusin Fase Mvil Tiempo de Retencin Ancho de base Fase Estacionaria Altura del plato terico. Eluyente Resolucin Tiempo muerto Nmeros de platos tericos 2. Establezca diferencias entre los mtodos de Cromatografa de Gases Cromatografa de Gases Cromatografa de Lquidos 3. Identifique los componentes generales de un Cromatgrafo de Gas y estudie la funcin de cada una de ellas. 4. Clasifique los diferentes detectores utilizados en Cromatografa de Gases. 5. Enumere las caractersticas de la Fase Estacionaria y Fase Mvil en Cromatografa de Gases 6. Como es normalmente un Cromatgrama en Gases. 7. Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografa de Gases Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) 1. Describa el fundamento de HPLC 2. Establezca la clasificacin de los tipos de HPLC 3. Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatgrafo lquido, y estudie la funcin de cada uno de ellos. Enumere las caractersticas de la Fase Estacionaria Enumere las caractersticas de la Fase Mvil Establezca las caractersticas del soporte ideal en la fase est5acionria de HPLC. 4. Enumere los tipos de Detectores usados en HPLC 5. Establezca diferencia entre separacin isocrtica y separacin con gradiente 6. Como afecta los siguientes parmetros en la Resolucin de la columna: 7. Enumere las aplicaciones de la HPLC

1.-Estudie las definiciones y trminos siguientes: 1.1.- Cromatografa: Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composicin. La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser slida o lquida. 1.2.- Cromatograma: Es una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. Registro producido por el cromatgrafo de gas / lquido. Es tambin una medida del funcionamiento del instrumento. 1.3.- Elucin: Es el procedimiento en el que la fase mvil se pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve. 1.4.- Fase Mvil: Puede ser un lquido o un gas que recorre la columna cromatogrfica transportando los componentes de la mezcla a travs de dicho sistema. 1.5.- Tiempo de Retencin: Es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la seal propia del componente en su mxima intensidad. Los tiempos de retencin no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatogrfica. 1.6.- Ancho de Base: Es la separacin de la longitud de las bases interceptado por agentes delongados en el detector. 1.7.- Fase Estacionaria: Es la que recubre la columna cromatogrfica, interiormente sin desplazarse. La fase estacionaria consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. 1.8.- Altura del Plato Terico: Se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna, este directamente relacionado con la

varianza, por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los trminos de varianza y longitud de la columna. 1.9.- Eluyente: Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase estacionaria y permite que se desplace la muestra. 1.10.- Resolucin: Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatogrfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolucin, tRA y tRB son los tiempos de retencin de los componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes. 1.11.- Tiempo Muerto: Es el tiempo de retencin del componente inerte o gas portador. 1.12.- Nmero de Platos Tericos: Se utiliza como una medida eficiente de la columna. 2.- Establezca las diferencias Cromatografa de Gases. entre los mtodos de

En cromotografa de gases se incluyen todos los mtodos cromatogrficos en los que la fase mvil es un gas (gas portador), siendo la fase estacionaria un lquido (CGL) o un slido (CGS).

La cromatografa gas-slido (CGS): Tiene una fase estacionaria slida en la cual se produce la retencin de los analitos debido a la adsorcin fsica sobre la superficie del slido. Esta tcnica ha tenido una aplicacin limitada debido a la tendencia de los picos de elucin a formar colas y a la retencin semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria. La cromatografia gas-lquido (CGL): Se basa en la distribucin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase estacionaria lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte (soporte) o en las paredes interiores de la columna, si sta es capilar.

3.Identifique los componentes generales de un Cromatgrafo de Gas, y estudie la funcin de cada una de ellas:

Gas Portador: es un gas inerte, generalmente helio, nitrgeno o argn, de elevado grado de pureza. El caudal del mismo que pasa por la columna, ha de ser conocido y controlado. Cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Inyector: Es slo una pequea cmara colocada inmediatamente antes de la(s) columna(s) de separacin, donde se accede mediante una jeringa adecuada o con una vlvula de inyeccin. El Inyector es el lugar por donde se introduce una pequea cantidad de muestra (del orden de 1 cm3 de gas o 1 micro-litro de lquido) en medio de la corriente de gas. Tambin se encarga de vaporizar las muestras cuando stas no son gaseosas. As, la temperatura del inyector ha de ser superior a la del punto de ebullicin del componente de la mezcla menos voltil. Columnas: El sistema de columnas cromatogrficas constituyen el corazn de todo cromatgrafo. Cada columna se disea para aprovechar alguna propiedad de los diferentes componentes que resulte adecuada para generar distinta velocidades de avance para cada uno de ellos durante el recorrido de la columna. Existen dos tipos: o Las columnas de relleno: Suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y tefln; con un dimetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia est en torno a 1.000-2.000 (platos tericos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, mximo 10 componentes. o Las columnas capilares: Tienen un dimetro interior inferior a 1 mm (320-250 m) y una longitud de 5 a 50 m. Suelen construirse con slice fundida que le dan gran resistencia fsica y flexibilidad. Alcanzan una eficacia hasta de 4.000 (platos tericos/m) y se usan para muestras complejas. La fase estacionaria se depositada sobre las paredes interiores del tubo capilar. Las columnas semicapilares tienen un dimetro interior de 530 m que admiten cantidades de muestra similares a las columnas de relleno, y proporcionan mayor eficacia que stas. Detector: Es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un cromatgrafo. Es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. El sistema de deteccin genera una seal cuando un componente de la mezcla completa el recorrido del sistema de separacin. Un sistema de Integracin: para cuantificar la seal generada por cada componente en el Detector.

4.- Clasifique los diferentes detectores utilizados en la cromatografa de Gases: Estos pueden ser clasificados: Detectores segn su Grado de Selectividad : o Universales: Responde a la mayora de los solutos que pasan por l. o Especficos Selectivos: Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mnimo de respuesta a otras. Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificacin, obviamente, es en referencia a si la muestra es destruda o no. Detectores segn su Modo de Respuesta: o Dependientes del Flujo Msico: Producen una seal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es independiente del volmen de gas portador requerido para la elucin. o Dependiente de la Concentracin: Dan una seal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volmen de gas portador que pasa a travs de l. Detectores segn el proceso de deteccin Ionizacin, pticoespectroscpico, Electroqumico, etc.

5.- Enumere las caractersticas de la Fase Estacionaria y Fase Mvil en Cromatografa de Gases:

Fase Estacionaria: Es la forma ms habitual La fase estacionaria es no polar y la mvil es polar Utiliza disolventes no polares

Fase Mvil Es habitual Utiliza una fase estacionaria polar y una mvil no polar Utiliza disolventes polares

6.- Como es normalmente una Cromatografa de Gases. La separacin de los compuestos de una mezcla se realiza en las siguientes etapas: 1.-Una vez elegida la columna y fase estacionaria, se ajustan las temperaturas de la cmara de inyeccin, columna y detector, as como el caudal de gas portador. Cuando la seal del detector es constante (sin ruidos la lnea base) se hace la inyeccin de la muestra. 2.-Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 l cuando son lquidas y sobre 1 ml si son gaseosas; se introducen en la cmara de inyeccin, donde se vaporizan, y son arrastradas hasta cabeza de columna. 3.-Los componentes se fijan en una pequea zona de la columna; por equilibrios sucesivos entre fase mvil y estacionaria cada componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes. 4.-Finalmente, los solutos que salen de la columna, pasan al detector y se obtiene el cromatograma. 7.- Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografa de Gases: CUALITATIVAS Identificacin Cromatogrfica: o Por Datos de Retencin o Por Serie Homlogas (Indices de Retencin de Kovacs) Identificacin No Cromatogrfica: o Anlisis Clsicos o Identificacin por: Adicin de Estndar Formacin de Derivados Sustraccin de un Componente Identificacin con Tcnicas Auxiliares: UV, IR, MS, RMN

CUANTITATIVAS Normalizacin de rea Normalizacin de rea con Factores de Respuesta Estandarizacin Externa Estandarizacin Interna

1.- Describa el fundamento de la HPLC: La cromatografa lquida es una tcnica cuyo objetivo es la separacin de los distintos componentes de una mezcla de sustancias, basndose en las diferentes retenciones que experimentan los componentes de la misma al pasar a travs de una fase estacionaria,

cuando la muestra es eluida por una fase mvil lquida. As, la separacin de los componentes de la muestra se produce debido a sus interacciones entre una fase mvil lquida y una fase estacionaria slida, contenida en una columna cromatogrfica. Para explicar el fenmeno cromatorgrfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro prximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los analitos: solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes como ocurre en cromatografa liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes: - Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica. 2.- Establezca la Clasificacin de los tipos de HPLC: Cromatografa de fase normal:

Fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.

Cromatografa de fase reversa:

Consiste en una fase inmvil apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuestodisolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase mvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuestodisolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin

neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC. Cromatografa de exclusin molecular

Tambin conocida como cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas. La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes. En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta. Cromatografa de intercambio inico:

En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i) Resinas de

poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio aninic. Cromatografa basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria. 3.- Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatgrafo lquido, y estudie la funcin de cada uno de ellos. Un equipo para cromatografa lquida de alta resolucin puede representarse por el siguiente esquema: - Bomba: Enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo, generalmente de acero inoxidable. El sistema de bombeo debe seguir los siguientes requerimientos: 1. 2. 3. 4. 5. Generacin de presiones por encima de 6000 psi(~410 atmsferas) Flujo libre de pulsaciones Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min(con control del 0.5%) Componentes resistentes a la corrosin (acero inoxidable o Tefln) Reproducible

Tipos de Bombas: Bombas reciprocas Bombas de desplazamiento Bombas neumticas - Vlvula Inyectora: Consiste en una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeas cantidades de muestra (0.1-100L)
-

Columna: Se produce la separacin de los componentes. Son, generalmente de Acero inoxidable, con una longitud de 10-30

cm y un dimetro interno de 4-10mm. De 1-10m tamao particula-40,000-60,000 platos/metro. PRECOLUMNAS Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y contaminantes de las disolvente. La composicin del relleno debe ser semejante a la columna analtica
-

Detector: Produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa seal es enviada al registrador. Deben de tener un volumen interno pequeo para reducir el ensanchamiento de pico. Basados en una propiedad de la fase mvil (refraccin, densidad etc.) y en una propiedad del soluto (absorbancia en UV, fluorescencia etc.) Registrador Integrador: Realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) que idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. Este que El integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia

3.1.- Caractersticas de la Fase Estacionaria:

Puede ser almina, slice o resinas de intercambio inico. Para que el lquido inmovilizado sea til debe poseer diferentes coeficient5es de participacin con los solutos.

Para que un soluto presente un tiempo de residencia razonable en la columna, debe poseer por lo menos, una cierta compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria. Entre solutos de polaridad similar, el orden de elusin generalmente sigue al orden de puntos de ebullicin; cuando stos difieren suficientemente son factibles separaciones limpias. Los solutos con puntos de ebullicin casi idnticos, pero de diferentes polaridades, retendrn selectivamente uno o ms de los componentes por interaccin dipolo o por formaciones de abducto

3.2.- Caractersticas de la Fase Mvil: Es un solvente lquido, el cual puede ser puro o una mezcla de solventes. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. El lquido, se obliga a pasar a travs del slido bajo presin o bien se deja percolar a travs de l, por efecto de la gravedad.

3.3.- Caractersticas estacionaria de HPLC

del

soporte

ideal

en

la

fase

La funcin bsica del soporte es la de mantener (sotener, retener) la fase estacionaria La mayora d elos soportes cromatogrficos est hecha de diatomita. Qumicamente es casi todo slice, con algunas impurezas. 4.- Enumere los tipos de detectores utilizados en HPLC: Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: Detectores basados en una propiedad de la fase mvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refraccin Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta Los detectores ms utillizados en HPLC son: Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: o Detector de Longitud de Onda Fija o Detector de Longitud de Onda Variable o Detector de Arreglo de Diodos Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: o Tipo Deflexin o Tipo Fresnel

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin . Detector de Fluorescencia Inducida por Laser o Segn la Fuente de Excitancin o Segn el sistema ptico Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: o Detector Amperomtrico o Detector Conductimtrico o Detector Potenciomtrico

5.- Establezca diferencia entre una separacin isocrtica y separacin con gradiente: En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos. Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras que los compuestos ms

hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos. 6.- Cmo afectan los siguientes parmetros en la Resolucin de la columna:

Dimetro de la partcula:
La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas. Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin, pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula. Esto significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara la presin necesaria en un factor de ocho.

Longitud de la columna:
Es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas. 7.- Enumere las aplicaciones de la HPLC Compuestos inicos, como aminocidos, sales inorgnicas, cidos orgnicos, etc. Compuestos de alto peso molecular, como polmeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc. Compuestos termolbiles y no voltiles, como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacuticos. Anlisis de compuestos vitamnicos es posible en corto tiempo.

 Determinaciones de constituyentes de cidos nucleicos (nucletidos, nuclesidos) por cromatografa de intercambio inico. Determinacin de esteroides. El anlisis de medicamentos (determinacin de los componentes activos de una tableta analgsica, anlisis de barbitricos, anticonceptivos, etc). En separaciones segn el tipo qumico, ya que su finalidad no es la separacin de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.